專利名稱：快速高效檢測致病菌的方法、生物敏傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種快速高效檢測致病菌的方法、生物傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件屢有發(fā)生，無論發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家， 食源性致病菌發(fā)生率居高不下，食源性致病菌的快速檢測一直是國內(nèi)外研究關(guān)注的焦點(diǎn)。 現(xiàn)有技術(shù)一般采用如下的檢測方法對(duì)食源性致病菌進(jìn)行快速檢測方案一、傳統(tǒng)的微生物法，即GB13091-2002規(guī)定的檢測方法，一般需要以下五個(gè)連續(xù)的階段用非選擇性液體培養(yǎng)基預(yù)增菌16 20小時(shí)；在選擇性液體培養(yǎng)基上增菌24 小時(shí)；選擇性培養(yǎng)基上劃線識(shí)別24小時(shí)；分離，挑出菌落再次培養(yǎng)24小時(shí)；鑒定，用合適的生化和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定76h最終得出檢測結(jié)果。由上述步驟可以看出，傳統(tǒng)的微生物法檢測致病菌的步驟包括富集、選擇培養(yǎng)、分離、生化鑒定、有時(shí)還需要種型確定，需要5 7天才能出報(bào)告，耗時(shí)長，操作繁瑣。方案二、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，Polymerase Chain Reaction)法，如 SNT1869-—2007食品中多種致病菌快速檢測方法；公開號(hào)CN1536090A、名稱為“食源性致病菌快速檢測基因芯片及其應(yīng)用”的方案；公開號(hào)為CN1814789A、名稱為“畜禽肉和水產(chǎn)品中常見致病菌多重PCR快速檢測試劑盒及其檢測方法”等，上述PCR技術(shù)均需要經(jīng)過特定引物設(shè)計(jì)、增菌，DNA或PNA的制備，PCR擴(kuò)增、檢測等步驟。但PCR技術(shù)由于及其敏感，很容易受外界因素影響，一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。一方面，食品是復(fù)雜的反應(yīng)基質(zhì)，影響PCR反應(yīng)的因素很多，如果不能有效排除各影響因素的干擾，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；另一方面，如果在PCR操作過程中各種試驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致產(chǎn)物突變，還可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵因素，引物不同則擴(kuò)增物不同，如果引物的設(shè)計(jì)不當(dāng).則直接影響對(duì)關(guān)鍵靶序列的選擇，從而降低PCR檢測的靈敏度和特異性，甚至完全失敗。另外，PCR方法所需的試劑昂貴，有些還對(duì)人身體有害，并且檢測過程中操作繁瑣復(fù)雜，需要較長的檢測時(shí)間，總體檢測時(shí)間大于48 小時(shí)。方案三、ELISA方法，如GB/T22429-2008規(guī)定的檢測方法，包括對(duì)樣品做前增菌處理24小時(shí)，增菌液經(jīng)加熱處理后一如包被特異性抗體(一抗)的固相容器內(nèi)，使目標(biāo)菌與一抗結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他成分；加入特異性酶標(biāo)二抗，再次洗去未結(jié)合的其他成分； 加入特定底物與之反應(yīng)，生成熒光化合物或有色化合物，通過檢測熒光強(qiáng)度或吸光度，與參照值比較，經(jīng)過2. 5小時(shí)得出檢驗(yàn)結(jié)果。但ELISA方法也有其無法克服的缺點(diǎn)首先，該技術(shù)的操作技巧性較強(qiáng)，而且對(duì)關(guān)鍵點(diǎn)的控制對(duì)結(jié)果影響很大，在ELISA方法中重要的第一步加樣，樣品加入及混勻過程的誤差會(huì)在以下的諸多操作中被逐級(jí)放大，造成檢測結(jié)果偏差較大甚至出現(xiàn)假陽性和假陰性；其次，操作過程中易出現(xiàn)孔間交叉污染，出現(xiàn)假陽性；另夕卜，該方法檢測限較高，達(dá)到IO6Cfu (ColonyForming Units，菌落形成單位)/升。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速高效檢測致病菌的方法，可解決現(xiàn)有技術(shù)檢測限高、檢測時(shí)間較長、過程煩瑣、成本高等問題。本發(fā)明還提供了一種生物敏傳感器及其制備方法，以保證上述快速高效檢測致病菌的方法在實(shí)際中的應(yīng)用。為了解決上述問題，本發(fā)明公開了一種快速高效檢測致病菌的方法，包括生物敏傳感器制備步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)酶標(biāo)孔中將嗜熱菌超聲破碎后形成并標(biāo)記有PH敏感熒光探針的色素體，與β亞基單抗_生物素_鏈親和素_生物素_目標(biāo)檢測物單克隆抗體捕捉復(fù)合體按4 1的體積比例混合均勻，在40轉(zhuǎn)/分鐘、35 38°C條件下孵育1小時(shí)，得到具有捕獲檢測目標(biāo)能力的生物敏傳感器；檢測物捕獲步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)酶標(biāo)孔加入10微升制備好的生物敏傳感器，再加入20 100微升樣品檢測液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品陽性濃度對(duì)照，在35 38°C條件下孵育25 35分鐘，捕獲檢測目標(biāo)物；檢測步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)酶標(biāo)孔再加入70微升腺苷三磷酸合成緩沖液啟動(dòng)腺苷三磷酸合成反應(yīng)，在38 45°C溫度下溫浴10 15分鐘后，用熒光掃描儀進(jìn)行檢測；其中，所述熒光掃描儀的激發(fā)波長為485納米、發(fā)射波長為538納米；所述腺苷三磷酸合成緩沖液包括濃度為50毫摩爾/升的三(羥甲基)甲基甘氨酸，10%的丙三醇，濃度為5毫摩爾/升的磷酸二氫鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂，氫氧化鈉調(diào)pH值至8. 0，臨用前加入終濃度為2毫摩爾的腺苷二磷酸。優(yōu)選的，在所述檢測物捕獲步驟之前還包括樣品預(yù)處理步驟將按標(biāo)準(zhǔn)處理程序制備的檢測樣品進(jìn)行滅活處理，取1 10毫升震蕩混勻的滅活后的樣品溶液，進(jìn)行4000轉(zhuǎn) /分鐘、30分鐘的離心分離處理，將得到的菌體沉淀用無菌生理鹽水懸浮到原體積，再重復(fù)執(zhí)行上述分離和懸浮過程1次或2次后，震蕩混勻懸浮后的樣品溶液，形成樣品檢測液。優(yōu)選的，在所述檢測步驟之后還包括數(shù)據(jù)處理步驟參照空白組和陽性對(duì)照組對(duì)檢測樣品是否含有致病菌進(jìn)行定性判斷。優(yōu)選的，所述生物敏傳感器包括具有信號(hào)轉(zhuǎn)化功能的色素體和具有分子識(shí)別功能的捕獲體系，所述生物敏傳感器的制備方法具體包括色素體制備步驟在60 80°C高溫?fù)u床培養(yǎng)嗜熱菌20 24小時(shí)，然后在4°C、 4000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘，棄上清，收集菌體；得到的菌體用洗滌緩沖液重懸，然后在4°C、8000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘，收集清洗后的菌體，在功率為200瓦、循環(huán)接通5秒斷開9秒、有效時(shí)間為10分鐘的條件下進(jìn)行低溫超聲破碎；將超聲破碎后的菌液在4°C、12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘去除細(xì)胞碎片和部分雜蛋白，收集上清液再在 40C，40000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下超速離心1小時(shí)，將沉淀用三羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液懸浮，得到色素體懸液；其中，所述洗滌緩沖液包括50毫摩爾/升的三(羥甲基)甲基甘氨酸， 濃度為0. 25摩爾/升的蔗糖和濃度為4毫摩爾/升的氯化鎂，氫氧化鈉調(diào)pH值至8. 0 ；所述羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液包括濃度為20毫摩爾/升的羥甲基氨基甲烷，濃度為100 毫摩爾/升的氯化鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂和濃度為10%的甘油，氯化氫調(diào)pH值至 8. 0.
