專利名稱：胞苷三磷酸的基因工程制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胞苷三磷酸的制備方法，具體地說涉及在大腸桿菌中同時高效表達(dá)大腸桿菌嘧啶代謝途徑中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脫羧酶(pyrF)、尿甘酸激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(ndk)和CTP連接酶(pyrG)基因，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胞苷三磷酸(cytidine triphosphate, CTP)，又稱胞嘧啶核苷三磷酸，CTP經(jīng)尿苷三磷酸(uridine 5' -triphosphate，UTP)由酶催化合成，是一種在胞苷的核糖-5 ‘ -OH 基上結(jié)合三分子磷酸的核苷酸。胞苷三磷酸是一種高能磷酸化合物，在體內(nèi)參與核酸和磷脂類的合成代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，并提供能量，是RNA生物合成的直接前體之一，并參與多糖的合成。CTP具有激活和促進(jìn)受損神經(jīng)組織再生和修復(fù)的功能，可健全和調(diào)節(jié)神經(jīng)組織、改善脂肪代謝等作用，還可以調(diào)節(jié)和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及血管壁細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)的合成與構(gòu)建，能夠?qū)褂膳d奮性氨基酸、自由基引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而起到抗血管硬化的作用。國外有實驗研究已證實了 CTP能減輕甚至逆轉(zhuǎn)多種原因所引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。CTP也是合成寡聚糖、胞苷二磷酸膽堿(CDP-膽堿)XMP-NeuAc (CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸)等多種藥物的中間體。近年來用于臨床的藥用CTP為三磷酸胞苷二鈉(cytidine 5' -triphosphatedisodium)，其化學(xué)名稱為胞嘧啶核苷-5'-三磷酸二鈉鹽，其分子式為 C9H14N3Na2O14P3，分子量為527. 14，是一種治療腦血管疾病的核苷酸類藥物。目前已有廠家生產(chǎn)注射液制劑，臨床上主要用于治療多種原因引起的神經(jīng)系統(tǒng)及心血管類疾病，如腦血管意外及其后遺癥；腦震蕩、外傷性昏迷、顱腦手術(shù)后功能障礙；神經(jīng)官能癥；腦血管硬化、老年性癡呆；外周神經(jīng)損傷；兒童腦發(fā)育不全等。已報道的胞苷三磷酸的合成工藝方法主要包括化學(xué)法、生物合成法、光合磷酸法等幾種。國內(nèi)生產(chǎn)CTP的方法主要是通過分離出酵母體內(nèi)的自身酶系通過對CMP進(jìn)行轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)CTP，生產(chǎn)工藝比較成熟。但該工藝不太可能完全分離出糖酵解系統(tǒng)中的所有酶，酶失活率高，轉(zhuǎn)化率受到影響，且轉(zhuǎn)化時間較長。近年來，CTP需求量的增加，臨床用量也顯著增加，已無法滿足市場需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有的生產(chǎn)胞苷三磷酸的方法存在的缺陷，而提供一種新的工藝簡單、生產(chǎn)周期短、低成本的使用酶工程法生產(chǎn)胞苷三磷酸的方法。本發(fā)明胞苷三磷酸的基因工程制備方法是采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)的胞苷三磷酸的制備方法，使用單一的基因工程菌的培養(yǎng)物或者其處理物作為酶源，催化氯化銨、乳清酸等底物進(jìn)行反應(yīng)，使得反應(yīng)液中生成和積聚胞苷三磷酸，并從所述反應(yīng)液中提取所述胞苷三磷酸。前述的基因工程菌具有可誘導(dǎo)表達(dá)編碼乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、尿甘酸激酶、核苷二磷酸激酶和胞苷三磷酸連接酶的基因。前述的可誘導(dǎo)表達(dá)胞苷三磷酸連接酶的基因位于所述基因工程菌的質(zhì)粒上。前述的可誘導(dǎo)表達(dá)所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因位于所述基因工程菌的染色體上。前述的可誘導(dǎo)表達(dá)所述胞苷三磷酸連接酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段來源于大腸桿菌，是根據(jù)大腸桿菌全基因組序列(genebank登錄號ECK3632)設(shè)計引物擴增得到的。