專(zhuān)利名稱(chēng)：重組畢赤酵母及其表達(dá)ngal蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及NGAL蛋白，特別是涉及重組畢赤酵母及其表達(dá)NGAL蛋白的方法。
背景技術(shù)：
中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL)由Kjeldsen等人于1993年在中性粒細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是一種25kD的糖蛋白。它具有l(wèi)ipocalin家族的典型β-折疊桶結(jié)構(gòu)，與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、趨化作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等過(guò)程密切相關(guān)。NGAL可參與細(xì)胞分化且作為一種存活因子抑制細(xì)胞凋亡；在人類(lèi)腫瘤中如肺腺癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌中可見(jiàn)NGAL高表達(dá)，并且NGAL蛋白可通過(guò)保護(hù)MMP-9的活性而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。近年來(lái)又研究證明，NGAL作為小分子鐵配合物結(jié)合蛋白直接參與了機(jī)體鐵代謝和天然免疫反應(yīng)等功能(Goetz DH，2002；Yang J，2002)，與腎缺血，腎毒性損傷以及動(dòng)脈粥樣硬化(Forsblad J，2002；Hemdahl AL，2006)等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且作為一種早期標(biāo)志物幫助判定缺血性腎損傷程度(Mishra J，2003；Mishra J，2005)。因此，制備重組NGAL蛋白對(duì)深入研究NGAL的功能及其臨床診斷的應(yīng)用具有重要的意義。
NGAL基因是單拷貝基因，定位于染色體9q34。NGAL基因的全長(zhǎng)5869bp，其中包括1695bp的5′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，178bp的3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)及由七個(gè)外顯子和六個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成的3696bp的原初轉(zhuǎn)錄區(qū)。其cDNA全序列由63bp的5′端非翻譯區(qū)和591bp的編碼區(qū)組成，編碼含197個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，此肽鏈包括178個(gè)氨基酸殘基的成熟肽段和19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列。目前，重組NGAL蛋白主要是通過(guò)大腸桿菌融合表達(dá)并進(jìn)行親和層析純化而獲得(Bundgaard，1994)。該表達(dá)系統(tǒng)存在的主要問(wèn)題是沒(méi)有翻譯后的修飾功能，而人NGAL是糖基化25kD蛋白。因此，用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組NGAL蛋白來(lái)研究人NGAL功能，尚存在明顯缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有原核表達(dá)NGAL蛋白方法上存在的問(wèn)題，提供一種能高效表達(dá)NGAL蛋白的重組畢赤酵母。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述重組畢赤酵母表達(dá)NGAL蛋白的方法。
1、重組畢赤酵母的構(gòu)建與高效轉(zhuǎn)化菌株的篩選(1)根據(jù)基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增NGAL cDNA片段。然后，將擴(kuò)增片段與pPIC9空載體連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9-NGAL，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。采用雙脫氧末端終止法對(duì)pPIC9-NGAL陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序(上?；倒?，并將測(cè)序結(jié)果用BLAST程序與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，確認(rèn)是NGAL編碼區(qū)且無(wú)突變。酶切pPIC9-NGAL質(zhì)粒，使之線性化后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母。