pH敏感熒光探針標(biāo)記步驟取色素體懸液600微升，在12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘去甘油，得到的沉淀用超聲緩沖液懸浮到原體積；然后加入1 2微升質(zhì)量濃度為1毫克/毫升的PH敏感熒光探針，混勻，在循環(huán)接通5秒斷開8秒有效時(shí)間為3分鐘的條件下水浴超聲，用超聲緩沖液補(bǔ)滿試管；然后在4°C、12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30 分鐘，用pH8. 0 8. 5的緩沖液懸浮沉淀，重復(fù)執(zhí)行離心、懸浮過程4次，后三次的離心時(shí)間為15分鐘，其他條件不變，最終完全去除游離的pH敏感熒光探針，得到標(biāo)記好的色素體；其中，所述超聲緩沖液為pH值5. 0 6. 0、濃度為0. 01毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷緩沖液；捕獲體系的構(gòu)建步驟將FOFl-ATP酶的β亞基的單抗與生物素、檢測目標(biāo)物的單抗與生物素均按3 2的連接比例混合，使得二種抗體的濃度均為為0.1毫克/毫升、生物素濃度為1微摩爾/升，室溫條件下等待半小時(shí)；然后，將FOFl-ATP酶的β亞基單抗-生物素復(fù)合體、檢測目標(biāo)物單抗_生物素復(fù)合體按1 1的體積比混勻后，加入1. 1倍體積1 微摩爾的鏈親和素，室溫條件下15 30分鐘后，得到具有捕獲能力的β亞基單抗-生物素_鏈親和素_生物素_目標(biāo)檢測物單克隆抗體組成的復(fù)合體；生物敏傳感器生成步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)孔中加入40微升的β單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標(biāo)檢測物單克隆抗體捕捉復(fù)合體，以及10微升標(biāo)記好的色素體，輕輕敲打混勻，在40轉(zhuǎn)/分鐘、35 38°C環(huán)境下孵育1小時(shí)，得到可以捕獲檢測目標(biāo)物的生物敏傳感器。優(yōu)選的，在所述捕獲體系的構(gòu)建步驟之前，還包括判斷所述FOFl-ATP酶的β亞基單抗溶液和檢測目標(biāo)物的單抗溶液中是否含有疊氮化鈉，若是，則使用ΡΗ8.0的磷酸鹽緩沖液透析去除其中的疊氮化鈉。 優(yōu)選的，在所述捕獲體系構(gòu)建步驟之前還包括β亞基單抗制備步驟以嗜熱菌基因組為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增FOFl-ATP酶的β亞基的基因序列，將β亞基的序列進(jìn)行克隆、外源表達(dá)、純化，再經(jīng)過單克隆抗體的制備得到FOFl-ATP酶的β亞基單克隆抗體。優(yōu)選的，所述FOFl-ATP酶的β亞基的序列為ATGACMGAGGACGCGTTATCCMGTCATGGGTCCGGTTGTAGACGTCMGTTTGAGMCGGCCACTTGCCGGCGATCTACMCGCCCTGAAMTTCMCATAMGCGCGCMCGAAMCGMGTCGACATCGACTTGACATTGGMGTCGCCTTGCACCTTGGCGATGATACAGTACGGACGATCGCGATGGCGTCCACAGACGGCCTCATCCGCGGCATGGMGTCATCGATACCGGTGCACCGATTTCGGTGCCGGTCGGCGMGTCACGCTTGGCCGCGTGTTCMCGTCTTGGGCGAGCCGATCGACTTGGMGGCGACATTCCGGCTGACGCCCGCCGCGACCCGATTCACCGTCCGGCGCCAAMTTCGAGGMTTGGCGACGGMGTCGAMTTTTGGAMCGGGGATTAMGTCGTTGACTTGCTTGCCCCGTATATTAMGGCGGAAAMTCGGTTTGTTCGGCGGCGCTGGCGTAGGMAMCGGTCTTGATTCMGAGCTGATCCACMCATCGCCCMGAGCACGGCGGGATTTCCGTCTTTGCTGGCGTCGGCGMCGGACGCGCGMGGAMCGACTTGTACCATGAGATGAMGATTCCGGCGTCATCAGCAMACGGCCATGGTGTTCGGACAMTGMTGAGCCGCCGGGGGCGCGGATGCGCGTCGCCTTGACCGGCTTGACGATGGCCGMTACTTCCGTGATGMCMGGCCMGACGTGTTGCTCTTTATCGATMCATCTTCCGTTTCACGCAGGCCGGTTCGGMGTGTCGGCGCTGTTAGGCCGCATGCCGTCGGCCGTTGGTTACCMCCGACATTGGCGACGGAGATGGGTCMTTGCMGAGCGGATCACGTCGACGGCGAMGGATCGATCACCTCGATTC
MGCGATTTACGTCCCGGCCGACGACTATACGGACCCGGCTCCGGCCACGACGTTCTCGCACTTGGATGCGACGACGMCCTGGAGCGGMGCTCGCGGAGATGGGGATTTATCCGGCCGTTGACCCGCTCGCTTCGACATCGCGTGCGTTGGCGCCGGAMTCGTCGGCGAGGAGCACTACCMGTCGCCCGCAMGTGCAGCAMCGCTGCMCGTTATAMGMTTGCMGACATCATCGCCATCTTGGGGATGGATGMCTGTCGGATGMGACMACTCGTCGTTCATCGCGCCCGCCGCATCCAGTTCTTCTTGTCGCAAMCTTCCACGTGGCGGAGCAGTTCACGGGCCMCCGGGCTCCTACGTGCCGGTGAMGAMCAGTGCGCGGCTTTAMGAMTTTTGGMGGCAMTACGACCATCTTCCGGMGATGCGTTCCGCTTAGTCGGCCGCATTGMGMGTCGTTGAAAMGCGMAGCGATGGGTGTCGAAGTGTGA。依據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例，還公開了一種生物敏傳感器，包括具有信號(hào)轉(zhuǎn)化功能的色素體和具有分子識(shí)別功能的捕獲體系，其中所述色素體為嗜熱菌超聲后細(xì)胞膜外翻形成的小囊泡，該小囊泡的膜上鑲嵌有FOFl-ATP酶，色素體細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記有pH敏感熒光探針；所述捕獲體系為FOFl-ATP酶的β亞基單抗與生物素連接形成的復(fù)合體，以及，檢測目標(biāo)物單抗與生物素連接形成的復(fù)合體，通過鏈親和素連接得到的β亞基單抗-生物素_鏈親和素_生物素_目標(biāo)檢測物單克隆抗體捕捉復(fù)合體。