專利名稱：二酸(5－雄甾烯－17－酮－3β－羥基)二酯用于制備藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(式I)在制藥中的應(yīng)用。
由于生活水平的提高和醫(yī)療保健的不斷進(jìn)步，人均壽命越來越長，使世界人口老齡化的趨勢越來越明顯。據(jù)中國老年協(xié)會專家指出，我國老年人口迅速增長，1990年以來，我國老年人口以平均每年3.32％的速度增長，1994年底，全國60歲以上老年人口總數(shù)已達(dá)到1.1億，約占人中總數(shù)的9.5％。2001年，我國已成為“老年型”國家，隨著老年人口增加，對老年性疾病的防治問題也越來越突出。因此，研制開發(fā)新的防治常見老年性疾病的新藥，已成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)界的一個研究熱點。
心律失常、心肌缺血、腦缺血、免疫功能低下、骨質(zhì)疏松、腎衰等是常見的老年性疾病，而且許多情況下是多種病癥同時出現(xiàn)于同一病人身上。但是，現(xiàn)有的治療這些疾病的藥物普通存在著適用癥單一、療效不盡理想的問題。因此，研究開發(fā)一種上述多種老年性疾病具有良好的綜合治療效果的藥物，這對方便老年性疾病的防治、保證老年人健康將具有十分重要的意義。
本發(fā)明的目的是研究提供二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯在制備用于藥物治療心律失常、心肌缺血、腦缺血、機體免疫功能低下、骨質(zhì)疏松、腎衰等常見老年性疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯化合物的結(jié)構(gòu)式如式I所示(以下簡稱式I化合物)。 式I中R’為 或 n＝2-5，n’＝1-4即式I化合物依R’基團(tuán)的不同可分為兩類，一類為二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(以下簡稱為式IA類化合物)，具體可以是乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯，或丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯，或丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯，或戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯；另一類為二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(以下簡稱為式IB類化合物)，具體可以是丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯。
本發(fā)明包括式I化合物在制備用于治療心律失常的藥物中的應(yīng)用；式I化合物在制備用于治療心肌缺血、腦缺血的藥物中的應(yīng)用；
式I化合物在制備用于增強機體免疫力的藥物中的應(yīng)用；式I化合物在制備用于治療骨質(zhì)疏松、腎衰的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的式I化合物最優(yōu)選的是丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(式II)。 實驗證明，本發(fā)明中的式I化合物在治療心律失常、心肌缺血、腦缺血、免疫功能低下、骨質(zhì)疏松、腎衰等方面具有顯著的效果，由此可知，以式I化合物作為活性成份制備的藥物，將對相應(yīng)的病癥具有良好的治療效果，特別是對心律失常、心肌缺血、腦缺血、免疫功能低下、骨質(zhì)疏松及腎功能衰竭等常見的老年性疾病具有良好的治療效果。說明式I化合物可用于制備治療上述病癥的藥物。
實驗還證明式I化合物具有低毒性和高安全性，適宜作為藥物應(yīng)用。
本發(fā)明的式I化合物用于制備藥物，可與普通常規(guī)的藥劑填充劑配合，經(jīng)常規(guī)方法而制得；可根據(jù)需要制成適當(dāng)?shù)膭┬?，如針劑、輸液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑或栓劑等。以式I化合物為活性成份的藥物，通常以口服方式使用，當(dāng)然也可以采用其它給藥方式；其每天使用劑量一般為約0.01～1000毫克，成年人常用量為每天0.1～500毫克，最常用劑量為0.3～300毫克。每天一次或分?jǐn)?shù)次服用。
本發(fā)明中的式IA類化合物可由5-雄甾烯-17-酮-3-磺酸鈉(式III)溶于乙二醇二甲醚中，加入二鹵代烷[二碘(或溴)乙(或丙、丁、戊)烷](式IV)，在相轉(zhuǎn)移劑(四正丁基溴化銨)存在下反應(yīng)而制得。其反應(yīng)過程示意如下R-OSO3Na (式III)+X(CH2)nX(式IV)↓(C4H9)4NBr ↓ H2OROSO3(CH2)nOSO3R(式IA)X＝I或Br，n＝2～5，R＝C19H27O，式Ⅳ中n與式I中的n相同。
