專利名稱：：一種hbvdna基因分型熒光pcr多通道檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及一種乙型肝炎病毒(H印atitisBVirus,HBV)基因分型的熒光PCR多通道檢測方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估計全球有20億人感染，其中慢性感染者3.5億，我國約占半數(shù)，全球每年約有100萬人死于HBV感染。此種感染最終可發(fā)展為肝硬化、肝癌，是當前WHO公布的人類疾病死亡原因中居第九位的疾病。乙型肝炎病毒主要通過宿主免疫機制引起肝臟損害，機體細胞識別病毒抗原并攻擊受感染的肝細胞引起炎癥，這個過程受宿主與病毒的多個因素影響。病毒基因異質(zhì)性影響著抗原的表達，可能也從中扮演了重要的角色。不同的毒株出現(xiàn)某些變異的頻率不同，不同毒株對機體免疫清除抵抗力不同以及其它的因素可能導(dǎo)致了不同基因型具有不同的感染后疾病譜，從目前的研究來看，HBVC基因型與較重的肝臟病變相關(guān)，B型則與較輕的病變相關(guān)；A型與慢性肝炎相關(guān)，D型與急性自限型肝炎相關(guān)；其它基因型與疾病譜的關(guān)系還有待發(fā)現(xiàn)。Kao發(fā)現(xiàn)C型與重癥如肝硬化和肝細胞癌有關(guān)，B型多存在于年輕的非肝硬化患者中。C型患者多是HBeAg(+)并且血清DNA含量高于B型，C型患者在HBV的免疫淸除階段血清轉(zhuǎn)化比B型延遲，同時C型比B型有更高的C基因啟動子突變率。在抗病毒治療中，B型比C型對拉咪呋啶敏感，不過兩型產(chǎn)生藥抗性的幾率是一樣的。Mayerat等比較了35例急性肝炎及30例慢性肝炎病人中的基因型分布，發(fā)現(xiàn)在慢性肝炎組中，A型占80X(28/35)，D型占11%(4/35);急性肝炎組D型占80X(24/30)，A型占10%(3/30)，提示病毒基因型在病毒一宿主相互作用中有一定差異，這可能是因為基因型A所產(chǎn)生的抗原性要弱于基因型D,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫清除的能力也較弱，導(dǎo)致感染遷延。Lindh等對東亞地區(qū)的43名基因型為C的HBV漫性感染者的基因型及CP變異的研究表明，T1762變異更易出現(xiàn)在C基因型，感染C型后更易出現(xiàn)較重的肝臟炎癥。對HBV進行基因分型有利于對HBV感染的流行病學(xué)、病因?qū)W和臨床診治進行更加深入細致的研究，現(xiàn)有研究表明不同亞型的HBV感染的臨床病程和對治療的反應(yīng)都存在著一定的差異。病毒變異是生物遺傳進化的基本因素之一，乙型肝炎病毒變異是在慢性感染過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而自然發(fā)生的，也可發(fā)生于應(yīng)用藥物或接種疫苗后。HBV在復(fù)制中利用RNA中間體，病毒聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活性是有效而迅速的，病毒聚合酶缺乏校對酶活性，發(fā)生核苷酸替代變異后難以修正。已發(fā)現(xiàn)HBV序列的變異在基因組各個區(qū)域均可發(fā)生。不同的病人機體和不同的藥物與不同的變異毒株長期相互作用表現(xiàn)出不同的基因型。雖然沒有確切數(shù)據(jù)表明HBV的變異比例，但病毒變異是高頻并永恒的，現(xiàn)在已經(jīng)由最初的AD四型發(fā)展到了AH八型，病毒與機體的繼續(xù)斗爭將會出現(xiàn)更多的變異熱點和基因型。盡管HBV分型、變異與臨床表征有著一定關(guān)聯(lián)度，但是目前仍然沒有完全闡明清楚。大規(guī)模的系統(tǒng)流行病學(xué)分子特征普査將更有助人們認識HBV與機體以及藥物的辨證關(guān)系，這就依賴于簡便快速的HBV基因分型方法。對HBV進行基因分型以及變異檢測已成為比較熱點的檢測，在臨床上選擇合適的藥物或制訂治療方案等方面都有重要的指導(dǎo)作用。