依據(jù)本發(fā)明的還一優(yōu)選實(shí)施例，公開了一種生物敏傳感器的制備方法，包括色素體制備步驟在60 80°C高溫?fù)u床培養(yǎng)嗜熱菌20 24小時(shí)，然后在4°C、 4000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘，棄上清，收集菌體；得到的菌體用洗滌緩沖液重懸，然后在4°C、8000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘，收集清洗后的菌體，在功率為200瓦、循環(huán)接通5秒斷開9秒、有效時(shí)間為10分鐘的條件下進(jìn)行低溫超聲破碎；將超聲破碎后的菌液在4°C、12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘去除細(xì)胞碎片和部分雜蛋白，收集上清液再在 440000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下超速離心1小時(shí)，將沉淀用羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液懸浮，得到色素體懸液；其中，所述洗滌緩沖液所述洗滌緩沖液包括50毫摩爾/升的三(羥甲基)甲基甘氨酸，濃度為0. 25摩爾/升的蔗糖和濃度為4毫摩爾/升的氯化鎂，氫氧化鈉調(diào)PH值至8. 0 ；所述羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液包括濃度為20毫摩爾/升的羥甲基氨基甲烷，濃度為100毫摩爾/升的氯化鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂和濃度為10%的甘油，氯化氫調(diào)PH值至8. 0 ；pH敏感熒光探針標(biāo)記步驟取色素體懸液600微升，在12000 轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘去甘油，得到的沉淀用超聲緩沖液懸浮到原體積；然后加入 1 2微升質(zhì)量濃度為1毫克/毫升的pH敏感熒光探針，混勻，在循環(huán)接通5秒斷開8秒有效時(shí)間為3分鐘的條件下進(jìn)行0 4°C水浴下超聲，之后用濃度為10毫摩爾/升的磷酸鹽緩沖液補(bǔ)滿試管；然后在4°C、12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘，用pH8. 0 8. 5的緩沖液懸浮沉淀，重復(fù)執(zhí)行離心、懸浮過程4次，后三次的離心時(shí)間為15分鐘，其他條件不變，最終完全去除游離的PH敏感熒光探針，得到標(biāo)記好的色素體；其中，所述超聲緩沖液為 pH值5. 0 6. 0、濃度為0. 01毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷緩沖液；捕獲體系的構(gòu)建步驟將FOFl-ATP酶的β亞基的單抗與生物素、檢測目標(biāo)物的單抗與生物素均按3 2的連接比例混合，使得二種抗體的濃度均為為0.1毫克/毫升、生物素濃度為1微摩爾/升，室溫條件下等待半小時(shí)；然后，將FOFl-ATP酶的β亞基單抗-生物素復(fù)合體、檢測目標(biāo)物單抗_生物素復(fù)合體按1 1的體積比混勻后，加入1. 1倍體積1 微摩爾的鏈親和素，室溫條件下15 30分鐘后，得到具有捕獲目標(biāo)檢測物功能的β亞基單抗_生物素_鏈親和素_生物素_目標(biāo)檢測物單克隆抗體組成的復(fù)合體
生物敏傳感器生成步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)孔中加入40微升的β單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標(biāo)檢測物單克隆抗體捕捉復(fù)合體，以及10微升標(biāo)記好的色素體，輕輕敲打混勻，在40轉(zhuǎn)/分鐘、35 38°C環(huán)境下孵育1小時(shí)，得到可以捕獲檢測目標(biāo)物的生物敏傳感器。優(yōu)選的，在所述捕獲體系構(gòu)建步驟之前還包括β亞基單抗制備步驟以嗜熱菌基因組為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增FOFl-ATP酶的β亞基的基因序列，將β亞基的序列進(jìn)行克隆、外源表達(dá)、純化，再經(jīng)過單克隆抗體的制備得到FOFl-ATP酶的β亞基單克隆抗體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)首先，本發(fā)明方案的檢測限低，檢測時(shí)間短。其檢測限可達(dá)到IOOcfu/孔，若按 lcfu/25g計(jì)算，整個(gè)檢測過程不超過12小時(shí)，至少比常規(guī)的微生物檢驗(yàn)方法縮短60小時(shí)， 比PCR方法縮短36小時(shí)；當(dāng)菌濃度高于lCfU//25g時(shí)，所需時(shí)間更短，因此，可對(duì)食品安全和治病菌控制產(chǎn)生深刻影響。其次，本發(fā)明方案所需試
第三，本發(fā)明方案還具有前增菌時(shí)間短、操作簡單(僅包括生物敏傳感器制備、力口樣和啟動(dòng)反應(yīng)、檢測等三個(gè)步驟，而且每批次可以檢測多個(gè)樣品)、可避免現(xiàn)有PCR檢測方法因外界因素影響而出現(xiàn)假隱性或假陽性檢測結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。另外，本發(fā)明方案不僅可參照空白組和陽性對(duì)照組對(duì)被檢測物進(jìn)行致病菌類的檢測，還根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)熒光強(qiáng)度建立的曲線對(duì)被檢測物進(jìn)行藥殘類檢測。


圖1是本發(fā)明生物敏傳感器制備方法一實(shí)施例所制備的色素體結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明生物敏傳感器制備方法一實(shí)施例PH敏感熒光探針單方向標(biāo)記色素體過程示意圖；圖3是本發(fā)明生物敏傳感器制備方法一實(shí)施例捕獲體系構(gòu)建過程示意圖；圖4是本發(fā)明生物敏傳感器一實(shí)施例基于FOFl-ATP酶的生物敏傳感器的模型示意圖；其中，41-酶標(biāo)孔；42-膜上負(fù)載有FOFl-ATP酶的色素體；43-F0F1-ATP酶；44_pH 敏感熒光探針；45-F0F1-ATP酶的β亞基單抗；46-生物素；47-鏈親和素；48-目標(biāo)檢測物單克隆抗體。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。本發(fā)明的核心構(gòu)思之一在于利用FOFl-ATP(Adenosine-Triphosphate，腺苷三磷酸)酶獨(dú)有的酶活機(jī)理研發(fā)了高靈敏生物傳感器FOFl-ATP酶的致病菌檢測技術(shù)。 FOFl-ATP酶是一旋轉(zhuǎn)分子馬達(dá)，它既能利用跨膜H+梯度合成ATP，又能水解ATP而反向轉(zhuǎn)運(yùn) H+。在ATP合成過程中，質(zhì)子能夠從色素體膜內(nèi)泵到膜外側(cè)，導(dǎo)致內(nèi)膜微環(huán)境溶液H+濃度變化。