專利名稱：一種豬α干擾素重組腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種豬α干擾素(IFN-α)重組腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
重組腺病毒rAdCMV-IFN-α在分類上屬于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳動(dòng)物腺病毒屬(Mastadenovirus)，人腺病毒種(Human adenovirus)，該重組腺病毒可以對(duì)目的蛋白進(jìn)行有效的表達(dá)，用該重組腺病毒感染動(dòng)物后不出現(xiàn)臨床癥狀，因此可以用來(lái)表達(dá)抗原蛋白。重組腺病毒基因工程技術(shù)在人類的基因治療方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，很多應(yīng)用于人類基因治療的重組腺病毒已經(jīng)進(jìn)入臨床三期階段。因?yàn)橹亟M腺病毒具有感染的宿主范圍大，能感染分裂和不分裂的細(xì)胞；可以表達(dá)人源和非人源蛋白，而且不會(huì)整合到宿主基因組內(nèi)，不會(huì)引起基因插入突變，可以復(fù)制得到高滴度等特點(diǎn)。豬α干擾素具有廣譜、高效抗病毒、腫瘤的作用，及其對(duì)免疫系統(tǒng)起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，豬α干擾素對(duì)入侵病毒的非特異性抑制功能，對(duì)許多重大傳染病致病病毒具有效的防御功能?；蚬こ特iα干擾素與血源性干擾素相比，具有沒(méi)有污染、安全性高、純度高、比活性高、成本低、療效確切等優(yōu)點(diǎn)。目前還沒(méi)有構(gòu)建成豬α干擾素重組腺病毒的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種豬α干擾素(IFN-α)重組腺病毒。該重組腺病毒能夠有效控制豬的各種病毒性疾病的感染，對(duì)外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定，且其效價(jià)穩(wěn)定。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述豬α干擾素(IFN-α)重組腺病毒的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述豬α干擾素(IFN-α)重組腺病毒在制備抗病毒感染疫苗中的應(yīng)用。該疫苗可有效預(yù)防和治療由各種病毒引起的豬的多種疾病，提高豬對(duì)病毒感染的抵抗力，使豬的整齊度大大提高。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種豬α干擾素重組腺病毒的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)豬α干擾素基因的擴(kuò)增、克隆根據(jù)GenBank豬IFN-α1基因序列(登錄號(hào)X57191)及相關(guān)假基因序列(登錄號(hào)AF350425)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中引物P1、引物P2擴(kuò)增基因前半段即F片段，引物P3、引物P4擴(kuò)增后半段即B片段；F片段與B片段兩段基因間有37bp的重復(fù)序列，可以滿足剪接重疊延伸PCR(splice overlap extensionPCR，SOE-PCR)的需要；引物P2、引物P3位于該基因內(nèi)部變異集中區(qū)，各自3’端堿基只特異地與豬IFN-α基因互補(bǔ)，而與假基因存在差異；在引物P1中引入了Nde I酶切位點(diǎn)，引物P4中引入了EcoR I酶切位點(diǎn)，在引物的5’端分別含限制性內(nèi)切酶酶位點(diǎn)。所述引物序列如下P15’-CTC ATA TGT GTG ACC TGC CTC AGA-3’；P25’-TTG CCC CCAAAA GCC TCA-3’；P35’-GGA CTT TGG ATC CCC TCA TG-3’；P45’CAG AAT TCA GAA TGG GCT TGT TAG-3’；提取豬肝組織中的DNA作模板，擴(kuò)增豬α干擾素(IFN-α)基因，PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，將獲得的重組質(zhì)粒命名為pMD-IFN-α，提取重組質(zhì)粒pMD-IFN-α進(jìn)行酶切、測(cè)序鑒定。
(2)含有IFN-α基因的重組穿梭載體的構(gòu)建用核酸限制性內(nèi)切酶KpnI和核酸限制性內(nèi)切酶HindIII將重組質(zhì)粒pMD-IFN-α中的豬α干擾素(IFN-α)基因片段切出純化后，克隆入腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV載體的KpnI和HindIII兩酶切位點(diǎn)間，獲得含有IFN-α基因的重組穿梭載體pAdTrack-CMV-IFN-α。
