專利名稱：：7α,15α-二羥基雄烯醇酮的提取純化方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵液中提取純化生物轉化產(chǎn)物的方法，具體地說，涉及從已將底物去氫表雄酮轉化為產(chǎn)物7a,15a-二羥基雄烯醇酮的發(fā)酵液中有效提取并純化產(chǎn)物的方法。
背景技術：
：甾體類中間體往往可用于生產(chǎn)臨床上各種藥物。7a，15a-二羥基雄烯醇酮及其類似物(其結構如下式I)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>是一種重要的甾體中間體，可用于合成內(nèi)酯類醛固酮受體拮抗劑、利尿劑和婦科藥物等多種藥物。例如，I是合成口服避孕藥Yasmin活性成分屈螺酮的重要中間體。微生物轉化在甾體藥物的合成中具有重要地位，幾種重要的甾體微生物轉化反應如羥化、脫氫和邊鏈降解已成為工業(yè)上生產(chǎn)甾體激素及其類似物的重要方法。化合物I的制備很難用化學的方法合成，目前主要由微生物轉化合成。Michael(WO2004070048,2004-08-19)等報道了黃色鐮孢(/^san'wmc"/mon/mUC16069)可將去氫表雄酮轉化為I，轉化后菌體用80%的丙酮水溶液進行提取兩次，然后加熱減壓去除丙酮后，過濾得到粗品，粗品溶于甲醇后用活性炭脫色，然后加熱減壓除去甲醇后用乙酸丁酯結晶，最后的總收率低，只有46.7%。尚珂等(中國醫(yī)學生物技術應用雜志.2,3034,2004)報道亞麻刺盤孢(Co〃e論/ch謂"m'AS3.4486)可將去氫表雄酮轉化為I，轉化完成后用乙酸乙酯萃取，加熱減壓濃縮得到粗品，然后粗品用4-甲基戊-2-酮溶解，溶解后加熱減壓濃縮結晶得到粗純品，重結晶一次得到純品，最后的總收率也比較低，大約為58.8%。由此可見現(xiàn)有的提取方法不能有效地將產(chǎn)物提取。
發(fā)明內(nèi)容針對上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種從己將底物去氫表雄酮轉化為產(chǎn)物7a，15a-二羥基雄烯醇酮的發(fā)酵液中有效提取并純化產(chǎn)物的方法。因此，本發(fā)明提供一種7a，15a-二羥基雄烯醇酮的提取純化方法，所述701，1501-二羥基雄烯醇酮由去氫表雄酮經(jīng)亞麻刺盤孢(0//^^〃/^附//m'AS3.4486)(中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號AS3.4486)生物轉化而得，轉化結束后，離心發(fā)酵液，用非極性有機溶劑萃取上清液，其特征在于，該方法包括轉化結束后發(fā)酵液中的菌體先用親水性有機溶劑提取，再用非極性有機溶劑萃取的步驟。本發(fā)明方法的具體步驟如下a)轉化結束后離心發(fā)酵液，上清液用非極性有機溶劑萃取，菌體則用親水性有機溶劑提取；b)菌體提取后得到的溶液加熱減壓蒸去溶液中的有機溶劑后，再用非極性有機溶劑萃?。籧)將所有的非極性有機溶劑萃取液合并，去水，蒸餾除去有機溶劑，結晶兩次即可得到高純度的產(chǎn)物。所述的非極性有機溶劑為乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲烷、乙酸丙酯、丙酸乙酯或丙酸甲酯，優(yōu)選乙酸乙酯。所述的親水性有機溶劑為醇溶液或酮溶液，用量為發(fā)酵液體積的至少0.5倍，提取次數(shù)為至少2次；優(yōu)選的醇溶液為甲醇或乙醇，甲醇的濃度為80%100%，優(yōu)選卯％;乙醇的濃度為85%100%，優(yōu)選90%;優(yōu)選的酮溶液為丙酮，丙酮的濃度為85%100%,優(yōu)選95%。一般而言，高濃度的甲醇、乙醇或丙酮溶液都可以有效地提取產(chǎn)物，而濃度降到一定值以下時提取效率明顯下降。以下是不同濃度甲醇、乙醇或丙酮溶液的提取效率實驗。將底物投料濃度為8g/L，轉化率為86.1%的3L發(fā)酵液分成15等份分別離心，得到的菌體分別用80%、85%、90%、95%和100%的甲醇、乙醇和丙酮溶液進行提取兩次。第一次用量200ml，第二次用量150ml，兩次提取的溶液混合均勻后取少量進行HPLC含量分析。