(2)鋪MM與MD平板進(jìn)行篩選，采用菌落PCR鑒定重組克隆。最后，將NGAL重組酵母菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，用已知濃度的原核表達(dá)NGAL蛋白為參照物，通過(guò)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE電泳及western blotting篩選出高效表達(dá)NGAL蛋白的酵母菌株。
2、重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)NGAL與純化(1)將高效NGAL重組菌株在BMGY培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)，使其分泌NGAL蛋白；離心收集發(fā)酵液。
(2)往發(fā)酵液中加入硫酸銨沉淀重組NGAL蛋白；PBS透析除鹽后，陽(yáng)離子交換層析純化，陽(yáng)離子交換層析的固定相為SP-SepharoseFast Flow；線性梯度洗脫A液為25mM PB，pH5.8，B液為1M NaCl；流速為1.5ml/min。洗脫組分經(jīng)超濾柱脫鹽后，分裝，儲(chǔ)存于-80℃。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明通過(guò)PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化與篩選，最終獲得高效表達(dá)NGAL蛋白的重組畢赤酵母菌株。該菌株能將目標(biāo)蛋白分泌到培養(yǎng)基中，可達(dá)＞100mg/L，而且無(wú)雜蛋白。這使得接續(xù)下來(lái)的純化工藝變得十分簡(jiǎn)單且成本低發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀、脫鹽、陽(yáng)離子交換層析即可。所得蛋白優(yōu)于原核表達(dá)蛋白，糖基化完整，可用于人NGAL功能研究以及臨床NGAL檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。


圖1為pPIC9載體結(jié)構(gòu)圖；
圖2為瓊脂糖凝膠電泳鑒定NGAL基因PCR產(chǎn)物電泳圖；圖3為瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組表達(dá)載體pPIC9-NGAL的電泳圖；圖4為PCR鑒定重組酵母克隆的電泳圖；圖5為western blotting檢測(cè)發(fā)酵上清中NGAL蛋白的表達(dá)電泳圖；圖6為western blotting評(píng)估發(fā)酵上清中NGAL蛋白表達(dá)產(chǎn)量的電泳圖；圖7為陽(yáng)離子交換層析梯度洗脫記錄圖；圖8為SDS-PAGE電泳檢測(cè)陽(yáng)離子交換層析后的目標(biāo)蛋白電泳圖。
其中，圖2中，1，100bp DNA ladder；2，PCR產(chǎn)物。圖3中，1，100bp DNA ladder；2，pPIC9-NGAL/XhoI+EcoRI；3，λDNA/EcoRI+HindIII DNAmarker。圖4中，1，100bp DNA ladder；2-9，1-8號(hào)克隆。
圖5中，1，2ng/μl原核表達(dá)NGAL蛋白；2-9，1-8號(hào)克隆發(fā)酵上清。
圖6中，1-7，1/258、1/128、1/64、1/32、1/16和1/4稀釋的樣品；8-9，1ng/μl和2ng/μl原核表達(dá)的NGAL蛋白。圖8中，Y，層析樣品原液；26-34，洗脫峰各管。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1重組畢赤酵母的構(gòu)建1.擴(kuò)增NGAL cDNA片段以pGEX-NGAL為模板，除去了信號(hào)肽序列的NGAL編碼區(qū)用下列引物擴(kuò)增P15’-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA-3’；P25’-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC-3’。PCR引物兩端分別引入XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)記)，而且產(chǎn)物的5′端引入了畢赤酵母內(nèi)切肽酶KEX2的酶切序列Glu-Ala-Arg*。25μl的PCR反應(yīng)體系成分為2×PCR mix 12.5μl，pGEX-NGAL 1μl，P1(12.5 μM)1μl，P2(12.5μM)1μl，PCR water 9.5μl。PCR反應(yīng)條件是95℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃5min。反應(yīng)結(jié)束后用1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，見(jiàn)圖22.構(gòu)建重組pPIC9-NGAL表達(dá)載體取經(jīng)過(guò)XhoI和EcoRI雙酶切的NGAL cDNA PCR產(chǎn)物和線型pPIC9空載體(見(jiàn)圖1)的連接反應(yīng)PCR產(chǎn)物3μl，pPIC9空載體1μl，2×ligation buffer 5μl，T4 ligase 1μl?；靹蚝笫覝叵逻B接1h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞和鋪LB(Amp+)板。次日挑取單克隆接種于2ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)(250rpm/min)14h。堿裂解法提取質(zhì)粒并進(jìn)行XhoI和EcoRI雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組表達(dá)載體pPIC9-NGAL，見(jiàn)圖3。所獲得的pPIC9-NGAL重組子進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行BLAST分析，確認(rèn)序列的正確性。