在FOFl-ATP酶上連接負(fù)載會(huì)不同程度影響其旋轉(zhuǎn)性能，在其β亞基上連接上不同負(fù)載引起質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)速率的改變不同。以PH敏感的熒光探針來感應(yīng)負(fù)載，其熒光強(qiáng)度作為信號(hào)反應(yīng)并定量負(fù)載情況，最終達(dá)到檢測目的。本發(fā)明方案中生物敏傳感器中生物識(shí)別元件為單克隆抗體，信號(hào)轉(zhuǎn)換元件為光學(xué)元件。其基本原理為待測物質(zhì)和分子識(shí)別元件特異性結(jié)合，發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的生物學(xué)信息通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為可以定量處理的光信號(hào)，再經(jīng)儀表放大和輸出，從而達(dá)到分析檢測的目的。生物敏傳感器分析技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有選擇性好、靈敏度高、 分析速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)食品安全和致病菌疾病爆發(fā)的預(yù)防具有重大意義。在食品污染物的快速實(shí)時(shí)及特異性檢測方面有廣闊的應(yīng)用前景。生物敏傳感器及其制備方法實(shí)施例一種檢測致病菌的生物敏傳感器，包括(1)具有信號(hào)轉(zhuǎn)化功能的色素體。從嗜熱菌制備得到的色素體，是嗜熱菌超聲后細(xì)胞膜外翻形成的小囊泡，該囊泡膜上鑲嵌的 FOFl-ATP酶也隨之外翻——疏水端暴露。(2)具有分子識(shí)別功能的捕獲體系。該生物敏傳感器可采用如下步驟制備步驟一、嗜熱菌ATPase的β亞基的外源表達(dá)與純化以嗜熱菌(Thermomicrobium ATCC27502)基因組為模板，以PCR方法擴(kuò)增 FOFl-ATP酶的β亞基，然后對(duì)擴(kuò)增基因測序并進(jìn)行序列比對(duì)，確定所擴(kuò)增基因?yàn)镕OFl-ATP 酶的β亞基，其序列為 ATGACMGAGGACGCGTTATCCMGTCATGGGTCCGGTTGTAGACGTCMGTTTGAGMCGGCCACTTGCCGGCGATCTACMCGCCCTGAAMTTCMCATAMGCGCGCMCGAAMCGMGTCGACATCGACTTGACATTGGMGTCGCCTTGCACCTTGGCGATGATACAGTACGGACGATCGCGATGGCGTCCACAGACGGCCTCATCCGCGGCATGGMGTCATCGATACCGGTGCACCGATTTCGGTGCCGGTCGGCGMGTCACGCTTGGCCGCGTGTTCMCGTCTTGGGCGAGCCGATCGACTTGGMGGCGACATTCCGGCTGACGCCCGCCGCGACCCGATTCACCGTCCGGCGCCAAMTTCGAGGMTTGGCGACGGMGTCGAMTTTTGGAMCGGGGATTAMGTCGTTGACTTGCTTGCCCCGTATATTAMGGCGGAAAMTCGGTTTGTTCGGCGGCGCTGGCGTAGGMAMCGGTCTTGATTCMGAGCTGATCCACMCATCGCCCMGAGCACGGCGGGATTTCCGTCTTTGCTGGCGTCGGCGMCGGACGCGCGMGGAMCGACTTGTACCATGAGATGAMGATTCCGGCGTCATCAGCAMACGGCCATGGTGTTCGGACAMTGMTGAGCCGCCGGGGGCGCGGATGCGCGTCGCCTTGACCGGCTTGACGATGGCCGMTACTTCCGTGATGMCMGGCCMGACGTGTTGCTCTTTATCGATMCATCTTCCGTTTCACGCAGGCCGGTTCGGMGTGTCGGCGCTGTTAGGCCGCATGCCGTCGGCCGTTGGTTACCMCCGACATTGGCGACGGAGATGGGTCMTTGCMGAGCGGATCACGTCGACGGCGAMGGATCGATCACCTCGATTCMGCGATTTACGTCCCGGCCGACGACTATACGGACCCGGCTCCGGCCACGACGTTCTCGCACTTGGATGCGACGACGMCCTGGAGCGGMGCTCGCGGAGATGGGGATTTATCCGGCCGTTGACCCGCTCGCTTCGACATCGCGTGCGTTGGCGCCGGAMTCGTCGGCGAGGAGCACTACCMGTCGCCCGCAMGTGCAGCAMCGCTGCMCGTTATAMGMTTGCMGACATCATCGCCATCTTGGGGATGGATGMCTGTCGGATGMGACMACTCGTCGTTCATCGCGCCCGCCGCATCCAGTTCTTCTTGTCGCAAMCTTCCACGTGGCGGAGCAGTTCACGGGCCMCCGGGCTCCTACGTGCCGGTGAMGAMCAGTGCGCGGCTTTAMGAMTTTTGGMGGCAMTACGACCATCTTCCGGMGATGCGTTCCGCTTAGTCGGCCGCATTGMGMGTCGTTGAAAMGCGMAGCGATGGGTGTCGAAGTGTGA。對(duì)此序列分子克隆、外源表達(dá)，純化，進(jìn)行單克隆抗體制備。制備得到的單克隆抗體進(jìn)行分子篩純化，備用。因得到的β亞基需要為期半年左右的單克隆抗體制備過程，方可得到該亞基單抗，因此本步驟需要在生物敏傳感器制備之前預(yù)先執(zhí)行。步驟二、色素體的制備在60 80 °C 高溫?fù)u床培養(yǎng)嗜熱菌(Thermomicrobium ATCC27502) 20 24h (Hour,小時(shí))。然后在 4 "C >4000rpm(Revolutions Per Minute,轉(zhuǎn) / 分鐘)條件下離心30min(Minute，分鐘)，棄上清，收集沉淀菌體。菌體用洗滌緩沖液(50mmol/L tricine-NaOH, ρΗ8· 0，0. 25mol/L 蔗糖，4mmol/L MgCl2 緩沖液)重懸，在 4 °C、8000rpm 條件下離心lOmin，收集清洗后的菌體進(jìn)行低溫超聲破碎(200w，on 5s, off 9s，有效時(shí)間 IOmin)。超聲破碎后的菌液在4°C、12000rpm條件下離心30min去除細(xì)胞碎片和部分雜蛋白，收集上清液再在4°C，40000rpm條件下進(jìn)行超速離心lh，沉淀即為色素體。所得色素體用 Tris-HCl 緩沖液(20mmol/L Tris-Cl, 100mmol/L NaCl,5mmol/L MgCl2,10% 甘油， pH8. 0)懸浮備用。該色素體的結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括超聲過程中細(xì)胞膜外翻形成的囊泡和 F0F1-ATP酶；該囊泡不僅是F0F1-ATP酶的載體，同時(shí)為該酶提供質(zhì)子庫，而膜內(nèi)外的質(zhì)子梯差是該酶合成ATP的動(dòng)力；F0F1-ATP酶包括Cn (10彡η彡14)環(huán)、以及α、β、δ、γ、 ε、a、b2亞基，在本發(fā)明方案中，選擇在F0F1-ATP酶的活性部位(即β亞基上)負(fù)載目標(biāo)檢測物。