專利名稱：一種中胚葉腎瘤模型及其建立方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞系建立方法，特別是涉及一種中胚葉腎瘤動(dòng)物模型及其建立方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞是研究腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性、癌變機(jī)理和癌癥治療的良好生物學(xué)模型。腫瘤細(xì)胞系的常規(guī)建立方法是應(yīng)用腫瘤組織進(jìn)行培養(yǎng)，如果在體外長期培養(yǎng)獲得不死性，即為永生化的腫瘤細(xì)胞系。另外一種腫瘤細(xì)胞系的建立方法是對正常細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后在細(xì)胞中導(dǎo)入癌基因如端粒酶基因[Biochem Biophys Res Commun.2004；315(3)643-651.]、SV40大T抗原[Biochim Biophys Acta.2005；1722(1)6-14.]、myc基因[Cancer Res.2005；65(6)2179-2185.]和人類乳頭瘤病毒基因等[Int JCancer.2004；110(3)313-319.]，細(xì)胞才能長期存活，獲得不死性，使細(xì)胞獲得惡性表型。這兩種建立永生化的腫瘤細(xì)胞系的方法成功率都很低。體外長期培養(yǎng)的人類成年正常細(xì)胞也能夠發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化形成腫瘤，但這種惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)率較低[Cancer Res2005；65(8)3035-3039]。
最近的研究證明，小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過多次傳代后，細(xì)胞的增殖突破限制，轉(zhuǎn)化為惡性表型，裸鼠體內(nèi)移植形成纖維肉瘤。骨髓基質(zhì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制與傳代次數(shù)的增加、染色體異常的累積、端粒酶表達(dá)的逐漸升高和c-myc基因表達(dá)的升高有關(guān)[Miura M，Miura Y，Padilla-Nash HM，et al.Stem Cells.2006 Apr；24(4)1095-103]。對人類的基質(zhì)細(xì)胞的研究證明，成人的干細(xì)胞在體外的短期培養(yǎng)是安全的(4-8周)，而人類基質(zhì)細(xì)胞長期培養(yǎng)會(huì)隨機(jī)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(4-5月)，支持了癌癥干細(xì)胞起源假說[Cancer Res 2005；65(8)3035-3039]。
體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞具有兩個(gè)控制點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活壽命衰老期和危機(jī)期。衰老與中等程度的端粒縮短有關(guān)，細(xì)胞周期阻滯。如果細(xì)胞能夠渡過此期，細(xì)胞繼續(xù)增殖直到端粒變得極短，細(xì)胞進(jìn)入危機(jī)期。此時(shí)細(xì)胞表現(xiàn)為無顯著特點(diǎn)的染色體不穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞大量調(diào)亡。[Cell 1999；97527-538.]如果此時(shí)的細(xì)胞能夠渡過危機(jī)期，就可能獲得永生化。人類細(xì)胞體外自發(fā)永生化的機(jī)率極低，對體外自發(fā)轉(zhuǎn)化有一定的抵抗。
以前國內(nèi)可見對人類胚胎肌肉細(xì)胞的長期培養(yǎng)研究，但未見培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生隨機(jī)惡性轉(zhuǎn)化的研究報(bào)告[柳霞，等.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2004，25(13)；高振南，等.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，23(2)；王守立，等.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2004，21(2)；陳曉萍，等.生理學(xué)報(bào)，2003，55(4)；楊志明，等.中國修復(fù)重建外科雜志2001，15(05)]。目前國際上也無利用人類的胚胎肌肉組織培養(yǎng)，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為肉瘤細(xì)胞系的報(bào)告，也沒有此方面的專利申請。據(jù)目前的文獻(xiàn)調(diào)研也沒有利用這種方法建立的腫瘤細(xì)胞系。
