專利名稱：：聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過使用離子交換技術(shù)過濾和/或純化樣品的設(shè)備和方法。
背景技術(shù)：
：由例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或測序反應(yīng)得到的反應(yīng)產(chǎn)物的純化面臨許多隨后的下游處理方面的挑戰(zhàn)。雜質(zhì)會導(dǎo)致隨后的處理步驟中出現(xiàn)假象(artifacts)。許多消除假象的純化步驟可能費力又無效。希望捕獲引物、未結(jié)合的核苷酸、引物二聚體、小DNA片段，在一些情況中脫鹽PCR產(chǎn)物。希望捕獲引物、染料標(biāo)記的引物、核苷酸、染料標(biāo)記的核苷酸、二脫氧核苷酸和染料標(biāo)記的二脫氧核苷酸以及脫鹽DNA測序反應(yīng)的產(chǎn)物。仍然需要找到解決與常規(guī)純化技術(shù)相關(guān)的這些和其它問題的分離方法。發(fā)明概述依據(jù)不同的實施方式，本發(fā)明提供一種顆粒，該顆粒包括包含離子交換材料的核和包含聚電解質(zhì)材料的涂層，其中核和涂層適合分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物。依據(jù)不同的實施方式，本發(fā)明提供一種純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物的方法，該方法包括提供多個顆粒，其中各顆粒包括用于離子交換的核和聚電解質(zhì)的涂層，與PCR反應(yīng)產(chǎn)物接觸以分離dsDNA片段。依據(jù)不同的實施方式，本發(fā)明提供一種顆粒，該顆粒包括包含離子交換材料的核和包含聚電解質(zhì)材料的涂層，其中核和涂層適合分離DNA測序反應(yīng)的產(chǎn)物。依據(jù)不同的實施方式，本發(fā)明提供一種純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物的方法，該方法包括提供多個顆粒，其中各顆粒包括用于離子交換的核和聚電解質(zhì)的涂層，與DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物接觸以分離染料標(biāo)記的ssDNA片段。依據(jù)不同的實施方式，本發(fā)明提供一種形成顆粒的方法，該方法包括:選擇適合分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物和DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物之一的核材料和聚電解質(zhì)材料；提供包含離子交換材料的核；用聚電解質(zhì)材料涂布該核。依據(jù)不同的實施方式，本發(fā)明提供一種包含聚電解質(zhì)材料的組合物，其中所述聚電解質(zhì)材料適合涂布離子交換材料，并且提供PCR反應(yīng)產(chǎn)物或DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物之一的分離。依據(jù)不同的實施方式，本發(fā)明提供一種用于生物分離的體系，該體系包括聚電解質(zhì)材料，其中所述聚電解質(zhì)材料適合涂布離子交換材料，并且提供篩分，用于PCR反應(yīng)產(chǎn)物或DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物之一的分離。在以下說明中將部分地陳述不同實施方式的其它特征和優(yōu)點，部分內(nèi)容通過說明會變得更清楚，或者通過實施不同的實施方式了解這些內(nèi)容。通過說明書和所附權(quán)利要求中特別指出的成分和組合能夠了解和實現(xiàn)不同實施方式的目的和其它優(yōu)點。附圖簡要說明圖1顯示了聚電解質(zhì)涂布的顆粒的截面圖，其中涂層包含生物聚合物；圖2顯示了聚電解質(zhì)涂布的顆粒的截面圖，其中涂層包含合成聚合物;圖2a顯示了可包含在用于聚電解質(zhì)涂布的顆粒的涂層中的幾種合成聚合物。圖3a-3d顯示了與標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)相比，用包含生物聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒對測序反應(yīng)產(chǎn)物進行的分離，其中圖3a-3c顯示依據(jù)不同實施方式的用聚電解質(zhì)涂布的顆粒進行的分離，圖3d顯示用未涂布的離子交換顆粒進行的分離；圖4a-4b顯示了用包含生物聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒進行的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的分離，其中圖4a顯示包含染料標(biāo)記的擴增子和染料標(biāo)記的引物的混合物的未純化的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，圖4b顯示了用聚電解質(zhì)涂布的顆粒分離除去染料標(biāo)記的引物后的PCR反應(yīng)產(chǎn)物；圖5a-5b是一組分別詳細(xì)說明圖4a-4b的圖；圖6顯示了用包含合成聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒對測序反應(yīng)產(chǎn)物進行的分離；圖7a-7b顯示了用聚電解質(zhì)涂布的顆粒合成聚合物對測序反應(yīng)產(chǎn)物進行的分離；圖8顯示了包含合成聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒進行分離的尺寸截止值，對于分離，使用不同分子量的涂料聚合物；圖9a和9b顯示了用包含合成聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒對測序反應(yīng)產(chǎn)物進行的分離；圖10顯示了使用包含合成聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒根據(jù)尺寸從較大的dsDNA片段中除去較小的dsDNA片段；圖11顯示了使用凝膠電泳(使用2%瓊脂糖膠)分離各組分的結(jié)果，使用聚電解質(zhì)涂布的顆粒除去PCR產(chǎn)物中的寡核苷酸引物；圖12顯示使用未脫鹽聚電解質(zhì)涂布的顆粒進行的DNA尺寸辨別。圖13-24顯示了其它實施例。應(yīng)理解，附圖不是按照比例繪制的。此外，圖中各物體之間的相互關(guān)系也可以不按比例，事實上與尺寸呈相反關(guān)系。附圖旨在幫助理解和清楚地表示各物體的結(jié)構(gòu)，因此，為了說明某結(jié)構(gòu)的具體特征，可以將一些特征放大。應(yīng)理解上述總體說明和以下詳細(xì)說明都只是示例性和解釋性的，旨在提供對本發(fā)明不同實施方式的解釋。不同實施方式的說明文中所用的各部分的標(biāo)題只是為了組織的目的，不應(yīng)理解為限制所述的主題內(nèi)容。該申請中所述的所有文獻(包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍和論文)的為了任何目的的全部內(nèi)容通過參考結(jié)合于此。文中所用的術(shù)語"顆粒"指可以被涂布的液態(tài)、固態(tài)和/或氣態(tài)的離子交換材料。涂層可覆蓋顆粒的全部外表面或主要部分。涂層可覆蓋顆粒的內(nèi)表面的部分。涂層可以不可逆地永久地涂布顆粒，或者可逆地在涂層溶解后脫離顆粒。顆?？梢允菃为氁环N材料或多種材料的團聚體，可通過例如熔化、燒結(jié)、擠壓、壓縮、相分離、沉淀、聚集和聚結(jié)來制備或一起形成。顆?？删哂腥魏我?guī)則或不規(guī)則的形狀，例如球形、橢圓形、三角形、圓柱形等。文中所用的術(shù)語"材料"指分子水平或大體積的任何物質(zhì)，可以是液體和/或固體，例如乳液或樹脂。文中所用的術(shù)語"孔徑大小"指平均測量值，提供一種標(biāo)準(zhǔn)，粒徑大于該孔徑大小的顆粒不大可能穿透進入顆粒的內(nèi)部，而粒徑小于該孔徑大小的顆粒更容易穿透進入顆粒的內(nèi)部。應(yīng)理解，進入孔或偏離孔的顆粒不必需精確的是給定的"孔徑大小"。也就是說，進入孔或被孔排除取決于許多因素，包括實際孔徑大小(其中核的各孔可具有不同的孔徑大小)、空間位阻因素、離子吸引、極化等。另外，一些顆粒，例如微孔凝膠類離子交換材料不含有明確的孔。顆粒具有的"孔徑大小"定義為凝膠基質(zhì)內(nèi)確定尺寸排阻極限的分子間距離。文中所用的術(shù)語"離子交換"指以下過程可"偶聯(lián)"或"捕獲"到離子交換表面上的各電荷等同物能夠釋放等價電荷(equivalentcharge)到合適的溶液中。這種從離子交換核中置換出抗衡離子能夠釋放大量抗衡離子到樣品溶液中。離子交換核的選擇性對于要從樣品溶液中排出的離子比離子交換核的抗衡離子高。與抗衡離子親和力相似的離子通過離子對離子交換劑的相對親和力建立了平衡分布。該平衡可以提供或不提供從溶液中提取離子?？购怆x子幾乎可以是任何離子，包括氯離子、氫氧根離子、乙酸根離子、甲酸根離子、溴離子、硫酸根離子、硝酸根離子、磷酸根離子或任何其它有機或無機陰離子?？购怆x子的選擇受溶液中要除去的離子的性質(zhì)影響。可以對抗衡離子進行選擇，使其對離子交換核的親和力明顯低于對溶液中離子的親和力，從而可與溶液中的離子交換。使用在混合床中的陽離子交換樹脂進行的中和能夠促使從溶液中提取離子。即使陽離子對樹脂的親和力低于對抗衡離子的親和力也是如此。雖然以上描述了陰離子交換顆粒的應(yīng)用，但是本發(fā)明是關(guān)于陽離子交換顆粒的類似描述。用于陽離子交換顆粒的抗衡離子包括水合氫離子、鈉離子、鉀離子、銨離子、鈣離子、鎂離子或任何其它有機或無機陽離子。聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆?？梢灾苽涑扇魏坞x子形式。文中所使用的術(shù)語"混合物"指一起使用在填充柱、混合床、均相床、流化床、具有連續(xù)流的靜態(tài)柱中的一種以上聚電解質(zhì)涂布的顆粒，或批量混合物。例如所述混合物可包括聚電解質(zhì)涂布的陽離子交換顆粒、聚電解質(zhì)涂布的陰離子交換顆粒、未涂布的陽離子交換顆粒、未涂布的陰離子交換顆粒、惰性物質(zhì)或它們的任意組合。所述混合物可包括分離