(3)重組腺病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建將重組穿梭載體pAdTrack-CMV-IFN-α、腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV用核酸限制性內(nèi)切酶Pme I線性化后轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架載體Adeasier-1的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，在大腸桿菌重組酶的作用下，在穿梭載體和骨架載體之間發(fā)生同源重組，將外源基因轉(zhuǎn)入腺病毒骨架載體，經(jīng)卡那霉素和酶切鑒定篩選獲得了含有外源基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAdCMV-IFN-α。
(4)重組腺病毒的獲得將重組腺病毒質(zhì)粒pAdCMV-IFN-α用核酸限制性內(nèi)切酶Pac I酶切線性化后，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝成重組腺病毒rAdCMV-IFN-α。
所述擴(kuò)增豬α干擾素(IFN-α)基因按下述方法進(jìn)行先分別將F片段、B片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行SOE反應(yīng)；F片段引物為P1、P2，B片段引物為P3、P4。
所述PCR反應(yīng)條件為開(kāi)始94℃預(yù)變性5min，然后以94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；所述SOE反應(yīng)條件為開(kāi)始94℃預(yù)變性5min，然后以94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
所述含腺病毒骨架載體Adeasier-1的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞的制備方法如下將腺病毒骨架載體質(zhì)粒pAdeasy-1用電轉(zhuǎn)化于大腸桿菌菌株BJ5183，用LB培養(yǎng)基平板篩選，挑取單克隆，提取腺病毒骨架載體pAdeasy-1，HindIII酶切鑒定，獲得轉(zhuǎn)化的含質(zhì)粒pAdeasy-1的BJ5183菌，然后將其制成感受態(tài)細(xì)胞。
本發(fā)明的豬α干擾素重組腺病毒就是通過(guò)上述構(gòu)建方法構(gòu)建而成的。
上述豬α干擾素重組腺病毒在制備抗病毒感染疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果1、本發(fā)明構(gòu)建的豬α干擾素重組腺病毒對(duì)外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定，且其效價(jià)穩(wěn)定，種毒的毒穩(wěn)定在104.56TCID50/1.0ml。通過(guò)小鼠免疫試驗(yàn)和中和試驗(yàn)表明了該重組腺病毒產(chǎn)生了針對(duì)豬α干擾素的抗體，其效價(jià)為1∶64。
2、本發(fā)明首次應(yīng)用重組腺病毒載體構(gòu)建豬α干擾素重組腺病毒，該重組腺病毒突破了常規(guī)病毒疫苗的局限性。該重組疫苗使豬α干擾素獲得了提前表達(dá)，使豬提前獲得了抵抗病毒感染的能力。由于該重組腺病毒疫苗采用人腺病毒中的血清5型載體，對(duì)人、豬等動(dòng)物沒(méi)有致病性。
3、與現(xiàn)有的疫苗相比，該重組腺病毒能在體內(nèi)有限生長(zhǎng)并且不斷表達(dá)IFN-α蛋白，表達(dá)的IFN-α具有廣譜的抗病毒作用，通過(guò)抑制病毒的吸附、脫衣殼和最初的病毒核酸轉(zhuǎn)錄、病毒蛋白合成以及成熟病毒的釋放等病毒感染過(guò)程的各環(huán)節(jié)，起到抑制病毒復(fù)制的效果。
4、該重組腺病毒疫苗可以有效預(yù)防由病毒引起的豬的多種疾病，預(yù)防公豬的精液質(zhì)量差，母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊及產(chǎn)仔數(shù)少，有效率可以達(dá)到90％，預(yù)防病毒感染的有效率可以達(dá)到98％以上，預(yù)防中大豬的呼吸道問(wèn)題和生長(zhǎng)緩慢問(wèn)題有效率達(dá)95％，可以提高豬的出欄時(shí)間達(dá)7～10天，使豬的整齊度大大提高。


圖1為重組豬α干擾素腺病毒的生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1如圖1所示，為重組豬α干擾素腺病毒的生產(chǎn)工藝流程圖。