目前臨床檢測市場迫切需要有相關(guān)成就的技術(shù)方案，尤其是針對病毒分子特征以及機理的方法，可進一步指導(dǎo)乙肝的臨床治療。雖然有很多實驗室都在研究HBV基因分型及變異的檢測方法，但國內(nèi)外市場上還沒有檢測HBV基因型的臨床診斷產(chǎn)口叩o國內(nèi)外對HBV進行基因分型的方法可分為全基因序列比對和片段基因序列比對兩大類。全基因序列比對是以生物系統(tǒng)發(fā)生學(xué)中的基因同源性為基礎(chǔ)的，它主要是通過HBV全基因序列測定來進行基因分型，另外，也可應(yīng)用對HBV全基因進行限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)。片段基因序列比對是利用HBV中的代表性片段的序列類型來反映全基因序列的類型，主要技術(shù)類型有片段基因序列測定、PCR—RFLP、型特異引物(SSP)擴增法和型特異探針(SSO)檢測法等。序列測定雖然結(jié)果準確可靠，但是由于其技術(shù)復(fù)雜、實驗流程長、實驗條件要求高、耗時長和費用昂貴難以作臨床常規(guī)使用，目前只作為實驗室研究使用；RFLP技術(shù)相對簡單，但是酶切位點易受基因變異影響，且遇混合感染或酶切不完全，會出現(xiàn)復(fù)雜條帶，影響分型結(jié)果判斷應(yīng)用SSP法進行PCR擴增需要多個擴增管，使用常規(guī)的PCR后產(chǎn)物電泳的方法也容易污染，其靈敏性比特異性探針低；應(yīng)用SSO法可通過對單管的PCR產(chǎn)物進行檢測來分型，因此具有操作相對簡單和費用較低等特點，最具有實用價值?；蛐酒夹g(shù)是近幾年發(fā)展起來的新技術(shù)，也能建立乙型肝炎毒基因分型診斷的方法，但費用較高，檢測時需要昂貴的芯片掃描儀，且檢測探針固定技術(shù)、檢測靈敏度等關(guān)鍵技術(shù)還未取得重大突破，目前尚未見有基因芯片進行HBV基因分型的產(chǎn)品上市。實時熒光PCR反應(yīng)是在常規(guī)PCR的一對引物之外，加入一個兩端帶有熒光標記的寡核苷酸探針。在探針完好的狀態(tài)下，5'端報告熒光基團的激發(fā)光被3'端的淬滅熒光基團所抑制。PCR反應(yīng)過程中，隨著鏈的延伸，Taq酶沿著DNA模板移動到熒光標記探針的結(jié)合位置，由于它的5'->3'外切核酸酶活性，將熒光探針切斷，釋放出報告熒光基團的熒光信號，每合成一條新生鏈，就有一個報告基團的信號釋放，被釋放的激離報告熒光基團的數(shù)目和PCR產(chǎn)物是一對一的關(guān)系。通過熒光PCR儀定時動態(tài)監(jiān)測每一循環(huán)，可以得到樣品實際擴增曲線，找到PCR擴增的對數(shù)期，可以對樣本作定性定量檢測。HBV的變異是不斷產(chǎn)生的，目前的分型方法均只能基于現(xiàn)在已取得的研究成果，分型依據(jù)和分型方法均在不斷發(fā)展中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種更有效又簡便的乙型肝炎病毒基因分型的檢測方法；本發(fā)明另一目的在于提供用于該方法的檢測試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)對HBV基因分型檢測比較煩瑣復(fù)雜的缺陷。技術(shù)方案為達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是一種乙型肝炎病毒基因分型的熒光PCR多通道檢測方法，即在聚合酶鏈式反應(yīng)中，使用以下結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸序列作為檢測探針序列B5'-CAAATCTCCA-3'序列C5'-CGTGTCCTGG-3'序列D5'-GGCAGAATCT-3'采用包含有上述序列的向5'端或/和3'端延長的序列，只要包含了述分型特異性序列B、C和/或D，即可同樣達到本發(fā)明的技術(shù)效果；同樣，與上述序列B、C、D和包含B、C、D的同源性大于75。/。