更進(jìn)一步地，所述基因工程菌的制備方法包括如下步驟a)將來源于大腸桿菌的可誘導(dǎo)表達(dá)胞苷三磷酸連接酶的基因核苷酸片段經(jīng)酶切后與質(zhì)粒載體(PUC18)連接形成重組質(zhì)粒；b)將來源于大腸桿菌的可誘導(dǎo)表達(dá)所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、 尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段經(jīng)酶切后插入到宿主細(xì)胞的染色體上；c)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到所述宿主細(xì)胞內(nèi)。胞苷三磷酸的基因工程制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點(1)采用單一的微生物工程菌株催化反應(yīng)，發(fā)酵、反應(yīng)條件更易于控制；(2)所使用的底物為乳清酸，成本較低，可低成本生產(chǎn)胞苷三磷酸；(3)反應(yīng)迅速、且轉(zhuǎn)化率較高。以下便結(jié)合實施例并附圖，對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步的詳述。


圖1是實施例中的基因工程菌的部分載體構(gòu)建的流程圖。
具體實施例方式本發(fā)明胞苷三磷酸的制備方法是使用單一基因工程菌的培養(yǎng)物或者其處理物作為酶源，催化包括氯化銨、乳清酸等為底物進(jìn)行反應(yīng)，使得反應(yīng)液中生成和積蓄胞苷三磷酸，從所述反應(yīng)液中提取所述。實施例1、染色體帶有pyrE、pyrF、pyrH、ndk操縱元的大腸桿菌的構(gòu)建1. UpyrE, pyrF、pyrH、ndk基因的擴增及載體的構(gòu)建pyrE基因、pyrF基因、pyrH基因、ndk基因和pyrG基因是根據(jù)大腸桿菌全基因組序列(genebank登錄號ECK3632)設(shè)計引物的。提取大腸桿菌K12MG1655基因組。然后，以大腸桿菌K12MG1655基因組為模板分別擴增出pyrE、pyrF、pyrH、ndk 基因，測序后，通過EcoRI、SacI酶切位點將pyrE片段連接于質(zhì)粒pUC18上，得到質(zhì)粒 PUCpyrE ；再通過McI、SmaI位點將pyrF片段連接到質(zhì)粒pUCpyrE上，得到質(zhì)粒pUC-pyrEF ； 接著將PyrH片段經(jīng)由SmaI和)(baI位點連接到pUC-pyrEF上，得到質(zhì)粒pUCpyrEHl ；最后通過XbaI和HindIII位點將ndk片段連接到pUCpyrEHl上，獲得在Iac啟動子后可誘導(dǎo)表達(dá)pyrE、pyrF、pyrH、ndk基因的操縱元的質(zhì)粒pUCpyrEFHk，具體構(gòu)建流程如圖1所示。1. 2、帶有KRT-Km-FRT元件的pyrE、pyrF、pyrH、ndk操縱元質(zhì)粒的構(gòu)建ndk基因引物上設(shè)計有BioI位點，將pUCpyrEFHk用BioI和kal酶切，與同樣帶有B10I和kal酶切位點的以質(zhì)粒pKD13為模板擴增出的帶有FRT位點的Kan基因片段相連，構(gòu)建成質(zhì)粒pUCpyrEFHkKmFRT，如圖1所示。1. 3、Red同源重組方法整合pyrE、pyrF、pyrH、ndk操縱元(1)線性雙鏈DNA打靶分子的制備與處理用于基因敲除的外源DNA的PCR擴增引物，它們分別由5，端的pyrE、pyrF、 pyrH、ndk操縱元同源區(qū)和3'端20bps的模板質(zhì)粒pKD13的卡那霉素抗性基因同源區(qū)或質(zhì)粒pUCpyrEFHkKmFRT上20bp同源區(qū)組成。使用高保真DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶)，經(jīng)PCR合成了線性雙鏈DNA打靶分子 (5’同源臂+篩選標(biāo)記+3’同源臂)。用Dpn I酶處理PCR產(chǎn)物，回收濃縮后用于重組。(2)重組酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)和感受態(tài)細(xì)胞的制備將編碼Red重組系統(tǒng)的質(zhì)粒pKD46用CaCl2法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，將宿主菌在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中30°C過夜振蕩培養(yǎng)，接種ImL菌液于50mL的含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)3-4h，在培養(yǎng)終止前Ih加入L-阿拉伯糖，使之終濃度為0. 1 %。 冰上預(yù)冷lOmin，離心收集菌體，用10%甘油或超純水洗3_4次，最后將菌體重懸于500 μ L 冷的無菌10%甘油中，取50 μ L用于電擊轉(zhuǎn)化，其余可存放于-80°C冰箱中備用。以上操作步驟都要在冰上進(jìn)行。(3)電擊轉(zhuǎn)化取2μ U20-100ng)純化后的PCR產(chǎn)物與50 μ 1剛制備的感受態(tài)混合，采用BioRad 公司Micro-Pulser電穿孔儀進(jìn)行，0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯，轉(zhuǎn)化參數(shù)為2. 5kV，5. 8ms。