專(zhuān)利名稱(chēng)：嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物療效預(yù)測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
專(zhuān)利說(shuō)明嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物療效預(yù)測(cè)試劑盒及其應(yīng)用 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人核苷酸還原酶M1亞基((ribonucleotide reductase M1，RRM1)在腫瘤組織中的表達(dá)水平的試劑盒，以此在臨床上預(yù)測(cè)對(duì)嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱治療療效好的患者。屬于生物技術(shù)和臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。隨著全球工業(yè)化水平提高帶來(lái)的空氣污染及吸煙等因素，肺癌已成為目前全世界范圍內(nèi)發(fā)生率及死亡率最高的腫瘤。在我國(guó)，近二十年來(lái)肺癌發(fā)病率年增長(zhǎng)達(dá)11％，預(yù)計(jì)到2025年我國(guó)每年新增肺癌患者超過(guò)100萬(wàn)。根據(jù)病理學(xué)的分型，確診的肺癌中約有80％為非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer NSCLC)，由于早期診斷的困難，在每年新確診的NSCLC中，大部分患者的病程已到晚期而無(wú)法行手術(shù)治療，化療及放療是針對(duì)這部分患者的主要治療方法。
抗代謝類(lèi)藥物是能干擾細(xì)胞正常代謝過(guò)程的藥物，這類(lèi)藥物與正常代謝物質(zhì)相似，在同一系統(tǒng)酶中互相競(jìng)爭(zhēng)，與其特異酶相結(jié)合，使酶反應(yīng)不能完成，從而阻斷代謝過(guò)程，阻止核酸合成，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖?；熤谐Ｓ玫挠腥?lèi)(1)葉酸類(lèi)抗代謝藥物；(2)嘌呤類(lèi)抗代謝藥物；(3)嘧啶類(lèi)抗代謝藥物?？勾x類(lèi)藥物為細(xì)胞周期特異性藥物，主要抑制細(xì)胞DNA的合成。S期細(xì)胞對(duì)它們最敏感。有時(shí)也可能抑制RNA與蛋白質(zhì)的合成。故對(duì)G1期或G2期細(xì)胞也有一定作用。
最新一代抗代謝類(lèi)藥物包括吉西他濱、卡培他濱和去氧氟尿苷三個(gè)藥物。其中吉西他濱是重要的嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物，屬細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥，主要作用于DNA合成期的腫瘤細(xì)胞，作為晚期非小細(xì)胞肺癌及胰腺癌的一線(xiàn)治療藥物在臨床上有廣泛應(yīng)用。吉西他濱在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)核苷激酶的作用轉(zhuǎn)化成具有活性的吉西他濱二磷酸核苷(dFdCDP)及吉西他濱三磷酸核苷(dFdCTP)，通過(guò)抑制DNA合成而發(fā)揮細(xì)胞毒作用。吉西它濱已經(jīng)被廣泛用于肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、轉(zhuǎn)移性腎癌以及頭頸部腫瘤的化療。
核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase，RR)是DNA合成過(guò)程中重要的限速酶，它能使二磷酸核苷酸轉(zhuǎn)化為二磷酸脫氧核苷酸，后者是DNA合成和修復(fù)所必不可少的原料。RR包括2個(gè)亞單位RRM1和RRM2，RRM1是核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，控制底物的特異性和整個(gè)酶的活性，同時(shí)也是核苷類(lèi)似物系的化療藥物的結(jié)合位點(diǎn)，RRM2是一個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)，有攜帶接觸抑制區(qū)，控制底物轉(zhuǎn)化的功能。其中的RRM1基因定位于染色體11q15.5區(qū)域，這是一個(gè)可出現(xiàn)于多種惡性腫瘤的雜合子丟失(loss of heterozygosity LOH)區(qū)域，稱(chēng)為L(zhǎng)OH11A。該區(qū)域與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)系。吉西他濱對(duì)核苷酸還原酶活性具有抑制作用從而影響DNA的合成。
根據(jù)臨床試驗(yàn)的結(jié)果，含吉西他濱的化療方案對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌有效率在30％左右，即使分期、身體狀況、體重等基本臨床因素相似，不同患者對(duì)于含吉西他濱化療方案的反應(yīng)率仍有較大差別。說(shuō)明個(gè)體差異性對(duì)化療療效有著較大的影響。隨著人類(lèi)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，不同個(gè)體間基因表達(dá)的細(xì)微差別越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn)，其中許多基因的表達(dá)差異對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展及治療轉(zhuǎn)歸有明確的影響。