本發(fā)明中的式IB類化合物可由3β-羥基-5-雄甾烯-17-酮(式V)與相應(yīng)的二酰氯(即丙、丁、戊或己二酰氯)(式VI)在四氫呋喃中110℃攪拌反應(yīng)制得。其反應(yīng)過程示意如下2R-OH (式V)+XCO(CH2)n’OCX (式VI)四氫呋喃↓110℃，攪拌 R＝C19H27O，n’＝1～4，X＝Cl，Br
以下通過實例對式I化合物的制備方法作進(jìn)一步詳細(xì)說明制備實例1稱取3.68g5-雄甾烯-17-酮-3β-磺酸鈉鹽溶于50ml乙二醇二甲醚中，加入1.5gl，2-二碘乙烷及1.6g四正丁基溴化銨和20m水，于60℃攪拌回流反應(yīng)4小時，得到的混合物冷卻后用乙醚萃取三次，合并萃取液，用水洗，再用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，得到6.1g所需產(chǎn)物一乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯。
若分別用1，3-二碘丙烷或1，4-二碘丁烷、1，5-二碘戊烷代替上述實例1中的1，2-二碘乙烷，則最后得到的產(chǎn)物即分別為丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯或丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯或戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯。
制備實例2稱取500g3β-羥基5-雄甾烯-17-酮溶于1000ml四氫呋喃溶液中，滴加入50ml丁二酰氯，110℃下攪拌反應(yīng)，TLC檢驗反應(yīng)基本完成后，將反應(yīng)混合物傾入冰水中，用乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)洗滌三次，得式II化合物粗品，硅膠H柱層析得式II化合物純品400g。
若分別用丙二酰氯、己二酰氯或戊二酰氯代替上述實例2中的丁二酰氯，則最后得到的產(chǎn)物即分別為丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯、己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯。
下列實驗實例將進(jìn)一步說明本發(fā)明的式I化合物的醫(yī)藥用途及其效果。
實驗實例1 急性毒性實驗一、材料實驗樣品式I化合物(8種，式LA類，n＝2，3，4，5；式IB類，n’＝1，2，3，4)，由廣州時珍堂天然產(chǎn)物生理活性研究中心提供，批號分別為19970101，19970102，19970103，19970104，19970105，19970106，19970107，19970108。
實驗動物NIH系小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗中心提供，批號1997A029二、方法與結(jié)果八種式I化合物分別按以下方法進(jìn)行實驗2.1灌胃給予受試物急性毒性實驗選擇健康NIH系小鼠，體重20±2g，20只，雌雄各半，將受試物以0.5％羧甲基纖維素鈉配成20mg/ml懸浮液，對小鼠一次灌胃受試物懸浮液0.8ml/20g體重，連續(xù)觀察七天，小鼠活動敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或異常反應(yīng)，限于給藥濃度和體積不能再增大，不能測出其LD50。故進(jìn)行最大耐受量試驗。選擇健康小鼠20只，雌雄各半，于24小時內(nèi)分3次灌服式I化合物懸浮液(20mg/ml)，每次0.5mg/20g體重，總劑量達(dá)1.5g/kg體重，觀察7天，此期間讓小鼠自由進(jìn)食和飲水，小鼠活動敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或異常反應(yīng)。
2.2腹腔注射給予受試物急性毒性實驗選取健康NIH系小鼠，體重20±2g，20只，雌雄各半，受試物以0.5％羧甲基纖維素鈉配成20mg/ml懸浮液，經(jīng)超聲波乳化器及高速攪拌器處理使顆粒細(xì)化、均勻，對小鼠一次腹腔注射受試物1.0ml/20g體重，連續(xù)觀察7d，小鼠活動正常、敏捷，毛皮光滑，未引起動物死亡或異常反應(yīng)，限于給受試樣品濃度和體積不能再增大，故進(jìn)行最大耐受量試驗。
另選擇健康NIH小鼠40只，體重20±2g，雌雄各半，于24h每隔4h受試物(20mg/ml)，每次0.5ml/20g體重，共6次。此后連續(xù)觀察7d，此期間讓小鼠自由進(jìn)食和飲水。
三、結(jié)論1.小鼠每天灌胃給予式I化合物最大耐受量應(yīng)不小于0.5×3×20×50＝1.5g/kg，按體表面積換算，相當(dāng)于70kg成年人用量(50mg)的232.7倍(0.5×3×20×387.9÷50)。在最大耐受量試驗給受試樣品后觀察期間，小鼠活動敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或異常反應(yīng)。
2.小鼠注射給予式I化合物最大耐受量為不小于3g/kg體重(＝0.5×20×6×50mg)。在最大耐受量試驗給受試樣品后觀察期間，小鼠活動敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或異常反應(yīng)。