一、豬α干擾素重組腺病毒質(zhì)粒(pAdCMV-IFN-α)的構(gòu)建(1)引物根據(jù)GenBank豬α干擾素IFN-α1基因序列(登錄號(hào)X57191)及相關(guān)假基因序列(登錄號(hào)AF350425)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中引物P1、引物P2擴(kuò)增基因前半段(F片段)，引物P3、引物P4擴(kuò)增后半段(B片段)。F片段與B片段兩段基因間有37bp的重復(fù)序列，可以滿足剪接重疊延伸PCR(splice overlapextension PCR，SOE-PCR)的需要。引物P2、引物P3位于該基因內(nèi)部變異集中區(qū)，各自3’端堿基只特異地與豬IFN-α基因互補(bǔ)，而與假基因存在差異。在引物P1中引入了Nde I酶切位點(diǎn)，引物P4中引入了EcoR I酶切位點(diǎn)，引物序列如下P15’-CTC ATA TGT GTG ACC TGC CTC AGA-3’；P25’-TTG CCC CCA AAA GCC TCA-3’；P35’-GGA CTT TGG ATC CCC TCA TG-3’；P45’CAG AAT TCA GAA TGG GCT TGT TAG-3’。
在引物的5’端分別含限制性內(nèi)切酶酶位點(diǎn)。引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
(2)豬α干擾素IFN-α基因的克隆提取豬肝組織DNA作模板，擴(kuò)增豬α干擾素IFN-α基因，擴(kuò)增豬α干擾素(IFN-α)基因分F片段、B片段擴(kuò)增。F片段引物為P1、P2，B片段引物為P3、P4，分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為開(kāi)始94℃預(yù)變性5min，然后以94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；然后進(jìn)行SOE反應(yīng)，反應(yīng)條件為開(kāi)始94℃預(yù)變性5min，然后以94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用試劑盒回收與pMD18-T載體進(jìn)行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測(cè)序篩選出重組質(zhì)粒命名為pMD-IFN-α。
(3)含有IFN-α基因的重組穿梭載體的構(gòu)建用核酸限制性內(nèi)切酶SalI、XbaI作雙酶切將重組質(zhì)粒pMD-IFN-α中豬α干擾素IFN-α基因片段切出純化后，克隆入腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV載體的SalI和XbaI兩酶切位點(diǎn)間，挑取Kan(卡那霉素)抗性的單菌落培養(yǎng)，提取其中的質(zhì)粒后，用SalI和XbaI雙酶切鑒定重組穿梭載體質(zhì)粒(pAdTrack-CMV-IFN-α)，然后測(cè)序(測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表1)證實(shí)，將獲得的重組腺病毒穿梭載體命名為pAdTrack-CMV-IFN-α。
表1豬α干擾素基因序列ATGTGTGACCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGCTCACACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACAAATGAGGAGAATCTCTCCCTTCTCCTGCCTGGACCACAGAAGGGACTTTGGATCCCCTCATGAGGCTCTTGGGGGCAACCAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCATGGCTCTGGTGCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTCCAGCTCTTCAGCACAGAGGGCTCGGCTGCTCCCTGGGATGAGAGCCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGCAGCTCAGGGACCTGGAAGCCTGTGTCATGCAGGAGGCGGCGCTGGAAGGGACCCCCCTGCTGGAGGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACCCTCTATCTGCAAGAGAAGAGCTACAGCCCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCAGAAGTCATGAGATCCTTCTCTTCCTCCAGAAACCTGCAAGACAGACTCAGGAAGAAGGAGTGACAGACACCTGGTTCATCATAGAAATGCTTCTTACAGACTAACAAGCCCATTCTGA(4)含Adeasier-1的大腸桿菌E.Coli的制備將腺病毒骨架載體pAdeasy-1用電轉(zhuǎn)化于大腸桿菌菌株BJ5183菌，用氨芐青霉素(100μg/mL)和鏈霉素(25μg/mL)的LB培養(yǎng)基平板篩選，挑取單菌落培養(yǎng)，提取腺病毒骨架載體pAdeasy-1，HindIII酶切鑒定，獲得轉(zhuǎn)化成功的含腺病毒骨架載體Adeasier-1的大腸桿菌BJ5183菌，然后將其制成感受態(tài)細(xì)胞備用。