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的任何物理結(jié)構(gòu)和離子交換領(lǐng)域中己知的任何化學(xué)混合物。所述混合物可以是任何比例，包括化學(xué)計量學(xué)上的等量。顆粒的混合物可以提供基于尺寸的除去作用，同時使溶液脫鹽。一個例子是在混合床中的氫氧根形式的聚電解質(zhì)涂布的陰離子交換顆粒和水合氫離子形式的陽離子交換顆粒。顆粒的混合物可以提供基于尺寸的對較小離子的除去作用，而不使溶液脫鹽。一個例子是氯離子或乙酸根形式(或任何其它不同于氫氧根的陰離子)的聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒，并且沒有陽離子交換材料?？梢愿鶕?jù)其要實施的應(yīng)用選擇用于聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的抗衡離子形式。文中所用的術(shù)語"涂層"及其語法上的變化形式指覆蓋在顆粒上的少于單層、單層或多層的具有相同電荷的聚電解質(zhì)，或者是多層的具有相反電荷的不同聚電解質(zhì)。無機緩沖離子和核苷酸之類的較小分子可穿透或滲透通過涂層，可被保留或者與顆粒發(fā)生離子交換。涂層可阻止較大分子(例如核酸)穿透或滲透通過涂層，并且與顆粒發(fā)生反應(yīng)。文中所用的術(shù)語"聚合物"、"聚合"、"使聚合"、"交聯(lián)產(chǎn)物"、"交聯(lián)的"、"交聯(lián)"以及其它類似形式旨在包括聚合產(chǎn)物和聚合方法，和相對于線型聚合物而言所得產(chǎn)物具有三維結(jié)構(gòu)的交聯(lián)產(chǎn)物和方法。術(shù)語"聚合物"還指寡聚物、均聚物和共聚物。聚合反應(yīng)可以熱引發(fā)、光化學(xué)引發(fā)、離子引發(fā)或通過聚合物化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何形式引發(fā)。依據(jù)不同的實施方式，聚合反應(yīng)可以是縮聚(或逐步(step)聚合)、開環(huán)聚合、高能電子束引發(fā)的聚合、自由基聚合，包括原子轉(zhuǎn)移自由基加成(ATRA)聚合、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)、可逆加成碎裂鏈轉(zhuǎn)移(reversibleadditionfragmentationchaintransfer)(RAFT)聚合或任何其它現(xiàn)有的自由基聚合。文中所用的前綴"(甲基)丙烯酰"指甲基丙烯酰和丙烯酰。例如，N-甲基(甲基)丙烯酰胺指N-甲基甲基丙烯酰胺和N-甲基丙烯酰胺，2-羥乙基(甲基)丙烯酸酯指2-羥乙基甲基丙烯酸酯和2-羥乙基丙烯酸酯。文中所用的術(shù)語"DNA"指任何核酸，包括RNA、PNA和分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的其它形式。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂布的顆?？删哂性S多用途，例如用于生物分子的分離。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂布的顆粒可通過限制大分子與所述顆粒上的離子交換活性位點的相互作用而使生物分子分離。能夠穿透進入聚電解質(zhì)涂布的顆粒的小分子能夠與離子交換活性位點相互作用，并且可以被保留在這些位點上。較大的高電荷物質(zhì)會由于涂層或核顆粒的孔徑大小而被限制與離子交換核的相互作用。這種較大的高電荷物質(zhì)會保留在溶液中，而不是與離子交換顆粒結(jié)合?？梢苑蛛x保留在溶液中的較大物質(zhì)。較大的分子不能被固定在涂層上。依據(jù)不同的實施方式，可以從聚電解質(zhì)涂布的顆粒中洗脫出小分子。依據(jù)不同的實施方式，大分子可包括單鏈DNA(ssDNA)片段和雙鏈DNA(dsDNA)片段，小分子可包括核苷酸、ssDNA的短片段、dsDNA的短片段以及氯離子、乙酸根和表面活性劑之類的小離子。依據(jù)不同的實施方式，可通過使離子交換核接觸過量的聚電解質(zhì)而得到聚電解質(zhì)涂布的顆粒。核表面可被聚電解質(zhì)涂布。聚電解質(zhì)可以是生物聚合物，包括天然產(chǎn)生的聚合物如DNA或文中所述的合成聚合物。依據(jù)不同的實施方式，可通過使離子交換核接觸含有與該核相反的電荷的聚電解質(zhì)而得到聚電解質(zhì)涂布的顆粒。在涂布第一聚電解質(zhì)后，使涂布的顆粒接觸另一種含有與第一聚電解質(zhì)相反的電荷的聚電解質(zhì)?？梢灾貜?fù)該涂布過程，得到具有多層聚陰離子和聚陽離子交替的聚電解質(zhì)涂布的顆粒。依據(jù)不同的實施方式，包含聚電解質(zhì)的涂層由于尺寸篩分效應(yīng)可以減小大分子(包括ssDNA)與核之間的相互作用。所述涂層可以覆蓋離子交換核的外表面，減小大分子與該表面的相互作用。所述涂層可以產(chǎn)生尺寸排阻阻擋層，減少大分子穿透進入核顆粒的內(nèi)部。聚電解質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)能夠決定聚電解質(zhì)涂布顆粒表現(xiàn)出來的篩分性質(zhì)。為了提供所需的篩分性質(zhì)，可以調(diào)節(jié)聚電解質(zhì)的性質(zhì)，例如電荷、電荷密度、疏水性、觸感、撓性、共聚物和三元聚合物中所用的單體單元的比例和分子量。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂層可以在之后的步驟中交聯(lián)，得到所需的物理性質(zhì)和尺寸排阻性質(zhì)。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂布的顆?？赏ㄟ^利用離子交換核固有的多孔性而用作尺寸排阻離子交換劑?？傻玫礁鞣N孔徑大小的離子交換核，例如5埃(微孔)和1000?；虼笥?000埃(大孔)?？筛鶕?jù)孔徑大小選擇離子交換核，從而可根據(jù)應(yīng)用的要求排除給定尺寸的分子。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂層可以足夠大，以被離子交換核的孔排除，從而涂布孔的外表面，而明顯減少對孔內(nèi)表面的涂布。聚電解質(zhì)涂層可以通過封堵大量表面離子交換位點而減少大分子如ssDNA與離子交換核的表面之間的相互作用。離子交換核珠的孔徑大小可以小至足以減少大分子如ssDNA穿透進入核的孔中而與核的離子交換位點相互作用。依據(jù)不同的實施方式，表面離子交換位點可以基本被封堵，使內(nèi)部的離子交換位點不易接近，這樣聚電解質(zhì)涂布的顆粒保留的大分子如dsDNA的量明顯減少。相反，較小離子如氯離子、乙酸根、磷酸根、焦磷酸根、小分子寡核苷酸和核苷酸能夠進入離子交換核的孔中，與內(nèi)部的離子交換位點相互作用。象大分子那樣，涂層可以減少小離子與表面交換位點之間的相互作用，這是因為表面位點被聚電解質(zhì)涂層占據(jù)。所得的這種聚電解質(zhì)涂布的顆粒的離子交換容量(對于小離子)等于裸露的離子交換核的工作容量減去核表面的容量。在表面離子交換位點已經(jīng)被聚電解質(zhì)涂層占據(jù)后，所述顆粒的內(nèi)孔提供了聚電解質(zhì)涂布的顆粒的主要的離子交換容量。依據(jù)不同的實施方式，可以在離子交換核上形成涂層，使得涂層的厚度從小于相當(dāng)于單層的厚度至多層的厚度。涂層在離子交換核表面上的厚度可不同，或者涂層的厚度在整個離子交換核表面上是完全均一的。依據(jù)不同的實施方式，涂層可以至少部分地覆蓋離子交換核。涂層材料可以至少部分地填充一個或多個離子交換核的孔或表面特征，例如孔、裂縫、縫隙、凹坑、通道、洞、凹陷或凹槽。例如，離子交換核的所有內(nèi)表面和外表面都可以被適用于形成涂層的聚電解質(zhì)涂布。依據(jù)不同的實施方式，圖l顯示了聚電解質(zhì)涂布的顆粒30，該顆粒30包括被由生物聚合物300組成的聚電解質(zhì)層20涂布的具有孔32的離子交換核12。圖2顯示了聚電解質(zhì)涂布的顆粒30，該顆粒30包括被主要由合成聚合物310組成的聚電解質(zhì)層20涂布的具有孔32的離子交換核12。如同在陰離子交換核中的情況，小離子顆粒(未示出)能夠篩過和/或進入孔32中，與正電荷表示的離子交換位點結(jié)合。聚電解質(zhì)涂層能夠很大程度地減少與離子交換核結(jié)合的大分子(用大ssDNA片段表示)的量。依據(jù)不同的實施方式，離子交換核可以是陰離子或陽離子材料。離子交換核可以是聚合物、交聯(lián)聚合物或無機材料，例如二氧化硅。離子交換核可以是能夠進行離子交換的固體核材料，或者是用離子交換樹脂處理的固體核材料。離子交換核可以是表面被活化的。離子交換核可以是無磁性的，順磁性的或磁性的。示例性的離子交換核材料包括下文所列的那些。依據(jù)不同的實施方式，用于核的離子交換材料包括陰離子交換樹脂，諸如Macro-Pr印HighQ、Macro-Prep25Q、AminexA-27、AGl-X2、AG1國X4、AGl-X8和AG2-X8(Bio曙Rad,Hercules,CA，USA)、Ch腿alite30SBG(PuroliteCompany,BalaCynwyd，PA，USA)、POROSHQ20(AppliedBiosystems,Framingham，MA,USA)、CA08Y和CA08S(MitsubishiChemicalAmerica,WhitePlains,NY,USA)、PowdexPAO(GraverTechnologies,Glasgow,DE5USA)、NucleosilSB(AlltechAssociates,Inc.,Deerfield,IL，USA)、FractogelTMAE(EMScience,Gibbstown,NJ5USA)、IE1-X8(SpectrumChromatography,Houston,TX,USA)、SuperQ-650S(TosoHaasBioscience,Montgomeryville,PA,USA)、TMAHP-100(IontosorbAV,CzechRepublic)、Chromalite30SBA(PuroliteInternationalLtd,,UK)和ANEX-QS(Transgenomic，Inc.,SanJose,CA,USA)。依據(jù)不同的實施方式，核材料可包括PMMA、PS-DVB、二氧化硅和/或纖維素。依據(jù)不同的實施方式，離子交換核可包括由類似于提供陰離子交換樹脂的制造商提供的陽離子交換樹脂，包括Chromalite30SAG(PuroliteInternationalLtd.,UK)、AG50WX8和Macro-PrepHighS(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)?？捎米麟x子交換核的其它陽離子和陰離子樹脂對離子交換樹脂領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。