3.pPIC9-NGAL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母pPIC9-NGAL質(zhì)粒分別用SacI、SalI和BglII酶進(jìn)行酶切使之線性化，并用瓊脂糖凝膠電泳回收，備用。然后，從YPD平板上挑畢赤酵母單克隆于10ml的YPD培養(yǎng)基中30℃搖床振蕩培養(yǎng)約16h，當(dāng)其OD600值＞0.6時(shí)，室溫2,000g離心5min收集菌體；用4ml無(wú)菌水重懸菌體，室溫1,500 g離心10min，去除無(wú)菌水，重復(fù)洗滌一次；加160μl 0.1M LiCl重懸菌體，室溫下14,000rpm離心15s；去除上清，加64μl 0.1M LiCl重懸菌體，取21μl分裝到1.5ml的離心管中，此為制備好的酵母感受態(tài)細(xì)胞。最后，取6μl鮭魚(yú)精DNA(10μg/μl)沸水煮5min后，馬上置于冰上，以制備擔(dān)體DNA；室溫下8,000rpm將上述酵母感受態(tài)細(xì)胞離心1min收集菌體；每個(gè)離心管按順序加入以下物品50％PEG3350 96μl，1M LiCl 14.4μl，鮭魚(yú)精DNA2μl，線性化pPIC9-NGAL0.74-0.9μg于50μl的無(wú)菌水中；劇烈渦旋和移液器打散至液體充分混勻；30℃水浴孵育30min；42℃熱休克25min；8,000rpm離心1min收集菌體；400μl無(wú)菌水重懸菌體，分別取100μl或200μl鋪于RDB平板；平板倒置培養(yǎng)于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-4天。PCR鑒定重組畢赤酵母，見(jiàn)圖4。
4.篩選高效表達(dá)的重組畢赤酵母用滅菌牙簽挑取RDB平板上的單克隆依次分別接種于MM(1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)和MD(1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％葡萄糖)平板上，再將牙簽置于裝有5ml BMGY培養(yǎng)液的50ml離心管中于30℃250rpm振蕩培養(yǎng)。上述兩種平板倒置培養(yǎng)于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-4天。對(duì)于BMGY培養(yǎng)菌液，則在24h后先取1ml菌液測(cè)其OD600，并且8,000rpm離心1min收集菌體，加500μl PBS重懸菌體，2,500g離心3min，棄上清，加100μlTE重懸菌體，沸水煮10min，馬上置于-70℃冷凍30min，取出放于沸水再煮10min，1,500g離心5min，取上清為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。25μl的PCR反應(yīng)體系成分為2×PCR mix12.5μl；酵母裂解上清1μl；P1(12.5μM)1μl；P2(12.5μM)1μl；無(wú)菌水9.5μl。PCR反應(yīng)條件同上。反應(yīng)結(jié)束后，取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。然后，剩下的菌液繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，并每隔24h加入終濃度為1％的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，120h后，菌液2,500g離心5min，收集上清，取5μl進(jìn)行western blotting檢測(cè)NGAL的表達(dá)水平，鑒定出高表達(dá)菌株，見(jiàn)圖5和圖6。
實(shí)施例2重組畢赤酵母表達(dá)生產(chǎn)NGAL及NGAL的純化1.從上述MD平板挑取經(jīng)western blotting鑒定為高表達(dá)的重組克隆接種于BMGY培養(yǎng)基中30℃，250-300rpm/min培養(yǎng)，當(dāng)OD600＞2.0時(shí)，25℃下2000g，5min離心，棄上清，加入BMMY培養(yǎng)基稀釋至OD600為1，30℃，250-300rpm/min繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24h加入終濃度為1％的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，120h后，25℃，5000g，10min離心，收上清。
