專利名稱：一種檢測乳腺癌易感性的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測乳腺癌易感性的試 劑盒，通過同時檢測Foxp3基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點與CD14基因的單核苷酸多態(tài) 性位點來預測個體對乳腺癌的易感性。
背景技術：
乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，我國女性乳腺癌發(fā)病率逐年增高，發(fā)病率占 惡性腫瘤的7% 10%，全年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌，占女姓腫瘤的18%。科學家已查明，BRCAl與BRCA2基因的突變很大程度上增加了女性患有乳腺癌的 可能性。在正常情況下，這兩種基因可傳遞控制細胞繁殖的信息。如果它們出現變異，細胞 就會無節(jié)制地繁殖，導致癌癥形成。但BRCAl和BRCA2在預測乳腺癌家族性風險上卻不能 令人滿意，因為攜帶BRCAl與BRCA2基因突變的人群相對很少。人轉錄因子叉狀頭翅膀狀螺旋轉錄因子(forkhead/winged helixtranscription factor Foxp3)基因定位于 Xpll. 23 Xql3. 3，屬于轉錄因子 forkhead/winged_he21ix 家族。Foxp3含有11個外顯子和10個內含子，cDNA全長為1869bp，其編碼的蛋白Foxp3/ Scurfin由431個氨基酸組成，N末端有鋅指蛋白、亮氨酸拉鏈和一個富含脯氨酸的區(qū) 域。fork2head結構域位于羧基端(氨基酸殘基的337 420)，通過該結構域與DNA特 定位點結合，調節(jié)目的基因的活化和表達。于2003年被證實為⑶4+⑶25+調節(jié)性T細胞 (regulatoryT cell, Treg)的特異性標志。免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要機制。在腫瘤學的研究領域中， Foxp3+CD4+CD25+Treg細胞在腫瘤免疫逃逸機制中發(fā)揮作用，Foxp3是CD4+CD25+調節(jié)性T 細胞特異性的表面標志，是發(fā)育與功能的決定因素，在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。在 黑素瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤中都檢測到Foxp3高表達。Wolf等在對浸 潤性乳腺癌中Foxp3的表達研究中發(fā)現，Foxp3表達的高低與淋巴結轉移的情況密切相關， 而與腫瘤大小、浸潤程度、激素受體、孕酮水平、是否絕經等無關(參見Wolf AM, Rumpold H, Wolf D, Gastl G, Reimer D, Jenewein N, Marth C, Zeimet AG. JClin Oncol. 2007 25 4499-4500.)。Zuo等在對超過200例的乳腺癌標本研究中的發(fā)現與其他文獻的結果不一 致，認為Foxp3可以抑制癌基因SKP2轉錄，降低乳腺癌的發(fā)病率，Foxp3基因突變會導致 SKP2表達上調，增加患乳腺癌的概率(參見=Zuo T，Liu R，Zhang H，Chang X，Liu Y，Wang L，Zheng P, Liu Y. JClin Invest. 2007 117:3765-3773)。人⑶14基因位于人5號常染色體的長臂端5q23_q31，約含有1338個核苷酸殘基。 從核苷酸的第76位到1200位，編碼一段有375個氨基酸殘基的多肽鏈。⑶14有兩個形態(tài)，即mCD14和s⑶14。mCD14是一種55kDa的糖蛋白，通過糖基磷 脂酰肌醇(GPI)錨固于細胞膜。mCD14蛋白質部分由包括356個氨基酸殘基組成的多肽鏈 和一個由19個氨基酸殘基組成的末端多肽鏈構成，其末端多肽為強疏水性性多肽鏈。人 ⑶14氨基酸序列中39 44位區(qū)段是與LPS結合的必要部分。s⑶14也是一種糖蛋白，其蛋白質結構與mCD14的蛋白質結構基本相同，(也有報道sCD14蛋白質多肽鏈序列較mCD14 蛋白質多肽鏈少8個氨基酸)，但s⑶14不含有PI結構，故分子量較mCD14小，為48kDa左
右οmCD14主要分布在單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞的細胞表面，被激活的中性粒細 胞表面也有少量mCD14的存在。而內皮細胞、上皮細胞等表面則未發(fā)現mCD14的存在。mCD14 還存在于中性粒細胞胞漿內膜性分泌小體和嗜苯胺蘭顆粒中。sCD14則存在于正常人和動 物的血漿(清)中，人血清中的正常濃度為2 5mg/ml，占血中全部⑶14含量的99%。mCD14是由含有CD14基因的單核細胞、巨噬細胞，自行轉錄、翻譯蛋白質多肽 鏈，在高爾基復合體內糖化后，其羧基端再與PI結合，并由PI的磷脂部分與細胞膜連接。 IL-I β和TNF- α能夠調節(jié)⑶14基因的表達，促進CDHmRNA的轉錄；FMLP和GM-CSF可刺 激中性粒細胞，使其細胞表面的mCD14增多。sCD14則是由單核細胞產生。單核細胞產生 sCD14的方式可能有兩種①由內源性酶促反應(由蛋白酶或磷脂酶催化)，使mCD14分解 (脫去PI成分)、脫落形成。因為體外培養(yǎng)的單核細胞受LPS和IFN-r等刺激后，細胞表面 的mCD14明顯減少，而培養(yǎng)上清液中s⑶14的濃度卻明顯增加；②由⑶14基因轉錄、合成的 ⑶14蛋白，不進行PI化或逃脫PI化，直接分泌入血。