纖維肉瘤細(xì)胞系的常規(guī)建立方法是應(yīng)用腫瘤細(xì)胞直接培養(yǎng)，細(xì)胞存活并且永生化則成功建立細(xì)胞系[Kawashima H，Ogose A，Gu W.Cancer Genet Cytogenet.2005 Aug；161(1)28-35].由于人類的纖維肉瘤的發(fā)病率較低，而且纖維肉瘤體外培養(yǎng)不容易存活，因此細(xì)胞系的建立存在極大的困難。據(jù)目前的文獻(xiàn)檢索，國內(nèi)尚無永生化的人類纖維肉瘤細(xì)胞系的成功建立。
在早期的研究中，應(yīng)用小鼠自發(fā)的纖維肉瘤細(xì)胞能夠建立永生化的細(xì)胞系[王志光，等.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997年02期].后續(xù)的研究中也有應(yīng)用3-甲基膽蒽等化學(xué)藥物誘發(fā)小鼠的纖維肉瘤。[司徒銳，等.癌癥.1986年02期；葛淑芬，蘭行簡.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，1998年06期；葛淑芬，孫長伏，鹽田覺.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997年01期]。由于小鼠容易發(fā)生纖維肉瘤，因此對于纖維肉瘤的研究對象多集中在小鼠。[牛挺，向兵，黃杰，等.華西醫(yī)學(xué)，2005年04期；劉英，李雅杰，朱麗影.中成藥，2004年05期]。
化學(xué)藥物二甲基苯蒽能夠誘導(dǎo)雞發(fā)生纖維肉瘤。[薛彬.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，1984年02期]。地鼠的胚胎細(xì)胞對化學(xué)藥物敏感，環(huán)磷酰胺[戴向國，吳德昌，王治喬.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1998年03期]和二乙基亞硝胺[高鳳鳴，李新蘭，王鳳榮.癌癥，1988年03期]能夠誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而建成永生化的細(xì)胞系。
二甲基苯丙蒽和3，4-苯并芘能夠誘導(dǎo)大鼠形成纖維肉瘤。[李懷奇，邢樹忠，宋曉陵，陳中堅(jiān).口腔醫(yī)學(xué)，2005年02期；張?jiān)鹿?，李賀書，袁孝純.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2002年04期]。
在對人類的研究中，國內(nèi)有人對卵巢上皮癌細(xì)胞長期培養(yǎng)，獲得了永生化的細(xì)胞系，細(xì)胞為成纖維細(xì)胞形態(tài)，裸鼠種植瘤呈肉瘤樣細(xì)胞形態(tài)，電鏡及角蛋白免疫組化證實(shí)其為上皮起源，不是肉瘤。[劉廣芝，馮捷，葉雪，等.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2002年03期]。目前國內(nèi)用于研究的纖維肉瘤主要是國外建立的細(xì)胞系如HT1080[范怡梅.國外醫(yī)學(xué).中醫(yī)中藥分冊，2000年02期；顏春洪，韓銳.中華腫瘤雜志，1999年03期；吳愛軍，王紅，俞守義.中國公共衛(wèi)生，1999年03期]。
申請人的專利申請?zhí)枮?00610036856.X、發(fā)明名稱為“一種新的肉瘤細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用”的專利申請公開了用哺乳動(dòng)物的胚胎肌肉細(xì)胞建立新的肉瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以在體外惡性轉(zhuǎn)化，細(xì)胞獲得不死性，裸鼠皮下移植能夠形成腫瘤。所建立的細(xì)胞系在體內(nèi)表現(xiàn)為肉瘤，常見的病理類型為軟骨肉瘤和纖維肉瘤。
先天性中胚葉腎瘤(CMN)也稱胎兒腎錯(cuò)構(gòu)瘤、平滑肌錯(cuò)構(gòu)瘤和嬰兒間葉性錯(cuò)構(gòu)瘤，是一種少見的腎梭形細(xì)胞腫瘤，1967年由Bolande首次報(bào)道。CMN主要發(fā)生于新生兒和年幼的嬰兒。大多數(shù)在生后3個(gè)月內(nèi)作出診斷，大約占兒童腎腫瘤的5％。先天性中胚葉腎瘤的病因目前不清，可能與遺傳因素有關(guān)。目前對于其研究大部分集中在臨床領(lǐng)域。腫瘤研究包括體內(nèi)和體外兩種形式。細(xì)胞培養(yǎng)是體外研究的基礎(chǔ)，提供一個(gè)可人為調(diào)控的腫瘤細(xì)胞生存環(huán)境。但在這種非自然環(huán)境中，缺乏間質(zhì)組織，也不受其他組織器官的影響。但生物機(jī)體是一個(gè)復(fù)合整體，各種器官，組織之間既有相對獨(dú)立性，又有不可分割的相互聯(lián)系。因此宿主因素，腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)的關(guān)系等在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移過程中的重要作用已越來越受到了人們的重視。腫瘤動(dòng)物模型具有整體性腫瘤研究的特點(diǎn)，即使受到局部的刺激，也會(huì)因神經(jīng)體液諸方面的綜合因素作用而比體外實(shí)驗(yàn)?zāi)芨鎸?shí)的反映情況。特別是臨床應(yīng)用之前在各種荷瘤動(dòng)物身上取得數(shù)據(jù)和結(jié)論，更是必不可少。
