專利名稱：：馬鈴薯病毒和類病毒檢測試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其涉及一種馬鈴薯病毒和類病毒的復(fù)合RT-PCR檢測試劑盒，本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法及應(yīng)用技術(shù)操作規(guī)程，屬于植物病毒檢驗、檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：馬鈴薯(So/fl"w/w加6erasM/wL.)是我國應(yīng)用價值較高的經(jīng)濟作物，種植面積居世界第一位，面積已達(dá)6600萬畝，總產(chǎn)量5609.6萬噸。馬鈴薯適宜栽培區(qū)域廣泛，但病毒病害嚴(yán)重影響了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，在我國引起馬鈴薯退化的主要病毒有馬鈴薯巻葉病毒(尸0加0/ea戶o//v!nw,PLRV)、馬鈴薯X病毒(尸ototovz>w《PVX)、馬鈴薯Y病毒(尸ototov&逝y，PVY)、馬鈴薯S病毒f尸ototoWrwsS,PVS)、馬鈴薯A病毒(尸ototoWr旭APVA)和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(戶ototoj/w加tfeft/6erwra試PSTVd)，且多數(shù)是復(fù)合感染。馬鈴薯已被列為我國7大作物之一，也是中國西部最重要的作物品種和主要的支柱型產(chǎn)業(yè)，發(fā)展勢頭良好，但目前我國馬鈴薯單產(chǎn)只有發(fā)達(dá)國家平均單產(chǎn)的1/3，馬鈴薯病毒是造成馬鈴薯產(chǎn)量低、質(zhì)量差的主要原因。目前生產(chǎn)上普遍采用馬鈴薯脫毒種薯來防治病毒病的危害，為確保馬鈴薯原原種、原種的脫毒質(zhì)量，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、高效的馬鈴薯病毒類病毒檢測技術(shù)是馬鈴薯種薯生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，也是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展的迫切需要。國內(nèi)馬鈴薯病毒檢測主要是山東農(nóng)科院和國際馬鈴薯研究中心提供的ELISA檢測試劑盒，這種酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)依賴于抗血清，血清大多依賴進口，價格高，不適合生產(chǎn)的需要，且免疫學(xué)檢測技術(shù)的靈敏度低和準(zhǔn)確性差，在生產(chǎn)t應(yīng)用具有較大的局限性，極大地限制了我國馬鈴薯種薯生產(chǎn)病毒檢測的普及和應(yīng)用；同時ELISA不能準(zhǔn)確的檢測到休眠塊莖中的PLRV和PVY病毒，在檢測前需打破休眠；此外，對于不具有免疫原性的PSTVd類病毒來說，根本無法使用ELISA技術(shù)進行檢測。因此生產(chǎn)上迫切需要一種全面、快速、簡便、靈敏、廉價的檢測技術(shù)。聚合酶聯(lián)式反應(yīng)(Polymerasechainreaction,PCR)與ELISA檢測相比具有靈敏度高、特異性強和準(zhǔn)確可靠及穩(wěn)定性好的特點，被認(rèn)為是病毒檢測技術(shù)的一次革命，已在許多植物病毒上應(yīng)用。常見的馬鈴薯病毒大多是單鏈RNA病毒，需要先將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄后再進行PCR擴增，即反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse-transcriptionPolymeraseChainReaction,RT-PCR)技術(shù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來已由一次只能檢測一種病毒的單一RT-PCR技術(shù)發(fā)展到可以同步檢測兩種至多種病毒的雙重PCR(d-RT-PCR)、復(fù)合RT-PCR(m-RT-PCR)檢測。