步驟三、用ρΗ敏感熒光探針F1300單方向標(biāo)記色素體及標(biāo)記后水解活性測定取步驟二制備的色素體懸液600 μ L，在12000rpm條件下離心30min去甘油，所得的沉淀用超聲緩沖液(ρΗ5· 0 6. 0,0. Olmmol/L Tris-HCl)懸浮到原體積。然后加入1 2口1^質(zhì)量濃度為111^/1^的？1300熒光探針，混勻，在0 41水浴下超聲(小功率下On 5s, Off 8s，有效時(shí)間3min)。超聲完成后用單倍磷酸鹽緩沖液(1XPBS，Phosphate Buffered Saline)補(bǔ)滿試管，然后在4°C、12000rpm條件下離心30min，用pH8. 0-8. 5緩沖液懸浮沉淀，重復(fù)4次，后三次離心時(shí)間為15min，其他條件不變，最終完全去除游離F1300探針，得到標(biāo)記好的色素體(以下簡稱F1300-ch)。標(biāo)記流程如圖2所示，包括加入熒光探針步驟21、 低PH值條件下超聲步驟22以及離心去除游離探針步驟23。需要說明的是，由于超聲放熱，為保證0 4°C的水浴條件，可選擇在水中放冰。F1300-ch的ATP水解活性測定可采用酶偶聯(lián)法，通過檢測NADH在340nm波長處的吸光度變化來測定ATPase水解活力。1個(gè)酶活單位定義為每毫克色素體每分鐘內(nèi)可水解 lymol ATP0步驟四、具有分子識(shí)別功能的捕獲體系的構(gòu)建將F0F1-ATP酶的β亞基的單抗(步驟一制備)與生物素、檢測目標(biāo)物的單抗與生物素的連接比例均按3 2混合，室溫半小時(shí)。其中抗體濃度為0. lmg/mL;生物素濃度為1 μ mol/L。如果抗體的儲(chǔ)存液中含有疊氮化鈉(NaN3)，使用前先采用pH8. 0的磷酸鹽緩沖液透析去除NaN3。F0F1-ATP酶的β亞基單抗-生物素、檢測目標(biāo)物單抗-生物素兩復(fù)合體按1 1 體積比混勻后，加入1. 1倍體積1 μ mol的鏈親和素，室溫15 30min。得到具有捕獲目標(biāo)檢測物的β亞基單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標(biāo)檢測物單克隆抗體組成的復(fù)合體。上述捕獲體系的構(gòu)建過程如圖3所示。步驟五、生物敏傳感器的完成
在酶標(biāo)板每孔中加入40 μ Li3單抗-生物素_鏈親和素-生物素-目標(biāo)檢測物單克隆抗體捕捉復(fù)合體，10 μ IL F1300-ch，輕輕敲打混勻。在40rpm、35 38°C (優(yōu)選采用 370C )條件下孵育lh，得到可以捕獲檢測目標(biāo)的生物敏傳感器，該生物敏傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示。利用生物敏傳感器檢測樣品中致病菌的方法實(shí)施例步驟一、樣品預(yù)處理

將參照GB/T 4789. 30規(guī)定的程序制備的檢測樣品進(jìn)行滅活處理，取1 IOmL震蕩混勻的滅活后的樣品溶液，進(jìn)行4000rpm、30min的離心分離處理，將得到的菌體沉淀用無菌生理鹽水懸浮到原體積，再重復(fù)執(zhí)行上述分離和懸浮過程1次或2次后，震蕩混勻懸浮后的樣品溶液，形成樣品檢測液。需要說明的是，不同的致病菌滅活的溫度和需要滅活的時(shí)間都是不同的，需要選擇最溫和的滅活條件，來保證對(duì)其破壞降低到最低限度，如0157 :H7菌55°C、5 20min即可滅活；單增李斯特70 80°C、20 30min即可滅活；而金黃色葡萄球菌一般需要80°C、 Ih滅活。步驟二、檢測物的捕獲在酶標(biāo)板的每個(gè)酶標(biāo)孔加入10 μ L前述生物敏傳感器制備步驟制備好的生物敏傳感器，再加入20μ L IOOyL樣品處理液。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品陽性對(duì)照，35°C 38°C孵育25 35min (優(yōu)選采用37°C孵育30min)，捕獲檢測目標(biāo)物。步驟三、檢測在酶標(biāo)板的每孔再加入70 μ L ATP合成緩沖液(50mmol/L Tricine_Na0HpH8. 0、 10%丙三醇、5mmol/L NaH2PO4、5mmol/L MgCl2,臨用前加入終濃度為2mmol腺苷二磷酸ADP) 啟動(dòng)ATP合成反應(yīng)，38 45°C溫浴10 15min (優(yōu)選采用45°C溫浴15min)后用熒光掃描儀進(jìn)行檢測，選擇激發(fā)波長485nm、發(fā)射波長538nm。步驟四、數(shù)據(jù)處理參照空白組和陽性對(duì)照組對(duì)檢測物中的致病菌進(jìn)行定性判斷。需要說明的是，通過本發(fā)明方案，還可以根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)熒光強(qiáng)度建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)食品中抗生素、藥殘情況進(jìn)行定量判斷。下面，以食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測方法為例，具體說明利用生物敏傳感器檢測食源性致病菌的方法，包括步驟一、樣品預(yù)處理參照GB/T 4789. 30規(guī)定的程序，制備檢測樣品，并進(jìn)行增菌培養(yǎng)；其中，增菌的處理過程具體為增菌液60 70°C，進(jìn)行5 20min滅活，然后取1 IOmL震蕩混勻的滅活后的增菌液，在4000rpm、30min條件下進(jìn)行分離，所得菌體沉淀用無菌生理鹽水懸浮到原體積，重復(fù)操作分離和懸浮過程兩次。第三次離心得到的菌體，用無菌生理鹽水懸浮到原體積，震蕩混勻，作為檢測液備用。步驟二、陽性對(duì)照培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC15313) 18 24h，將菌液梯度稀釋后涂板計(jì)數(shù)，算出標(biāo)準(zhǔn)菌液濃度為5. 03X 108cfu/mL，標(biāo)準(zhǔn)菌株液體的增菌處理過程與前述增菌過程相同。沉淀的菌體恢復(fù)至原體積后梯度稀釋得到5X 103、5X 104、5X IO5CfVmL的陽性對(duì)照。需要說明的是，由于對(duì)致病菌檢測為定性檢測，理論上講只需要一組陽性對(duì)照即可，這里設(shè)計(jì)多個(gè)陽性對(duì)照組，是為了更好的說明本技術(shù)方案的可行性。步驟三、FOFl-ATP酶免疫生物傳感器的制備首先，進(jìn)行制備色素體，并進(jìn)行熒光標(biāo)記，具體步驟為在60°C 高溫?fù)u床培養(yǎng)嗜熱菌(Thermomicrobium ATCC27502) 24h，然后在 4 °C、 4000rpm的條件下離心30min，棄上清，收集菌體；得到的菌體用洗滌緩沖液(50mmol/L tricine-NaOH, pH8. 0,0. 