專利名稱：通過cetp檢測高脂血癥易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測高脂血癥易感性的試劑盒，通過檢測血 漿膽固醉酯轉(zhuǎn)移蛋白基因(cholesteryl ester transfer protein, plasma, CETP)的單核苷酸多態(tài)性(SNP) 位點來預測個體對高脂血癥的易感性。
背景技術(shù)：
由于脂肪代謝或運轉(zhuǎn)異常使血漿中一種或幾種脂質(zhì)高于正常稱為高脂血癥(hyperlipideniia)，可表現(xiàn) 為高膽固醇血癥(hyperchoesterolemia)、高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia)或兩者兼有(混合型 高脂血癥)。脂質(zhì)不溶或微溶于水，必須與蛋白質(zhì)結(jié)合以脂蛋白形式存在，才能在血液循環(huán)中運轉(zhuǎn)，因此， 高脂血癥常為高脂蛋白血癥(hyperlip叩roteinemia)的反映。由于逐漸認識到血漿中高密度脂蛋白降低也 是一種血脂代謝紊亂，因而稱之為血脂異常(dyslipidemia)更為全面、準確。目前冊O(shè)將高脂蛋白血癥分 為五大類，主要為根據(jù)血漿脂蛋白升高的程度不同進行的表型分類:家族性高乳糜微粒血癥(家族性高甘
油三酯血癥)、家族性高膽固醇血癥(家族性高e脂蛋白血癥)、家族性異常e脂蛋白血癥、高前P脂蛋白
血癥、混和型高甘油三酯血癥(混和型高脂血癥)。
脂蛋白的蛋白部分是一種特殊蛋白，因與脂質(zhì)結(jié)合擔負在血漿運轉(zhuǎn)脂類的功能，故稱為載脂蛋白 (apoprotein)。載脂蛋白除了與脂質(zhì)結(jié)合形成水溶性物質(zhì),成為轉(zhuǎn)運脂類的載體以外，還有其它特殊功能， 尤其是參與酶活動的調(diào)節(jié)，以及參與脂蛋白與細胞膜受體的識別和結(jié)合反應。血漿中的脂蛋白呈微粒狀，
核心主要為甘油三酯和膽固醇酯，外層由磷脂、膽固醇、載脂蛋白構(gòu)成，水溶性酶可透過表層進入內(nèi)層起
作用。脂蛋白的代謝有兩條途徑①外源性代謝途徑是指飲食攝入的膽固醇和甘油三酯在小腸中合成CM
及其代謝過程；②內(nèi)源性代謝途徑是指由肝合成的VLDL轉(zhuǎn)變?yōu)镮DL和LDL，以及LDL被肝或其他器官代 謝的過程。其中乳糜微粒CM不能進入動脈壁內(nèi)， 一般不致動脈粥樣硬化，但易誘發(fā)胰腺炎。血漿極低密 度脂蛋白VLDL水平升高是冠心病的危險因素。低密度脂蛋白LDL容易進入動脈壁并被氧化修飾，是主要 的致動脈粥樣硬化的因素。高密度脂蛋白HDL水平升高有利于外周組織移除膽固醇，防止動脈粥樣硬化發(fā)生。
高脂血癥(高脂蛋白血癥)臨床上可分為兩類①原發(fā)性，屬遺傳性脂代謝紊亂疾??；②繼發(fā)性，常
見于控制不良的糖尿病、飲酒、甲狀腺功能減退癥、腎病綜合癥、透析、腎移植、膽道阻塞、口服避孕藥 等。血脂異常與心血管病，尤其與冠心病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，是代謝綜合癥的組成成分之一。
已知部分原發(fā)性高脂血癥是由先天性基因缺陷所致，如LDL受體基因缺陷可引起家族性高膽固醇血癥。
而常見繼發(fā)性高脂血癥病因有下列兒種
1、 高膽固醇血癥糖尿病、腎病綜合癥、甲狀腺功能減退、Cushing綜合癥；
2、 高甘油三酯血癥糖尿病(未控制)、腎病綜合癥、尿毒癥(透析時)、肥胖癥、雌激素治療、糖原貯 積癥(I型)、飲酒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、異常Y-球蛋白血癥、痛風；
3、 高異常脂蛋白血癥各種原因引起的肝內(nèi)外膽道梗阻、膽汁淤積性肝膽病、包括肝內(nèi)膽小管性肝炎、
膽汁性肝硬化。
我國人群血脂平均水平低于發(fā)達國家，但其升高幅度卻很驚人。我國對不同地區(qū)9組人群，從20世 紀80年代初至90年代末的20年間進行了 3次可比性調(diào)査，結(jié)果表明血清總膽固醇(TC)〉5.20mmo1/ L(200mg/dl),男性患病率由17%連續(xù)上升至33%,女性患病率由9%連續(xù)上升至32%。因此，積極檢出、 預防和控制血脂異常成為經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)心血管病預防工作的主要內(nèi)容之一。
SNP (single nucleotide polymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性標記，是一類基于單堿基變異引起的DNA 多態(tài)性，被遺傳學界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標記，占
大約90%。這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復雜疾病的易感 性和對環(huán)境因素、藥物反應的差異。
CETP位于第16號染色體16q21位置，全長約25kb， mRNA全長1790bp，由16個外顯子和15個內(nèi)含 子組成，編碼的蛋白全長494個氨基酸。CETP是血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白編碼基因，由該基因編碼的蛋白是 脂代謝中重要的轉(zhuǎn)運蛋白之一，它主要介導膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運過程，即在高密度脂蛋白(HDL)顆粒與其 它脂蛋白或細胞膜之間不斷地進行脂質(zhì)成分交換的同時增加膽固醇從組織細胞中流出轉(zhuǎn)運至肝臟的過程。
近年來研究認為CETP基因上的多態(tài)現(xiàn)象與多種異常脂蛋白血癥(異常e脂蛋白血癥，家族性高膽固醇血