的序列，事實上也可以達到HBV基因分型的目的，但本發(fā)明需要指出的是，其替代效果不一定比上述明確指出的序列更好；同理，不管上述序列B、C、D還是包含B、C、D的序列還是同源性大于75%的序列，其堿基互補序列只是堿基形式上的變化，并未改變本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)性。上述的各種序列還可以經(jīng)添加互站臂形成分子信標探針，以利用分子熒光進行HBV基因分型檢測，這種分子信標探針是上述各種序列所構(gòu)成的發(fā)明方案的一種合理延伸，也是上述序列的一種理所當然可以利用的方式。在實際應(yīng)用中，還有一種可能是使用上述所有序列中的任意一條或一條以上的組合，來達到檢測HBV某一型或一型以上的目的。上述的HBV基因分型的熒光PCR多通道檢測方法的一種優(yōu)選方案為以所說的探針之一或一條以上作為引物參與聚合酶鏈式反應(yīng)。其原理是，以上各種探針是特異地與目標序列嚴格互補的，所以同時也可以作為引物作用。這種可以省略引物的使用技術(shù)方案，也是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員常用的手段之一。上述的HBV基因分型的熒光PCR多通道檢測方法的另一種優(yōu)選方案為可以采用標記探針技術(shù)，即所說的檢測探針。用來標記的熒光發(fā)光基團可以為FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine6G、OrengonGreen488、OrengonGreen500、OrengonGreen514、TexasRed、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、或ROX中的任意一種或一種以上的組合；熒光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。熒光發(fā)光基團和熒光淬滅基團的不同選擇將影響到檢測的靈敏度和使用的成本，但不影響本發(fā)明所提供檢測方案的實質(zhì)。本發(fā)明同時還提供上述探針在PCR反應(yīng)過程中的使用方法，即采用單管PCR反應(yīng)檢測HBV多個型，具體說明如下-上述的HBV基因分型的熒光PCR多通道檢測方法的實現(xiàn)方式是，由一個反應(yīng)管同時加入序列B、序列C和序列D進行實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)檢測。上述的HBV基因分型的熒光PCR多通道檢測方法的實現(xiàn)方式的優(yōu)選方案為，在上述反應(yīng)管之外增加一個總HBV反應(yīng)管，與型檢測反應(yīng)管在同一時間運行同一PCR擴增程序進行實時熒光檢測，并且使用的檢測探針為探針U5'-GGATGTGTCTGCGGCGTTTTATC-3'或者包含有上述序列的向5，端或/和3'端延長的序列；或者與上述序列同源性大于75%的序列；或者上述序列的堿基互補序列；或者上述序列經(jīng)添加互補臂形成的分子信標探針；上述的HBV基因分型的熒光PCR多通道檢測方法的PCR反應(yīng)程序如下:反應(yīng)管先在45-55t:反應(yīng)l-3分鐘，然后93-95。C保溫3-6分鐘，再按93-97°C15-30秒和55-65°C30-40秒循環(huán)35-45次。其中最優(yōu)選的運行程序為反應(yīng)管先在50。C反應(yīng)l-3分鐘，然后95t:保溫5分鐘，再按94。C20秒一60°C30秒循環(huán)40次。上述的HBV基因分型的熒光PCR多通道檢測方法的結(jié)果處理可以釆取如下方案即根據(jù)基因型管與U管檢測的Ct值的差值判斷樣本中HBVDNA中B基因型病毒、C基因型病毒、D基因型病毒與總病毒的病毒相對量。其中，Ct值的"C"代表Cycle,"t"代表threshold,Ct值的含義是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。上述的HBV基因分型檢測方法另一種檢測形式的優(yōu)選方案為使用序列B、序列C、序列D中的任意一條或一條以上的組合，固定在膜載體或其它固相載體上，與包含特異性互補序列的DNA進行雜交。