依據(jù)不同的實施方式，在離子交換核包含能進行離子交換的固體核材料的情況中，固體核材料可以是大孔二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)、具有內(nèi)孔的大孔聚合物微球、離子交換分離領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其它多孔材料或它們的組合。固體核材料可具有各種不同的表面特征，包括，例如，孔、裂縫、縫隙、凹坑、通道、洞、凹陷或凹槽。固體核材料可包括氧化鈉、二氧化硅、硼酸鈉或它們的組合?？梢詫腆w核材料進行表面活化，以使其能夠進行離子交換，例如使材料具有陽離子交換或陰離子交換能力的改性。固體核材料的改性包括處理該固體核材料，在固體核材料的表面上形成陽離子或陰離子取代基。文中所用的術(shù)語"表面"可包括外表面和/或內(nèi)表面。內(nèi)表面可以是例如固體核材料內(nèi)的空隙或孔的表面?？梢詫腆w核材料進行表面活化，使得在固體核材料的表面上具有以下基團中的一個或多個季銨化官能團、羧酸基、磺酸基、離子交換分離領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道的其它陽離子或陰離子官能團或它們的組合。依據(jù)不同的實施方式，生物聚電解質(zhì)可以是天然產(chǎn)生物聚合物，例如DNA。天然產(chǎn)DNA的例子包括剪切的鮭精DNA、質(zhì)粒DNA、限制(性內(nèi)切酶)消化的質(zhì)粒DNA、鯡魚精子DNA、小牛胸腺DNA和其它天然產(chǎn)DNA?？缮藤彽腄NA的例子是剪切的鮭精DNA(E卯endorfAG，Hamburg,Germany)。依據(jù)不同的實施方式，可用作涂層中聚電解質(zhì)的天然產(chǎn)生物聚合物DNA可被認(rèn)為不是樣品DNA，以表示它的來源不是已經(jīng)經(jīng)歷過生物反應(yīng)的樣品。依據(jù)不同的實施方式，可以用水溶性或至少微溶于水的聚陰離子涂布離子交換核。依據(jù)不同的實施方式，含有陰離子官能團的聚陰離子可用于涂布。陰離子官能團可包括羧酸、硼酸、磺酸、硫酸、磷酸或磷基團、或它們的組合。還可以使用含無機酸官能團的聚陰離子。依據(jù)不同的實施方式，可通過含酸或酚的單體與水溶性、至少微溶于水或不溶于水的共聚單體進行共聚反應(yīng)來制備水溶性或至少微溶于水的聚陰離子，其中所述含酸或酚的單體例如丙烯酸、甲基丙烯酸、可水解得到酚基的1-乙酰氧基苯乙烯、4-苯乙烯磺酸、苯乙烯基乙酸或馬來酸酐。依據(jù)不同的實施方式，合成聚合物可以是均聚物、共聚物、三元共聚物或其它聚合物。依據(jù)不同的實施方式，合成聚合物可包含包括以下的單體(甲基)丙烯酰胺、N-甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基(甲基)丙烯酰胺、N-正丙基(甲基)丙烯酰胺、N-異丙基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基-N-甲基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯酰胺、N-羥甲基(甲基)丙烯酰胺、N-(3-羥丙基)(甲基)丙烯酰胺、N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基乙酰胺、N-甲基-N-乙烯基乙酰胺、在聚合之后能水解形成乙烯醇的乙酸乙烯酯、2-羥乙基(甲基)丙烯酸酯、3-羥丙基(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基吡咯垸酮、聚(環(huán)氧乙烷)(甲基)丙烯酸酯、N-(甲基)丙烯?；《啺?、聚茴香腦磺酸酯N-(甲基)丙烯?；鶈徇?、N-2，2，2-三氟乙基(甲基)丙烯酰胺、N-乙?；?甲基)丙烯酰胺、N-酰氨基(甲基)丙烯酰胺、N-乙酰氨基(甲基)丙烯酰胺、N-三(羥甲基)甲基(甲基)丙烯酰胺、N-(甲基)丙烯?；?羥甲基)甲基酰胺、(甲基)丙烯酰基脲、乙烯基噁唑垸酮、乙烯基甲基噁唑烷酮或它們的組合。依據(jù)不同的實施方式，合成聚合物聚電解質(zhì)可以是聚(丙烯酸-共-N,N-二甲基丙烯酰胺)或聚(N,N-二甲基丙烯酰胺-共-苯乙烯磺酸)。依據(jù)不同的實施方式，可以用水溶性或至少微溶于水的聚陽離子涂布離子交換核。依據(jù)不同的實施方式，含有陽離子官能團的聚陽離子可用于涂布。陽離子官能團可包括質(zhì)子化的伯胺、仲胺和叔胺。依據(jù)不同的實施方式，可通過帶正電荷的單體與水溶性、至少微溶于水或不溶于水的共聚單體進行共聚反應(yīng)來制備水溶性或至少微溶于水的聚陽離子。聚陽離子的例子包括鹽酸烯丙胺、氯化(3-丙烯酰氨基丙基)三甲基銨、鹽酸N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺和能水解產(chǎn)生氨基的N-乙烯基酰胺。依據(jù)不同的實施方式，合成聚合物是聚(N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺-共-N，N-二甲基丙烯酰胺)。依據(jù)不同的實施方式，圖2a顯示了用于所列的這些合成聚合物的單體亞單元?？s寫包括丙烯酸(AA)、丙烯酰胺(AAm)、N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA)、(聚環(huán)氧乙烷)單丙烯酸酯(PEO丙烯酸酯)和乙烯基磺酸(VSA)。依據(jù)不同的實施方式，合成聚合物的制備可提供的重均分子量(Mw)為50千道爾頓至15.0兆道爾頓，或200千道爾頓至4.0兆道爾頓，或500千道爾頓至3.0兆道爾頓。依據(jù)不同的實施方式，帶負(fù)電荷或正電荷的共聚單體的摩爾百分?jǐn)?shù)為0.01%至100%，或0.1%至20.0%，或1.0%至10.0%。依據(jù)不同的實施方式，其它合成聚合物可包括苯乙烯磺酸的均聚物，丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基磺酸、苯乙基磺酸、4-乙酰氧基苯乙烯(4-羥基苯乙烯的前體)和乙烯基膦酸的均聚物和共聚物。依據(jù)不同的實施方式，其它合成聚合物可包括鹽酸烯丙胺、氯化(3-丙烯酰氨基丙基)三甲基銨、鹽酸N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺的均聚物和共聚物。共聚單體可包括丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、之后的步驟中能轉(zhuǎn)化為乙烯醇的乙酸乙烯酯，N，N-二甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-丙基丙烯酰胺、N-乙烯基-N-甲基乙酰胺、2-羥乙基丙烯酸酯和乙烯基甲基醚。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)可包括聚陰離子，例如聚(苯乙烯磷酸)、聚(磷酸)、馬來酸及其衍生物等的均聚物和共聚物、富馬酸及其衍生物等的均聚物和共聚物；肽類合成聚陰離子，例如聚(天冬氨酸)、聚(半乳糖醛酸)、聚(谷氨酸)；核酸類合成聚陰離子，例如聚(腺苷酸)、聚(肌苷酸)、聚(尿苷酸)；天然聚陰離子，例如多糖。依據(jù)不同的實施方式，離子交換核可以被多層聚電解質(zhì)涂布。聚電解質(zhì)層可包括交替的聚陰離子和聚陽離子層。這類交替層能提供強度耐久性和調(diào)節(jié)涂層滲透性的手段。只要多層結(jié)構(gòu)的最外層聚電解質(zhì)帶負(fù)電荷，則DNA片段不會離開它的溶液而被固定。氯離子和引物之類的小陰離子能夠穿透或滲透通過多層結(jié)構(gòu)，與核偶聯(lián)。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂布的顆?？梢宰鳛榛旌衔锾峁；旌衔锟梢越Y(jié)合到床或柱中。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂布的顆?？纱罅?inabulkmode)提供。不一定需要聚電解質(zhì)涂布的顆粒的形成良好的色譜床。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂布的顆?？勺鳛檠b置提供。該裝置可以是具有一個或多個通道的微流體裝置，其中至少一個通道的至少一部分包含聚電解質(zhì)涂布的顆粒。該裝置可具有與聚電解質(zhì)涂布的顆粒流體連通的進口和出口。例如，顆粒可以存在于柱中。此處所用的柱可以是水平或垂直取向的，或者是介于水平和垂直取向之間的任何位置。所述柱可包括容器，例如腔、室、貯池、孔、反應(yīng)區(qū)、床、凹槽或適用于容納或保留聚電解質(zhì)涂布的顆粒和反應(yīng)產(chǎn)物的其它容器。所述柱可含有多個聚電解質(zhì)涂布的顆粒。所述裝置的出口可與純化樣品孔、管、玻璃盤或其它收集純化樣品的裝置之類的容器流體連通。依據(jù)不同的實施方式，多個聚電解質(zhì)涂布的顆?？梢允腔旌衔?。依據(jù)不同的實施方式，可以提供用于分離反應(yīng)產(chǎn)物的裝置。該裝置可包括聚電解質(zhì)涂布的顆粒的混合物。該方法可包括向所述裝置的柱中加入顆粒?？梢詫⒎磻?yīng)產(chǎn)物放置或引入到所述裝置的進口。反應(yīng)產(chǎn)物可以從進口進入通過包含聚電解質(zhì)涂布的顆粒和任選的其它材料的柱。該樣品經(jīng)尺寸排阻分離和離子交換的組合作用，使反應(yīng)產(chǎn)物得到過濾和/或純化。經(jīng)過過濾和/或純化的溶液可以通過出口從柱中洗脫或排出，將其引入到容器中，用于分析/和或進一步處理。反應(yīng)產(chǎn)物在向心力的作用下能夠移動通過柱。依據(jù)不同的實施方式，可以將多個聚電解質(zhì)涂布的顆粒與反應(yīng)產(chǎn)物大量(inbulk)混合。多個聚電解質(zhì)涂布的顆粒形成第一體積，而反應(yīng)產(chǎn)物形成第二體積，第一體積小于或等于第二體積。依據(jù)不同的實施方式，使用足以提供足夠的離子交換容量(例如至少80%、至少90%或至少95%的反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生離子交換)的體積的聚電解質(zhì)涂布的顆粒體積可以實現(xiàn)使用聚電解質(zhì)涂布的顆粒進行的反應(yīng)產(chǎn)物的分離。分離可以在等于或小于IO分鐘內(nèi)、等于或小于5分鐘內(nèi)或等于或小于兩分鐘內(nèi)發(fā)生。分離可包括使反應(yīng)產(chǎn)物與聚電解質(zhì)涂布的顆粒接觸一段足夠的時間，以使聚電解質(zhì)涂布的顆粒與反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生離子交換，從聚電解質(zhì)涂布的顆粒中移出純化的反應(yīng)產(chǎn)物。依據(jù)不同的實施方式，從所述顆粒中分離純化的反應(yīng)產(chǎn)物可包括從聚電解質(zhì)涂布的顆粒中移出純化的反應(yīng)產(chǎn)物，從純化的反應(yīng)產(chǎn)物中移出顆粒，和/或從顆粒和純化的反應(yīng)產(chǎn)物的混合物中抽取純化的產(chǎn)物作為樣品。