癥和混合型高脂蛋白血癥)，肥胖、糖尿病、腎病綜合癥以及AS型心腦血管疾病等因素相關(guān)。CETP基因的 缺陷可以引起HDL中CE蓄積、TG降低；VLDL、 LDL中的CE減少，TG增加。而CETP活性增加，脂肪攝取 過多易沉積于肝，更多富含CE和LDL顆粒和VLDL殘粒集聚于血漿中，過多的LDL就聚集在動脈壁細胞內(nèi)， 導致CE沉積于動脈壁內(nèi)，從而引發(fā)多種癥狀。
國內(nèi)外大樣本研究均表明CETP基因上的rsl7237904號SNP位點(SEQ ID NO: 1所示序列中146位) 基因型與血漿高密度脂蛋白膽固醇水平的升高有顯著關(guān)系，rsl7237904號位點是位于第16染色體上CETP 基因第1內(nèi)含子的酶切位點Taq IB處的一個的G/A多態(tài)SNP位點，低頻等位基因A即為國內(nèi)外文獻中常 見的TaqIB的B2位點，可以降低血漿內(nèi)膽固醇脂轉(zhuǎn)運蛋白的濃度，抑制高密度脂蛋白向低密度脂蛋白的 轉(zhuǎn)化，因此對于心腦血管疾病的發(fā)生有一定的保護作用。國內(nèi)外的大量的關(guān)聯(lián)分析表明，CETP基因上的 rsl7237904號SNP位點基因型為A時能夠降低高脂血癥的發(fā)生。這個SNP位點的多態(tài)性可用于評估個體 對高脂血癥的易感性，目前已通過中國科學院國家生物基因檢測技術(shù)應用評估認證中心的認證。

發(fā)明內(nèi)容
基于CETP基因上的rsl7237904號SNP位點的多態(tài)性可用于評估個體對高脂血癥的易感性的基礎(chǔ)上， 本發(fā)明提供一種檢測高脂血癥易感性的試劑盒。
該試劑盒包括檢測CETP基因SEQ ID NO: 1中第146位SNP位點的特異性引物對及特異性炎光探針、 Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對SEQ ID NO: 1中第146位SNP而設(shè)計，能特異性擴增出SEQ IDNO: 1中包含第146位SNP位點的DNA片段的引物對。設(shè)計這類引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成 的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對。特異性引物對可用常規(guī)的合成技 術(shù)進行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對引物。
本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID NO: 1中第146位SNP位點而設(shè)計，能通過熒光 定量PCR技術(shù)特異性檢測出這個SNP位點高脂血癥易感基因型的探針。設(shè)計這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能 夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ IDNO: 4所示序列的Tacpan探針。特異性熒光探針可用 常規(guī)的合成技術(shù)進行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這條探針，所有 可用于熒光定量PCR檢測SEQ ID NO: 1中第146位SNP位點的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括-
I" 10 X熒光定量PCR反應緩沖液，
0. lul 25raM dNTP混合液，
0.5nl 25mM MgCl2溶液，
0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶，
20一特異性引物對(二條)各0.225nl，
IOHM特異性熒光探針0. 25jxl，
去離子水5. 68pl。
本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-2℃ 。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例l.檢測試劑盒的使用
步驟l: DNA模板的抽取
用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。
步驟2:熒光定量PCR反應
使用可檢測高脂血癥易感性的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和熒光探針
有義引物5' - AACAGCCAGGTATAGGGAT -3' (SEQ ID NO: 2) Tm值為56°C
反義引物5' - TATACACCMCCTCCTAATC -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值為56°C
炎光探針5' - GGTTCGAGTTAGGGTTCAGATC _3' (SEQ ID NO: 4) Tm值為66°C
熒光定量PCR反應體系為總體積10nl,包含濃度為20ng/nl的DNA模板2pl、 1^1 10 X熒光定量PCR 反應緩沖液、0. lpl 25mM dNTP混合液、0. 5pl 25raM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM的有義引物和反義引物各0. 225jxl、 10—的熒光探針0.25^x1,去離子水5. 68^1。
在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為5(TC、 2分鐘，95'C、 10分鐘，進行60個循環(huán)的 95'C、 30秒，6CTC、 l分鐘。反應結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟3: SNP基因型分析