腫瘤動(dòng)物模型可分為誘發(fā)性動(dòng)物模型、自發(fā)性動(dòng)物模型和裸小鼠異體移植瘤模型，它們均為腫瘤的基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)研究提供了良好的平臺(tái)。
先天性中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型研究較早的文獻(xiàn)報(bào)告在1977年[Hard GC，Grasso P.J NatlCancer Inst，1976；57(2)323-329]。隨后幾年的時(shí)間里也有相繼的報(bào)告。應(yīng)用的動(dòng)物模型時(shí)是大鼠，在成年鼠的腹腔內(nèi)或者經(jīng)過臍帶注入化學(xué)藥物誘發(fā)中胚葉腎臟腫瘤。這種動(dòng)物模型的缺點(diǎn)是發(fā)病率低，一般低于10％[Hasgekar NN，Pendse AM，Lalitha VS.Pediatr Pathol，1989；9(2)131-139；.Deshpande RB，Hasgekar NN，Chitale AR，et al.Comparative pathology.Pediatr Pathol.1989；9(2)141-151；Frank AA，Heidel JR，Thompson DJ，et al.ToxicolPathol.1992；20(3Pt1)313-322]。而且在進(jìn)行病理解剖前不能確定其病理類型。因此這種動(dòng)物模型不能用于與治療相關(guān)的深入研究，也沒有應(yīng)用這種模型進(jìn)行相關(guān)深入研究的報(bào)告。
先天性中胚葉腎瘤大致可分為三種組織學(xué)類型經(jīng)典型、細(xì)胞型及混合型。經(jīng)典型CMN由中等量增生的呈疏松排列的纖維母細(xì)胞構(gòu)成；而細(xì)胞型則以細(xì)胞豐富、多形性和許多分裂像為特征；混合型兼有上述二型的特點(diǎn)。由于目前尚未見到中胚層腫瘤細(xì)胞系成功建系的報(bào)告，因此也沒有人類的中胚層腎瘤動(dòng)物模型的研究報(bào)告。國內(nèi)有關(guān)于腎母細(xì)胞瘤動(dòng)物模型方面的研究，腫瘤的誘發(fā)也是應(yīng)用化學(xué)藥物，成瘤率也很低，其病理特點(diǎn)與中胚性腎瘤有一定程度的區(qū)別，腎母細(xì)胞瘤中一般含有上皮組織，而中胚性腎瘤則無[李凱，高解春，陳蓮，等.中華小兒外科雜志，2002；23(5)458-460].

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單實(shí)用的中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型的建立方法。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案為(1)用組織塊培養(yǎng)法或者酶消化法對哺乳動(dòng)物的胚胎肌肉細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；(2)細(xì)胞生長致融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；(3)在體外培養(yǎng)3-8個(gè)月后，培養(yǎng)物中出現(xiàn)增殖旺盛的克隆細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)獲得不死性，部分細(xì)胞已經(jīng)惡性轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞，即得到永生化的腫瘤細(xì)胞系；(4)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后經(jīng)過多次傳代，應(yīng)用單克隆培養(yǎng)法獲得單克隆的細(xì)胞株；(5)將單克隆的細(xì)胞株裸鼠皮下移植，獲得病理表現(xiàn)為纖維肉瘤的單克隆細(xì)胞株；(6)采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法或者分子生物學(xué)的方法對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定；(7)獲得的纖維肉瘤細(xì)胞株裸鼠腎包膜下移植，得到中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型。
其中，步驟(4)總所指的多次傳代是指傳代培養(yǎng)時(shí)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞處于穩(wěn)定生長狀態(tài)即可，次數(shù)沒有限制。
本發(fā)明的另一目的是提供一種中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型。
一種中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型，是由上述中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型建立方法得到的中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型，其中肉瘤細(xì)胞系的超微結(jié)構(gòu)特征是胞漿中含有脂滴；表達(dá)波形蛋白和結(jié)蛋白，不表達(dá)p16，肉瘤細(xì)胞系在裸鼠腎包膜下分裂增殖而獲得與人類中胚葉腎瘤病理表現(xiàn)相同的動(dòng)物模型。