復(fù)合RT-PCR檢測技術(shù)可以同時檢測多種病毒和類病毒，在大大提髙檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度的同時，還大大降低了檢測的成本、縮短了檢測時間，成為馬鈴薯病毒類病毒RT-PCR檢測的方向和主流。加拿大科學(xué)家Nie等曾經(jīng)探討用隨機引物進行馬鈴薯主要病毒和類病毒的復(fù)合RT-PCR檢測研究，國內(nèi)王中康等也開展了有關(guān)研究。但是他們都沒有對病毒檢測過程中存在的假陰性結(jié)果的問題提出有效解決的辦法，沒能構(gòu)建一種試劑盒來同時檢測馬鈴薯的5種病毒和1種類病毒。研究馬鈴薯的5種病毒和1種類病毒同步快速RT-PCR檢測，解決RT-PCR檢測過程中易出現(xiàn)假陰性結(jié)果的問題，解決同時檢測馬鈴薯病毒和類病毒的問題，解決脫毒馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制性問題都具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有檢測方法不能同時檢測馬鈴薯病毒和類病毒，檢測成本高，時間長的問題；克服RT-PCR檢測中的假陰性問題，提供一種新的馬鈴薯病毒和類病毒的復(fù)合RT-PCR檢測試劑盒，來同時檢測馬鈴薯病毒和類病毒，且快速、簡便、靈敏、廉價。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種馬鈴薯病毒和類病毒的復(fù)合RT-PCR檢測試劑盒，由組分I和組分II組成，組分I由將馬鈴薯病毒和類病毒mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈的必要試劑所組成，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑，dNTP混合物，檢測對象的cDNA第l鏈的互補引物，cDNA第1鏈反應(yīng)緩沖液；組分H由以cDNA第l鏈為摸板進行PCR擴增的必要試劑所組成，包括PCR反應(yīng)緩沖液，dNTP混合物，MgCl2，TaqDNA聚合酶，復(fù)合PCR引物組合等；所述的檢測對象合成cDNA第l鏈的引物是由7對引物中的互補引物按照任意比例所組成的、混合物SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14。所述的PCR復(fù)合引物組合是由以下7對引物所組成SEQIDNO:l、SEQIDNO:2(引物對1);SEQIDNO:3、SEQIDNO:4(引物對2);SEQIDNO:5、SEQIDNO:6(引物對3);SEQIDNO:7、SEQIDNO:8(引物對4);SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO(引物對5);SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12(引物對6)和SEQIDNO:13、SEQIDNO:14(引物對7)。優(yōu)選的，上述7對引物按照以下比例所組成弓l物對i:引物對2:弓l物對3:弓l物對4:弓l物對5:弓l物對6:弓l物對7=1:i:i:i:i:i:0.5。其中，組分I中還可包含有無RNA酶的去離子水；組分II中還可包含有馬鈴薯巻葉病毒(PLRV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯S病毒(PVS)A、馬鈴薯A病毒(PVA)和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)的混合物，即陽性對照樣品，該陽性對照無侵染活性。上述試劑盒中，除了組分I中合成cDNA第1鏈的引物和組分II中PCR引物不能從生物試劑公司購買得到外，其余的試劑或酵都能從國內(nèi)外普通生物試劑公司購買得到，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選為M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。組分I中合成cDNA第1鏈的引物和組分II中PCR引物可按照序列表中所公開各引物的核苷酸序列將其人工合成后，再將其按照上述比例混合在一起，配制成濃度為50uM的核苷酸混合液。