⑶14(包括mCD14和s⑶14)的化學結構為糖蛋白，其生物學功能主要是識別、結合 LPS或LPS/LBP復合物，介導LPS所致的細胞反應，在LPS性炎癥反應、內毒素休克等病理反 應中起重要作用。最近的研究表明，⑶14也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程(參見=Subimerb C, Pinlaor S, Lulitanond V, Khuntikeo N, Okada S, McGrath MS, Wongkham S. Clin Exp Immunol. 2010161:471_479 ；Wu CC,Hsu Cff,Chen CD,Yu CJ,Chang KP，Tai DI,Liu HP,Su WH, Chang YS, Yu JS. Mol Cell Proteomics. 2010 J9 :1100_1117·)。rs2569190位于⑶14基因上5，UTR，為A/G多態(tài)，在亞洲人群中該多態(tài)的頻率分布 為 AO. 500，GO. 500，基因型 A/AO. 205、A/GO. 590、G/GO. 205。rs2569190 位點不同的基因型 可以通過影響⑶14基因的轉錄水平，從而對⑶14的表達起調節(jié)作用。SNP (Single nucleotide polymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性標記，是一類基于單 堿基變異引起的DNA多態(tài)性，被遺傳界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水 平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它 是基因組中最為廣泛存在的的一類多態(tài)性標記，占大約90%。這些基因組序列變異可以導 致個體間表型的差異以及不同個體對疾病、特別是復雜疾病的易感性和對環(huán)境因素、藥物 反應的差異。如果可以研發(fā)一種通過檢測人Foxp3基因和⑶14基因檢測乳腺癌易感性的方法 將有助于乳腺癌的預防和治療。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種檢測乳腺癌易感性的試劑盒。本發(fā)明的原理為發(fā)明人經研究發(fā)現Foxp3基因上rs2294021號SNP位點和⑶14 基因上rs2569190號SNP位點的多態(tài)性與人體對乳腺癌易感性相關，可用于評估個體對乳 腺癌的易感性的基礎；并且，當被檢測DNA的Foxp3基因上的rs2294021號SNP位點基因型 為雜合CT型，為乳腺癌易感型；被檢測DNA的⑶14基因上的rs2569190號SNP位點基因型攜帶有G型，為乳腺癌易感型；同時為Foxp3基因rs2294021號SNP位點為雜合CT型，⑶14 基因上rs2569190號SNP位點攜帶G型的，罹患乳腺癌的風險最高。為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是一種檢測乳腺癌易感性的試劑盒，包 括檢測Foxp3基因上rs2294021號SNP位點和CD14基因上rs2569190號SNP位點的特異 性引物以及檢測所述兩個SNP位點的特異性內切酶。上述技術方案中，所述試劑盒中特異性引物對是指針Foxp3基因上rs2294021號 SNP位點和⑶14基因上rs2569190號SNP位點而設計，能夠特異性擴增包含Foxp3基因上 rs2294021號SNP位點和CD14基因上rs2569190號SNP位點的DNA片段的引物對。所述 特異性引物優(yōu)選為SED ID NO :1所述堿基序列、SED ID NO 2所述堿基序列、SED ID NO 3 所述堿基序列和SEDID NO :4所述堿基序列。本領域的技術人員能夠理解本發(fā)明的引物不 限于這兩對引物。上述技術方案中，所述試劑盒中的特異性內切酶是指針對Foxp3基因上 rs2294021號SNP位點和CD14基因上rs2569190號SNP位點而選用，能夠通過酶切片段長 度檢測出這兩個SNPs位點乳腺癌易感基因型的限制性內切酶，優(yōu)選為內切酶Haelll。上述技術方案中，所述試劑盒還包括PCR擴增檢測的常規(guī)組件(Taq酶、dNTP混合 液、MgCl2溶液、PCR反應緩沖液、去離子水)及酶切常規(guī)組件(反應緩沖液、去離子水)。上述技術方案中，本發(fā)明試劑盒中PCR擴增檢測的常規(guī)組件的組分和含量為，每 10 μ LPCR擴增體系中包括1 μ 1 10XPCR反應緩沖液，0. 5μ 1 25mMMgCl2溶液，0. 2 μ 1 25mM dNTP混合液，IU Taq DNA聚合酶，余量為去離子水。上述技術方案中，本發(fā)明試劑盒中酶切常規(guī)組件的組分和含量為，每20μ 1酶切 反應體系中包括2μ1 IOX內切酶反應緩沖液。由于上述技術方案運用，本發(fā)明與現有技術相比具有下列優(yōu)點1、本發(fā)明通過檢測Foxp3基因上rs2294021號SNP位點和CD14基因上rs2569190 號SNP位點的多態(tài)性實現了對乳腺癌易感性的評估。2、本發(fā)明所述試劑盒可同時檢測Foxp3基因上rs2294021號SNP位點和CD 14基 因上rs2569190號SNP位點的多態(tài)性；一步PCR擴增可同時擴增兩個目標基因序列；單一種 類內切酶通過一步反應實現兩段目標基因序列的酶切。3、本發(fā)明相對于其他方法更為簡便、快速。