本發(fā)明的另一目的是提供所述的中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型在抗嬰幼兒纖維肉瘤和中胚葉腎瘤的藥物篩選中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的一種中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型的建立方法能夠容易建立永生化的中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型，比傳統(tǒng)的中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型的建立更省時(shí)、省力，將細(xì)胞株裸鼠腎包膜下移植，獲得了與人類中胚葉腎瘤病理表現(xiàn)完全相同的動(dòng)物模型。本發(fā)明建立的中胚葉腎瘤的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞來源是人類，因此研究的結(jié)果更能體現(xiàn)人類的生理和病理過程。這種動(dòng)物模型的制作容易，腎原位移植瘤模型成瘤率高，能夠用于深入研究。具有與來源腫瘤相似的惡性生長特點(diǎn)。這對于肉瘤的研究和抗肉瘤藥物的篩選有廣泛的應(yīng)用前景，所述的中胚葉腎瘤病理動(dòng)物模型為這種疾病的發(fā)病機(jī)制和治療研究建立了技術(shù)平臺(tái)。


圖1是顯微鏡下(×10)腫瘤組織沿肌間隙浸潤裸鼠肌肉組織的示意圖；圖2是顯微鏡下(×10)MS0504-N裸鼠皮下移植形成的腫瘤的病理特征為纖維肉瘤的示意圖；圖3是顯微鏡下(×10)MS0504-N表達(dá)PCNA的示意圖；圖4是顯微鏡下(×10)MS0504-N波形蛋白表達(dá)的示意圖；圖5是顯微鏡下(×10)所有腫瘤細(xì)胞表達(dá)Desmin的示意圖；圖6是顯微鏡下(×10)所有腫瘤細(xì)胞表達(dá)Actin的示意圖；圖7是顯微鏡下(×10)部分腫瘤細(xì)胞比表達(dá)SMA的示意圖；圖8是顯微鏡下(×10)部分腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF-c的示意9是顯微鏡下(×10)部分腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ferritin的示意圖；圖10是電子顯微鏡(×2500)檢查MS0504-N細(xì)胞骨架成分和細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)的示意圖；圖11是顯微鏡下(×100)MS0504-N細(xì)胞系的染色體分析，典型的中期分裂相(p100)的示意圖；圖12裸鼠腎包膜下腫瘤形成，突出皮膚表面，移植后2個(gè)月的示意圖；
圖13部分腎組織被腫瘤浸潤的示意圖；圖14是顯微鏡下(20×)腫瘤組織編織成束狀，單個(gè)細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞形態(tài)，可見核分裂相的示意圖；圖15是顯微鏡下(20×)腎包膜下部分為正常腎組織，部分為腫瘤，病理表現(xiàn)與中胚葉腎瘤相同的示意圖；圖16是顯微鏡下(20×)腫瘤組織內(nèi)可見變性的腎小球結(jié)構(gòu)的示意圖；圖17是顯微鏡下(20×)腫瘤細(xì)胞表達(dá)中胚層的標(biāo)志物波形蛋白的示意圖；圖18是顯微鏡下(20×)腫瘤組織Masson染色結(jié)果的示意圖；圖19是顯微鏡下(20×)腫瘤組織VG染色結(jié)果的示意圖。
具體實(shí)施例方式
對獲得的人類胚胎肌肉組織進(jìn)行培養(yǎng)，胚胎的胎齡可從孕期5周一直到出生；培養(yǎng)的方法為貼壁培養(yǎng)，可以應(yīng)用組織塊直接培養(yǎng)，也可以將肌肉組織酶消化后培養(yǎng)，消化的酶類包括膠原酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、透明脂酸酶、脫氧核糖核酸酶，或者乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)等；培養(yǎng)基中一般含有血清的成分，如牛血清、馬血清、兔血清或者雞胚提取物，培養(yǎng)基的基本成分為DMEM(用于培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括以下多種，但不僅限于以下描述的內(nèi)容DMEM，ADC-1，RPMI1640，BGJ，HAM F10，F(xiàn)12，DCCM1，IMEM-20，M199，MEME，CMRL1415，CMRL1969，CMRL1066，NCTC135，MB75261，MAB8713，DM145，MCDB202，MCDB401，MDBC153，最常用的是DMEM培養(yǎng)基和DMEM/F12(1∶1))，培養(yǎng)基中含有10％的胎牛血清，血清的濃度可以波動(dòng)在很寬的范圍，最低可以在1％左右，最高可達(dá)50％以上。培養(yǎng)基中可加入L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、兩性霉素或氟康唑等抗細(xì)菌和真菌的藥物，也可以不加以上成分。組織塊培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，一般在原代培養(yǎng)最早12小時(shí)后就能發(fā)現(xiàn)貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞的成分含有成肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和其它的基質(zhì)細(xì)胞，依據(jù)胎齡的不同各種細(xì)胞成分比例有一定的差別。