注射給予式I化合物對小鼠最大耐受量，相當(dāng)于70kg成年人每天用量(10mg)的2327倍(0.5×6×20×387.9÷100)。
3、由此可知，式I化合物屬無毒性級化合物。
實驗實例2 抗心律失常作用一、實驗材料丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物J)；均由本實驗室合成提供，使用時0.5％CMC-Na配成所需濃度液體；去氫異雄甾酮(Prasterone，Pras)，胺腆酮(Amiodarin，Amio)Sanofi&Winthrop藥廠出品；烏頭堿(Aconitine，Aco)和哇巴因(Ouabain，Oua)是Merck藥廠出品；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，廣州市化學(xué)試劑玻璃儀器批發(fā)部進(jìn)口分裝。
NIH小鼠，廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號97A018SD大鼠，廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號97A017新西蘭大白兔，醫(yī)動字26-97043號，廣東省南海市黃岐泌沖威龍養(yǎng)殖場提供。
MS-302多媒體生物信號記錄分析系統(tǒng)(廣東藥學(xué)院)；WZ-50D型微量注射泵(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠)二、方法與結(jié)果1、對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常的影響SD大鼠，雄性，體重218.3±20.0g，腹腔注射烏拉坦1.2g/kg麻醉，以MS302生物信號記錄分析系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)視并記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖(ECG)。舌下靜脈給藥或0.5％CMC-Na后10min，頸外靜脈插管，以2.5μg/min速度恒速靜脈注射Aco，分別記錄出現(xiàn)室性早搏(ventricular premature beat，VP)，室性心動過速(ventricular tachycardia，VT)，心室纖顫(ventricular fibrillation，VF)及心臟停搏(cardiacarrest，CA)時Aco的用量并進(jìn)行t檢驗，表1顯示式I的化合物C、化合物D、化合物E出現(xiàn)VP、VT、VF和CA所需Aco的用量均顯著高于靜脈注射0.5％CMC-Na組，在0.5mg/kg劑量下，化合物C、化合物D、化合物E效果明顯較Pras及胺腆酮好。
表1 對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常的作用(n＝10，x±s)
與CMC-Na組相比較*P＜0.05，**P＜0.012、對Oua誘發(fā)豚鼠心律失常的影響雄性豚鼠40只，體重288.8±38.3g，分6組腹腔注射烏拉坦1.2g/kg麻醉。頸外靜脈給藥或靜脈注射0.5％CMC-Na后10min，頸外靜脈插管以3μg/min速度靜脈注射Oua，記錄ECG，分別測出VP，VT，VF及CA時的Oua用量并進(jìn)行t檢驗。表2顯示化合物F、化合物G、化合物H組出現(xiàn)VP，VT，VF及CA時所需Oua用量顯著增加，表明化合物F、化合物G、化合物H組能顯著提高豚鼠心臟Oua中毒的耐受劑量。
表2. 對Oua引起的心律失常的作用(n=8，x±s)
與CMC-Na組相比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
3、對氯化鋇(BaCl2)誘發(fā)心律失常的影響SD大鼠50只，雄性，體重236.7±13.7，腹腔注射10％水合氯醛0.3g/kg麻醉，記錄ECG，頸外靜脈插管作給藥用。靜脈注射BaCl24mg/kg，一般立即出現(xiàn)室性早搏、心動過速，并發(fā)展成穩(wěn)定和典型的雙向性心律失常。待出現(xiàn)穩(wěn)定和典型的雙向性心律失常后立即靜脈注射藥或0.5％CMC-Na，以竇性心律恢復(fù)和恢復(fù)后維持時間(60min內(nèi))為標(biāo)準(zhǔn)，比較5組作用。由表3可見化合物I、化合物J對BaCl2所致心律失常均有非常顯著的治療作用，維持時間較長，相較胺腆酮起效快。
表3 對氯化鋇(BaCl2)誘發(fā)心律失常的作用(n＝10，x±s)
與CMC-Na組相比，***P＜0.001實驗實例3 對心肌缺血的保護(hù)作用一、實驗材料丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物J)；均由中山大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)實驗室合成提供，使用時0.5％CMC-Na配成所需濃度液體；硝苯地平(Nifedipine，Nif)，大同市利群制藥廠生產(chǎn)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，廣州市化學(xué)試劑玻璃儀器批發(fā)部進(jìn)口分裝。