隨著個(gè)體基因表達(dá)與臨床治療間的關(guān)系逐漸被揭示，當(dāng)前的腫瘤治療已進(jìn)入一個(gè)規(guī)范化、個(gè)體化治療的新時(shí)期。以不同個(gè)體的基因表達(dá)差異為基礎(chǔ)制定的有針對(duì)性的治療方案能夠盡可能地為患者提供最有效治療并將毒副作用減至最小，同時(shí)避免不必要的醫(yī)療費(fèi)用的支出。在最新的靶向藥物治療領(lǐng)域，例如針對(duì)gefitinib這種表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑臨床已發(fā)現(xiàn)能特別獲益的人群。而在傳統(tǒng)化療方面也觀察到許多有意義的現(xiàn)象，ERCC1低表達(dá)者對(duì)鉑類(lèi)藥物反應(yīng)性較好，β-tubulinIII低水平表達(dá)時(shí)對(duì)紫杉類(lèi)藥物反應(yīng)性較好，同樣也有研究表明患者對(duì)吉西他濱治療的敏感性與腫瘤組織核苷酸還原酶M1亞基的表達(dá)水平相關(guān)，高表達(dá)RRM1的患者接受吉西他濱治療時(shí)預(yù)后較差。因此，通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織中RRM1基因的表達(dá)水平來(lái)篩選對(duì)吉西他濱治療敏感的患者不失為一項(xiàng)有益的措施。
熒光定量PCR技術(shù)是當(dāng)前檢測(cè)基因表達(dá)水平的較精確的方法之一，技術(shù)成熟規(guī)范適合于臨床標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)，對(duì)于活組織切除，纖支鏡檢查及手術(shù)中取得的腫瘤組織標(biāo)本均可進(jìn)行檢測(cè)。其檢測(cè)結(jié)果將有益地指導(dǎo)晚期及術(shù)后的非小細(xì)胞肺癌患者的治療。本發(fā)明的目的在于應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)出一種檢測(cè)人核苷酸還原酶M1亞基(ribonucleotide reductase M1，RRM1)在腫瘤組織中的表達(dá)水平的試劑盒。該試劑盒包括Trizol、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑、T-載體連接試劑、熒光定量PCR試劑、引物、TAQ酶、標(biāo)準(zhǔn)品，其中RT-PCR檢測(cè)試劑是oligo(dT)20，dNTP mix，DEPC-treated water，10X RT buffer，MgCl2，DTT，RNASEOUTTM，SuperScriptTMIII RT。T-載體連接試劑是2X Rapid Ligation Buffer，pGEM-T Vector，T4 DNA連接酶。熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)人腫瘤組織RRM1試劑是SYBRPremix Ex Taq(2X)，Rox reference dye，引物。
目標(biāo)基因RRM1上下游引物分別是forward5’-TCT GCT GGA GGA ATT GGT GTT-3’reverse5’-GAC GCT TGT TCC CAC CTT GA-3’；看家基因Beta-Actin上下游引物分別是forward5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’reverse5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’。
目標(biāo)基因RRM1標(biāo)準(zhǔn)品序列為T(mén)CTGCTGGAGGAATTGGTGTTGCTGTGAGTTGTATTCGGGCTACTGGCAGCTACATTGCTGGGACTAATGGCAATTCCAATGGCCTTGTACCGATGCTGAGAGTATATAACAACACAGCTCGATATGTGGATCAAGGTGGGAACAAGCGTC；看家基因β-Actin標(biāo)準(zhǔn)品序列為GCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCAGCGCTGTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。
該試劑盒采用SYBR Green嵌合熒光法進(jìn)行Real-Time PCR對(duì)臨床能取得腫瘤組織的患者進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)方法簡(jiǎn)單可行，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，具有高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)，而且非常適于批量樣本檢測(cè)，可以用來(lái)篩選對(duì)吉西他濱治療有效的晚期或術(shù)后非小細(xì)胞肺癌患者。

圖1為β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖2為β-actin擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖3為RRM1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖4為RRM1擴(kuò)增曲線(xiàn)。實(shí)施例1組織RNA的提取1.新鮮組織取下后，立即置于液氮中，然后存于-80℃冰箱中保存待檢測(cè)。
2.取適當(dāng)大小組織標(biāo)本(約100毫克)用研鉑在液氮中磨碎，移入裝有1000ul Trizol的預(yù)冷的1.5毫升離心管中，冰上放置10分鐘。
3.加入200ul的氯仿。
4.用鑷子取子彈頭，蓋上蓋子，上下顛倒混勻，15S左右。
5.靜置5min。
6.離心，12000RPM/min，4℃，15min。
7.取上層。(中下層為蛋白質(zhì)和DNA的混合物)8.加入異丙醇1000ml Trizol加入500ul異丙醇.