(5)重組腺病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建將pAdTrack-CMV-IFN-α，pAdTrack-CMV用核酸限制性內(nèi)切酶Pme I線性化后轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架載體Adeasier-1的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，在大腸桿菌重組酶的作用下，在穿梭載體和骨架載體之間發(fā)生同源重組，把外源基因轉(zhuǎn)入腺病毒骨架載體，經(jīng)卡那霉素和酶切鑒定篩選獲得了含有外源基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAdCMV-IFN-α。同源重組后的腺病毒質(zhì)粒用核酸限制性內(nèi)切酶Pac I酶切得到一條大小為4.5kb小片段和一條大小約為30kb的大片段，表明含有外源基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAdCMV-IFN-α構(gòu)建成功。
二、重組腺病毒rAdCMV-IFN-α的包裝及免疫實(shí)驗(yàn)1、293細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)與凍存(1)將凍存的293細(xì)胞株迅速放入37℃水浴中1～2min，使之快速融化；(2)轉(zhuǎn)入10mL離心管中，加入5mL含10％(v/v)(按體積比計(jì))小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打使293細(xì)胞團(tuán)塊分散后，2500rpm離心3min；(3)棄上清，加入5mL含10％(v/v)小牛血清的DMEM，輕輕吹打混勻后，轉(zhuǎn)入25mL培養(yǎng)瓶，置37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(4)18～24h后在倒置顯微鏡下觀察，如見(jiàn)細(xì)胞貼壁，表明復(fù)蘇成功，并予常規(guī)更換培養(yǎng)液一次；(5)每天在倒置顯微鏡下觀察293細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3天傳代一次；(6)把健康生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期的293細(xì)胞完全消化下來(lái)，離心，沉淀293細(xì)胞，用盡少量10％(v/v)血清的DMEM重懸細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行記數(shù)；(7)用含5％(v/v)血清的DMEM+10％(v/v)DMSO(二甲基亞砜)+40％(v/v)新生牛血清使每毫升細(xì)胞密度達(dá)到1×106個(gè)，在1.8mL的凍存管分裝1.0mL的293細(xì)胞，把凍存管放在泡沫盒內(nèi)置低溫冰箱24h，24h后迅速把低溫冰箱的293細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中。
2、豬α干擾素重組腺病毒的獲得與鑒定、重組腺病毒表達(dá)IFN-α基因的鑒定將重組腺病毒質(zhì)粒pAdCMV-IFN-α用Pac I酶切線性化后，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝成重組腺病毒粒子rAdCMV-IFN-α和AdCMV(不含豬IFN-α基因的重組腺病毒粒子)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)生明顯病變。將有病變的細(xì)胞直接放在熒光顯微鏡下，可觀察到大量呈粗顆粒狀或團(tuán)塊狀的綠色熒光的細(xì)胞，重組病毒液用P1、P4為引物作PCR鑒定，擴(kuò)增出了約570bp的片段，未轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞和AdCMV細(xì)胞培養(yǎng)液結(jié)果為陰性，與預(yù)期結(jié)果相符。將感染rAdCMV-IFN-α的293細(xì)胞離心收集細(xì)胞，加入2×SDS(十二烷基硫酸鈉)上樣緩沖液，煮沸5min，用12％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。同時(shí)以不含IFN-α基因感染AdCMV的293細(xì)胞系做對(duì)照。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明重組腺病毒在293細(xì)胞系中表達(dá)出一條分子量大小約為21kD的蛋白條帶，大小與預(yù)期的蛋白質(zhì)分子量一致。這一條蛋白帶為豬α干擾素(IFN-α)基因表達(dá)的產(chǎn)物。進(jìn)一步從分子水平上表明表達(dá)的重組蛋白能被α干擾素抗血清所識(shí)別，具有良好的抗原性。