從顆粒和純化的反應(yīng)產(chǎn)物的混合物中抽取純化的產(chǎn)物作為樣品的例子可包括通過將毛細(xì)管直接浸入到管中，注入到用于進一步分析的儀器中來分析管中的產(chǎn)品。依據(jù)不同的實施方式，采用該聚電解質(zhì)涂布的顆粒的分離可包括例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物的分離、DNA測序反應(yīng)混合物的分離和RNA的純化。聚電解質(zhì)涂布的顆粒還可用于以下物質(zhì)的純化和/或分離例如，寡核苷酸、連接酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物、蛋白質(zhì)，抗體結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物、寡核苷酸連接試驗產(chǎn)物、雜交產(chǎn)物和抗體。聚電解質(zhì)涂布的顆粒還可用于使生物學(xué)產(chǎn)物或反應(yīng)混合物脫鹽。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂布的顆粒的選擇性可取決于以下因素中的至少一個(l)涂層中聚電解質(zhì)的分子量，(2)涂層中聚電解質(zhì)的帶電荷的官能團的化學(xué)性質(zhì)和電荷密度或電荷摩爾百分?jǐn)?shù)，(3)離子交換核的孔徑大小，(4)涂層聚合物中共聚單體的性質(zhì)和(5)聚合物中各種共聚單體的比例。各分離可能需要上述因素中至少一個不同的特征。依據(jù)不同的實施方式，PCR產(chǎn)物包括會干擾下游分析的物質(zhì)。PCR產(chǎn)物可包括擴增的靶序列(擴增子)、緩沖鹽、表面活性劑、金屬離子、酶(例如聚合酶)、核苷酸、寡核苷酸引物和溶液中的其它組分。依據(jù)不同的實施方式，可分析雙鏈DNA(dsDNA)的靶序列，或用于后續(xù)的對至少一些其它PCR產(chǎn)物敏感的酶反應(yīng)中。例如，游離的核苷酸和寡核苷酸引物會干擾下游的酶反應(yīng)。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂布的顆粒能夠?qū)⒑塑账帷⒐押塑账嵋锖途彌_鹽與dsDNA的靶序列相分離。所得溶液含有脫鹽環(huán)境下純化的PCR產(chǎn)物，可用于下游的反應(yīng)和分析中。依據(jù)不同的實施方式，PCR純化可直接用于分離小分子ssDNA和dsDNA(例如引物二聚體、不要的副反應(yīng)產(chǎn)物dsDNA或其它非特異性擴增片段)、游離核苷酸和鹽與較大的雙鏈DNA(dsDNA)。依據(jù)不同的實施方式，要除去的PCR產(chǎn)物包括核苷酸、含ssDNA的45個核苷酸的引物、含dsDNA的60bp的引物二聚體和小于200bp的dsDNA片段。依據(jù)不同的實施方式，引物、引物二聚體和小于100bp的DNA片段可被聚電解質(zhì)涂布的顆粒捕獲。依據(jù)不同的實施方式，引物、引物二聚體和小于300bp的DNA片段可被聚電解質(zhì)涂布的顆粒捕獲。依據(jù)不同的實施方式，較大的dsDNA與其它PCR產(chǎn)物的分離可包括脫鹽處理。依據(jù)不同的實施方式，較大的dsDNA與其它PCR產(chǎn)物的分離不包括脫鹽處理。當(dāng)脫鹽會干擾下游的處理，例如較大dsDNAPCR產(chǎn)物的分離和檢測時會存在這種情況。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂布的顆粒在PCR終止和純化之前可以經(jīng)歷與PCR反應(yīng)物相同的PCR條件。聚電解質(zhì)涂布的顆?？梢越?jīng)歷65'C至95'C的溫度循環(huán)。聚電解質(zhì)涂布的顆粒能夠團束到提供PCR和之后的純化的裝置中。依據(jù)不同的實施方式中，用Mw為1.0兆道爾頓至3.0兆道爾頓的聚電解質(zhì)涂布的孔徑大小為100埃至2000埃的離子交換核進行PCR純化。依據(jù)不同的實施方式，用Mw為1.7兆道爾頓至2.6兆道爾頓的聚電解質(zhì)涂布的孔徑大小為IOOO埃的離子交換核進行PCR純化。依據(jù)不同的實施方式，DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物可包含會干擾下游分析的物質(zhì)?？赏ㄟ^分析以下標(biāo)準(zhǔn)中的至少一個來評價用于純化測序反應(yīng)產(chǎn)物的分離的效果(l)殘余染料假象("團")，表現(xiàn)為重疊在序列數(shù)據(jù)上的寬峰，(2)在大或小片段之間平衡的峰密度和(3)測序反應(yīng)產(chǎn)物的脫鹽。依據(jù)不同的實施方式，DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物可包括染料標(biāo)記的耙序列("序列梯")、緩沖鹽、磷酸根離子和焦磷酸根離子、酶(例如，聚合酶)、核苷酸、寡核苷酸引物、染料標(biāo)記的寡核苷酸引物和其它組分，例如殘余的、未結(jié)合的染料標(biāo)記的二脫氧核苷酸("染料終止子")。依據(jù)不同的實施方式，可以對染料標(biāo)記的靶序列進行電泳分析和DNA測序("堿基呼叫(basecalling)")，這些分析可能對至少一些其它測序反應(yīng)產(chǎn)物敏感，產(chǎn)生"團"，結(jié)果導(dǎo)致"堿基呼叫"的誤差。依據(jù)不同的實施方式，毛細(xì)管測序儀可使用電動注射將測序反應(yīng)產(chǎn)物引入毛細(xì)管中，進行電泳分離。測序反應(yīng)產(chǎn)物中存在鹽會影響它們被引入到毛細(xì)管中，而降低鹽濃度可以改善其注入到毛細(xì)管中。依據(jù)不同的實施方式，聚電解質(zhì)涂布的顆?？梢猿y序反應(yīng)產(chǎn)物中產(chǎn)生"團"的物質(zhì)，使測序反應(yīng)產(chǎn)物脫鹽。依據(jù)不同的實施方式，用聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化的測序反應(yīng)產(chǎn)物具有的鹽濃度小于或等于100pM或者小于或等于50pM。用聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化的樣品溶液適用于電動毛細(xì)管注射。為了這些和其它目的，聚電解質(zhì)涂布的顆粒的尺寸排阻限度(例如)小于IO個核苷酸的ssDNA，并且能夠除去樣品溶液中的小離子如鹽和染料標(biāo)記的引物，同時使ssDNA自由地留在溶液中。使用聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化測序反應(yīng)可用于使尺寸為IO個核苷酸至1500個核苷酸或更大的ssDNA與較小組分如染料標(biāo)記的引物和鹽相分離。依據(jù)不同的實施方式，DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物的分離包括通過基本排除大于45核苷酸的染料標(biāo)記的ssDNA片段將引物、染料標(biāo)記的引物和鹽與染料標(biāo)記的靶ssDNA相分離。依據(jù)不同的實施方式，測序反應(yīng)樣品的純化可通過以下步驟從測序反應(yīng)產(chǎn)物中除去染料標(biāo)記的二脫氧核苷酸和鹽使這類組分通過涂層，與離子交換核反應(yīng)，留下經(jīng)過純化的樣品，該樣品含有的ssDNA的量為過濾之前的量的70%或70%以上、80%或80%以上、90%或卯％以上、95%或95%以上。依據(jù)不同的實施方式，用Mw為1000道爾頓至6.0兆道爾頓的聚電解質(zhì)涂布的孔徑大小為5埃至IOOO埃的離子交換核來純化測序反應(yīng)產(chǎn)物。依據(jù)不同的實施方式，用Mw為2.4兆道爾頓至4.9兆道爾頓的聚電解質(zhì)涂布的孔徑大小為10埃至50埃的離子交換核來純化測序反應(yīng)產(chǎn)物。依據(jù)不同的實施方式，用于純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物的方法包括提供多個聚電解質(zhì)涂布的顆粒，接觸DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物，以分離染料標(biāo)記的ssDNA片段。該方法可包括除去殘余的染料假象如染料標(biāo)記的引物，它們會導(dǎo)致在測序分析中出現(xiàn)團。該方法可包括維持染料標(biāo)記的ssDNA片段的長度。實施例用生物聚合物涂布顆粒通過用1000微升1M鹽、酸或堿溶液洗滌100微升樹脂而將其轉(zhuǎn)化為離子交換樹脂。將混合物旋振5分鐘，離心沉降。除去上清液，再加入1000微升等份的鹽、酸或堿溶液。這樣重復(fù)三次。然后使用1000微升等份的去離子水對離子交換核洗滌和離心5次。通過用100微升等份的1毫克/毫升的剪切鮭精DNA(EppendorfAG，Hamburg,Germany)反復(fù)洗滌而將DNA涂布于離子交換核。通過用100微升1毫克/毫升的剪切鮭精DNA洗滌100微升樹脂來進行涂布。將混合物旋振5分鐘，然后離心沉降。除去上清液，另加100微升等份1毫克/毫升的剪切鮭精DNA。這樣重復(fù)兩次。然后使用IOOO微升等份的去離子水對SEIE顆粒洗滌和離心三次。用合成聚合物涂布顆粒通過以下步驟得到用于涂布顆粒的聚(AA-共-DMA)聚電解質(zhì)0.32克(4.44毫摩爾)丙烯酸與8.04克(81.07毫摩爾)N,N-二甲基丙烯酰胺在200毫升去離子水中，在45'C自由基聚合15分鐘，使用過硫酸銨作為引發(fā)劑，N,N,N'N'-四甲基乙二胺作為催化劑。通過透析(50KMWCO)純化所得聚合物，凍干，得到7.70克(產(chǎn)率92%)聚合物；Mw=3.40Mda，Mn=2.67Mda。在涂布之前，首先按照與之前實施例中所述相同的方法將陰離子交換樹脂轉(zhuǎn)變?yōu)闅溲醺庪x子交換核。向0.20-0.25毫升氯離子形式的陰離子交換核中加入1000微升等份去離子水。將混合物旋振2分鐘，離心沉降。除去上清液，該去離子水洗滌重復(fù)兩次。向經(jīng)過洗滌的樹脂中加入IOOO微升等份2.0M氫氧化銨。將混合物旋振2分鐘，在室溫下靜置5分鐘，旋振l分鐘，離心沉降。除去上清液，該氫氧化銨洗滌重復(fù)兩次。向沉淀的離子交換顆粒中加入IOOO微升等份去離子水，旋振1分鐘，離心沉降，除去上清液。該最后的去離子水洗滌再重復(fù)一次。將該樹脂再分散在500微升去離子水中，放入加蓋的聚丙烯微量離心管中，在冰箱中儲存，至使用。向含有15-20微升濕陰離子交換樹脂的1.5毫升微離心管中加入1.0毫升聚合物溶液(用去離子水配成0.5重量％的溶液)。