9.混勻，靜置10min。離心，12000RPM/min，4℃，15min。
10.直接將上清液棄掉，可以看見(jiàn)壁上有少許白色沉淀黏附。
11.75％酒精洗滌加入量與Trizol一樣?；靹?。離心，8000g/min，4℃，15min。
12.棄上清。
13.真空干燥，約10min。
14.用20ul DEPC-水溶解RNA(用Tip頭反復(fù)吹打)。
15.55℃-60℃水浴5min。
16.1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的提取情況完整的RNA在紫外分析儀下可見(jiàn)三條帶，分別為28S，18S，5S。28S的亮度應(yīng)該為18S的兩倍，5S帶一般較弱，如有降解可見(jiàn)5S帶增強(qiáng)。
17.測(cè)定所提RNA的OD260和OD280值，計(jì)算總RNA的濃度以及純度OD260/OD280應(yīng)在1.8-2.1之間實(shí)施例2RT-PCR合成cDNA1.將試劑盒中的所有試劑混勻并快速離心收集；2.在0.2ml PCR反應(yīng)管中加入以下反應(yīng)物1ug總RNA nul50uM oligo(dT)20 1ul10mM dNTP mix1ulDEPC-treatedwater 補(bǔ)足到 10ul3.65℃孵育5分鐘，立即置于冰上至少1分鐘。
4.再在此管中加入以下反應(yīng)物，混勻。
10XRT buffer2ul25mM MgCl2 4ul0.1M DTT2ulRNASEOUTTM(40U/ul) 1ulSuperScriptTM III RT(200U/ul) 1ul5.50℃孵育50分鐘，然后85℃反應(yīng)5分鐘。立即置于冰上。
6.離心收集產(chǎn)物。加入1ul RNase H，37℃孵育20分鐘。
7.cDNA合成以后置于-20℃保存待下游工作。
實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建1.快速離心PGEM-T Vector，收集反應(yīng)物于管低。
2.建立連接體系在0.2mlL離心管中以下反應(yīng)物2X Rapid Ligation Buffer 5ulpGEM-T Vector1ulPCR Product 2ulT4DNA連接酶(3U/ul) 1ul無(wú)菌水 1ul3.混勻，室溫1小時(shí)或4℃孵育過(guò)夜。
4.準(zhǔn)備兩個(gè)AMP LB平板，室溫放置備用。
5.將連接體系中的反應(yīng)物取2ul于7ml的離心管中。
6.取50ul感受態(tài)細(xì)胞于7ml管中，輕彈混勻，冰浴30分鐘。
7.42℃水浴熱休克90秒。立即置于冰中2分鐘。
8.加950ul soc培養(yǎng)基于管中。37℃，150rpm培養(yǎng)1個(gè)半小時(shí)。
9.離心，1000g/min，10min后棄上清收集細(xì)胞。
10.加入100ul或200ul的SOC培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)胞，輕彈混合。
11.于每個(gè)平板中加入100ul混合細(xì)胞液，用接種環(huán)鋪開(kāi)反應(yīng)液。
12.37℃孵育過(guò)夜。
13.觀察菌的生長(zhǎng)情況，將單個(gè)菌落用槍頭挑出后放進(jìn)含100ulSOC培養(yǎng)液的0.5ml的離心管中反復(fù)吹打，將菌落洗脫。
14.PCR進(jìn)行菌落的挑選，挑選目標(biāo)菌落。
15.取PCR結(jié)果合適的SOC培養(yǎng)基加入(5ml+50ulAmp)的LB培養(yǎng)肉湯中，150rpm培養(yǎng)過(guò)夜。
16.提取質(zhì)粒，測(cè)OD值，計(jì)算此標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。
17.按照所需濃度稀釋成工作液。
18.測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的序列，驗(yàn)證轉(zhuǎn)入序列的正確性。
實(shí)施例4熒光定量檢測(cè)包括標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作和未知樣品的檢測(cè)1.確定未知樣品的位置和重復(fù)數(shù)，最好每個(gè)樣品重復(fù)三次。
2.將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品ERCC1和看家基因標(biāo)準(zhǔn)品B-actin倍比稀釋成6個(gè)濃度108，107，106，105，104，103，確定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的位置和重復(fù)數(shù)。
3.在反應(yīng)板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入以下體積的液體SYBRPremixEx12.5ulTaq(2X)10uM sense primer 0.5ul10uM antisense primer 0.5ulRox reference dye 0.5ulTemplate DNA1ul無(wú)菌水 10ul4.蓋上熱反應(yīng)膜，將反應(yīng)板裝入定量分析儀。
5.按儀器操作創(chuàng)建定量反應(yīng)板。
6.指定熱循環(huán)的條件并開(kāi)始運(yùn)行反應(yīng)板聚合酶的活化20秒@95℃PCR擴(kuò)增(40個(gè)循環(huán))5秒@95℃，31秒@60℃7.保存文件，單擊start開(kāi)始。
8.待反應(yīng)完畢，分析數(shù)據(jù)，以B-actin作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的ERCC1的表達(dá)水平，如在中位數(shù)以上定為陽(yáng)性，如在中位數(shù)以下定為陰性。
實(shí)施例5、檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱治療的療效我們對(duì)60例服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱的非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行了檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱的療效，其準(zhǔn)確率達(dá)82％，假陰性率為8％，假陽(yáng)性率為10％。
實(shí)施例6、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱的乳腺癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效80例乳腺癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)吉西他濱的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)80％，假陰性率為10％，假陽(yáng)性率為10％。
實(shí)施例7、檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱療效我們對(duì)80例服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)吉西他濱的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)85％，假陰性率為6％，假陽(yáng)性率為13％。