3、豬α干擾素重組腺病毒的噬斑純化在6孔細(xì)胞板的每一個(gè)孔接種3.0×105個(gè)293細(xì)胞，5％(v/v)的二氧化碳溫箱中靜止培養(yǎng)；待細(xì)胞完全長(zhǎng)成單層后，把重組病毒液原液按6孔板所加營(yíng)養(yǎng)液量的1/5體積(600μl)接種重組腺病毒，37℃吸附1.5h；加入2.0mL 2％(v/v)新生牛血清的DMEM2.0h；完全棄去上清，用37℃預(yù)熱的無(wú)菌PBS洗滌兩次；高壓后的2％(v/v)瓊脂糖放在50℃水浴鍋中；含1％(v/v)青霉素、1％(v/v)鏈霉素和4％(v/v)血清的2×DMEM預(yù)熱到37℃；在一無(wú)菌的100.0mL的玻璃瓶中加入10.0mL的2×DMEM和10.0mL的2％(v/v)瓊脂糖，充分混勻后置37℃水浴鍋中；按6孔板的每一孔加3.0mL覆蓋瓊脂，鋪板，觀察噬斑；用滅菌槍頭挑取包含噬斑的瓊脂糖塊放入無(wú)菌離心管中，加入200.0μL的無(wú)菌PBS，將瓊脂塊搗碎后，反復(fù)凍融三次；12000rpm離心5min；收獲的重組腺病毒接種于一新的24孔細(xì)胞板中。
4、豬α干擾素重組腺病毒的TCID50的測(cè)定按病毒學(xué)操作手冊(cè)介紹之方法，用含2％(v/v)血清、1％(v/v)青霉素和1％(v/v)鏈霉素的維持液將重組腺病毒作10倍梯度稀釋。然后分別接種于長(zhǎng)滿293細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，每孔接種100μL。同時(shí)設(shè)定兩排孔用含2％(v/v)血清、1％(v/v)青霉素和1％(v/v)鏈霉素的維持液作對(duì)照。37℃，5％的CO2溫箱培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變。并按Reed-Mucch法計(jì)算病毒TCID50。效價(jià)值為104.56TCID50/1.0mL。
5、豬α干擾素重組腺病毒的小白鼠免疫試驗(yàn)取20只8周齡健康清潔級(jí)小白鼠隨機(jī)分成4組，每組5只，一組設(shè)定為對(duì)照，其余3組分別采取口服、皮下和肌肉注射3種免疫方式。免疫劑量為104TCID50/0.2mL，免疫間隔時(shí)間2周，連續(xù)免疫4次后，采集小白鼠血清做病毒中和試驗(yàn)，3種免疫方式的中和抗體效價(jià)差異不顯著，中和抗體效價(jià)為1∶64。
6、豬α干擾素重組腺病毒的穩(wěn)定性試驗(yàn)將重組腺病毒rAdCMV-IFN-α在293細(xì)胞上連續(xù)傳代30代，每5代分別檢測(cè)rAdCMV-IFN-α中IFN-α蛋白的表達(dá)，同時(shí)測(cè)定其組織細(xì)胞半數(shù)感染量。結(jié)果表明，IFN-A蛋白在重組腺病毒rAdCMV-IFN-α連續(xù)傳代過(guò)程中表達(dá)穩(wěn)定，其組織細(xì)胞半數(shù)感染量也未發(fā)生變化。
綜上所述，將純化的重組腺病毒rAdCMV-IFN-α在293細(xì)胞上連續(xù)傳代30次，每5代檢查重組腺病毒對(duì)IFN-α蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)測(cè)定其TCID50。結(jié)果證明，重組腺病毒對(duì)IFN-α蛋白表達(dá)穩(wěn)定，而且組織細(xì)胞半數(shù)感染量穩(wěn)定，接毒后細(xì)胞出現(xiàn)病變明顯。種毒的毒價(jià)穩(wěn)定在104.56TCID50/1.0mL。
實(shí)施例2豬α干擾素(IFN-α)重組腺病毒疫苗的制備將純化的豬α干擾素重組腺病毒在293細(xì)胞上連續(xù)傳代30次，檢測(cè)其豬α干擾素的表達(dá)情況，證明豬α干擾素表達(dá)穩(wěn)定，重組腺病毒的毒價(jià)穩(wěn)定在104.56TCID50/1.0mL。
在擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中取用純化保存的豬α干擾素重組腺病毒按104TCID50接種長(zhǎng)成單層293細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)70～90％時(shí)收毒，經(jīng)反復(fù)凍融一次即可獲得豬α干擾素重組腺病毒疫苗。