組分I和組分II中各組分的量可根據(jù)實際情況(例如待檢樣品的數(shù)量)而定。例如，組分I中各組分的量可以是完成1次cDNA第1鏈合成反應(yīng)的用量也可以是完成多次cDNA第l鏈合成反應(yīng)的用量，同樣，組分II中各組分的量可以是完成1次PCR反應(yīng)的用量也可以是完成多次PCR反應(yīng)的用量，這些都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易掌握或設(shè)計的。作為一種參考，本發(fā)明馬鈴薯病毒和類病毒的復(fù)合RT-PCR檢測試劑盒，組分I中各試劑的量和組分II中各試劑的量可按照如下用量進行組裝組分I:50iiM合成cDNA第1鏈的引物0.5-5000uL5XcDNA第1鏈反應(yīng)緩沖液1-5000uL40UuI/1RNA酶抑制劑0.5-5000iiLlOmmolL-1dNTPs0.2-5000uL200UuL"M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5-5000uL組分IIIOXPCR反應(yīng)緩沖液l國5000nL25mMMgC120.1-5000nL，0.1-5000nL，0.1-5000nL0.1國500(HiL。l一5000nL10mMdNTPs50uMPCR引物TaqDNA聚合酶陽性對照將上述各種試劑單獨分裝后，放置于試劑盒中，保存在一20C冰箱里，即得本發(fā)明試劑盒。其中，組分I中的各種試劑要嚴(yán)格滅活RNA酶，用于分裝組分I各種試劑的容器也要做到無RNA酶污染。本發(fā)明試劑盒的使用方法，可參照下述操作規(guī)程進行1.合成cDNA第l鏈待測病原樣品RNA(10—100ng/uL)5uL50uMcDNA第l鏈的引物UL88r，lOmin，O"C5min;再加入下述試劑5XcDNA第1鏈反應(yīng)緩沖液6uLRNA酶抑制劑(40UuL'1)1uLdNTPs(lOmmolL-l)2uL反轉(zhuǎn)錄酶(200UuL-l)1.5uL補加無RNA酶的去離子水直到反應(yīng)總體積到30nL;反應(yīng)條件混勻后37'C保溫10min，42'C反應(yīng)1.5h，即合成cDNA第1鏈；2.按以下組份進行復(fù)合PCR反應(yīng)(同時設(shè)置陽性對照)cDNA第l鏈產(chǎn)物5jiL，IOXPCR反應(yīng)緩沖液5&，25mMMgC121^L，lOmMdNTPs1mL，pcr引物混合物1mL，TaqDNA聚合酶1.4&，加滅菌雙蒸水補足到50nLpcr擴增條件94。C3min;9化50s，54。C30s，72"Cl.Omin，35個循環(huán);72匸10min。3.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳及判定方法反應(yīng)結(jié)束后取10liLPCR產(chǎn)物經(jīng)5%聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察結(jié)果，陽性對照均出現(xiàn)各個檢測帶。檢測樣品時，如果僅出現(xiàn)N2190bp片段者，則為健康樣品；若無190bp的DNA帶出現(xiàn)，則為假陰性樣品，需要繼續(xù)進行檢測確定；若l卯bp片段和其他片段同時出現(xiàn)，則為感病樣品，其中PVX的擴增帶為520bp，PVY的擴增帶為420bp,PVA為410bp，PSTVd為360bp,PVS為310bp，PLRV為270bp。本發(fā)明RT-PCR檢測試劑盒中所用到的引物是本研究特異設(shè)計的，能夠檢測病毒的不同株系且容易區(qū)分，它們之間沒有相互干擾，由于引物設(shè)計方面減小了擴增片段的長度，增加了檢測的靈敏度。本發(fā)明首先從馬鈴薯病毒和類病毒基因序列克隆和同源性分析入手，首先建立這些病原的單一RT-PCR檢測技術(shù)，并對PCR產(chǎn)物進行克隆和序列同源性分析，獲得無侵染活性的陽性對照，為設(shè)計本發(fā)明試劑盒中復(fù)合RT-PCR特異引物提供序列信息，所設(shè)計的引物特異性強，并充分考慮到病毒株系的基因組變異，從基因組最為保守的序列區(qū)段設(shè)計特異引物，且不同病毒的引物之間不相互互補干擾反應(yīng)，能檢測病毒和類病毒的不同株系、引物之間無互補干擾、且引物擴增條帶大小容易區(qū)分，可同步檢測多重侵染馬鈴薯的5種主要病毒和1種類病毒。