實(shí)施例8、檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性腎癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱的療效30例服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱治療的轉(zhuǎn)移性腎癌患者接受了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)吉西他濱的療效，其準(zhǔn)確率達(dá)73％，假陰性率為13％，假陽(yáng)性率為14％。
實(shí)施例9、頭頸部腫瘤患者檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱的療效35例頭頸部腫瘤患者接受嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱的治療，我們對(duì)這35例患者進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)吉西他濱的療效，其準(zhǔn)確率達(dá)77％，假陰性率為10％，假陽(yáng)性率為13％。
實(shí)施例10、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物卡培他濱的乳腺癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效50例乳腺癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)卡培他濱的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)86％，假陰性率為10％，假陽(yáng)性率為4％。
實(shí)施例11、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物卡培他濱的胃癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效40例乳腺癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)卡培他濱的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)80％，假陰性率為14％，假陽(yáng)性率為6％。
實(shí)施例12、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物卡培他濱的直腸癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效36例直腸癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)卡培他濱的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)78％，假陰性率為10％，假陽(yáng)性率為12％。
實(shí)施例13、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物卡培他濱的晚期胰腺癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效24例晚期胰腺癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物吉西他濱，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)卡培他濱的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)70％，假陰性率為20％，假陽(yáng)性率為10％。
實(shí)施例14、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的乳腺癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效100例乳腺癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)去氧氟尿苷的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)85％，假陰性率為10％，假陽(yáng)性率為5％。
實(shí)施例15、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的胃癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效20例胃癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)去氧氟尿苷的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)90％，假陰性率為5％，假陽(yáng)性率為5％。
實(shí)施例16、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的直腸癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效40例直腸癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)去氧氟尿苷的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)80％，假陰性率為10％，假陽(yáng)性率為10％。
實(shí)施例17、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的鼻煙癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效20例鼻煙癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)去氧氟尿苷的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)90％，假陰性率為5％，假陽(yáng)性率為5％。
實(shí)施例18、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的宮頸癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效25例宮頸癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)去氧氟尿苷的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)80％，假陰性率為10％，假陽(yáng)性率為10％。
實(shí)施例19、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的膀胱癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效30例膀胱癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)去氧氟尿苷的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)90％，假陰性率為5％，假陽(yáng)性率為5％。