對于培養(yǎng)的細(xì)胞的鑒定主要是基于細(xì)胞的表面分子和細(xì)胞蛋白和基因的表達(dá)，這些方法包括(1)，用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白和表面分子的表達(dá)，具體可用流式細(xì)胞儀、ABC法或SP法(DAB或AEC顯色)，也可以用間接免疫熒光的方法直接在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白的表達(dá)。(2)，在mRNA水平檢測相應(yīng)基因的表達(dá)，可用原位雜交的方法，或RT-PCR技術(shù)對基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定，也可以用Northern雜交的方法和基因芯片技術(shù)對cDNA檢測。(3)，在蛋白水平可用Western雜交的方法鑒定，對蛋白表達(dá)的多少可以進(jìn)行定量分析。
原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后能夠繼續(xù)增殖，當(dāng)細(xì)胞趨于融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，一般細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)間超過3個(gè)月，細(xì)胞會(huì)逐漸衰老，最后死亡，細(xì)胞衰老的時(shí)間隨培養(yǎng)細(xì)胞的胎齡和培養(yǎng)條件的不同有一定的差異，一般都發(fā)生在原代培養(yǎng)后3-8個(gè)月。但有部分細(xì)胞能夠渡過衰老期和危機(jī)期，細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化而獲得不死性，能夠惡性轉(zhuǎn)化為肉瘤細(xì)胞，在裸鼠體內(nèi)移植能夠形成肉瘤組織。細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化最常見的時(shí)間是培養(yǎng)后3個(gè)月至8個(gè)月。來源的肉瘤細(xì)胞系可能來源于干細(xì)胞的隨機(jī)突變。細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志是增殖速度明顯加快，癌基因表達(dá)和抑癌基因的失活。
在體外長期培養(yǎng)條件下，人類胚胎肌肉組織的細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)率很高，大約50％的人類胚胎肌肉長期培養(yǎng)會(huì)發(fā)生細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞其特征是表達(dá)波形蛋白和結(jié)蛋白，p16基因失活。裸鼠皮下移植都能夠形成肉瘤組織，病理類型為軟骨肉瘤和纖維肉瘤，即組織中含有軟骨肉瘤和纖維肉瘤兩種成分；也有的病理類型只是纖維肉瘤，而不含有軟骨肉瘤成分。
實(shí)施例1建立具有纖維肉瘤特性的細(xì)胞株一材料和方法1建系過程流產(chǎn)胚胎，來源于潮州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，8-13周齡，組織的獲取得到病人或家屬的同意。無菌條件下切取胚胎大腿肌肉組織，浸泡于含有雙抗(青霉素100μ/ml、鏈霉素100μg/ml)及兩性霉素B(2μg/ml)的生理鹽水中，用含有雙抗及兩性霉素B的無菌生理鹽水及DMEM培養(yǎng)液各沖洗3遍，剪成0.5-1mm3小組織塊，接種一個(gè)24孔或12孔培養(yǎng)板中。將小組織塊貼附于培養(yǎng)板底部，加入少量含DMEM/10％血清的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入37℃、含5％CO2及一定濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10小時(shí)后加入足量的培養(yǎng)基，使肌肉組織塊浸泡于培養(yǎng)液中。第二天少量補(bǔ)液，每天觀察細(xì)胞生長情況。以后每2天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)第1-7天，可見貼壁組織塊周圍有細(xì)胞爬出，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，貼壁的細(xì)胞不斷增多，細(xì)胞集落明顯增大，待細(xì)胞生長融合時(shí)，將培養(yǎng)板中的細(xì)胞0.25％胰酶-0.02％EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)消化細(xì)胞5分鐘，收集細(xì)胞，離心1000rpm，5分鐘，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶中持續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長至融合時(shí)，將其消化、離心、傳代培養(yǎng)，細(xì)胞重新貼壁生長；細(xì)胞以后連續(xù)傳代，以后每1-2天傳代1次。