現(xiàn)有檢測技術(shù)體系方面沒有有效解決復(fù)合RT-PCR檢測過程中存在的假陰性結(jié)果的問題。本發(fā)明RT-PCR檢測試劑盒中引入了馬鈴薯基因組的mRNA作為內(nèi)對照，監(jiān)測整個馬鈴薯病毒類病毒RT-PCR過程，從根本上解決了馬鈴薯病毒和類病毒檢測中易出現(xiàn)假陰性結(jié)果的問題。本試劑盒是用于檢測PLRV、PVY、PVX、PVS、PVA和PSTVd的病毒的RNA的RT-PCR檢測試劑盒，可以同步快速檢測這些病毒和類病毒，釆用了兩步RT-PCR法，用于定性檢測PLRV、PVY、PVX、PVS、PVA和PSTVd。該試劑盒附加了無侵染活性的陽性對照和植物的內(nèi)對照RNA，用于內(nèi)對照實驗和陽性對照試驗，可以防止假陽性和假陰性的出現(xiàn)。本發(fā)明試劑盒具有成本低廉的特點，與我國目前應(yīng)用的酶聯(lián)吸附測定法(ELISA)相比，不僅大大提高了馬鈴薯檢測技術(shù)水平，同時檢測的靈敏度得到了大幅度提高，所用試劑除了M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶為進口產(chǎn)品外，其余的試劑均為閨產(chǎn)試劑，大大節(jié)約了成本和資金，為我國馬鈴薯病毒、類病毒的檢測提供了快速、準(zhǔn)確、靈敏、高效的方法。利用本發(fā)明試劑盒對田間自然感病和脫毒試管苗的大量樣品的檢測，證明完全可以對馬鈴薯病毒類病毒進行快速檢驗；同時對馬鈴薯原原種、原種和種苗進行脫毒檢驗，可以特異性檢測出主要病毒的種類。與傳統(tǒng)的ELISA和雙向電泳法進行了比對，結(jié)果該技術(shù)具有更髙的穩(wěn)定性、靈敏度和準(zhǔn)確度。本發(fā)明檢測試劑盒操作簡便、快速、成本低，可廣泛應(yīng)用于脫毒馬鈴薯種薯和種苗的室內(nèi)檢測、生產(chǎn)田檢測、抗毒病毒材料的鑒定、篩選及植物檢驗檢疫等方面。圖1內(nèi)對照引物N2的特異性?；疪NA擴增產(chǎn)物1:DNsae處理后RT-PCR;2:DNsae處理后PCR;3:樣品直接RT-PCR;4:樣品直接PCR。圖25%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果1，3，5,10:空白對照；2:PLRV產(chǎn)物；4:PVY產(chǎn)物；6:為PLRV和PVY的雙擴增產(chǎn)物；7:200bpDNAmarker;8:N2和PLRV的雙擴增產(chǎn)物；9:PVY和N2的雙擴增產(chǎn)物.ll:N2的單擴增產(chǎn)物圖3以N2亞基基因為內(nèi)對照雙重RT-PCR檢測PLRV和PVY結(jié)果M:PCRmarker(994bp，697bp，515bp，377bp，237bp);l:空白對照；2:健康對照；3-5:大田馬鈴薯樣品。圖45%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果1:N2和PSTVd的雙擴增產(chǎn)物；2:PSTVd單擴增產(chǎn)物；3:空白對照；M:DNAMarker。圖5本發(fā)明復(fù)合RT-PCR試劑盒檢測部分樣品結(jié)果1-7號采集的不同樣品檢測結(jié)果，見材料部分。M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；J:健康對照；K:空白對照。圖6本發(fā)明復(fù)合RT-PCR試劑盒檢測部分樣品結(jié)果8—19號采集的不同樣品檢測結(jié)果，見材料部分。M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；J:健康對照；K:空白對照;Z:混合樣品多重RT-PCR產(chǎn)物圖7多重RT-PCR檢測靈敏度試驗M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；K:空白對照；J:健康對照；l一6:稀釋度試驗(1X、10X、IOOX、200X、300X、400X)。具體實施方式以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。