實(shí)施例3豬α干擾素重組腺病毒作為疫苗免疫豬該含有豬α干擾素(IFN-α)基因的重組腺病毒經(jīng)過(guò)人工培養(yǎng)后毒價(jià)達(dá)到104.56TCID50/1.0mL，經(jīng)過(guò)冷凍真空干燥，作為疫苗使用，對(duì)豬的多種疾病有較好的有預(yù)防效果。使用方法是母豬和公豬每年免疫3次，每次4～6毫升；小豬在7～10天肌肉注射1～3毫升，10天后再肌肉注射1～3毫升；中豬的大豬可以再加強(qiáng)免疫一次，每次肌肉注射3～6毫升?？梢杂行ьA(yù)防由PCV2引起的豬的多種疾病，預(yù)防公豬的精液質(zhì)量差，母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊及產(chǎn)仔數(shù)少，有效率可以達(dá)到90％，預(yù)防豬的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)有效率可以達(dá)到98％以上，預(yù)防豬的皮炎腎炎綜合征有效率可以達(dá)到95％以上，預(yù)防中大豬的呼吸道問(wèn)題和生長(zhǎng)緩慢問(wèn)題有效率達(dá)95％，可以提高豬的出欄時(shí)間達(dá)7～10天，使豬的整齊度大大提高。
如上所述，可較好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
SEQUENCE LISTING<110>廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所<120>一種豬α干擾素重組腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用<130>12<160>4<170>patentIn version 3.2<210>1<211>24<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據(jù)GenBank中豬α干擾素IFN-α1基因序列(登錄號(hào)X57191)及相關(guān)假基因序列(登錄號(hào)AF350425)設(shè)計(jì)引物P1<400>1ctcatatgtg tgacctgcct caga24<210>2<211>18<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據(jù)GenBank中豬α干擾素IFN-α1基因序列(登錄號(hào)x57191)及相關(guān)假基因序列(登錄號(hào)AF350425)設(shè)計(jì)引物P2<400>2ttgcccccaa aagcctca 18<210>3<211>20<212>DNA
<213>Artificial sequence<220>
<223>根據(jù)GenBank中豬α干擾素IFN-α1基因序列(登錄號(hào)X57191)及相關(guān)假基因序列(登錄號(hào)AF350425)設(shè)計(jì)引物P3<400>3ggactttgga tcccctcatg20<210>4<211>24<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據(jù)GenBank中豬α干擾素IFN-α1基因序列(登錄號(hào)X57191)及相關(guān)假基因序列(登錄號(hào)AF350425)設(shè)計(jì)引物P4<400>4cagaattcag aatgggcttg ttag 2權(quán)利要求
1.一種豬α干擾素重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟如下(1)豬α干擾素基因的擴(kuò)增、克隆根據(jù)GenBank豬IFN-α1基因序列及相關(guān)假基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中引物P1、引物P2擴(kuò)增基因前半段F片段，引物P3、引物P4擴(kuò)增后半段B片段；兩段基因間有37bp的重復(fù)序列；在引物P1中引入了Nde I酶切位點(diǎn)，引物P4中引入了EcoR I酶切位點(diǎn)，在引物的5’端分別含限制性內(nèi)切酶酶位點(diǎn)；所述引物序列如下P15’-CTC ATA TGT GTG ACC TGC CTC AGA-3’；P25’-TTG CCC CCA AAA GCC TCA-3’；P35’-GGA CTT TGG ATC CCC TCA TG-3’；P45’-CAG AAT TCA GAA TGG GCT TGT TAG-3’；提取豬肝組織的DNA作模板，擴(kuò)增豬α干擾素基因，PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒pMD-IFN-α進(jìn)行酶切、測(cè)序鑒定；(2)含有IFN-α基因的重組穿梭載體的構(gòu)建用核酸限制性內(nèi)切酶Sal I和核酸限制性內(nèi)切酶Xba