實(shí)施例20、服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物去氧氟尿苷的結(jié)腸癌患者行檢測(cè)腫瘤組織RRM1表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)其療效40例結(jié)腸癌患者服用嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥去氧氟尿苷，進(jìn)行了腫瘤組織RRM1表達(dá)水平檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)患者對(duì)去氧氟尿苷的療效，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)70％，假陰性率為20％，假陽(yáng)性率為10％。
雖然上面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了具體描述，但是熟悉本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員均了解，在不違背本發(fā)明的原則和精神的情況下，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)及所附權(quán)利要求書(shū)中公開(kāi)的內(nèi)容，可對(duì)本發(fā)明做出各種變動(dòng)和改進(jìn)。因此，所有這些變動(dòng)和改進(jìn)均應(yīng)包括在所附權(quán)利要求書(shū)中所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物療效預(yù)測(cè)試劑盒及其應(yīng)用<110>廣東省人民醫(yī)院<120>嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物療效預(yù)測(cè)試劑盒及其應(yīng)用<160>6<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>引物<400>1tctgctggag gaattggtgt t 21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>引物<400>2gacgcttgtt cccaccttga20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>引物<400>3
gccaaccgcg agaagatga 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>引物<400>4catcacgatg ccagtggta 19<210>5<211>153<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>目標(biāo)基因RRM1標(biāo)準(zhǔn)品序列<400>5tctgctggag gaattggtgt tgctgtgagt tgtattcggg ctactggcag ctacattgct60gggactaatg gcaattccaa tggccttgta ccgatgctga gagtatata acaacacagc 120tcgatatgtg gatcaaggt gggaacaagc gtc 153<210>6<211>120<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>看家基因β-Actin標(biāo)準(zhǔn)品序列為<400>6gccaaccgcg agaagatgac ccagatcatg tttgagacct tcaacacccc agccatgtac 60gtggccatcc aggcagcgct gtccctgtac acctctggcc gtaccactgg catcgtgatg 120
權(quán)利要求
1.一種嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物療效預(yù)測(cè)試劑盒，它包括Trizol、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑、T-載體連接試劑、熒光定量PCR試劑、引物、Taq酶、標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于目標(biāo)基因RRM1上下游引物分別是forward5’-TCT GCT GGA GGA ATT GGT GTT-3’reverse5’-GAC GCT TGT TCC CAC CTT GA-3’；看家基因Beta-Actin上下游引物分別是forward5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’reverse5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’。目標(biāo)基因RRM1標(biāo)準(zhǔn)品序列為T(mén)CTGCTGGAGGAATTGGTGTTGCTGTGAGTTGTATTCGGGCTACTGGCAGCTACATTGCTGGGACTAATGGCAATTCCAATGGCCTTGTACCGATGCTGAGAGTATATAACAACACAGCTCGATATGTGGATCAAGGTGGGAACAAGCGTC；看家基因β-Actin標(biāo)準(zhǔn)品序列為GCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCAGCGCTGTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于RT-PCR檢測(cè)試劑是oligo(dT)20，dNTP mix，DEPC-treated water，10X RTbuffer，MgCl2，DTT，RNASEOUTTM，SuperScriptTMIII RT。
3.如權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于T-載體連接試劑是2X Rapid Ligation Buffr，pGEM-T Vector，T4DNA連接酶。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)人腫瘤組織RRM1試劑是SYBR Premix Ex Taq(2X)，Rox reference dye，引物。
5.權(quán)利要求1所述試劑盒應(yīng)用于嘧啶類(lèi)抗代謝化療藥物對(duì)肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、轉(zhuǎn)移性腎癌以及頭頸部腫瘤的療效預(yù)測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種檢測(cè)核苷酸還原酶M1亞基(ribonucleotide reductase M1，RRM1)在腫瘤組織中的表達(dá)水平的試劑盒，該試劑盒可以用來(lái)有效篩選對(duì)抗代謝藥治療有效的惡性腫瘤患者。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1975388SQ20061012245
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月27日
發(fā)明者吳一龍, 董嵩, 郭愛(ài)林, 陳志紅, 張緒超, 林嘉穎, 謝至, 陳世良, 聶強(qiáng) 申請(qǐng)人:廣東省人民醫(yī)院