試驗材料1、馬鈴薯感病樣品馬鈴薯感病部分樣品從張家口壩上地區(qū)釆集，另外一部分樣品為河北慧谷科技有限公司進行脫毒馬鈴薯種苗檢測時獲得。這些樣品經(jīng)過馬鈴薯病毒和類病毒的單一RT-PCR技術(shù)檢測，其帶毒的種類經(jīng)過確定(表l)。其中樣品2號為復(fù)合感染PVA、PVS和PVX的煙草葉片，由重慶大學(xué)王中康教授惠贈。表i不同馬鈴薯樣品感染病毒和類病毒情況<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2、所用試劑RNA酶抑制劑(Rnasin)購自寶生物公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Progmega公司,TaqDNA聚合酶、dNTP等購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。其它各種化學(xué)試劑購自北京化學(xué)試劑公司。3、引物序列表2馬鈴薯病毒和類病毒復(fù)合RT-PCR檢測所用的引物對及其擴增大小<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>試驗例1內(nèi)對照引物的特異性試驗設(shè)計的N2引物(SEQIDNO:13和SEQIDNO:14)表現(xiàn)對RNA專化的特異性擴增，提取的樣品總RNA經(jīng)過DNase處理后進行反轉(zhuǎn)錄后，PCR擴增出一條特異帶，而不經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄的步驟PCR擴增無任何條帶。NAD2基因引物擴增出190bp的特異帶(圖1)。本發(fā)明將內(nèi)對照引入到RT-PCR檢測試劑盒中，高等植物的N2基因廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實和種子等器官中，且該基因在高等植物中具有很高的保守性，利用N2引物對三生煙、普通煙、心葉煙、番茄、茄子和辣椒等進行了RT-PCR試驗，結(jié)果也能特異的擴增出目的片段，這說明N2基因在植物中具有一定的保守性，可用做植物RNA病毒檢測的內(nèi)對照。試驗例2PLRV和PVY的雙重檢測對已經(jīng)復(fù)合感染了PLRV和PVY的病毒樣品(表l:樣品標(biāo)號IO)進行了雙重檢測，經(jīng)5。/。的PAGE電泳表明(圖2)，N2特異引物(SEQIDNO:13和SEQIDNO:14)可擴增出一條約190bp的特異片段，PLRV特異引物(SEQIDNO:l和SEQIDNO:2)可擴增出一條約310bp的特異片段，PVY的特異引物(SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)則擴增出大約420bp的片段，這與理論設(shè)計的大小一致。在進行復(fù)合RT-PCR時，分別用N2引物和PLRV復(fù)合引物、N2和PVY復(fù)合引物、PVY和PLRV復(fù)合引物等組合進行了復(fù)合擴增，結(jié)果均擴增出目的條帶(圖3)。試驗例3內(nèi)對照RT-PCR檢測PSTVd將已提取塊莖的樣品(表l，樣品標(biāo)號6)總RNA進行雙重RT-PCR，經(jīng)5%的PAGE電泳表明，用N2特異引物可擴增出一條約190bp的特異核苷酸片段，PSTVd特異引物可擴增出一條約360bp的特異核苷酸片段。在進行雙重RT-PCR時，結(jié)果擴增出兩條目的條帶，如圖4所示。試驗例4本發(fā)明復(fù)合RT-PCR試劑盒檢測馬鈴薯病毒和類病毒一、馬鈴薯感染病毒材料所收集的馬鈴薯感染病毒材料已經(jīng)過ELISA和單一RT-PCR檢測，確認(rèn)出感染病毒的種類(表l)。二、檢測試劑盒本發(fā)明復(fù)合RT-PCR試劑盒三、檢測方法1.按照現(xiàn)有技術(shù)方法提取樣品的高質(zhì)量的總RNA(例如各生物技術(shù)公司的RNA提取試劑盒，或者改良CTAB法提取RNA等〉。2.樣品總RNA5wL，20umol/L的cDNA第1鏈的互補引物1wL。