25mol/L 蔗糖，4mmol/L MgCl2 緩沖液)重懸，然后在 4°C、8000rpm 的條件下離心lOmin，收集清洗后的菌體，在功率為200w、0N 5s,OFF 9s、有效時(shí)間為IOmin 的條件下進(jìn)行低溫超聲破碎；將超聲破碎后的菌液在4°C、12000rpm的條件下離心30min去除細(xì)胞碎片和部分雜蛋白，收集上清液再在4°C，40000rpm的條件下超速離心lh，將沉淀用 Tris-HCl 緩沖液(20mmol/L Tris-Cl, 100mmol/L NaCl,5mmol/L MgCl2,10%甘油，pH8. 0) 懸浮，得到色素體懸液，pH敏感熒光探針標(biāo)記步驟取色素體懸液600μ ，在12000rpm的條件下離心 30min去甘油，得到的沉淀用超聲緩沖液(pH5. 0 6. 0,0. 01mmol/LTris-HCl)超聲懸浮到原體積；然后加入IpL質(zhì)量濃度為lmg/mL的pH敏感熒光探針F1300，混勻，在小功率下 ON 5s、OFF 8s、有效時(shí)間為3min的條件下水浴超聲，用超聲緩沖液補(bǔ)滿試管；然后在4°C、 12000rpm的條件下離心30min，用pH8. 0 8. 5的緩沖液懸浮沉淀，重復(fù)執(zhí)行離心、懸浮過程4次，后三次的離心時(shí)間為15min，其他條件不變，最終完全去除游離的pH敏感熒光探針， 得到標(biāo)記好的色素體；其次，是捕獲體系的建立步驟將F0F1-ATP酶的β亞基的單抗與生物素、檢測目標(biāo)物的單抗與生物素均按3 2 的連接比例混合，使得二種抗體的濃度均為為0. lmg/mL、生物素濃度為lymol/L，室溫條件下等待半小時(shí)；然后，將F0F1-ATP酶的β亞基單抗-生物素復(fù)合體、檢測目標(biāo)物單抗-生物素復(fù)合體按1 1的體積比混勻后，加入1.1倍體積1微摩爾的鏈親和素，室溫條件下15 分鐘后，得到具有捕獲目標(biāo)檢測物的β亞基單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標(biāo)檢測物單克隆抗體組成的復(fù)合體；第三，F(xiàn)0F1-ATP酶免疫生物傳感器的完成生物敏傳感器生成步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)孔中加入40 μ L的β單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標(biāo)檢測物單克隆抗體捕捉復(fù)合體，以及10 μ L標(biāo)記好的色素體，輕輕敲打混勻，在40rpm、35 38°C環(huán)境下孵育lh，得到可以捕獲檢測目標(biāo)物的生物敏傳感器。步驟四、檢測首先，在酶標(biāo)板的酶標(biāo)孔中加樣，包括樣品檢測液、5X 103Cfu/mL陽性對(duì)照、5X 104cfu/mL陽性對(duì)照、5X 105cfu/mL的陽性對(duì)照、空白對(duì)照(無菌生理鹽水)共五組，選用英國Corning公司酶標(biāo)板，每組設(shè)置10個(gè)平行孔，每孔加入20 μ L，五組分別對(duì)應(yīng)“未知數(shù)量”cfu/孔，IO2Cfu/孔，IO3Cfu/孔，IO4Cfu/ 孔和 Ocfu/ 孔，37 °C 孵育 30min。然后，啟動(dòng)合成反應(yīng)并記錄檢測結(jié)果每孔再加入70 μ L終濃度為2mmol/L ADP的ATP合成緩沖液(50mmol/LTricine
14ρΗ8· 0、10%丙三醇、5mmol/L NaH2PO4、5mmol/L MgCl2)啟動(dòng) ATP 合成反應(yīng)，45°C溫浴 15min， 選擇激發(fā)波長485nm、發(fā)射波長538nm進(jìn)行反應(yīng)后相對(duì)熒光值的檢測。步驟五、檢測結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種快速高效檢測致病菌的方法，其特征在于，包括生物敏傳感器制備步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)酶標(biāo)孔中將嗜熱菌超聲破碎后形成并標(biāo)記有 PH敏感熒光探針的色素體，與β亞基單抗-生物素-鏈親和素-生物素-目標(biāo)檢測物單克隆抗體組成的捕捉復(fù)合體按4 1的體積比例混合均勻，在40轉(zhuǎn)/分鐘、35 38°C條件下孵育1小時(shí)，得到具有捕獲目標(biāo)檢物能力的生物敏傳感器；檢測物捕獲步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)酶標(biāo)孔加入10微升制備好的生物敏傳感器，再加入 20 100微升樣品檢測液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品陽性對(duì)照，在35 38°C條件下孵育 25 35分鐘，捕獲目標(biāo)檢測物；檢測步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)酶標(biāo)孔再加入70微升腺苷三磷酸合成緩沖液啟動(dòng)腺苷三磷酸合成反應(yīng)，在38 45°C溫度下溫浴10 15分鐘后，用熒光掃描儀進(jìn)行檢測；其中，檢測用到熒光掃描儀的激發(fā)波長為485納米、發(fā)射波長為538納米；所述腺苷三磷酸合成緩沖液包括濃度為50毫摩爾/升、pH值為8. 0的離子緩沖劑，10%的丙三醇，濃度為5毫摩爾/ 升的磷酸二氫鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂，臨用前加入2毫摩爾的腺苷二磷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，在所述檢測物捕獲步驟之前還包括樣品預(yù)處理步驟將按標(biāo)準(zhǔn)處理程序制備的檢測樣品進(jìn)行滅活處理，取1 10毫升震蕩混勻的滅活后的樣品溶液，進(jìn)行4000轉(zhuǎn)/分鐘、30分鐘的離心分離處理，將得到的菌體沉淀用無菌生理鹽水懸浮到原體積，再重復(fù)執(zhí)行上述分離和懸浮過程1次或2次后，震蕩混勻懸浮后的樣品溶液，形成樣品檢測液。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，在所述檢測步驟之后還包括數(shù)據(jù)處理步驟參照空白組和陽性對(duì)照組對(duì)檢測樣品是否含有致病菌進(jìn)行定性判斷。