結果見圖l，由圖可見卯％、95%和100%的丙酮都可以有效地將1從菌體中提取出來，而以95%為最佳；85%、90%、95%、100%的甲醇或乙醇溶液都可有效的將I從菌體中提取出來，而以卯％為最佳，總體而言，以95%的丙酮溶液為最佳。從以下的實驗可以說明此方法的優(yōu)越性。底物投料濃度為8g/L，轉化率為86.4%的2.5L發(fā)酵液分成5等份分別離心，然后分別采用不同的提取方法提取，具體方法如下，其中方法a和b為現(xiàn)有技術。a發(fā)酵液離心，上清液用500ml的乙酸乙酯提取一次，菌體先后用1.5L和1L的乙酸乙酯提取，將所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入10g的無水硫酸鈉去除水。然后蒸餾除去絕大部分乙酸乙酯至200ml左右，冷卻后過濾所得固體用10ml預冷的乙酸乙酯洗滌得到粗純品，粗純品用4-甲基-2-戊酮結晶兩次得到純品。b發(fā)酵液離心,上清液用500ml的乙酸乙酯提取一次，然后加熱減壓除去乙酸乙酯，所得固體用丙酮溶解。菌體先后用500ml和300ml80%的丙酮提取，然后將所有丙酮溶液合并，加熱減壓除去丙酮后得到的漿狀物過濾得到粗品，粗品用甲醇溶解后用活性炭脫色，然后加熱減壓除去甲醇后用乙酸正丁酯結晶兩次，但仍有較多雜質(zhì)不能分離，因此純度較低。c發(fā)酵液離心,上清液用500ml的乙酸乙酯提取一次，菌體先后用500ml和300ml丙酮提取，然后將所有丙酮溶液合并，加熱減壓除去有機溶劑后得到的漿狀物先后用1.5L和1L的乙酸乙酯萃取。將所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入10g的無水硫酸鈉去除水。然后蒸餾除去絕大部分乙酸乙酯至150ml左右，冷卻后過濾所得固體用10ml預冷的乙酸乙酯洗滌得到粗純品，粗純品用4-甲基-2-戊酮結晶兩次得到純品。d菌體先后用500ml和300ml甲醇提取，其他同方法c。e菌體先后用500ml和300ml乙醇提取，其他同方法c。五種提取方法的結果見表l，有表可知c,d和e三種方法的提取效果明顯的要好于a，b,兩種現(xiàn)有提取方法。表1五種提取方法的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明的方法由于改進了提取方式，使微生物轉化產(chǎn)物I的提取效率明顯的提高，產(chǎn)物的收率可達到將近90%，由去氫表雄酮轉化制備I的總收率可達到75%，從而有效地提高了去氫表雄酮轉化合成I的總收率，降低I的生成成本。圖l為不同濃度的甲醇、乙醇或丙酮的提取效率。具體實施例方式實施例1底物投料濃度為8g/L，轉化率為85.1%的1L發(fā)酵液離心(轉速4000rpm，時間15分鐘)。上清液用1L的乙酸丙酯萃取；菌體0.24kg先加入1.2L的100%丙酮常溫攪拌浸泡4小時后過濾，菌體再用0.8L的100%丙酮以同樣方法再提取一次。兩次提取得到的丙酮溶液混合，蒸餾除去溶液中的有機溶劑后，先后用3L和2L的乙酸丙酯萃取。將所有的萃取液合并，加入10g無水硫酸鈉去除水。然后蒸餾除去絕大部分乙酸乙酯至200ml左右，冷卻至室溫放置2小時后過濾得到的固體用20ml預冷的乙酸丙酯洗滌，然后用30ml甲醇加熱溶解，再加入200ml4-甲基-2-戊酮，加熱到55'C蒸餾除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶體形成時停止蒸餾，放置冷卻至室溫結晶4小時，過濾得到晶體再用同樣方法重結晶一次得到純度為98.2X的產(chǎn)物6.02g。實施例2底物投料濃度為8g/L，轉化率為85.1%的1L發(fā)酵液離心(轉速4000rpm，時間15分鐘)。上清液用1L的乙酸丙酯萃取；菌體0.24kg先加入1.2L的100%甲醇常溫攪拌浸泡4小時后過濾，菌體再用0.8L的100%甲醇以同樣方法再提取一次。兩次提取得到的甲醇溶液混合，蒸餾除去溶液中的有機溶劑后，先后用3L和2L的乙酸丙酯萃取。將所有的萃取液合并，加入10g無水硫酸鈉去除水。然后蒸餾除去絕大部分乙酸乙酯至200ml左右，冷卻至室溫放置2小時后過濾得到的固體用20ml預冷的乙酸丙酯洗滌，然后用30ml甲醇加熱溶解，再加入200ml4-甲基-2-戊酮，加熱到55"C蒸餾除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶體形成時停止蒸餾，放置冷卻至室溫結晶4小時，過濾得到晶體再用同樣方法重結晶一次得到純度為98.9%的產(chǎn)物5.96g。