88"C變性10min，冰上冷卻3-5min;然后再加入下列試劑20umol/LRNasinlixL，5Xbuffer6uL，dNTPs(lOmmol-L-l)2uL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1.5uL(200UuL-l)，DEPC水補足到30uL，混勻后37'C保溫10min，42X:反應(yīng)1.5h，即合成cDNA第一鏈。3.PCR多重擴增(1)10XPCRbuffer5fiL，25mMMgCl21^L，10mMdNTPs1^iL，PCR復(fù)合引物組合lnL，TaqDNA聚合酶1.4^L,加滅菌雙蒸水補足到50^L，加入一滴礦物油，881C變性510分鐘后(2)加入cDNA第1鏈產(chǎn)物5^L，然后進行PCR循環(huán)擴增；PCR擴增條件94"C3min;50s，54'C30s，72°C1.0min，35個循環(huán)；72匸10min;4.聚丙烯酰胺凝膠電泳分析復(fù)合PCR擴增產(chǎn)物，銀染聚丙烯酰胺凝膠；5.電泳結(jié)果分析如果僅出現(xiàn)190bp片段者，則為健康樣品；若無190bp的DNA帶出現(xiàn)，則為假陰性樣品，需要繼續(xù)進行檢測確定；若190bp片段和其他片段同時出現(xiàn)，則為感病樣品，其中PVX的擴增帶為520bp，PVY的擴增帶為420bp，PVA為410bp，PSTVd為360bp，PVS為3l0bp，PLRV為270bp。四、檢測結(jié)果檢測結(jié)果見圖5和圖6。檢測結(jié)果表明，用本發(fā)明試劑盒檢測樣品，可以準(zhǔn)確的檢測出樣品所感染的病毒和類病毒的種類。本發(fā)明所設(shè)計引物的特異'生很強，在復(fù)合RT-PCR檢測中只對病毒的特異帶進行了擴增，且不同病毒和類病毒之間的引物沒有干擾性，每個病原的特異帶均能擴增出來，且內(nèi)對照的特異帶也能清晰的擴增出來。擴增的條帶和大小和預(yù)期設(shè)計的要擴增的基因片段大小一致，且不同病毒擴增的片段的強度不一樣，這可能是由于病毒在寄主體內(nèi)的濃度不同或病毒的引物序列與病毒的基因序列配對程度不同引起的。將所擴增出的片段克隆并測定序列，測序證明所擴增的復(fù)合RT-PCR產(chǎn)物為病毒和類病毒的特異片段，N2引物擴增的l卯bp的片段為馬鈴薯本身基因的成熟的mRNA部分片段，與預(yù)期設(shè)計序列區(qū)間大小一致。試驗例5本發(fā)明試劑盒多重檢測的靈敏度試驗為了確定以內(nèi)對照為基礎(chǔ)的本發(fā)明多重RT-PCR試劑盒檢測馬鈴薯病毒和類病毒的靈敏度，對感染了PLRV，PVS,PVY的樣品(表l)進行了靈敏度試驗，將提取的樣品RNA(100ng)分別稀釋IX、10X、100X、200X、300X、400X的梯度標(biāo)準(zhǔn)，用本發(fā)明試劑盒進行多重RT-PCR檢測，結(jié)果表明在200X(0.3-0.5ng)的稀釋度下所有條帶仍然可見(圖7)。但是不同病毒擴增的片段的強度不一樣，這可能是由于樣品RNA的起始濃度不同或病毒在寄主體內(nèi)的濃度不同或病毒的引物序列與病毒的基因序列配對程度不同引起的。加17幼202015序列表<110>河北^T農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所<i2o>馬鈴班禍毒^禍錄檢ai試劑食及幾w用<130>卿<160>14<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>幼<212>DNA<213>Sol抑umtuberosumL<柳>1cccaaggaagtttcaccttc<210>2<211>20<212>DNA<213>Sol助umtuberosumL<400>2agaatcgtgccattctaccc<210>3<211>17<212>DNA<213>Solan咖tuberosumL"00>3tgccaactgtgaatggg<210>4<211>20<212>DNA<213>Solan腿tuberos咖L<柳>4gtggtgt柳tctctgtgtt<210>5<211>20<212>DNA<213>So1助ubtuberos咖L<400>5gcaacaaatgaggacctcag<210>6<211>20<212>DNA<213>Solanumtub枕osuaL<400>6tcagcggttgttgttccagt720DNASolan咖tuberosuml.