本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二為HBV基因分型實時熒光PCR多通道檢測試劑盒，所述的試劑盒組成包括核酸提取試劑、反應(yīng)液、熒光標記探針、耐熱DNA聚合酶和對照品，其特征在于，反應(yīng)液使用的引物序列為引物l和引物2;熒光標記探針序列B為5'端用FAM標記、3'端用TAMRA標記；熒光標記探針序列C為5'端用JOE標記、3'端用TAMRA標記；熒光標記探針序列D為5'端用Cy5標記、3'端用BHQ-1標記。其中，引物1為5'-AGACTCGTGGTGGACTTCTC-3，引物2為5，-TGAGGCATAGCAGCAGGATG-3，上述試劑盒的具體組成包括核酸提取試劑PCR擴增試劑，其組成為反應(yīng)液熒光檢測探針耐熱DNA聚合酶對照品其中，反應(yīng)液使用的引物序列為引物1和引物2;熒光檢測探針序列為序列B和序列C的混合物，其中序列B5'端用FAM標記、3'端用TAMRA標記；序列C5'端用JOE標記、3'端用TAMRA標記。PCR運行程序為反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)1-3分鐘，然后95'C保溫5分鐘，再按94。C20秒一60'C30秒循環(huán)40次。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有HBV基因分型檢測方法相比，具有以下有技術(shù)效果-本發(fā)明的HBV基因分型實時熒光PCR多通道檢測方法是利用了HBV基因組有型別特異性位點，并證明這個位點應(yīng)用于實際檢測。應(yīng)用特異性探針與配套的實時熒光多通道檢測方法，解決了
背景技術(shù)：
中所說的片段基因序列測定、PCR-RFLP、型特異性引物(SSP:'擴增法和型特異探針(SSO)檢測法等方法的缺陷，比DNA序列測定以及單管法熒光PCR測定更簡便和快速，同時，還可以避免PCR產(chǎn)物進一步處理中產(chǎn)生的模板污染，簡化實驗室設(shè)置和防護的要求，減少實驗失敗的可能，提高生物安全性和檢測的穩(wěn)定性。具*《皿方《下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制發(fā)明的范圍。在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1設(shè)計和制備引物、探針序列。(針對HBV基因組相關(guān)序列設(shè)計，GeneBank序列號為B型AF121244,C型AB033553，D型AY741794)引物l(上游引物)5'-AGACTCGTGGTGGACTTCTC-3，引物2(上游引物)5'-TGAGGCATAGCAGCAGGATG-3，B基因型探針5，-CGCAGTCCCAAATCTCCAGTCAC-3，(包含序列B)、C基因型探針5，-AGCACCCACGTGTCCTGGCCAA-3，(包含序列C)、D基因型探針5，-GCATGGGGCAGMTCTTTCCACC-3，(包含序列D)B基因型探針熒光標記為熒光發(fā)光基團FAM;熒光淬滅基團為TAMRA。C基因型探針熒光標記為熒光發(fā)光基團JOE;熒光淬滅基團為TAMRA。D基因型探針熒光標記為熒光發(fā)光基團Cy5;熒光淬滅基團為BHQ-1。實施例2制備HBV基因分型實時熒光PCR多通道檢測試劑盒。組成為(10人份/盒)<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>核酸提取液配方提取液A:8%聚乙二醇、lMNaCl提取液B:10mMNaOH、0.1%SDS、15%Chelex-100、l%Tween-20陽性對照品為人工合成的HBVB型、C型和D型DNA片段的混合液。實施例3HBV基因分型實時熒光PCR多通道檢測方法，同時也是檢測試劑盒的使用方法。1、HBVDNA提取取待測血清樣本10(^1，加入lOOpl提取液A，振蕩10秒，13，000rpm離心10分鐘，棄上清；加入充分混勻的提取液B5CHU，振蕩混勻，IO(TC水浴IO分鐘，13，000rpm離心2分鐘，取上清供PCR擴增用。2、實時熒光PCR多通道檢測按樣本數(shù)(樣本數(shù)-待測標本數(shù)+對照品)n分別配制反應(yīng)液-取反應(yīng)液nX28nl、MgCl2nX8pl、熒光探針B、C、DnX6pl、Taq酶nX3pl混于一離心管中混勻。