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述生物敏傳感器包括具有信號(hào)轉(zhuǎn)化功能的色素體和具有分子識(shí)別功能的捕獲體系，所述生物敏傳感器的制備方法具體包括色素體制備步驟在60 80°C高溫?fù)u床培養(yǎng)嗜熱菌20 24小時(shí)，然后在4°C、4000 轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘，棄上清，收集菌體；得到的菌體用洗滌緩沖液重懸，然后在 48000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘，收集清洗后的菌體，在功率為200瓦、循環(huán)接通5 秒斷開9秒、有效時(shí)間為10分鐘的條件下進(jìn)行低溫超聲破碎；將超聲破碎后的菌液在4°C、 12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘去除細(xì)胞碎片和大部分雜蛋白，收集上清液再在4°C， 40000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下超速離心1小時(shí)，將沉淀用三羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液懸浮， 得到色素體懸液；其中，所述洗滌緩沖液包括濃度為50毫摩爾/升的三(羥甲基)甲基甘氨酸，濃度為0. 25摩爾/升的蔗糖和濃度為4毫摩爾/升的氯化鎂，氫氧化鈉調(diào)pH值至 8.0;所述羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液包括濃度為20毫摩爾/升的羥甲基氨基甲烷，濃度為100毫摩爾/升的氯化鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂和濃度為10%的甘油，氯化氫調(diào) pH值至8. 0 ；PH敏感熒光探針標(biāo)記步驟取色素體懸液600微升，在12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心 30分鐘去甘油，得到的沉淀用超聲緩沖液懸浮到原體積；然后加入1 2微升質(zhì)量濃度為1 毫克/毫升的PH敏感熒光探針，混勻，在循環(huán)接通5秒斷開8秒有效時(shí)間為3分鐘的條件下水浴超聲，用超聲緩沖液補(bǔ)滿試管；然后在4°C、12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘，用 PH8. 0 8. 5的緩沖液懸浮沉淀，重復(fù)執(zhí)行離心、懸浮過程4次，后三次的離心時(shí)間為15分鐘，其他條件不變，最終完全去除游離的PH敏感熒光探針，得到標(biāo)記好的色素體；其中，所述超聲緩沖液為pH值5. O 6. O、濃度為0. 01毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液；捕獲體系的構(gòu)建步驟將FOFl-ATP酶的β亞基的單抗與生物素、檢測目標(biāo)物的單抗與生物素均按3 2的連接比例混合，使得二種抗體的濃度均為0.1毫克/毫升、生物素濃度為1微摩爾/升，室溫條件下等待半小時(shí)；然后，將FOFl-ATP酶的β亞基單抗-生物素復(fù)合體、檢測目標(biāo)物單抗-生物素復(fù)合體按1 1的體積比混勻后，加入1.1倍體積濃度為1 微摩爾/升的鏈親和素，室溫條件下15 30分鐘后，得到β亞基單抗-生物素-鏈親和素_生物素_目標(biāo)檢測物單克隆抗體組成的捕捉復(fù)合體；生物敏傳感器生成步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)孔中加入40微升的β單抗-生物素-鏈親和素_生物素_目標(biāo)檢測物單克隆抗體捕捉復(fù)合體，以及10微升標(biāo)記好的色素體，輕輕敲打混勻，在40轉(zhuǎn)/分鐘、35 38°C環(huán)境下孵育1小時(shí)，得到可以捕獲檢測目標(biāo)物的生物敏傳感器。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，在所述捕獲體系構(gòu)建步驟之前還包括 β亞基單抗制備步驟以嗜熱菌基因組為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增FOFl-ATP酶的β亞基的基因序列，將β亞基的序列進(jìn)行克隆、外源表達(dá)、純化，最后通過單克隆抗體的制備得到FOFl-ATP酶的β亞基單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述FOFl-ATP酶的β亞基的序列為 ATGACAAGAGGACGCGTTATCCAAGTCATGGGTCCGGTTGTAGACGTCAAGTTTGAGAACGGCCACTTGC CGGCGATCTACAACGCCCTGAAAATTCAACATAAAGCGCGCAACGAAAACGAAGTCGACATCGACTTGAC ATTGGAAGTCGCCTTGCACCTTGGCGATGATACAGTACGGACGATCGCGATGGCGTCCACAGACGGCCTC ATCCGCGGCATGGAAGTCATCGATACCGGTGCACCGATTTCGGTGCCGGTCGGCGAAGTCACGCTTGGCC GCGTGTTCAACGTCTTGGGCGAGCCGATCGACTTGGAAGGCGACATTCCGGCTGACGCCCGCCGCGACCC GATTCACCGTCCGGCGCCAAAATTCGAGGAATTGGCGACGGAAGTCGAAATTTTGGAAACGGGGATTAAA GTCGTTGACTTGCTTGCCCCGTATATTAAAGGCGGAAAAATCGGTTTGTTCGGCGGCGCTGGCGTAGGAA AAACGGTCTTGATTCAAGAGCTGATCCACAACATCGCCCAAGAGCACGGCGGGATTTCCGTCTTTGCTGG CGTCGGCGAACGGACGCGCGAAGGAAACGACTTGTACCATGAGATGAAAGATTCCGGCGTCATCAGCAAA ACGGCCATGGTGTTCGGACAAATGAATGAGCCGCCGGGGGCGCGGATGCGCGTCGCCTTGACCGGCTTGA CGATGGCCGAATACTTCCGTGATGAACAAGGCCAAGACGTGTTGCTCTTTATCGATAACATCTTCCGTTT CACGCAGGCCGGTTCGGAAGTGTCGGCGCTGTTAGGCCGCATGCCGTCGGCCGTTGGTTACCAACCGACA TTGGCGACGGAGATGGGTCAATTGCAAGAGCGGATCACGTCGACGGCGAAAGGATCGATCACCTCGATTC AAGCGATTTACGTCCCGGCCGACGACTATACGGACCCGGCTCCGGCCACGACGTTCTCGCACTTGGATGC GACGACGAACCTGGAGCGGAAGCTCGCGGAGATGGGGATTTATCCGGCCGTTGACCCGCTCGCTTCGACA TCGCGTGCGTTGGCGCCGGAAATCGTCGGCGAGGAGCACTACCAAGTCGCCCGCAAAGTGCAGCAAACGC TGCAACGTTATAAAGAATTGCAAGACATCATCGCCATCTTGGGGATGGATGAACTGTCGGATGAAGACAA ACTCGTCGTTCATCGCGCCCGCCGCATCCAGTTCTTCTTGTCGCAAAACTTCCACGTGGCGGAGCAGTTC ACGGGCCAACCGGGCTCCTACGTGCCGGTGAAAGAAACAGTGCGCGGCTTTAAAGAAATTTTGGAAGGCA AATACGACCATCTTCCGGAAGATGCGTTCCGCTTAGTCGGCCGCATTGAAGAAGTCGTTGAAAAAGCGAA AGCGATGGGTGTCGAAGTGTGA。