將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對照相對比，熒光探針最終的熒光信號明顯高于正 常對照，說明被檢測DNA的CETP基因上的rsl7237904號SNP位點基因型攜帶有G型，為高脂血癥易感型；
實施例2.指導人們主動預防高脂血癥的服務(wù)
目前在上海主健生物工程有限公司已經(jīng)開展了這項服務(wù)。
步驟l: DNA提取
對被檢測者進行服務(wù)前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習慣問巻調(diào)査表。依照取樣 盒中的指示使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的CETP基因上的rsl7237904號SNP位點進行熒光定量PCR 檢測，確定這個SNP位點的基因型。
步驟3:指導人們主動預防高脂血癥
通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具基因分型檢測報告和被檢測者個體化健康指導報告。基因檢 測報告詳細說明了被檢測者高脂血癥易感程度的高低以及患病的概率大小。個體化健康指導報告以被檢測 者的基因分型檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習慣問巻調(diào)査結(jié)果，評估被檢測者高脂血癥遺傳易感的相 對風險。同時制定出針對于被檢測者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習慣、生活方式上的改進建 議等，并為被檢測者普及預防高脂血癥的健康知識。
5
序列表
〈110〉上海主健生物工程有限公司
<120>通過CETP檢測高脂血癥易感性的試劑盒
<160> 4
<210〉 1
<211〉 300 <212〉DNA 〈213〉人工序列
人種(Homo sapiens, human)
〈 1 gggag3tggg tctttggtga ctgagaccca
tg3gtC3ggg
gccaaagtca
ctgagcggag ctgtcatcac cccctcctga cctcgccttc aaggtcaagt 60
g卿gtccta gctgcattgc aaacagccag gtatagggat ttgtgtttgt 120
g33tC3Ctgg ggttCg3gtt agggttC3g3 tCtg3gCC3g g"3gggggt 180
ggt纖gatt aggaggttgg tgtatatttg gtgttggggg tcactctatg 240
ggggttgcca tgagctcagg tgacggaggc tccatcactg actgttgtgt 300
<210> 2 <211> 19 <212>廳 <213〉人:l:序列
〈220>
<223〉引物
<■ 2
aacagccagg tatagggat
19
<210〉 3
<211〉 20
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<223〉引物
<400〉 3
tatacaccaa cctcctaatc
20〈210〉 4
<211〉 22
<212〉 DNA
<213〉人工序列
<220>
<223>探針
<400〉 4
ggttcgagtt agggttcaga tc2權(quán)利要求
1.一種檢測高脂血癥易感性的試劑盒，包括檢測CETP基因SEQ ID NO1中第146位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對SEQIDNO: 1中第146位SNP位點而設(shè)計，能特異性擴增出包含SEQ ID NO: 1中第146位SNP位點的DNA片段的引物對。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID N0: l中第146位SNP位點而設(shè)計，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測出這個SNP位點髙脂血癥易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQ ID NO: 2和I3所示序列的引物對。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ ID NO: 4所示序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1ul IOX熒光定量PCR反應緩沖液，0. lul 25mMdNTP混合液,0. 5ul 25mMMgCl2溶液，0.02ul (5unitsul) Taq DNA聚合酶，20uM 特異性引物對(二條)各0.225ul， 10nM特異性熒光探針0.25ul，去離子水5.68ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測高脂血癥易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測CETP基因SEQ ID NO1中第146位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測分析個體的CETP基因上的SNP位點基因攜帶型來預測個體對高脂血癥的易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101173309SQ200610117928
公開日2008年5月7日 申請日期2006年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月3日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司