旋振1分鐘，在室溫下靜置5分鐘，再旋振1分鐘，離心沉降，除去上清液。聚合物溶液涂布再重復(fù)一次。然后用1毫升去離子水洗滌沉淀顆粒，離心三次。將最后經(jīng)過洗滌的樹脂再分散在500微升去離子水中，儲存在冰箱中，至使用?；蛘?，通過在惰性氣氛(超純氮)下進行聚合來得到用于涂布顆粒的聚(AA-共-DMA)聚電解質(zhì)。向裝配有2"聚四氟乙烯攪拌葉片、用于吹洗的玻璃排放管和水冷卻冷凝器的500毫升圓底三頸燒瓶中加入150毫升Milli-Q水、8.0160克(80.86毫摩爾)重蒸餾N，N-二甲基丙烯酰胺(Dajac)、0.3285克(4.56毫摩爾)重蒸餾丙烯酸(AldrichChemical)和0.8043克1.9972重量％的過硫酸銨水溶液。用超純氮以150毫升/分鐘的速率吹洗混合物60分鐘，同時以200rpm的恒定速率攪拌。向經(jīng)過吹洗的溶液中加入80微升N,N,N，,N，-四甲基乙二胺(來自AIdrichChemical的電泳試劑)。將混合物降低到50土rC的油浴中，在200rpm攪拌3.5小時。在反應(yīng)結(jié)束后，加入50毫升去離子水，攪拌5分鐘。使用50KMWCOSpectra/Pro膜以5加侖去離子水中對所得澄清水溶液透析4天，每24小時換水兩次。經(jīng)過透析的溶液凍干，得到7.70克(產(chǎn)率92.0%)共聚物。通過GPC/MALLS確定分子量為2.4MdaMw和L26MDaMn。用含有生物聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物為了DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物的純化，制備含有400微升dRhodamineTerminatorReadyReactionMix(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA，USA)、50微升M13通用反向引物(3.2皮摩爾/微升)、25微升模板-擴增子(約100納克/微升)和525微升去離子水的樣品。將該溶液以20微升/孔的體積等份加入到熱循環(huán)儀平板的各孔中。將該混合物進行25輪循環(huán)的加熱，其中每輪循環(huán)包括在95'C加熱IO秒，在5(TC加熱5秒，在6(TC加熱120秒。為了提供含有生物聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒，如上所述，將各100微升AminexA-27、Bio-RadAGl-X8和Bio-RadAG2-X8制備為氫氧化物聚電解質(zhì)涂布的顆粒。如上所述用1毫克/毫升剪切的鮭精DAN涂布樹脂，用去離子水洗滌。如上所述，將IOO微升涂布的陰離子交換顆粒與IOO微升Chromalite30SAG混合，制備為氫形式的聚電解質(zhì)涂布的顆粒，形成混合離子交換床。如上所述，用l毫克/毫升剪切的鮭精DNA洗滌混合床，用去離子水洗滌。將各2微升涂布的混合床加入到MicroAmp⑧小管(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA,USA)中。由未涂布的AminexA-27禾口Chromalite30SAG制備的混合床作為對照。為了進行純化，將1微升上述測序反應(yīng)產(chǎn)物加入到含有2微升DNA涂布的混合床離子交換樹脂的各MicroAmp管中。將各管旋振5分鐘，然后用移液管向各管中加入5微升去離子水，并混合。5000Xg離心微量離心管，從各管中取出5微升上清液，移液到96孔板中，用ABIPrism3100測序儀進行分析。在ABIPrism3100上利用36厘米陣列、POP6聚合物(AppliedBiosystems)和標(biāo)準(zhǔn)測序模塊分析樣品。圖3a-3d顯示了該純化操作的結(jié)果。圖3a-3c顯示了生物聚合物-聚電解質(zhì)涂布的顆粒提供所需的純化效果(圖3a顯示DNA涂布的AminexA-27，圖3b顯示DNA涂布的Bio-RadAGl-X8，圖3c顯示DNA涂布的Bio-RadAG2-X8，所有三種樣品都是陽離子-陰離子混合床)。例如，基本上除去了染料團(殘余的染料標(biāo)記的ddNTP)，較高的信號強度表明樣品達(dá)到了所需的脫鹽效果。相反，圖3d顯示未涂布的混合床(與Chromalite30SAG混合的AminexA-27)不能提供所需的純化效果。如同用未涂布的陰離子交換樹脂進行純化所預(yù)計的那樣，觀察到大部分DNA片段喪失。用含有生物聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物為了論證PCR反應(yīng)產(chǎn)物的純化，使用熒光標(biāo)記的引物制備樣品，這樣可以用熒毛細(xì)管光測序儀分析PCR產(chǎn)物。制備含有102微升PCR主混合物(AppliedBiosystems)、4微升FAM標(biāo)記的正向引物(20皮摩爾/微升)、4微升反向引物(20皮摩爾/微升)、20微升人gDNA、CEPH1347-02(50微克/微升)和70微升去離子水(DI)的溶液。將該溶液以20微升/孔的體積等份加入到熱循環(huán)儀平板的孔中。將該混合物在96'C加熱5分鐘，然后經(jīng)歷40輪加熱循環(huán)，其中各輪循環(huán)包括在96'C加熱30秒，然后在60'C加熱120秒。提供類似于之前所述實施例的用生物聚合物涂布的顆粒。為了進行純化。將1微升上述溶液加入到含有2微升DNA涂布的混合床離子交換樹脂的MicroAmp小管中。將該管旋振5分鐘，然后用移液管向管中加入5微升去離子水，并混合。5000Xg離心微量離心管，取出5微升上清液，加入到5微升去離子甲酰胺中，移液到96孔板中，用ABIPrism⑧3100測序儀進行分析。在ABIPrism3100上利用36厘米陣列、P0P-6⑧毛細(xì)管電泳聚合物(AppliedBiosystems)和標(biāo)準(zhǔn)片段分析模塊分析樣品。圖4和圖5顯示了使用GeneScan⑧軟件分析的該純化處理的結(jié)果。設(shè)計該實驗，以觀察大部分染料標(biāo)記的引物從550bpPCR產(chǎn)物中除去，同時保留雙鏈DNA擴增子。圖4a顯示純化之前的PCR反應(yīng)溶液。圖4b顯示用聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化和脫鹽的PCR反應(yīng)溶液。圖4a顯示在4000-5000掃描處由引物產(chǎn)生的標(biāo)記為330的峰，而在15500掃描處由550bp擴增子產(chǎn)生的標(biāo)記為320的峰。PCR引物的存在通常會干擾之后的PCR產(chǎn)物分析或之后的反應(yīng)。除去PCR產(chǎn)物中的引物是必需的。圖4b顯示了按照之前章節(jié)所述使用含有生物聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化PCR產(chǎn)物時得到的數(shù)據(jù)。標(biāo)記為320的550bp擴增子仍然可見，但是引物已經(jīng)減少到低于可檢測含量。圖5a和5b是圖4a和圖4b所示的電泳圖譜的區(qū)域放大圖，集中在標(biāo)記為330的PCR引物區(qū)域。在純化步驟之后，但是在用ABIPrism310分析之前，向注射溶液中加入內(nèi)標(biāo)。使用內(nèi)標(biāo)(濃度為20nM的合成ROX標(biāo)記的寡核苷酸)來測量兩種溶液的相對注射效率。在兩個電泳圖譜中都觀察到標(biāo)記為340的內(nèi)標(biāo)。圖5顯示兩種溶液的注射效率相似。使用內(nèi)標(biāo)歸一化峰高度，引物減少了100%，而PCR產(chǎn)物喪失22X。該實施例說明與聚電解質(zhì)涂布的顆粒接觸可以大大減少PCR溶液中的引物，同時保留78%的PCR產(chǎn)物在溶液中。同一溶液與未涂布的離子交換珠接觸會導(dǎo)致大部分引物和所有PCR產(chǎn)物的喪失(未示出)。用含有合成聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物為了純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物，使用熒光標(biāo)記的引物制備樣品，這樣可以用熒光毛細(xì)管測序儀分析測序反應(yīng)產(chǎn)物。制備含有400微升dRhodamineTerminatorReadyReactionMix(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,California)、50微升M13通用反向引物(3.2皮摩爾/微升)、25微升模板-擴增子(約100微克/微升)和525微升去離子水的溶液。將該主溶液以20微升/孔的體積等份加入到熱循環(huán)儀平板的各孔中。將該混合物進行25輪循環(huán)的加熱，其中各輪循環(huán)包括在95'C加熱10秒，在50'C加熱5秒，在60'C加熱120秒。為了提供用合成聚合物涂布的聚電解質(zhì)涂布的顆粒，如文中所述，將20微升Bio-RadMacro-PrepHighQ離子交換樹脂制備為氫氧化物聚電解質(zhì)涂布的顆粒。如文中所述，用聚(丙烯酸-共-N,N-二甲基丙烯酰胺)(下文中稱為聚(AA-共-DMA))涂布樹脂，用去離子水洗漆。將20微升聚(AA-共-DMA)涂布的Macro-PrepHighQ與20微升Chromalite30SAG混合(如上所述，作為氫聚電解質(zhì)涂布的顆粒)。將5微升離子交換顆?；旌衔锛尤氲組icroAmp⑧小管(AppliedBiosystems,FosterCity,CA，USA)中。為了提供純化，將1微升上述測序反應(yīng)產(chǎn)物加入到含有5微升DNA涂布的混合床離子交換樹脂的MicroAmp小管中。將該管旋振5分鐘，然后用移液器向管中加入5微升去離子水，并混合。5000Xg離心微量離心管，取出5微升上清液，移液到96孔板中，用ABIPrism⑧3100測序儀進行分析。在ABIPrism3100上利用36厘米陣列、POP-6(AppliedBiosystems)和標(biāo)準(zhǔn)測序模塊分析樣品。圖6顯示了該純化操作的結(jié)果。圖6顯示了合成聚合物-聚電解質(zhì)涂布的顆粒提供所需的純化效果。例如，聚(AA-共-DMA)聚電解質(zhì)涂布的顆?；旧铣チ巳玖蠄F(殘余的染料標(biāo)記的ddNTP)，并且提供較高的信號強度，表明樣品達(dá)到所需的脫鹽效果。用聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化其它dRhodamine測序反應(yīng)產(chǎn)物。圖7a顯示了用按照文中所述制備的聚(AA-共-DMA)涂布的Bio-RadAGl-X8離子交換樹脂對測序反應(yīng)產(chǎn)物進行純化。圖7b顯示了用按照文中所述制備的聚(AA-共-DMA)涂布的AminexA-27離子交換樹脂對測序反應(yīng)產(chǎn)物進行純化。