2.細(xì)胞系的維持、凍存與復(fù)蘇 取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25％胰酶-0.02％EDTA消化細(xì)胞5min，收集細(xì)胞，離心1000rpm，5min，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，1瓶細(xì)胞分種2-3瓶，同時(shí)凍存適量細(xì)胞，凍存液為培養(yǎng)液，含有10％-20％二甲基亞砜(DMSO)，放入液氮罐中或超低溫冰箱中永久保存。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，將盛有細(xì)胞的冷凍管從液氮或超低溫冰箱中取出，37℃水浴，使細(xì)胞融化、離心、棄上清，將預(yù)溫至37℃、含有10％血清的培養(yǎng)液加入離心管中重懸細(xì)胞，置于37℃、5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3單克隆株的獲得取傳代過程穩(wěn)定生長的細(xì)胞，0.25％胰酶/0.02％EDTA消化細(xì)胞5min，收集細(xì)胞，離心1000rpm，5min，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，采用有限稀釋法將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，挑選單個(gè)細(xì)胞孔，待單個(gè)細(xì)胞增殖至1-2×103個(gè)，以0.25％胰酶/0.02％EDTA消化細(xì)胞5min，收集細(xì)胞直接接種于培養(yǎng)瓶，以獲得單克隆細(xì)胞株，單克隆細(xì)胞株以英文字母加以標(biāo)識(shí)。
4.形態(tài)學(xué)觀察和免疫細(xì)胞化學(xué)將細(xì)胞接種于放有蓋玻片的小平皿中，長成單層，經(jīng)PBS洗滌后，用4％多聚甲醛固定，做常規(guī)HE染色及免疫組化染色。免疫細(xì)胞化學(xué)檢查波形蛋白、PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)、α-SMA(α-平滑肌肌動(dòng)蛋白)、鐵蛋白(ferritin)、p16等在細(xì)胞中的表達(dá)。
5.染色體分析取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入終濃度為0.04μg/ml的秋水仙素，5％CO2、37℃孵育2h，吸出培養(yǎng)液，用0.25％胰酶消化細(xì)胞，離心1500rpm，8min，棄上清，加入0.075M KCl，37℃水浴20min，離心棄上清，加入新鮮配制的固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)，室溫固定10min，離心后棄上清，重復(fù)固定一次，滴片，室溫干燥，進(jìn)行Gimsa染色，進(jìn)行核型分析。
6.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)BALB/C nu/nu裸鼠，雌雄兼具，6-10周齡，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件恒溫26±1℃，恒濕50％-70％；飲水、飼料、墊料及籠具均經(jīng)高壓滅菌，并在無菌操作下定期更換。取對數(shù)生長期單克隆細(xì)胞株制備成細(xì)胞懸液接種裸鼠皮下，接種量1×106-2×106細(xì)胞/只，觀察成瘤率、腫瘤潛伏期。皮下接種的裸鼠在當(dāng)腫瘤接種1-3個(gè)月，照相后處死。取出腫塊作病理組織學(xué)檢查。所有裸鼠對全身重要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查，注意有無局部淋巴結(jié)及全身轉(zhuǎn)移。
二、結(jié)果1.形態(tài)學(xué)觀察胎兒骨骼來源的細(xì)胞原代培養(yǎng)1-7天，可見組織塊周圍有成纖維樣細(xì)胞生長，細(xì)胞呈梭形，中有圓形或橢圓形核；細(xì)胞大小形態(tài)均勻一致。10-15d后細(xì)胞融合成片，原代培養(yǎng)的細(xì)胞70％-80％為成肌細(xì)胞，表達(dá)結(jié)蛋白，但不表達(dá)肌球蛋白。細(xì)胞融合面積達(dá)80％予傳代，傳至4-5代左右大部分細(xì)胞停止增殖，相繼衰老死亡(體外培養(yǎng)約3-8個(gè)月)。也有少部分細(xì)胞在體外培養(yǎng)3-8個(gè)月左右細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，增殖速度明顯加快，細(xì)胞呈單層貼壁生長，無明顯接觸抑制，核分裂相多見。細(xì)胞能夠在體外長期傳代培養(yǎng)，目前已經(jīng)獲得6個(gè)細(xì)胞系(來源于5個(gè)胚胎)，最長的細(xì)胞體外培養(yǎng)超過兩年，細(xì)胞已經(jīng)獲得不死性。在相差顯微鏡下，細(xì)胞為成纖維細(xì)胞形態(tài)，梭形，可重疊生長。細(xì)胞可以凍存和復(fù)蘇。