實施例3底物投料濃度為8g/L，轉化率為85.1%的1L發(fā)酵液離心(轉速4000rpm，時間15分鐘)。上清液用1L的乙酸丙酯萃?。痪w0.24kg先加入1.2L的100%乙醇常溫攪拌浸泡4小時后過濾，菌體再用0.8L的100%乙醇樣方法再提取一次。兩次提取得到的乙醇溶液混合，蒸餾除去溶液中的有機溶劑后，先后用3L和2L的乙酸丙酯萃取。將所有的萃取液合并，加入10g無水硫酸鈉去除水。然后蒸餾除去絕大部分乙酸乙酯至200ml左右，冷卻至室溫放置2小時后過濾得到的固體用20ml預冷的乙酸丙酯洗滌，然后用30ml甲醇加熱溶解，再加入200ml4-甲基-2-戊酮，加熱到55"C蒸餾除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶體形成時停止蒸餾，放置冷卻至室溫結晶4小時，過濾得到晶體再用同樣方法重結晶一次得到純度為97.8%的產(chǎn)物5.89g。實施例4底物投料濃度為8g/L，轉化率為85.1%的1L發(fā)酵液離心(轉速4000rpm，時間15分鐘)。上清液用1L的乙酸乙酯萃取；菌體先用2L85%丙酮溶液提取，再用0.6L85X丙酮溶液提取，其他同實施例l，最后得到98.5%純度的產(chǎn)物5.89g。實施例5底物投料濃度為8g/L,轉化率為85.1%的1L發(fā)酵液離心(轉速4000rpm，時間15分鐘)。上清液用1L的乙酸丙酯萃?。痪w0.24kg先用85%甲醇溶液提取三次，用量均為0.6L，三次提取得到的甲醇溶液混合，蒸餾除去溶液中的有機溶劑后，先后用3L和2L的乙酸丙酯萃取。后續(xù)步驟同實施例1,最后得到98.3X純度的產(chǎn)物5.93g。實施例6底物投料濃度為8g/L，轉化率為85.1%的1L發(fā)酵液離心(轉速4000rpm，時間15分鐘)。上清液用1L的乙酸丙酯萃??；菌體0.24kg先后用1.5L和1L85%乙醇溶液提取兩次，兩次提取得到的乙醇溶液混合,蒸餾除去溶液中的有機溶劑后，先后用3L和2L的乙酸丙酯萃取。后續(xù)步驟同實施例1，最后得到97.9X純度的產(chǎn)物5.76g。實施例7底物投料濃度為8g/L，轉化率為85.7%的5L發(fā)酵液離心(轉速4000rpm，時間15分鐘)。上清液用5L的乙酸乙酯萃取；菌體1.18kg先加入6L95%丙酮溶液常溫攪拌浸泡4小時后過濾，菌體再用4L的95%丙酮溶液同樣方法再提取一次。兩次提取得到的溶液混合，蒸餾除去溶液中的丙酮后，先后用15L和IOL的乙酸乙酯萃取。將所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入50g的無水硫酸鈉去除水。然后蒸餾除去絕大部分乙酸乙酯至800ml左右，冷卻至室溫放置2小時后過濾得到的固體用100ml預冷的乙酸乙酯洗滌，然后用100ml甲醇加熱溶解，再加入800ml4-甲基-2-戊酮，加熱到55。C蒸餾除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶體形成時停止蒸餾，放置冷卻至室溫結晶4小時，過濾得到晶體再用同樣方法重結晶一次得到純度為98.7%的產(chǎn)物30.58g。實施例8底物投料濃度為8g/L，轉化率為86.1%的5L發(fā)酵液離心(轉速4000rpm，時間15分鐘)。上清液用5L的乙酸丁酯萃?。痪w1.21kg先加入8L90%甲醇溶液常溫攪拌浸泡4小時后過濾，菌體再用3L90%甲醇溶液以同樣方法再提取一次。兩次提取得到的溶液混合，蒸餾除去溶液中的甲醇后，先后用15L和IOL的乙酸丁酯萃取。將所有的乙酸丁酯萃取液合并，加入50g的無水硫酸鈉去除水。然后蒸餾除去絕大部分乙酸丁酯至800ml左右，冷卻至室溫放置2小時后過濾得到的固體用100ml預冷的乙酸丁酯洗滌，然后用100ml甲醇加熱溶解，再加入800ml4-甲基-2-戊酮，加熱到55。C蒸餾除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶體形成時停止蒸餾，放置冷卻至室溫結晶4小時，過濾得到晶體再用同樣方法重結晶一次得到純度為97.9X的產(chǎn)物29.88g。