<400>7助tgccgccta助cc卿tc>>>>2020242524〈■>8ggaUtccatcttgaaceigc<400〉9caagccgaaactcttgatgc<210>10<211>20〈212>DNA<213〉SolariumtuberosumL<400>10ccat,catggtccaaactcca<210〉U<211>24〈212〉DNA〈213>SolanumtuberosumL〈400〉11ggatccccgggga犯cctggagcg〈400>12ggatccctgaagcgctcctccgagc<400>13aagatcactgcagttcctttteat<柳>14t.aagatcatagaagcaatgctgcSolan測tuberosum920DNASolanumUiberosuinL1225DNASolanumtuberosumL1324DNASolanumtuberosumLSolan函tuberosumLA:>>>><<<<o123222210032222o1C12io123222權(quán)利要求1.一種馬鈴薯病毒和類病毒的復(fù)合RT-PCR檢測試劑盒，由組分I和組分II組成；組分I和組分II中的各試劑單獨分裝，組分I由將馬鈴薯病毒或類病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈的必需試劑所組成，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑，dNTP混合物，檢測對象的cDNA第1鏈的互補引物，反應(yīng)緩沖液；組分II由進行PCR擴增的必需試劑所組成，包括PCR反應(yīng)緩沖液，dNTP混合物，MgCl2，TaqDNA聚合酶，PCR復(fù)合引物組合；其特征在于所述的檢測對象的cDNA第1鏈的互補引物是由以下7個引物按照任意比例組成的混合物SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12和SEQIDNO14；所述的PCR復(fù)合引物組合是由以下7對引物所組成SEQIDNO1、SEQIDNO2(引物對1)；SEQIDNO3、SEQIDNO4(引物對2)；SEQIDNO5、SEQIDNO6(引物對3)；SEQIDNO7、SEQIDNO8(引物對4)；SEQIDNO9、SEQIDNO10(引物對5)；SEQIDNO11、SEQIDNO12(引物對6)；SEQIDNO13、SEQIDNO14(引物對7)。2、按照權(quán)利要求1的RT-PCR試劑盒，其特征在于所述PCR復(fù)合引物組合中7對引物的組成比例是:引物對i:引物對2:引物對3:引物對4:引物對5:引物對6:引物對7=1:i:2:i:2:2:0.5。3、按照權(quán)利要求1的RT-PCR試劑盒，其特征在于組分I的組成為50UM合成cDNA第1鏈的引物0.5-5000uL，反應(yīng)緩沖液1-5000VL，RNA酶抑制劑0.5-5000nL，lOmmolL1dNTPs0.2-5000liL,200UuL1M國MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5-5000wL;組分II的組成為PCR反應(yīng)緩沖液l-5000fiL,25mMMgCl20.1-5000jiL，10mMdNTPs0.1-5000nL,50uMPCR復(fù)合引物組合0.1-500(HiL，TaqDNA聚合酶0.1-500(HiL。4、按照權(quán)利要求1的RT-PCR試劑盒，其特征在于組分I的組成為50UM合成cDNA第1鏈的引物0.5-5000uL，反應(yīng)緩沖液1-5000uL,40UuL"RNA酶抑制劑0.5-5000UL，lOmmolL"dNTPs0.2-5000uL，200UUL"M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5-5000PL;組分H的組成為PCR反應(yīng)緩沖液l-5000nL，25mMMgCl20.1-5000nL，10mMdNTPs0.1-5000nL，50uMPCR復(fù)合引物組合0.1-5000jaL,TaqDNA聚合酶0.1-5000nL。5、按照權(quán)利要求1的RT-PCR試劑盒，其特征在于組分I中還包括無RNA酶的去離子水；組分II中還包括有馬鈴薯巻葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒混合物的無侵染活性的陽性對照。