SD大鼠，廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號98A033新西蘭大白兔，醫(yī)動字26-98043號，廣東省南海市黃岐泌沖威龍養(yǎng)殖場提供。
MS-302多媒體生物信號記錄分析系統(tǒng)(廣東藥學(xué)院)；WZ-50D型微量注射泵(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠)二、實驗方法SD大鼠，試驗前測定ECG和胸導(dǎo)聯(lián)，棄去T波、ST段位移有異常和心律失常者。選取合格大鼠，體重208.1±18.8g，雌雄兼用，按表4分組，每組8只大鼠，按表4劑量十二指腸給予受試化合物或同體積0.5％CMC-Na溶液，30min后乙醚麻醉，記錄ECG后頸背部皮下注射異丙腎上腺素(Isoproterenol，ISO)2mg/kg，30min后再記錄ECG1次，于第一次灌胃供試品后24h和48h，各組按上述方法重復(fù)給供試藥及ISO并記錄ECG。72h后眼眶取血并離心分離血清，處死大鼠，剪取心尖以4℃生理鹽水制成10％的心肌組織勻漿備用。對∑ST段位移幅度的影響測量第一次給ISO前、第一、二、三次皮下注射ISO后30min各鼠ST值，計算∑ST的mv數(shù)均值作為心肌損傷程度的指標(biāo)并做t檢驗。對血清中CK、LDH和MDA的影響用試劑盒測血清中的丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的變化。對心肌組織勻漿中CK、LDH和MDA的影響用試劑盒測血清和心肌勻漿中的丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的變化。
三、結(jié)果1.對∑ST段的影響ST段的變化幅度可基本反映心肌缺血的嚴(yán)重程度，而∑ST段可作為缺血程度的定量指標(biāo)。皮下注射ISO誘發(fā)大鼠心肌缺血后，ST段明顯抬高，顯示大鼠心肌有嚴(yán)重的心肌缺血損傷。實驗結(jié)果(見表4)表明受試化合物各組和硝苯地平均能降低皮下注射ISO引起的ST段的異常抬高程度(∑ST平均位移幅度)，式I化合物對ISO致心肌缺血大鼠的心肌具有保護(hù)作用。表4 對異丙腎上腺素致大鼠心肌損傷模型中∑ST的影響Group Dose ∑ST/mv/mg·kg-130min 24h 48h 72hCMC-Na 1.26±0.241.18±0.21 0.87±0.170.90±0.15化合物C0.760.64±0.21***0.52±0.11***0.50±0.14***0.52±0.12***化合物D0.760.42±0.20***0.47±0.13***0.42±0.08***0.40±0.10***化合物E0.760.53±0.11***0.50±0.10***0.57±0.04***0.51±0.07***化合物F0.760.47±0.10***0.57±0.15***0.61±0.05***0.53±0.08***化合物G0.760.51±0.13***0.50±0.14***0.67±0.19***0.42±0.07***化合物H0.760.53±0.11***0.50±0.10***0.52±0.04***0.51±0.12***化合物I0.760.49±0.12***0.54±0.12***0.50±0.06***0.54±0.08***化合物J0.760.54±0.12***0.52±0.07***0.56±0.07***0.54±0.08***Nif組 0.760.50±0.09***0.53±0.08***0.52±0.05***0.51±0.07***x±s，n＝8，與CMC-Na組相比，***P＜0.0012.對血清中CK、LDH和MDA的影響大鼠皮下注射ISO后，血清中的CK、LDH和MDA均明顯上升，顯示由于心肌組織的損傷而使心肌細(xì)胞中的CK和LDH漏出到血液中，血清中的脂質(zhì)過氧化物(Lipid per-oxidation，LPO)大量增加。表5顯示受試化合物可明顯抑制CK和LDH從心肌細(xì)胞內(nèi)向血清中漏出，顯著抑制Iso致大鼠血清中MDA的異常升高，對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。表5 對Iso致心肌損傷大鼠血清的影響Group Dose Activity of CK Activity of LDH MDA/mg·kg-1(U/L) (U/L) (nmol/ml)CMC-Na 359.23±34.25 389.23±34.4150.42±3.21化合物C 0.76 262.50±35.41***270.13±27.46***28.29±6.56***化合物D 0.76 229.27±31.32***218.55±37.35***18.15±4.52***化合物E 0.76 275.44±21.81***267.35±38.42***25.54±3.80***化合物F 0.76 252.17±18.41***250.40±31.30***24.16±4.18***化合物G 0.76 248.20±20.50***254.75±30.81***20.54±2.11***化合物H 0.76 261.24±24.27***253.24±31.55***21.17±3.36***化合物I 0.76 242.14±22.72***233.35±18.46***24.64±2.53***化合物J 0.76 239.40±16.15***257.05±31.30***26.47±3.25***Nif 0.76 255.90±31.22***224.01±51.20***27.17±3.44***與CMC-Na組相比，x±s，n＝8，***P＜0.0013.