圖1為實施例一中步驟3所得酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例一一種檢測乳腺癌易感性試劑盒，其組分和含量包括1 μ 1 10XPCR反應緩沖液， 0. 5μ 1 25mM MgCl2 溶液，0. 2 μ 1 25mM dNTP 混合液，0. 2 μ l(5Units/y l)Taq DNA 聚合酶， ΙΟμΜ特異性引物對(四條)各0. 2ul，0. 5μ 1 HaeIII內切酶(10U/ul)，2 μ 1 IOX內切酶 反應緩沖液，去離子水9 μ 1。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒保存溫度為-20°C。
上述試劑盒的使用方法包括以下步驟步驟1:DNA模板的抽取使用血液基因組DNA提取系統(tǒng)(非離心柱型)提取外周血的基因組DNA。步驟2 =PCR反應，目的片段的復制使用可檢測乳腺癌易感性的PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物有義引物2 5，-ACACACAATCCATAAAGTCACC-3，(SED ID NO 1) Tm 值為 56°C反義引物2 :5，-ATCTCCATGCCCTAAGAAGGCCA—3‘(SED ID NO 2) Tm 值為 56 °C有義引物1 :5，-CCCCAAGACCCTACACTCAC 3'(SED ID NO 3) Tm 值為 56 °C反義引物 1 5，-AGGACACTGCCAGGAGACAC-3，(SED ID NO :4) Tm 值為 56°C有義引物1，反義引物1特異性地復制Foxp3基因上rs2294021號SNP位點多態(tài)性 的片段，有義引物2，反義引物2特異性地復制⑶14基因上rs2569190號SNP位點多態(tài)性的 片段。PCR反應體系總體積為10 μ 1，包括Iul 10XPCR反應緩沖液，0. 5 μ 1 25mMMgCl2 溶液，0. 2μ1 25mM dNTP 混合液，0. 2 μ 1 (5Units/μ 1) Taq DNA 聚合酶，10 μ M 特異性引物 對(四條)各0. 2 μ 1，去離子水7. 3 μ 1。在Biometra TprofessionalPCR擴增儀上進行反 應，反應條件是94°C 5分鐘、進行35個循環(huán)的94°C 40秒、56°C 40秒、72°C 40秒，72°C 10 分鐘。步驟3 限制性內切酶酶切使用可檢測乳腺癌易感性的PCR檢測試劑盒。在步驟2所得產物加入試劑盒中所 包含IOX內切酶反應緩沖液2 μ 1，HaeIII內切酶0. 5 μ 1 (IOU/μ 1)，去離子水7. 5 μ 1，在 37°C條件下水浴3小時。步驟4 =SNP基因型分析3%瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟3所得酶切產物，電泳圖如圖1所示。根據凝膠成像顯示不同條帶，所代表的基因型分析如下
權利要求
一種檢測乳腺癌易感性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測Foxp3基因上rs2294021號SNP位點和CD14基因上rs2569190號SNP位點的特異性引物以及檢測所述兩個SNP位點的特異性內切酶。
2.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述特異性引物為SEDID NO: 1所述堿 基序列、SED ID NO: 2所述堿基序列、SED ID NO: 3所述堿基序列和SED ID NO: 4所述堿 基序列。
3.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，檢測所述兩個SNP位點的特異性內切酶 為內切酶Haelll。
4.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR擴增檢測的常規(guī) 組件Taq酶、dNTP混合液、MgC12溶液、PCR反應緩沖液、去離子水；酶切常規(guī)組件反應緩 沖液、去離子水。
5.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中PCR擴增檢測的常規(guī)組件 的組分和含量為，每10 μ LPCR擴增體系中包括IyL IOX PCR反應緩沖液，0. 5 μ L 25mM MgC12溶液，0. 2yL 25mM dNTP混合液，IU Taq DNA聚合酶，余量為去離子水。
6.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，試劑盒中酶切常規(guī)組件的組分和含量 為，每20yL酶切反應體系中包括2yL IOX內切酶反應緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測乳腺癌易感性的試劑盒，所述試劑盒包括檢測Foxp3基因上rs2294021號SNP位點和CD14基因上rs2569190號SNP位點的特異性引物以及檢測所述兩個SNP位點的特異性內切酶。本發(fā)明通過檢測Foxp3基因上rs2294021號SNP位點和CD14基因上rs2569190號SNP位點的多態(tài)性實現了對乳腺癌易感性的評估。
文檔編號C12Q1/68GK101985662SQ201010583569
公開日2011年3月16日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權日2010年12月10日
發(fā)明者周翊峰, 王艷萍, 鄧杰瓊, 郁曉 申請人:蘇州大學