聚電解質(zhì)涂布的顆?；旧铣チ巳玖蠄F(殘余的染料標(biāo)記的ddNTP)，并且提供較高的信號強度，表明樣品達(dá)到了所需的脫鹽效果。對其它離子交換樹脂與各種用于測序反應(yīng)產(chǎn)物純化的合成聚合物聚電解質(zhì)進行了測試，所述其它離子交換樹脂包括Nucleosil、Isolute、Chromalite30SBG、Purolite-Chromalite、Macro-PrepHi-Q、Bio-RadAG2-X8、Bio-RadAGl-X8、AminexA-27、Powdex-PAO，所述合成聚合物聚電解質(zhì)包括聚(AA)、聚(AA-共-AAm)、聚(AA-共-DMA)、聚(AA-共-PEO丙烯酸酯)、聚(苯乙烯磺酸)、聚(苯乙烯磺酸-共-DMA)和聚(AA-PEO丙烯酸酯-VSA)。圖8顯示了用聚(AA-共-DMA)涂布的聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化測序反應(yīng)的產(chǎn)物。用不同分子量的聚(AA-共-DMA)純化測序反應(yīng)產(chǎn)物，對于第一列和第二列，聚(AA-共-MDA)的分子量在電泳圖譜上從下往上逐漸增加。使用基于GeneScan500ROX試劑(AppliedBiosystems)的試驗評價聚電解質(zhì)涂布的顆粒的尺寸分辨能力。尺寸標(biāo)準(zhǔn)由16個尺寸為35bp至500bp的dsDNA片段構(gòu)成。通過向5微升聚電解質(zhì)涂布的顆粒中加入5微升GeneScan500ROX試劑來進行試驗。將混合物攪拌或旋振5分鐘，將液體與聚電解質(zhì)涂布的顆粒分離。通過離心混合物并除去上清液或者通過過濾混合物來完成聚電解質(zhì)涂布的顆粒與液體的分離。然后使用DNA測序儀分析所得液體。圖8顯示了此試驗的結(jié)果。圖8的第一列表示用孔徑大小IO埃至15埃的涂布樹脂進行分離后的電泳圖。第二列表示用孔徑大小1000埃的涂布樹脂進行分離后的電泳圖。在電泳圖中早期觀察到的最大峰是引物峰，表示25個核苷酸的片段。圖8第一列的電泳圖顯示對于任何分子量的涂層，都沒有除去小片段，這些電泳圖與未處理的對照相似。圖8第二列的電泳圖顯示在用低分子量涂層分離后，消除了較早的峰(較小的片段)。這些數(shù)據(jù)表明圖8第二列的聚電解質(zhì)涂布的顆粒的尺寸截取值是100bp，而圖8第一列的聚電解質(zhì)涂布的顆粒的尺寸截取值小于35bp。圖8顯示了用于純化測序反應(yīng)產(chǎn)物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒進行分離的尺寸截取值。圖9a和9b顯示了聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化測序反應(yīng)產(chǎn)物，所述聚電解質(zhì)涂布的顆粒包括被聚(AA-共-DMA)涂布的Powdex-PAO離子交換樹脂。圖9a顯示了在純化之前獲取的電泳圖，圖9b顯示了在純化之后獲取的電泳圖。如圖9a所標(biāo)記的那樣，聚電解質(zhì)涂布的顆粒去除了測序反應(yīng)產(chǎn)物中的LIZ⑧染料dTDP(2PP)和LIZ⑧染料dTTP(3PP)。聚電解質(zhì)涂布的顆粒除去了測序反應(yīng)產(chǎn)物中的其它陰離子，并改善測序反應(yīng)產(chǎn)物的電動注射，結(jié)果提高了信號強度10倍。用含有合成聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物用含有合成聚合物的聚電解質(zhì)涂布的顆粒提供對PCR反應(yīng)產(chǎn)物的純化。用聚(AA-共-DMA)涂布Macro-PrepHQ離子交換樹脂。圖IO顯示了不同的丙烯酸的摩爾百分?jǐn)?shù)和聚(AA-共-DMA)的分子量。分子量和摩爾百分?jǐn)?shù)從下往上逐漸增加，在電泳圖的最下端表示用涂布了1.1摩爾％丙烯酸和98.9摩爾XDMA的樹脂進行的分離，而電泳圖的最上端表示用涂布了100摩爾X丙烯酸或聚(AA)但無N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA)的樹脂進行的分離。含有100%丙烯酸的聚電解質(zhì)涂布的顆粒除去引物、引物二聚體和所有DNA片段。用含有少量丙烯酸(1.1摩爾X丙烯酸)的聚(AA-共-DMA)可以觀察到相同的現(xiàn)象。圖11顯示了通過上述范圍內(nèi)的聚(AA-共-DMA)涂布的未脫鹽Macro-Prep50HQ(氯化物形式)離子交換樹脂除去寡核苷酸引物、引物二聚體和DNA片段。圖11的泳道1加載(beloaded)尺寸標(biāo)準(zhǔn)品，泳道2加載具有20微摩爾引物的l微升粗制(未用聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒分離)PCR產(chǎn)物，泳道3-7加載l微升用聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒分離后的PCR產(chǎn)物，泳道8-12加載2微升用聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒分離后的PCR產(chǎn)物。泳道2顯示未分離的PCR產(chǎn)物，諸如引物、引物二聚體等，作為主帶下方的擴散帶。泳道3-12不具有這樣的相應(yīng)帶。圖12顯示根據(jù)尺寸，用上述范圍內(nèi)的聚(AA-共-DMA)涂布的未脫鹽Macro-Prep50HQ(氯化物形式)離子交換樹脂從PCR產(chǎn)物中除去引物二聚體和非特異性擴增的dsDNA。上部的電泳圖顯示用聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒尚沒有分離的PCR產(chǎn)物。下部的電泳圖顯示用聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒分離的PCR產(chǎn)物。這種區(qū)別表明在用聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒進行分離后，小于100bp的dsDNA片段與留在溶液中的較大的片段已分離。用含有合成聚合物和表面活性劑的聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物在使用尺寸為基礎(chǔ)的純化方法進行純化之前，向DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物中加入表面活性劑。例如，在使用尺寸排阻旋轉(zhuǎn)柱純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物之前，可以加入十二烷基硫酸納(SDS)以促進純化。此外，在使用尺寸排阻旋轉(zhuǎn)柱進行純化之前，可以先對包含SDS的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物進行加熱。在不同的實施方式中，在用聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物中，可以用非離子型表面活性劑替代陰離子表面活性劑。這種替代可以防止離子表面活性劑與離子交換顆粒之間的相互作用，從而避免對聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的離子交換容量造成不利的影響。文中所用的術(shù)語"非離子"型表面活性劑指非離子型表面活性劑、兩性離子表面活性劑或基本上對溶液的導(dǎo)電性沒有影響的其它表面活性劑。非離子型表面活性劑的例子包括Brij35和Brij58(CalBiochem,SanDiego,CA)、TritonX-100(Sigma,St.Louis,MO)、辛基-(3-D-葡糖苷、辛基葡糖吡喃糖苷和(3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨]-l-丙磺酸鹽)("CHAPS")(PierceBiotechnology,Rockford,IL)。在不同的實施方式中，為了便于從DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物中除去未結(jié)合的染料終止子，非離子型表面活性劑可以在不加熱的情況下起作用。為了純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物，使用熒光標(biāo)記的二脫氧核苷酸終止子制備樣品，這樣可以用熒光毛細(xì)管測序儀分析測序反應(yīng)產(chǎn)物。使用8微升BigDyeTerminatorv.3.1ReadyReactionMix(AppliedBiosystems,FosterCity,California)制備含20微升的溶液。測序引物是M13通用反向引物(3.2皮摩爾/微升)。模板是質(zhì)粒pGEM(200納克/微升)。將該主體溶液等份加入到GeneAmp9700熱循環(huán)儀平板的孔中。該混合物經(jīng)歷25輪循環(huán)的加熱，其中各輪循環(huán)包括在95'C加熱10秒，在5(TC加熱5秒，在6(TC加熱240秒。在合并后，將10微升未純化的合并反應(yīng)混合物再分配到16個新的用于純化的96孔MicroAmp⑧盤的孔中。各孔含有10微升反應(yīng)混合物、20微升去離子水、10微升表面活性劑和10微升聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的漿料，所述漿料包括按照上述方法制備的具有AG50WX-8的混合床中的聚(苯乙烯磺酸)涂布的AGlX-8。因為聚電解質(zhì)涂布的離子交換漿料含有50%的水，所以混合物的最終體積是45微升。在這些實施例中，使用兩種不同的表面活性劑溶液(1)10微升3體積X的Brij35水溶液，Brij35在整個溶液中的最終濃度為0.67%;(2)10微升10體積％的TritonX-100水溶液，TritonX-100在整個溶液中的最終濃度為2.2%。對于各表面活性劑的對照，用10微升水替代表面活性劑。在不同的實施方式中，表面活性劑的有效濃度范圍是0.01%至10%。在不同的實施方式中，表面活性劑的有效濃度濃度范圍是0.1%至5。％。然后用粘性膜覆蓋MicroAmp⑧盤中的樣品，用旋振儀混合30分鐘。在混合后，含將有樣品的MicroAmp⑧盤以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。然后將MicroAmp⑧盤轉(zhuǎn)移到ABIPrism基因分析儀(GeneticAnalyzer)中，進行DNA測序。用50厘米毛細(xì)管陣列和POP-6⑧毛細(xì)管電泳聚合物進行DNA測序。如下文所述，注射條件是1000V，22秒，直接用含有樣品和珠的管中的上清液進行測試。