實施例9底物投料濃度為8g/L,轉化率為85.1%的5L發(fā)酵液離心(轉速4000rpm，時間15分鐘)。上清液用5L的氯仿萃取；菌體1.10kg先加入4L卯％乙醇溶液常溫攪拌浸泡4小時后過濾，菌體再用相同方法提取兩次。三次提取得到的溶液混合，蒸餾除去溶液中的乙醇后，先后用15L和IOL的氯仿萃取。將所有的氯仿萃取液合并，加入50g的無水硫酸鈉去除水。然后蒸餾除去絕大部分氯仿至800ml左右，冷卻至室溫放置2小時后過濾得到的固體用100ml預冷的氯仿洗滌，然后用100ml甲醇加熱溶解，再加入800ml4-甲基-2-戊酮，加熱到55。C蒸餾除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶體形成時停止蒸餾，放置冷卻至室溫結晶4小時，過濾得到晶體再用同樣方法重結晶一次得到純度為98.1X的產(chǎn)物29.18g。權利要求1.7α，15α-二羥基雄烯醇酮的提取純化方法，所述7α，15α-二羥基雄烯醇酮由去氫表雄酮經(jīng)亞麻刺盤孢(ColletotrichumliniAS3.4486)生物轉化而得，轉化結束后，離心發(fā)酵液，用非極性有機溶劑萃取上清液，其特征在于，該方法包括離心后所得的菌體先用親水性有機溶劑提取，再用非極性有機溶劑萃取的步驟。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下-a)轉化結束后離心發(fā)酵液，上清液用非極性有機溶劑萃取，菌體則用親水性有機溶劑提??；b)菌體提取后得到的溶液加熱減壓蒸去溶液中的有機溶劑后，再用非極性有機溶劑萃??；c)將所有的非極性有機溶劑萃取液合并，去水，蒸餾除去有機溶劑，結晶兩次即可得到高純度的產(chǎn)物。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的親水性有機溶劑的用量為發(fā)酵液體積的至少0.5倍。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的親水性有機溶劑的提取次數(shù)為至少2次。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的親水性有機溶劑為醇溶液或酮溶液。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的醇溶液為甲醇或乙醇，所述的酮溶液為丙酮。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述甲醇的濃度為80%100%,所述乙醇的濃度為85%100%，所述丙酮的濃度為85%100%。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述甲醇和乙醇的濃度為90%，所述丙酮的濃度為95%。9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非極性有機溶劑為乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲垸、乙酸丙酯、丙酸乙酯或丙酸甲酯。10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的非極性有機溶劑為乙酸乙酯。全文摘要本發(fā)明提供一種7α，15α-二羥基雄烯醇酮的提取純化方法，所述7α，15α-二羥基雄烯醇酮由去氫表雄酮經(jīng)亞麻刺盤孢(ColletotrichumliniAS3.4486)生物轉化而得，轉化結束后，離心發(fā)酵液，用非極性有機溶劑萃取上清液，其特征在于，該方法包括離心后所得的菌體先用親水性有機溶劑提取，再用非極性有機溶劑萃取的步驟。采用本方法進行提取純化，產(chǎn)物的收率可達到將近90％，由去氫表雄酮轉化制備I的總收率可達到75％，從而有效地提高了去氫表雄酮轉化合成I的總收率，降低I的生成成本。文檔編號C12P33/00GK101182565SQ20061011833公開日2008年5月21日申請日期2006年11月14日優(yōu)先權日2006年11月14日發(fā)明者琴張,胡海峰,陶榮盛申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院