I將重組質(zhì)粒pMD-IFN-α中的豬α干擾素基因片段切出純化后，克隆入腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV載體的核酸限制性內(nèi)切酶Sal I和Xba I兩酶切位點(diǎn)間，獲得含有IFN-α基因的重組穿梭載體pAdTrack-CMV-IFN-α；(3)重組腺病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建將重組穿梭載體pAdTrack-CMV-IFN-α、腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV用核酸限制性內(nèi)切酶Pme I線性化后轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架載體Adeasier-1的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，在大腸桿菌重組酶的作用下，在穿梭載體和骨架載體之間發(fā)生同源重組，將外源基因轉(zhuǎn)入腺病毒骨架載體，經(jīng)卡那霉素和酶切鑒定篩選獲得了含有外源基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAdCMV-IFN-α；(4)重組腺病毒的獲得將重組腺病毒質(zhì)粒pAdCMV-IFN-α用核酸限制性內(nèi)切酶Pac I酶切線性化后，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝成重組腺病毒rAdCMV-IFN-α。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬α干擾素重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述擴(kuò)增豬α干擾素基因按下述方法進(jìn)行先分別將F片段、B片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行SOE反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種豬α干擾素重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為開(kāi)始94℃預(yù)變性5min，然后以94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；所述SOE反應(yīng)條件為開(kāi)始94℃預(yù)變性5min，然后以94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬α干擾素重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述含腺病毒骨架載體Adeasier-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞的制備方法如下將腺病毒骨架載體pAdeasy-1用電轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BJ5183，用LB培養(yǎng)基平板篩選，挑取克隆，提取質(zhì)粒，HindIII酶切鑒定，獲得轉(zhuǎn)化的腺病毒骨架載體pAdeasy-1菌，將其制成含腺病毒骨架載體Adeasier-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞。
5.一種豬α干擾素重組腺病毒就是通過(guò)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法構(gòu)建而成的。
6.一種權(quán)利要求5所述的豬α干擾素重組腺病毒在制備抗病毒感染疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬α干擾素重組腺病毒及其構(gòu)建方法，其構(gòu)建方法步驟如下豬α干擾素IFN－α基因的擴(kuò)增、克?。缓蠭FN－α基因的重組穿梭載體的構(gòu)建；重組腺病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建；重組腺病毒的獲得。本發(fā)明還公開(kāi)了豬α干擾素重組腺病毒在制備抗病毒疫苗中的應(yīng)用。該重組腺病毒能在體內(nèi)有限生長(zhǎng)并且不斷表達(dá)IFN－α蛋白，使豬具有持久的抗病毒感染的保護(hù)力，在病毒的防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/19GK1970774SQ20061012419
公開(kāi)日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者宋長(zhǎng)緒, 季芳, 蔣智勇 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所