圖15A和15B分別顯示了使用或不使用Brij35表面活性劑進行的DNA測序產(chǎn)物純化。在圖15A中，不使用Brij35表面活性劑進行純化，例如在該序列的15-60核苷酸區(qū)域中出現(xiàn)染料假象。在圖15B中，用Brij35表面活性劑進行純化，在相同區(qū)域不出現(xiàn)染料假象。圖16A和16B分別顯示了使用和不使用X-100表面活性劑進行的DNA測序產(chǎn)物純化。在圖16A中，不使用X-100表面活性劑進行純化，例如，在序列的15-60核苷酸區(qū)域中出現(xiàn)染料假象。在圖16B中，用TritonX-100表面活性劑純化，在相同的區(qū)域沒有出現(xiàn)染料假象。在兩種情況中，表面活性劑能夠在不加熱和不干擾直接電動注射或聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒純化的情況下促進染料假象的去除。用多個合成聚合物層涂布顆粒按照上文所述制備聚(AA-共-DMA)聚電解質(zhì)。聚(鹽酸烯丙胺)或"PAH"(Mw0.07MDa)和聚(丙烯酸)或"PAA"(Mw4.00MDa)(AldrichChemicals)容易得到。通過向去離子水中加入合適量的聚合物，然后在環(huán)境溫度下攪拌過夜來制備以下聚電解質(zhì)溶液(0.5重量％):聚(AA-共-DMA)0.2286克/39.915克H20;PAH0.2268克/40.033克H20;PAA0.1192克/19.99克H20。在進行涂布之前，用去離子水對陰離子交換樹脂(Macro-PrepHighQ50，Bio-Rad)洗滌三次。將樹脂的漿料溶液(3亳升，0.35克濕樹脂)和20毫升去離子水加入到50毫升管中。為了涂布樹脂，加入聚電解質(zhì)溶液(0.750毫升)。將管旋振l分鐘，以1760rpm的轉(zhuǎn)速離心三分鐘，然后傾析出上清液。濕樹脂在70'C的高真空烘箱中干燥2小時。然后依次用聚電解質(zhì)溶液重復(fù)該涂布過程兩次，共施加三層聚電解質(zhì)涂層。對于最后一干燥步驟，涂層干燥過夜。通過旋振使干燥的球粒與40毫升去離子水混合，以1670rpm的轉(zhuǎn)速離心3分鐘，除去上清液。將最終經(jīng)過洗滌的樹脂再分散在IO毫升去離子水中，并儲存在冰箱中，待使用。圖13顯示了一個實施例中施加在樹脂上的多個聚電解質(zhì)涂層。圖14通過顯示除去較小數(shù)目的堿基對(bp)說明了未涂布的樹脂、涂布的樹脂的性能和幾次試驗中多層聚電解質(zhì)涂層的三種序列對離子交換樹脂的影響。下表1中描述了該聚電解質(zhì)的三種序列，第一層與樹脂表面最接近，然后依次是其它層。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>聚電解質(zhì)涂布的樹脂的磁化PAA(Mw4,00MDa)(AldrichChemicals)和Fe304(EMG1111)(FerrotecCorp.)容易得到。將PAA溶液(0.750毫升)加入到樹脂(0.2克濕樹脂)和10毫升去離子水的漿料溶液中。將該混合物旋振l分鐘，在室溫下培育5分鐘，以1760rpm的轉(zhuǎn)速離心三分鐘，傾析出上清液。用去離子水(10毫升)洗滌樹脂一次。懸浮液以1760rpm的轉(zhuǎn)速離心三分鐘，傾析出水。向濕樹脂中加入Fe304(0.20毫升)和去離子水的水溶液。通過旋振一分鐘混合懸浮液，在室溫下培育5分鐘。該懸浮液以1670rpm的轉(zhuǎn)速離心三分鐘，除去水溶液。洗滌樹脂三次，以除去過量的未結(jié)合的Fe304。將經(jīng)過涂布的樹脂再分散在去離子水(10毫升)中。觀察到樹脂已磁化。聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的分離在上文提供的各類反應(yīng)和/或?qū)嵤├?，有許多特定的應(yīng)用。例如，聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物能應(yīng)用于序列檢測(終點和實時檢測)，PCR克隆等，而聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物能用于各類核酸測序，例如，測序，片段分析，單核苷酸多態(tài)性鑒定等。希望在進行核酸測序之前，將聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒與經(jīng)過純化的上清液相分離?？赏ㄟ^例如毛細(xì)管電泳來實現(xiàn)測序。從聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒中分離得到純化的上清液在純化和測序之間增加了移液、樣品轉(zhuǎn)移、離心、去磁和/或熱循環(huán)之類的步驟。希望消除這些步驟以提高效率和速度，并且降低成本以及減少用戶花在純化和測序之間的操作時間。依據(jù)不同的實施方式，可通過過濾保留顆粒或離心收集顆粒，然后吸取上清液來實現(xiàn)聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒與純化的上清液的分離。希望通過直接加載上清液樣品作毛細(xì)管電泳而取消從純化的上清液中除去聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的步驟。但是，由于妨礙電動注射，導(dǎo)致測序數(shù)據(jù)的隨機中斷，或者由于毛細(xì)管抵達(dá)樣品管底部時會壓碎聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒導(dǎo)致毛細(xì)管堵塞，聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒會干擾加載。依據(jù)不同的實施方式，本發(fā)明提供了一種從樣品孔(well)、樣品管或樣品室的底部加載毛細(xì)管的方法?？梢詫⒕垭娊赓|(zhì)涂布的離子交換顆粒轉(zhuǎn)移到孔的側(cè)部或頂部。圖17A-17C顯示了孔170，在此聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒172已經(jīng)與上清液174分離。本發(fā)明提供將聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒172置于孔170頂部(如圖17B所示)，或者將聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒置于孔170的側(cè)部(如圖17C所示)。依據(jù)不同的實施方式，可以通過用較高密度的溶劑進行漂浮而將聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒置于孔頂部?？梢蕴岣呱锨逡旱拿芏?，使上清液的密度大于聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的密度?？商岣呱锨逡好芏鹊娜軇┑睦影ǜ鞣N濃度的乙二醇(密度=1.113)、碳酸亞丙酯(密度=1.189)、聚乙二醇(蠟狀固體，密度=1.127)、丙三醇(密度=1.261)和它們的組合。在不同的實施方式中，離子交換樹脂的密度可以低至1.03。在提高了上清液的密度之后，聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒漂浮在孔的頂部。然后將毛細(xì)管和電極浸入到孔中低于聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒層的位置。毛細(xì)管的加載可以沒有聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒。加入溶劑消除了樣品制備中的離心步驟，并且能夠通過陣列吸移管自動進行。依據(jù)不同的實施方式，可以通過磁引力將聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒置于孔的側(cè)部。如上所述，可以用Fe304涂布聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒，以提供磁化作用。聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆?？梢栽谠O(shè)置在孔側(cè)面或孔周圍的磁鐵產(chǎn)生或電誘導(dǎo)的磁場作用下被吸引到孔的側(cè)部。然后可以將毛細(xì)管和電極浸入到離開同心層或在聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒層旁邊的孔的中心。毛細(xì)管的加載可以沒有聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒。聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的磁化消除了樣品制備中的離心步驟。依據(jù)不同的實施方式，本發(fā)明提供了一種從樣品孔、樣品管或樣品室的頂部加載毛細(xì)管的方法。可以將聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒轉(zhuǎn)移到孔的底部。圖17A顯示了孔170，在此聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒172已經(jīng)與上清液174分離?？梢酝ㄟ^上述離心或磁化將顆粒轉(zhuǎn)移至底部?？梢詫y序儀設(shè)備進行校準(zhǔn)，以從孔中不含聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的較高點加載樣品?？梢酝ㄟ^增加毛細(xì)管尖端與管底部的距離調(diào)節(jié)毛細(xì)管加載上清液的位置。對于標(biāo)準(zhǔn)微量滴定盤，這種距離的一個例子是4.5毫米。這相當(dāng)于30微升96孔盤的一個孔體積?？梢栽黾由锨逡旱捏w積，以確保毛細(xì)管浸入到上清液中，進行良好的電動注射。可以加入去離子水增加上清液的體積。可以通過旋振30分鐘得到去離子水和上清液的混合物。依據(jù)不同的實施方式，可以對測序儀進行校準(zhǔn)，通過滴定盤或與該盤匹配的機械改變架使滴定盤位于測序儀中較低的位置，從而可以從孔中較高的點加載樣品。依據(jù)不同的實施方式，可以對測序儀進行校準(zhǔn)，通過調(diào)節(jié)固件初始化文件改變z軸參考點，從而可以從孔中較高的點加載樣品。依據(jù)不同的實施方式，可以對測序儀進行校準(zhǔn)，通過程序設(shè)計軟件使毛細(xì)管從底部加載位置縮回到聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒上方的上清液層中某點，從而可以從較高的點加載樣品。