6、權(quán)利要求l的RT-PCR試劑盒在檢測馬鈴薯巻葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒中的應(yīng)用，包括(1)將馬鈴薯待檢樣品RNA用組分1的試劑按照常規(guī)的反應(yīng)條件逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈(2)將cDNA第1鏈用組分II的試劑按照常規(guī)的反應(yīng)條件進行PCR擴增；(3)結(jié)果判定將PCR擴增產(chǎn)物進行5%聚丙烯酰胺凝膠電泳；如果樣品僅擴增出了l卯bp片段，則為健康樣品；若樣品無190bp的DNA帶出現(xiàn)，則為假陰性樣品，需要繼續(xù)進行檢測確定；若樣品擴增產(chǎn)物中，190bp片段和其它片段同時出現(xiàn)，則為感病樣品，其中馬鈴薯X病毒的擴增帶為520bp,馬鈴薯Y病毒的擴增帶為420bp，馬鈴薯A病毒的擴增帶為410bp，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的擴增帶為360bp,馬鈴薯S病毒的擴增帶為310bp，馬鈴薯巻葉病毒的擴增帶為270bp。7、按照權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于，步驟(1)中所述的逆轉(zhuǎn)錄是按照以下反應(yīng)條件來合成cDNA第1鏈(1)首先加入樣品總RNA5uL和20umol/L的檢測對象的cDNA第1鏈的互補引物1uL;88r變性10min，冰上冷卻3-5min;(2)再加入下列試劑20umol/LRNA酶抑制劑1uL，5X反應(yīng)緩沖液6uL，dNTPs2uL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1.5uL，DEPC水補足到30uL，混勻后37"保溫10min，42T反應(yīng)1.5h。8、按照權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所述的PCR擴增條件如下(1)10XPCR反應(yīng)緩沖液5nL，25mMMgCl21jiL，10mMdNTPs1pL，PCR復(fù)合引物組合l^iL，TaqDNA聚合酶1.4^L，加滅菌雙蒸水補足到50pL，加入一滴礦物油,88X:變性510分鐘；(2)加入cDNA第1鏈產(chǎn)物5pL，進行PCR循環(huán)擴增；PCR擴增條件94"C3min;94'C50s,54'C30s,72"Cl.Omin，35個循環(huán)；72'C10min。全文摘要本發(fā)明公開了馬鈴薯病毒和類病毒的復(fù)合RT-PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒采用了特異的引物組合進行復(fù)合逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，可以快速、準(zhǔn)確、靈敏的同步檢測出馬鈴薯X病毒，馬鈴薯Y病毒，馬鈴薯A病毒，馬鈴薯S病毒，馬鈴薯卷葉病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。本發(fā)明試劑盒引入了來自馬鈴薯本身基因的mRNA作為內(nèi)對照，用于監(jiān)測馬鈴薯病毒和類病毒復(fù)合檢測的過程，解決了馬鈴薯病毒和類病毒復(fù)合RT-PCR分子檢測中易出現(xiàn)假陰性結(jié)果的問題，同時設(shè)置了無侵染活性的陽性對照，用于監(jiān)督試劑盒試劑的質(zhì)量。本發(fā)明試劑盒操作簡便、快速，成本低，可廣泛應(yīng)用于脫毒馬鈴薯種薯和種苗的室內(nèi)檢測、生產(chǎn)田檢測、抗毒病毒材料的鑒定、篩選及植物檢驗檢疫等方面。文檔編號C12Q1/70GK101210271SQ20061015612公開日2008年7月2日申請日期2006年12月27日優(yōu)先權(quán)日2006年12月27日發(fā)明者銘劉,吳志明,周巧梅,溫春秀,偉田,董文琦,謝曉亮,馬占元,高秀瑞申請人:河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所