對心肌組織勻漿中CK、LDH和MDA的影響大鼠皮下注射ISO后，心肌組織中的CK、LDH含量顯著降低，MDA含量明顯升高。實驗結(jié)果(表6)顯示，與CMC組相比，硝苯地平組，說明式I化合物可明顯抑制CK和LDH從胞內(nèi)漏出。說明式I化合物對Iso所致的心肌組織損傷有明顯的保護(hù)作用。表6 對Iso致心肌損傷大鼠心肌組織勻漿的影響(x±s，n＝8)GroupDose Activity of CKActivity of LDH MDA/mg·kg-1(U/L) (U/L)(nmol/g)CMC-Na 108.84±21.11 98.57±12.81 253.23±35.11化合物C 0.76 186.55±26.25*201.33±25.24***121.670±15.24***化合物D 0.76 270.41±34.31*292.27±29.44*78.43±7.51***化合物E 0.76 206.18±43.80***160.27±20.36***89.62±12.37***化合物F 0.76 221.58±45.58***157.39±20.69***105.02±10.84***化合物G 0.76 225.60±31.81***152.22±25.42***99.52±13.15***化合物H 0.76 230.15±53.46***167.23±27.44***105.52±14.64***化合物I 0.76 214.27±40.62***159.82±31.69***115.02±10.34***化合物J 0.76 268.28±42.59***197.45±26.88***95.67±15.67***Nif 0.76 195.67±32.63*166.68±29.64***183.15±29.67***與CMC-Na組相比，*P＜0.05，***P＜0.001實驗實例4 對腦缺血模型的保護(hù)作用一、實驗材料NIH系小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供合格證號98A032，99A030；達(dá)納康(Tanakan)，由Ipsen公司生產(chǎn)，丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物J)；均由中山大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)實驗室合成提供，使用時0.5％CMC-Na配成所需濃度液體。二、實驗方法與結(jié)果NIH小鼠稱體重后，以戊巴比妥鈉60mg·kg-1，麻醉，進(jìn)行手術(shù)。將小鼠仰臥位固定，頸部正中切開皮膚約7mm，分離兩側(cè)頸總動脈，并套以“O”號絲線，缺血時用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈2min，造成大腦缺血狀態(tài)，缺血結(jié)束，松開動脈夾，恢復(fù)血液再灌注，短時間歇5min，如此反復(fù)二次。阻斷頸總動脈血流后，縫合切口。加上尾端放血，放血量為總血量的10％以下。術(shù)畢從腹腔內(nèi)注入適量的生理鹽水以補充血容量。假手術(shù)組麻醉后分離雙側(cè)頸總動脈但不阻斷血流，亦不放血。
雙側(cè)頸總動脈完全阻斷后，首先出現(xiàn)驚厥，體溫降低，呼吸減慢，最后翻正反射消失。實驗動物以體溫降低和翻正反射消失為缺血陽性指標(biāo)，無典型缺血指征者棄之不用。在缺血過程中、或手術(shù)后均會有動物死亡?；謴?fù)血液灌注后，動物翻正反射逐漸恢復(fù)，呼吸加快，3～5h基本恢復(fù)正常活動。手術(shù)后的動物隨機分為11組假手術(shù)組，化合物C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J組，達(dá)納康組，空白組。每天給藥一次，按表7劑量灌胃，連續(xù)給藥10天。10天后進(jìn)行記憶試驗。表7 對腦缺血再灌注損傷小鼠腦記憶避暗實驗的作用(x±s，n＝10)
與空白對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；從表7的結(jié)果顯示，假手術(shù)組與空白組相比，進(jìn)入暗箱的潛伏期明顯延長，受電擊次數(shù)明顯減少(P＜0.001)，說明腦缺血再灌注對小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能造成了明顯損害。與空白對照組相比，受試化合物能夠明顯延長進(jìn)入暗箱的潛伏期，同時能顯著降低錯誤次數(shù)，對腦缺血造成記憶功能損傷具有保護(hù)作用。實驗實例5 對機體免疫功能的影響一、實驗材料NIH系小白鼠，實驗動物合格證號97A018，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供；S.D.