2單克隆株的獲得獲得了不同遺傳背景的單克隆細(xì)胞株35個(gè)。
3.單克隆細(xì)胞株裸鼠皮下移植裸鼠購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(Balb/C)，單克隆細(xì)胞株皮下接種裸鼠(8-12周)，成瘤率為100％，腫瘤形成潛伏期為14-40天(平均20天左右)；當(dāng)皮下移植瘤直徑達(dá)1cm時(shí)，將裸鼠處死，取下腫瘤。從大體形態(tài)上觀察，表面有豐富的血管，切面白色，質(zhì)脆，中心區(qū)有壞死組織。病理組織學(xué)證實(shí)，細(xì)胞接種裸鼠后形成腫瘤的瘤細(xì)胞排列成束狀，縱橫交織，也可呈旋渦狀。腫瘤浸潤至周圍的脂肪、皮膚、肌肉和神經(jīng)組織；對肌肉組織的侵襲主要沿著肌間隙進(jìn)行，反應(yīng)了腫瘤的低度惡性(附圖1)。細(xì)胞高度分化，偶見病理性核分裂。皮下移植鼠未見全身重要臟器及局部淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移。在大部分的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了軟骨樣結(jié)構(gòu)，軟骨樣結(jié)構(gòu)與軟骨肉瘤的病理表現(xiàn)基本一致，軟骨細(xì)胞具有異型性；我們也獲得了幾個(gè)細(xì)胞株皮下移植得到的腫瘤成分只有纖維肉瘤，而無軟骨肉瘤成分，如MS0504-N，MS0504-M等(附圖2)。
2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色MS0504-N和MS0504-M表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)(附圖3)；p16、CD31、CD34、HLA-DR等在細(xì)胞中無表達(dá)。MS0504-N和MS0504-M細(xì)胞表達(dá)中胚層的標(biāo)志物波形蛋白(圖4)和肌肉細(xì)胞的標(biāo)志物結(jié)蛋白(圖5)和Actin(圖6)；部分細(xì)胞表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(圖7)，證明了細(xì)胞具有肌纖維母細(xì)胞的表型特征。部分細(xì)胞表達(dá)鐵蛋白(ferritin)(圖8)和血管內(nèi)皮生長因子-c(VEGF-c)(圖9)；透射電鏡下細(xì)胞的特征結(jié)構(gòu)是細(xì)胞漿中可見較多脂滴(附圖10)，從圖10中可見細(xì)胞大小均勻，呈圓形，表面可見微絨毛結(jié)構(gòu)，核呈圓形或不規(guī)則形狀，胞質(zhì)內(nèi)可見較多脂滴樣結(jié)構(gòu)。
3.核型分析結(jié)果分析分裂中期細(xì)胞，細(xì)胞染色體數(shù)目明顯異常，為非整倍體，染色體可見雙著絲粒、環(huán)狀染色體、易位等結(jié)構(gòu)異常(附圖11)。
實(shí)施例2建立中胚葉腎瘤動(dòng)物模型MS0504-N細(xì)胞接種裸鼠腎包膜下(具體方法與例1相同，只是細(xì)胞種植的部位為腎包膜下)，皮下接種的裸鼠在當(dāng)腫瘤接種1-2個(gè)月時(shí)，裸鼠背部能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長(圖12)，取出腫塊作病理組織學(xué)檢查。所有裸鼠對全身重要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查，注意有無局部淋巴結(jié)及全身轉(zhuǎn)移。腎包膜下種植成瘤率為100％，取下腫瘤和腎臟組織，以及肝臟、肺和心臟組織。從大體形態(tài)上觀察，腫瘤為單發(fā)或多發(fā)，實(shí)性，有的腫瘤腎包膜較完整，腫瘤也可以浸潤到腎外組織，腹膜后和皮下也能見到腫瘤組織(附圖13)。腫瘤切面灰白色，質(zhì)脆，中心無明顯壞死液化。病理組織學(xué)檢查證明腫瘤組織的形態(tài)與皮下移植基本相同，為纖維肉瘤成分，細(xì)胞高度分化，低度惡性(圖14)。腫瘤組織結(jié)構(gòu)和正常的腎組織結(jié)構(gòu)鏡下較為清楚，腫瘤組織浸潤到正常的腎組織中，可見腫瘤組織中變性的腎小球和殘余的腎小管(附圖15，16)。免疫組織化學(xué)證明腫瘤細(xì)胞表達(dá)中胚層的標(biāo)志物波型蛋白，陽性部位染成棕色，表達(dá)部位在胞漿(附圖17)。特殊染色證明腫瘤組織的纖維為膠原纖維(圖18，19)，圖18中可見腫瘤組織染色為紅色，說明是膠原纖維；圖19中可見腫瘤組織染色為藍(lán)色，說明是膠原纖維。這種病理表現(xiàn)與人類兒童腫瘤中胚葉腎瘤(congenital mesoblastic nephroma，CMN)的病理表現(xiàn)完全相同。