2.NGAL蛋白純化將發(fā)酵上清液按5g/10ml加入硫酸銨固體，搖動(dòng)使充分溶解，4℃靜置過(guò)夜。然后4℃下10,000g離心10min，小心棄上清。將沉淀用25mM PB(pH＝5.8)溶解后，在25mM PB(pH＝5.8)中透析48h，其間換液三次。所得樣品按如下步驟進(jìn)行SP-Sepharose fast flow陽(yáng)離子交換A.預(yù)處理Sepharose。取25ml SP-Sepharose fast flow傾去上層20％乙醇液，加50ml 25mMPB(pH＝5.8)，攪勻，傾去上層液。再用10ml25mMPB(pH＝5.8)洗兩次。加7ml 25mMPB(pH＝5.8)，混勻。
B.裝柱。關(guān)閉下端，柱內(nèi)留5ml 25mMPB(pH＝5.8)，沿柱壁加入膠漿液，完畢后，用25mMPB(pH＝5.8)加滿柱子，打開(kāi)下端出口，以400cm/h的流速裝柱。待柱高固定后，跑柱60ml.檢查流出液pH值是否與加入時(shí)一樣(若不同，繼續(xù)跑柱至pH值一樣)C.上樣。打開(kāi)柱蓋，讓柱中緩沖溶液流至接近柱床平面時(shí)(二者相差約1mm)，加入樣品溶液。加壓使樣品液進(jìn)入柱床中，此時(shí)加滿緩沖溶液，蓋緊柱蓋，即可跑柱。
D.洗柱。25mMPB(pH＝5.8)洗柱，流速1.5ml/min，每管2min收集，至基線水平。
E.1MNaCl梯度洗脫。A液25mMPB(pH＝5.8)，B液1MNaCl。流速1.5ml/min，每管2min收集。
F.取洗脫峰樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定目標(biāo)蛋白，并合并目標(biāo)蛋白。陽(yáng)離子交換層析洗脫記錄，見(jiàn)圖7。
G除鹽。將層析得到的純化蛋白移入U(xiǎn)ltra-15 5K中，4℃下4000g離心20min。然后用PBS(pH 7.4)洗三次，每次10min。取出截留液，稀釋至一定體積，Bradford法測(cè)蛋白含量，分裝后，置于-80℃保存。SDS-PAGE電泳檢測(cè)離子交換層析后的目標(biāo)蛋白見(jiàn)圖8。
權(quán)利要求
1.一種重組畢赤酵母，其特征在于由如下方法制備而成(1)PCR擴(kuò)增NGAL的cDNA；(2)PCR產(chǎn)物與載體pPIC9連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9-NGAL；(3)重組質(zhì)粒pPIC9-NGAL轉(zhuǎn)化畢赤酵母，得到重組畢赤酵母。
2.如權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于所述NGAL為人源NGAL。
3.如權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的引物為P15’-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA-3’，P25’-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC-3’；模板為pGEX-NGAL。
4.一種利用權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母表達(dá)生產(chǎn)NGAL蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟(1)篩選高效表達(dá)NGAL蛋白的重組畢赤酵母；(2)將高效表達(dá)的重組畢赤酵母用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得含有NGAL蛋白的發(fā)酵液；(3)往發(fā)酵液中加入硫酸銨，沉淀，收集沉淀物；(4)透析除鹽；(5)陽(yáng)離子交換層析。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于所述陽(yáng)離子交換層析的固定相為SP-Sepharose Fast Flow；線性梯度洗脫A液為25mMPB，pH5.8，B液為1M NaCl；流速為1.5ml/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及NGAL蛋白，公開(kāi)了重組畢赤酵母及其表達(dá)NGAL蛋白的方法。本發(fā)明通過(guò)PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化與篩選，最終獲得高效表達(dá)NGAL蛋白的重組畢赤酵母菌株。該菌株能將目標(biāo)蛋白分泌到培養(yǎng)基中，可達(dá)＞100mg/L，而且無(wú)雜蛋白。這使得接續(xù)下來(lái)的純化工藝變得十分簡(jiǎn)單發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀、脫鹽、陽(yáng)離子交換層析即可。所得蛋白優(yōu)于原核表達(dá)蛋白，糖基化完整，可用于人NGAL功能研究以及臨床NGAL檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1978632SQ20061012367
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2006年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月21日
發(fā)明者李恩民, 張丕顯, 吳炳禮, 杜則澎, 許麗艷 申請(qǐng)人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院