7.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，在所述捕獲體系的構(gòu)建步驟之前，還包括判斷所述FOFl-ATP酶的β亞基單抗溶液和檢測目標(biāo)物的單抗溶液是否含有疊氮化鈉，若是，則使用ΡΗ8. 0的磷酸鹽緩沖液透析去除其中的疊氮化鈉。
8.一種用于致病菌檢測的生物敏傳感器，其特征在于，包括具有信號(hào)轉(zhuǎn)化功能的色素體和具有分子識(shí)別功能的捕獲體系，其中所述色素體為嗜熱菌超聲后細(xì)胞膜外翻形成的小囊泡，該小囊泡的膜上鑲嵌有 FOFl-ATP酶，色素體細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記有ρΗ敏感熒光探針；所述捕獲體系為FOFl-ATP酶的β亞基單抗與生物素連接形成的復(fù)合體，以及，檢測目標(biāo)物單抗與生物素連接形成的復(fù)合體，通過鏈親和素連接得到的β亞基單抗-生物素-鏈親和素_生物素_目標(biāo)檢測物單克隆抗體具有捕捉功能的復(fù)合體。
9.一種用于食品安全檢測的生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括色素體制備步驟在60 80°C高溫?fù)u床培養(yǎng)嗜熱菌20 24小時(shí)，然后在4°C、4000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘，棄上清，收集菌體；得到的菌體用洗滌緩沖液重懸，然后在4°C、8000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘，收集清洗后的菌體，在功率為200瓦、循環(huán)接通5秒斷開9秒、有效時(shí)間為10分鐘的條件下進(jìn)行低溫超聲破碎；將超聲破碎后的菌液在4°C、12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘去除細(xì)胞碎片和部分雜蛋白，收集上清液再在4°C，40000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下超速離心1小時(shí)，將沉淀用羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液懸浮，得到色素體懸液；其中，所述洗滌緩沖液包括50毫摩爾/升的三(羥甲基)甲基甘氨酸，濃度為0. 25摩爾/升的蔗糖和濃度為4毫摩爾/升的氯化鎂，氫氧化鈉調(diào)ρΗ值至8. 0 ；所述羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液包括濃度為20毫摩爾/升的羥甲基氨基甲烷，濃度為100毫摩爾/升的氯化鈉， 濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂和濃度為10%的甘油，氯化氫調(diào)ρΗ值至8. 0 ；PH敏感熒光探針標(biāo)記步驟取色素體懸液600微升，在12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心 30分鐘去甘油，得到的沉淀用超聲緩沖液懸浮到原體積；然后加入1 2微升質(zhì)量濃度為1 毫克/毫升的PH敏感熒光探針，混勻，在循環(huán)接通5秒斷開8秒有效時(shí)間為3分鐘的條件下進(jìn)行0 4°C水浴下超聲，之后用濃度為10毫摩爾的磷酸鹽緩沖液補(bǔ)滿試管；然后在4°C、 12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心30分鐘，用pH8. 0 8. 5的緩沖液懸浮沉淀，重復(fù)執(zhí)行離心、 懸浮過程4次，后三次的離心時(shí)間為15分鐘，其他條件不變，最終完全去除游離的ρΗ敏感熒光探針，得到標(biāo)記好的色素體；其中，所述超聲緩沖液為ρΗ值5. 0 6. 0、濃度為0. 01毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷緩沖液；捕獲體系的構(gòu)建步驟將FOFl-ATP酶的β亞基的單抗與生物素、檢測目標(biāo)物的單抗與生物素均按3 2的連接比例混合，使得二種抗體的濃度均為為0.1毫克/毫升、生物素濃度為1微摩爾/升，室溫條件下等待半小時(shí)；然后，將FOFl-ATP酶的β亞基單抗-生物素復(fù)合體、檢測目標(biāo)物單抗-生物素復(fù)合體按1 1的體積比混勻后，加入1.1倍體積1微摩爾的鏈親和素，室溫條件下15 30分鐘后，得到β亞基單抗-生物素-鏈親和素-生物素_目標(biāo)檢測物單克隆抗體捕捉復(fù)合體；生物敏傳感器生成步驟在酶標(biāo)板的每個(gè)孔中加入40微升的具有捕獲功能的β單抗_生物素_鏈親和素_生物素_目標(biāo)檢測物單克隆抗體組成的復(fù)合體，以及10微升標(biāo)記好的色素體，輕輕敲打混勻，在40轉(zhuǎn)/分鐘、35 38°C環(huán)境下孵育1小時(shí)，得到可以捕獲檢測目標(biāo)物的生物敏傳感器。
10.如權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，在所述捕獲體系構(gòu)建步驟之前還包括 β亞基單抗制備步驟以嗜熱菌基因組為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增FOFl-ATP酶的β亞基的基因序列，將β亞基的序列進(jìn)行外源表達(dá)、純化，經(jīng)過單克隆抗體的制備得到 FOFl-ATP酶的β亞基單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速高效檢測致病菌的方法、生物傳感器及其制備方法，其中，所述生物傳感器包括具有信號(hào)轉(zhuǎn)化功能的色素體和具有分子識(shí)別功能的捕獲體系；所述快速高效檢測致病菌的方法包括生物敏傳感器的制備，用生物敏傳感器捕獲樣品檢測液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品陽性濃度對(duì)照，啟動(dòng)腺苷三磷酸合成反應(yīng)，然后用熒光掃描儀進(jìn)行檢測。本發(fā)明方案的檢測限低，檢測時(shí)間短，其檢測限可達(dá)到100cfu/孔，若按1cfu/25g計(jì)算，整個(gè)檢測過程不超過12小時(shí)，至少比常規(guī)的微生物檢驗(yàn)方法縮短60小時(shí)，比PCR方法縮短36小時(shí)；當(dāng)樣品中菌濃度高于1cfu/25g時(shí)，所需時(shí)間更短，因此，可對(duì)食品安全和治病菌控制產(chǎn)生深刻影響。
文檔編號(hào)G01N33/52GK102221610SQ20101015061
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者亢子佳, 倫永志, 劉清珺, 武會(huì)娟, 魏玲 申請人:北京市理化分析測試中心