系大白鼠，實驗動物合格證號97A017，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供；家雞，由中山大學(xué)菜市場購得；丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物J)；均由中山大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)實驗室合成提供，使用時0.5％CMC-Na配成所需濃度液體。二、實驗方法對小鼠胸腺和脾臟的作用選擇健康NIH系小鼠90只，18～22g，雌雄各半，每只實驗時腹腔注射環(huán)磷酰胺60mg/Kg體重，隨機分成9組，每組10只，雌雄各半，即空白對照組，化合物C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J組。灌胃給受試樣品，給受試樣品劑量見表8，連續(xù)給受試樣品30d，第30d各組小鼠禁食一天，但提供飲水。第31d，處死各組小鼠，稱量各組小鼠的體重，胸腺及脾臟重量，計算胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)，比較各組間的差異。三、實驗結(jié)果表8 對小鼠胸腺和脾臟的作用(x±SD，n＝10)項目 劑量胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)組別(mg/kg) (mg/10g體重) (mg/10g體重)空白對照組 1％CMC11.06±3.2142.42±8.31化合物C 10 18.98±2.32***57.55±11.23**化合物D 10 25.59±3.70***103.47±13.40***化合物E 10 20.22±2.75***68.20±9.82***化合物F 10 16.24±3.31***75.24±15.48***化合物G 10 18.39±3.24***80.22±17.33***化合物H 10 19.75±3.06***72.30±11.17***化合物I 10 16.44±3.25***69.60±16.10***化合物J 10 17.24±3.34***61.29±15.34**與空白對照組相比，**P＜0.01，**P＜0.01。
從表8所示小鼠免疫器官重量實驗結(jié)果可知，與空白對照組相比，化合物C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J組小鼠胸脾指數(shù)及小鼠脾臟脂數(shù)能夠顯著升高。實驗實例6 對骨質(zhì)疏松的藥理作用一、實驗材料1.1動物SD系大鼠，雌雄各半，體重(196±47.3)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。1.2藥品與試劑丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物J)；均由中山大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)實驗室合成提供；維甲酸，重慶華邦制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(95)衛(wèi)藥準(zhǔn)字X-140號，批號991201。羅鈣全，上海羅氏制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(96)衛(wèi)藥準(zhǔn)字J-88-3(1)號，批號B1063。以上藥品試劑臨用前用0.5％CMC-Na配制成混懸液。13儀器XSP-BM生物顯微鏡，由上海光學(xué)儀器六廠制造。Panasonic彩色閉路監(jiān)控攝象機，由MatushitaElectric Industrial Co.Ltd制造。創(chuàng)格圖象分析軟件，由中青旅創(chuàng)格科技集團(tuán)公司設(shè)計。IRIS Advantage(HR)等離子體發(fā)射光譜儀(中山大學(xué)測試中心提供)由Thermo Jarrell Ash Corporation，U.S.A.制造。二、實驗方法2.1維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松模型選取大鼠88只，體重(196±47.3)g，雌雄各半，隨機分成11組。分為正?？瞻捉M(空白組)、維甲酸模型組(模型組)、陽性藥物對照組(羅鈣全組)、受試化合物C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J給藥組。除正?？瞻捉M灌服0.5％CMC-Na溶液10ml.Kg-1體重外，各組大鼠每天上午灌服維甲酸70mg.Kg-1體重，下午各組大鼠相應(yīng)灌服受試物。連續(xù)給藥30天后，處死大鼠，取大鼠右股骨。2.2股骨骨組織計量學(xué)觀察與測量取右股骨相同部位組織塊，常規(guī)脫鈣，石蠟包埋，HE染色。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，將所有圖象經(jīng)攝象機模數(shù)轉(zhuǎn)換后輸入主機，經(jīng)圖象分析軟件處理可得到如下參數(shù)指標(biāo)相對骨體積，指骨小梁占骨髓腔的百分比，1.25×10×4倍；平均骨小梁寬度，1.25×10×10倍；單位面積骨小梁內(nèi)骨細(xì)胞數(shù)，用圖象分析軟件采集同樣面積骨小梁的圖象(640×480)，計算相應(yīng)區(qū)域內(nèi)的骨細(xì)胞數(shù)，1.25×10×40倍；平均骨細(xì)胞陷窩長度，1.25×10×40倍；平均骨細(xì)胞陷窩寬度，1.25×10×40倍。以上5個靜態(tài)指標(biāo)參數(shù)，均觀察10個視野，求其均值。