反應(yīng)液按45nl/管分裝到反應(yīng)管中，取待測樣本DNA抽提產(chǎn)物及對照品各5nl依次加入上述反應(yīng)液中，蓋緊反應(yīng)管，低速離心數(shù)秒。置于全自動多通道熒光PCR檢測儀上運行如下程序反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)l-3分鐘，然后95'C保溫5分鐘，再按94。C20秒一60°C30秒循環(huán)40次。實施例4HBV基因分型實時熒光PCR多通道定量檢測方法，同時也是檢測試劑盒的使用方法。1、HBVDNA提取取待測血清樣本lOOnl，加入100nl提取液A，振蕩10秒，13，000rpm離心10分鐘，棄上清；加入充分混勻的提取液B50nl，振蕩混勻，IO(TC水浴IO分鐘，13，000rpm離心2分鐘，取上清供PCR擴增用。2、實時熒光PCR多通道檢測按樣本數(shù)(樣本數(shù)=待測標本數(shù)+對照品)n分別配制反應(yīng)液-<分型管>:取反應(yīng)液nX28nl、MgCl2nX8nl、熒光探針B、C、DnX6pl、Taq酶nX3iLil混于一離心管中混勻。<11管>:取反應(yīng)液nX28pl、MgCl2nX8nl、熒光探針UnX6nl、Taq酶nX3pl混于一離心管中混勻。反應(yīng)液按45nl/管分裝到反應(yīng)管中，取待測樣本DNA抽提產(chǎn)物、HBV定量模板l-4號(濃度分別為107、106、105、104U/ml)各5|Lil依次加入上述兩種反應(yīng)液中，蓋緊反應(yīng)管，低速離心數(shù)秒。置于全自動多通道熒光PCR檢測儀上運行如下程序反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)l-3分鐘，然后95。C保溫5分鐘，再按94'C20秒—60°C30秒循環(huán)40次。根據(jù)HBV定量模板1-4號的Ct值和己知濃度可以模擬出定量標準曲線，并按此曲線，根據(jù)待測樣本在分型管中所檢測出基因型的Ct值和U管Ct值計算出該樣本基因型DNA和總HBVDNA的量值，并相除得出基因型DNA占總HBVDNA的含量。根據(jù)經(jīng)驗公式，Ct值與原始模板濃度存在線性關(guān)系，Ct值越大則原始模板數(shù)量越少，每3.3個Ct值的變化代表約10倍原始模板數(shù)量的變化。某樣本的分型管所檢出的某種基因型的Ct.g大于U管的Ct.u，差值為ACt-Ct.g-CU，則該樣本基因型HBV占總HBVDNA的比例約為10的(-ACt/3.3)次冪。權(quán)利要求1.一種乙型肝炎病毒(HBV)DNA基因分型的熒光PCR多通道檢測方法，其特征在于，在聚合酶鏈式反應(yīng)中使用以下結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸序列作為檢測探針序列B5’-CAAATCTCCA-3’序列C5’-CGTGTCCTGG-3’序列D5’-GGCAGAATCT-3’或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于75％的序列；或者上述序列的堿基互補序列；或者上述序列經(jīng)添加互補臂形成的分子信標探針；2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBVDNA基因分型檢測方法，其特征在于，以所說的探針之一或一條以上作為引物參與聚合酶鏈式反應(yīng)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBVDNA基因分型的熒光PCR多通道檢測方法，其特征在于，標記探針的熒光發(fā)光基團為FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine6G、OrengonGreen488、OrengonGreen500、OrengonGreen514、TexasRed、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、或ROX中的任意一種或一種以上的組合；熒光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-l、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。