迅速加入LB 培養(yǎng)基1ml，置于37°C搖床中培養(yǎng)l_2h，復(fù)蘇，用含篩選標(biāo)記的LB平板篩選發(fā)生了同源重組的陽性克隆，獲得菌株重組菌Kl。(4)驗證引物設(shè)計及卡那霉素抗性基因的去除對重組菌Kl進(jìn)行鑒定時，引物設(shè)計的一般原則是一條引物設(shè)計在打靶區(qū)外圍， 另外一條則位于線性打靶序列內(nèi)部。通過測序確認(rèn)了重組事件發(fā)生的位置，獲得的菌株Kl 即可用于下一步抗性去除。質(zhì)粒pCP20表達(dá)FLP重組酶，作用在重組體染色體上兩個FRT靶位點上，使卡那霉素抗性基因丟失。將具有氨芐青霉素抗性的質(zhì)粒PCP20利用CaCl2方法轉(zhuǎn)化進(jìn)入具有Kan 抗性的陽性菌株Kl中，于30°C培養(yǎng)條件下在含有Amp和Kan的平板上獲得陽性轉(zhuǎn)化子。然后轉(zhuǎn)接到?jīng)]有抗生素的LB培養(yǎng)基中，42°C培養(yǎng)5h，37°C平板劃線培養(yǎng)。對所得到的單菌落進(jìn)行Amp和Kan敏感檢測，最后的Amp和Kan敏感的表型菌株就是去除掉Kan基因的重組子，如K1-E。同時使用Kan這對引物對抗性消除進(jìn)行驗證，條件同上。得到去除抗性的重組子Kl-E即為染色體上帶有pyrE、pyrF、pyrH、ndk共表達(dá)操縱元的大腸桿菌菌株。實施例2、pyrG基因表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)已知大腸桿菌K12MG1655的pyrG基因核酸序列，以大腸桿菌的染色體作為模板，擴增出全長PyrG基因。采用常規(guī)細(xì)菌DNA提取方法提取了本實驗室保藏的大腸桿菌菌株DH5 α的基因組 DNA。擴增使用的是保真性較好的pfu酶，加A尾后連接于pUC19-T vector，挑取陽性克隆送交測序公司，測序證實序列正確的用于下一步操作。將連接于pUC19-T vector上的pyrG基因從載體上酶切下來，使用的限制性內(nèi)切酶為Sma I和BamH I，同時載體pUC18使用限制性內(nèi)切酶Nru I和BamH I進(jìn)行酶切，將載體酶切產(chǎn)物回收后，與回收的PyrG基因片段進(jìn)行酶連反應(yīng)，通過Sma I和BamH I等限制性酶消化，進(jìn)行分析，確認(rèn)片段已經(jīng)連接成功。最終獲得質(zhì)粒PUCG，pyrG基因此時是由IacZ 啟動子誘導(dǎo)表達(dá)的。實施例3、產(chǎn)胞苷三磷酸的基因工程菌的構(gòu)建將實施例1中獲得的所述重組子Kl-E制備為感受態(tài)細(xì)胞，再將實施例2中構(gòu)建完成的所述質(zhì)粒PUCG轉(zhuǎn)化入Kl-E中，命名為Kl-E/pUCG，即為具有催化乳清酸和氯化銨等合成胞苷三磷酸能力的基因工程菌，加甘油保藏于-80°C冰箱中。實施例4、發(fā)酵及催化反應(yīng)將固體培養(yǎng)基上的工程菌Kl-E/pUCG菌株接入5-20ml含氨芐青霉素(100 μ g/ml) 的種子培養(yǎng)液中，30-37°C以150480rpm振蕩培養(yǎng)8-16小時。按0.的接種量將該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至50-200ml含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的種子LB培養(yǎng)基液的IL三角燒瓶中，在30-37°C以150480rpm振蕩培養(yǎng)2-8小時，然后加入終濃度為0. I-ImM的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時，培養(yǎng)溫度可適當(dāng)下調(diào)。用冷凍離心機將發(fā)酵液于4-20°C下以1000-5000rpm的速度離心5_10min，棄上清，用 10-20ml 0. 05M, pH 8. 0 的 Tris-HCl 重懸菌體細(xì)胞。將重懸后的重約4g大腸桿菌細(xì)胞加入三角瓶中，并向其中添加IOg葡萄糖、0. 6g 乳清酸、0. 8g氯化銨、Ig磷酸氫二鉀、Ig磷酸二氫鉀、Img硫酸亞鐵、0. 8mg硫酸錳、20mg硫酸鎂和0. 4mL 二甲苯，再加入蒸餾水定容至100mL。將此混合液裝入2L容量的三角瓶中，在 280C UOOrpm的條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)中，在適宜的進(jìn)程中添加KOH以便保持反應(yīng)體系pH 值為7. 2。反應(yīng)M小時后，用HPLC方法測定反應(yīng)液中胞苷三磷酸的含量為7. 15g/L。實施例5、分離與純化反應(yīng)終止后，在轉(zhuǎn)化液中加入硅藻土，攪拌，以去掉蛋白質(zhì)。再將轉(zhuǎn)化液離心，收集上清液。在離心上清液中加入陽離子交換樹脂攪拌吸附，調(diào)PH為1.2至4.0范圍內(nèi)皆可， 靜置，過濾，得濾液。在濾液中加入乙醇，至乙醇含量達(dá)60%以上，靜置。再過濾，收取濾餅。 將得到濾餅加水溶解稀釋，過濾，得濾液。濾液調(diào)PH為2. 0-2. 5左右，上樹脂分離柱，進(jìn)行吸附。檢測從分離柱下口流出的溶液，吸附飽和時停止進(jìn)樣，用氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫。為進(jìn)一步純化，在上述7中洗脫下來的溶液中加入藥用活性炭，攪拌脫色，過濾， 將獲得的濾液中按1 2-1 20的比例加入藥用酒精，收集沉淀，抽濾除去水分，即可得到純度較高的胞苷三磷酸。本發(fā)明中，作為載體，只要在宿主微生物中能夠復(fù)制即可；作為宿主微生物，只要能夠表達(dá)重組DNA，用于胞苷三磷酸生產(chǎn)即可。培養(yǎng)本發(fā)明中基因工程菌的培養(yǎng)基，只要含有本發(fā)明中基因工程菌可以用于代謝的碳源、氮源、無機鹽類等、可有效地培養(yǎng)本發(fā)明微生物，不管是天然培養(yǎng)基，還是合成培養(yǎng)基均可。其中碳源，只要是本實施例中基因工程菌可以用于代謝者即可，如葡萄糖、果糖、蔗糖； 含有上述糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解產(chǎn)物等碳水化合物；醋酸、丙酸等有機酸；乙醇和丙醇等醇類。氮源，可以用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨和磷酸銨等含氮化合物；以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浸漬液、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物、各種發(fā)酵菌體及其消化產(chǎn)物等。無機鹽，可以用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣等。培養(yǎng)本實施例中基因工程菌的最適溫度為25-37°C，培養(yǎng)中培養(yǎng)基的pH值最好維持在中性范圍，培養(yǎng)時間是6-M小時。本發(fā)明能廣泛地應(yīng)用于胞苷三磷酸的制備中。本發(fā)明尚有多種實施方式，凡采用等同變換或者等效變換而形成的所有技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.胞苷三磷酸的制備方法，其特征在于使用單一的基因工程菌的培養(yǎng)物或者其處理物作為酶源，催化包括乳清酸、氯化銨等底物進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)液中生成、積累胞苷三磷酸， 并從所述反應(yīng)液中提取胞苷三磷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞苷三磷酸的制備方法，其特征在于所述基因工程菌具有編碼乳清苷酸焦磷酸化酶、核苷二磷酸激酶、尿甘酸激酶、乳清苷酸脫羧酶和胞苷三磷酸連接酶的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于可誘導(dǎo)表達(dá)所述胞苷三磷酸連接酶的基因位于所述基因工程菌的質(zhì)粒上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于可誘導(dǎo)表達(dá)所述乳清苷酸焦磷酸化酶、核苷二磷酸激酶、尿甘酸激酶和乳清苷酸脫羧酶的基因位于所述基因工程菌的染色體上。
5.根據(jù)權(quán)利要求3和4所述的方法，其特征在于可誘導(dǎo)表達(dá)所述編碼胞苷三磷酸連接酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段來源于大腸桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項所述的胞苷三磷酸的制備方法，其特征在于所述基因工程菌的制備方法包括如下步驟a)將位于可誘導(dǎo)表達(dá)啟動子后，來源于大腸桿菌的編碼乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段整合到宿主細(xì)胞的染色體上；b)將來源于大腸桿菌的可誘導(dǎo)表達(dá)胞苷三磷酸連接酶的基因片段酶切后與質(zhì)粒載體連接形成重組質(zhì)粒；c)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到所述宿主細(xì)胞內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒載體為質(zhì)粒PUC18。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種胞苷三磷酸的制備方法，使用單一基因工程菌的培養(yǎng)物或其處理物作為酶源，催化包括氯化銨、乳清酸等進(jìn)行反應(yīng)，使得反應(yīng)液中生成和積聚胞苷三磷酸，并從所述反應(yīng)液中提取所述胞苷三磷酸。本發(fā)明的有益效果為(1)采用單一的微生物催化反應(yīng)，更易于控制反應(yīng)；(2)底物成本較低，可低成本生產(chǎn)胞苷三磷酸；(3)反應(yīng)迅速、且轉(zhuǎn)化率較高。本發(fā)明能廣泛地應(yīng)用于胞苷三磷酸的制備中。
文檔編號C12N15/52GK102199644SQ20111009464
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者夏冰, 李曉丹, 江玉梅, 汪仁, 王 忠, 賀佳 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所