表9 對維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松模型的股骨病變的影響，n＝8，x±s
與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001從表9所示維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松實驗結(jié)果可知，與模型組相比，化合物C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J能夠有效提高相對骨體積、單位面積骨小梁內(nèi)細(xì)胞數(shù)、平均骨小梁寬度，提示受試化合物具有治療骨質(zhì)疏松作用。實驗實例7 對腎功能衰竭的作用一、實驗材料1.1動物NIH小鼠，18-22g，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。
1.2試劑內(nèi)毒素，Sigma ChemicaI Com.；丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯(代號化合物J)；均由中山大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)實驗室合成提供，使用前用0.5％CMC-Na配制成所需液體。二、實驗方法內(nèi)毒素致動物急性腎衰模型選取小鼠100只，隨機分為10組，分別正常對照組、病理模型組、受試化合物C、D、E、F、G、H、I、J組，各組分別腹腔注射給予受試物或同體積溶媒(0.5％CMC-Na)后，立即尾靜脈注射內(nèi)毒素0.06g/kg(正常對照組注射等量的生理鹽水)。5h后，小鼠摘眼球取血，測定血清尿素氮(BUN)和肌肝(Cr)濃度。取各小鼠一只腎分別制成100ml·L-1勻漿，測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。三、實驗結(jié)果從表10所示急性腎功能衰竭實驗結(jié)果可知，與病理模型組相比，化合物C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J能夠有效抑制因內(nèi)毒素致小鼠血清BUN、Cr值升高，提高GSH-Px酶活性，對內(nèi)毒素致動物急性腎衰具有保護(hù)作用。表10 受試化合物對急性腎功能衰竭的作用(x±SD，n＝10)項目劑量Cr/10mg·L-1BUN/10mg·L-1GSH-Px/nU·L-1組別 (mg/kg)正常對照組0.5％CMC12.28±2.53***182.5±26.9***45.5±18.7***病理模型組0.5％CMC59.23±13.15 485.8±34.7 19.3±8.4化合物C組10 37.99±8.74***387.0±40.2***29.8±11.6*化合物D組10 29.31±7.94***295.5±36.0***38.4±15.0**化合物E組10 32.86±8.07***315.9±40.8***32.0±14.4*化合物F組10 38.31±9.69***377.1±38.1***35.2±12.8*化合物G組10 40.42±10.94***412.2±40.5***31.8±12.3*化合物H組10 35.78±7.26***366.0±30.2***35.6±10.7*化合物I組10 34.41±9.65***344.4±40.6***37.6±15.1***化合物J組10 37.60±8.44***337.6±32.8***32.2±13.1**與病理模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
本發(fā)明上述實驗例說明式I化合物在治療心律失常、心肌缺血、腦缺血、免疫功能低下、骨質(zhì)疏松、腎衰等方面同樣具有顯著的治療效果，可用于制備治療心律失常、心骯缺血、腦缺血、骨質(zhì)疏松、腎衰以及增強機體免疫力的藥物。
權(quán)利要求
1.式I的二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)二酯化合物在制備用于治療心律失常、心骯缺血、腦缺血、骨質(zhì)疏松、腎衰以及增強機體免疫力的藥物中的應(yīng)用。 式I中R’為 或 n＝2-5，n’＝1-全文摘要
本發(fā)明涉及式I的二酸(5－雄甾烯－17－酮－3β－羥基)二酯化合物在制備用于治療心律失常、心肌缺血、腦缺血以及機體免疫功能低下、骨質(zhì)疏松、腎衰等疾病的藥物中的應(yīng)用。式I中R’為或n=2～5,n’=1～4。
文檔編號A61P9/06GK1348764SQ0111486
公開日2002年5月15日 申請日期2001年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月28日
發(fā)明者許東暉, 許實波 申請人:中山大學(xué)