4.根攝權(quán)利要求1所述的HBVDNA基因分型的熒光PCR多通道檢測方法，其特征在于，序列B、序列C和序列D均加入同一反應(yīng)管進行實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)檢測。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的HBVDNA基因分型的熒光PCR多通道檢測方法，其特征在于，增加一個通用型HBV反應(yīng)管，與型檢測反應(yīng)管在同一時間運用同一PCR擴增程序進行實時熒光檢測，并且使用如下檢測探針探針U5'-GGATGTGTCTGCGGCGTTTTATC-3'或者包含有上述序列的向5'端或/和3'端延長的序列；或者與上述序列同源性大于75%的序列；或者上述序列的堿基互補序列；或者上述序列經(jīng)添加互補臂形成的分子信標探針；6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的HBVDNA基因分型的熒光PCR多通道檢測方法，其特征在于，聚合酶鏈式反應(yīng)運行程序為反應(yīng)管先在45-55'C反應(yīng)l-3分鐘，然后93-95。C保溫3-6分鐘，再按93-97°C15-30秒和55-65°C30-40秒循環(huán)35-45次。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的HBVDNA基因分型的熒光PCR多通道檢測方法，其特征在于，根據(jù)基因型管與U管檢測的Ct值的差值判斷樣本中HBVDNA中B基因型病毒、C基因型病毒、D基因型病毒與總病毒的病毒相對里。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBVDNA基因分型的檢測方法，其特征在于，使用序列B、序列C、序列D中的任意一條或一條以上的組合，固定在膜載體或其它固相載體上，與包含特異性互補序列的DNA進行雜交。9.一種乙型肝炎病毒(HBV)DNA基因分型的熒光PCR多通道檢測試劑盒，所述的試劑盒組成包括核酸提取試劑、反應(yīng)液、熒光標記探針、耐熱DNA聚合酶和對照品，其特征在于，反應(yīng)液使用的引物序列為引物1和引物2;熒光標記探針序列B為5'端用FAM標記、3'端用TAMRA標記；熒光標記探針序列C為5'端用JOE標記、3'端用TAMRA標記；熒光標記探針序列D為5'端用Cy5標記、3'端用BHQ-1標記。其中，引物1為5'-AGACTCGTGGTGGACTTCTC-3'引物2為5'-TGAGGCATAGCAGCAGGATG-3'全文摘要本發(fā)明涉及一種HBVDNA基因分型熒光PCR多通道檢測方法及其試劑盒，其方法特征在于，從GenBank中找出已作基因分型的HBVDNA全序列進行序列聯(lián)配；根據(jù)序列聯(lián)配結(jié)果找出HBV基因型的型特異性堿基的聚集區(qū)域；根據(jù)型特異性堿基的聚集區(qū)域設(shè)計探針及配套的引物，采用多色標記探針在一個PCR管中進行多通道基因型和通用型檢測，根據(jù)型和通用型檢測Ct值的差值，對臨床樣本中HBV病毒中型病毒的比例含量進行判斷。本發(fā)明的試劑盒性能穩(wěn)定、操作簡便、檢測快速，能很好地判斷HBVDNA的型別，有助于更全面的判斷慢性乙型肝炎病毒感染者的預(yù)后和選擇更合適的治療方案。文檔編號C12Q1/70GK101195843SQ20061011909公開日2008年6月11日申請日期2006年12月5日優(yōu)先權(quán)日2006年12月5日發(fā)明者吳大治,懿夏,廖興中,沈維祥申請人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團)股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司