該原位移植模型在組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和分子遺傳學(xué)方面能夠準(zhǔn)確地重現(xiàn)所來源的腫瘤的生物學(xué)和遺傳學(xué)特征，是進(jìn)行兒童實(shí)體瘤體內(nèi)自然增殖、分化和干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究的一個(gè)可靠的工具。該模型腫瘤原位器官生長的自然環(huán)境更確切的模擬腫瘤自然生長過程，是一個(gè)更理想的研究平臺(tái)，具有更好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1一種中胚葉腎瘤動(dòng)物模型的建立方法，包括以下步驟(1)用組織塊培養(yǎng)法或者酶消化法對哺乳動(dòng)物的胚胎肌肉細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；(2)細(xì)胞生長至融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；(3)在體外培養(yǎng)3-8個(gè)月后，培養(yǎng)物中出現(xiàn)增殖旺盛的克隆細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)獲得不死性，部分細(xì)胞已經(jīng)惡性轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞，即得到永生化的腫瘤細(xì)胞系；(4)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后經(jīng)過多次傳代，應(yīng)用單克隆培養(yǎng)法獲得單克隆的細(xì)胞株；(5)將單克隆的細(xì)胞株裸鼠皮下移植，獲得病理表現(xiàn)為纖維肉瘤的單克隆細(xì)胞株；(6)采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法或者分子生物學(xué)的方法對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定；(7)獲得的纖維肉瘤細(xì)胞株裸鼠腎包膜下移植，得到中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中胚葉腎瘤動(dòng)物模型的建立方法，其特征是，胚胎肌肉細(xì)胞來源于人類的胚胎的肌肉組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中胚葉腎瘤動(dòng)物模型的建立方法，其特征是，所述人類胚胎組織的胎齡為從孕期7周到出生，胚胎的體長4cm以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的中胚葉腎瘤動(dòng)物模型的建立方法，其特征是，所述纖維肉瘤為嬰幼兒纖維肉瘤。
5.一種中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型，其特征是，是由權(quán)利要求1-4任一所述的建立方法得到的中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型，其中肉瘤細(xì)胞系的超微結(jié)構(gòu)特征是胞漿中含有脂滴；表達(dá)波形蛋白和結(jié)蛋白，不表達(dá)p16，肉瘤細(xì)胞系在裸鼠腎包膜下分裂增殖而獲得與人類中胚葉腎瘤病理表現(xiàn)相同的動(dòng)物模型。
6.如權(quán)利要求5所述的中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型在抗嬰幼兒纖維肉瘤和中胚葉腎瘤的藥物篩選中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中胚葉腎瘤動(dòng)物模型的建立方法對哺乳動(dòng)物的胚胎肌肉細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；細(xì)胞生長致融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；在體外培養(yǎng)3－8個(gè)月后，培養(yǎng)物中出現(xiàn)增殖旺盛的克隆細(xì)胞，得到永生化的腫瘤細(xì)胞系；細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后經(jīng)過多次傳代，應(yīng)用單克隆培養(yǎng)法獲得單克隆的細(xì)胞株；將單克隆的細(xì)胞株裸鼠皮下移植，獲得病理表現(xiàn)為纖維肉瘤的單克隆細(xì)胞株；采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法或者分子生物學(xué)的方法對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定；獲得的纖維肉瘤細(xì)胞株裸鼠腎包膜下移植，得到中胚葉腎瘤的動(dòng)物模型。由該建立方法得到的中胚葉腎瘤動(dòng)物模型為中胚葉腎瘤的發(fā)病機(jī)制和治療研究建立了技術(shù)平臺(tái)。
文檔編號C12N5/06GK101020896SQ20061012437
公開日2007年8月22日 申請日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者楊立業(yè), 陳強(qiáng), 鄭佳坤, 黃天華, 劉桂英, 李文玉, 張松, 溫建成, 黃革 申請人:潮州市中心醫(yī)院