圖18A-18B顯示了使用校準(zhǔn)的測序儀用BigDyeTerminator化學(xué)品(圖18A)和dRhodamineterminator化學(xué)品(圖18B)測定上清液中的核酸序列，通過調(diào)節(jié)固件初始化文件改變z軸參考點而從孔中較高的點加載樣品。用合成聚合物涂布顆粒依據(jù)不同的實施方式，可以用共聚物涂布聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒，以選擇對于顆粒的尺寸排阻性能所需的截取值。所需的截取值是在低于某個特定尺寸時物質(zhì)的量急劇下降時的數(shù)值，表現(xiàn)為溶液中堿基對(bp)的量減少("衰減")。測定截取值的衰減試驗使用毛細(xì)管電泳顯示片段喪失隨尺寸的變化來測量具有熒光標(biāo)記的dsDNA尺寸標(biāo)準(zhǔn)的聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的性能?？梢詫⒏髌蔚姆甯甙茨硺?biāo)準(zhǔn)樣品和曲線歸一化，從而至顯示尺寸區(qū)分能力。實驗方案的一個例子可以是使用ROX-500作為dsDNA尺寸標(biāo)準(zhǔn)，使用LIZ-500作為內(nèi)標(biāo)。衰減試驗可表明純化過程中片段有無喪失。顯示低衰減的樣品并不顯示試驗中所用的ROX-500標(biāo)準(zhǔn)的低堿基對片段的明顯喪失。顯示高衰減的樣品則顯示出低堿基對片段(例如，35、50、IOO和139堿基對片段)的高喪失。依據(jù)不同的實施方式，用于涂布聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的共聚物可包括由N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA)和丙烯酸(AA)制備的那些共聚物。如圖19中所示，用于涂布MP-IMBioBad離子交換樹脂的DMA-AA共聚物表現(xiàn)出較高的衰減，AA的部分從15W、10%、7.5%和5%下降。依據(jù)不同的實施方式，用于涂布聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的共聚物可包括由丙烯酰胺和AA制備的那些共聚物。如圖20所示，用于涂布MP-IMBioRad離子交換樹脂的丙烯酰胺-AA共聚物表現(xiàn)出較高的衰減，AA的部分從10%和5%下降。依據(jù)不同的實施方式，用于涂布聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的共聚物可包括由2-羥乙基丙烯酸酯(HEA)和AA制備的那些共聚物。如圖21所示，用于涂布MP-IMBioRad離子交換樹脂的HEA-AA共聚物表現(xiàn)出較高的衰減，AA的部分從10%和5%下降。依據(jù)不同的實施方式，共聚物可提高被處理的離子交換樹脂的衰減性能和貯存壽命。助劑可以是由單體制備的水溶性或微溶于水的均聚物或共聚物，所述單體包括，例如(甲基)丙烯酰胺、N-甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基(甲基)丙烯酰胺、N-正丙基(甲基)丙烯酰胺、N-異丙基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基-N-甲基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯酰胺、N-羥甲基(甲基)丙烯酰胺、N-(3-羥丙基)(甲基)丙烯酰胺、N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基乙酰胺、N-甲基-N-乙烯基乙酰胺、在聚合后可水解得到乙烯醇的乙酸乙烯酯、2-羥乙基(甲基)丙烯酸酯、3-羥丙基(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基吡咯烷酮、聚(環(huán)氧乙烷)(甲基)丙烯酸酯、N-(甲基)丙烯酰基丁二酰亞胺、N-(甲基)丙烯?；鶈徇-2,2,2-三氟乙基(甲基)丙烯酰胺、N-乙酰基(甲基)丙烯酰胺、N-酰氨基(甲基)丙烯酰胺、N-乙酰氨基(甲基)丙烯酰胺、N-三(羥甲基)甲基(甲基)丙烯酰胺、N-(甲基)丙烯酰基三(羥甲基)甲胺、(甲基)丙烯?；濉⒁蚁┗鶉f唑垸酮、乙烯基甲基噁唑烷酮或它們的組合、以及與丙烯酸的共聚物。用含有合成聚合物、表面活性劑和穩(wěn)定添加劑的聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物在DNA測序儀中通過毛細(xì)管電泳(CE)分離之前，可以先純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物。該純化操作可以除去會干擾CE分離的未結(jié)合的染料標(biāo)記的二脫氧核苷酸。為了提供足夠的注射，注入到CE系統(tǒng)中的溶液的離子強度應(yīng)該相當(dāng)?shù)?，例如lmM鹽。采用CE的DNA測序儀可以是自動化儀器，可以儲存和處理多個滴定盤的DNA測序樣品。這些系統(tǒng)在處理之前可多達(dá)24小時在自動化DNA測序儀的儲存區(qū)域?qū)⒁幌盗袠悠放懦申犃?。目前的大多?shù)純化方法不能保持純化介質(zhì)與樣品系列的接觸超過8小時，以避免破裂。希望用能夠穩(wěn)定的可抵制降解8小時以上(例如48小時)的聚電解質(zhì)涂布的顆粒純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物。希望提供作為去離子的水性注射溶液形式的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物穩(wěn)定且抵抗降解，而不會抑制DNA測序產(chǎn)物電動注入到CE系統(tǒng)中。其它穩(wěn)定方法如加入乙二胺四乙酸(EDTA)提高了DNA測序產(chǎn)物溶液的離子強度，從而抑制了電動注射。希望用聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒的混合床純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物。所述混合床能夠使DNA測序溶液的離子強度保持在相當(dāng)?shù)偷乃健ｋx子形式的穩(wěn)定劑可以被顆粒吸收，并從溶液中除去。希望用不需要利用聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒從溶液中除去的非離子材料穩(wěn)定DNA測序溶液。用于CE系統(tǒng)的電動注射溶液可包括去離子水或去離子甲酰胺(DI甲酰胺)。EDTA已經(jīng)用作含有DI甲酰胺的DNA測序產(chǎn)物溶液的穩(wěn)定劑。添加或不添加碳酸氫鈉的DTT已經(jīng)用作含有甲酰胺的DNA測序產(chǎn)物溶液的穩(wěn)定劑，以抵抗熒光染料破碎。曾認(rèn)為DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中的不穩(wěn)定性是非實質(zhì)性的的。但是，儲存在去離子水中的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物會變得不穩(wěn)定，并破碎。例如，在去離子水中儲存24小時的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物在分析時表現(xiàn)出明顯的峰加寬現(xiàn)象。如圖22A所示，在去離子水中三小時的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物表現(xiàn)出不明顯的峰加寬。然而，如圖22B中所示，在去離子水中24小時的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物表現(xiàn)出明顯的峰加寬。希望注入到CE中的DNA測序產(chǎn)物溶液中使用去離子水，因為去離子水不貴且無毒，去離子水與DI甲酰胺注射液相比，提供更高的信號強度，并且去離子水與聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒相容。依據(jù)不同的實施方式，兩性離子化合物能夠抵抗DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中的降解。例如，氫氧化l-羧甲基-N,N,N，-三甲基-甲垸銨內(nèi)鹽(甜菜堿)能夠穩(wěn)定在去離子水中的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物，形成用于電動注射的穩(wěn)定水溶液。兩性離子化合物能夠提供基本中性、基本低電導(dǎo)、和/或基本非離子性條件，用于電動注入到CE系統(tǒng)中?？商幚韮尚噪x子化合物使其成為中性，而用聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒純化DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物，兩性化合物不會象其它離子化合物(如鹽)那樣被所述顆粒大量除去。依據(jù)不同的實施方式，可以將穩(wěn)定添加劑與純化介質(zhì)(例如，聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒等)一起引入到DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物中，或者引入到已經(jīng)通過其它方法(例如乙醇沉淀、異丙醇沉淀、旋轉(zhuǎn)柱、聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒等)純化的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物中，然后從純化介質(zhì)中分離。依據(jù)不同的實施方式，如上所述，在純化之前向DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物中加入表面活性劑能夠在樣品隨后在DNA測序儀中通過CE分離時提高染料假象的除去。在不同的實施方式中，表面活性劑可以與穩(wěn)定添加劑和聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒一起存在于DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物的溶液中。表面活性劑可以陰離子、陽離子、非離子、兩性離子或它們的組合類型的表面活性劑。表面活性劑可以0.01%至10%或0.5%至5%或1%至10%的濃度加入。穩(wěn)定添加劑可以是兩性離子，例如甜菜堿、含硫化合物如二硫蘇糖醇，可氧化苯酚如鄰苯二酚、單糖、二糖、多糖或氨基酸。穩(wěn)定添加劑的濃度可以為lmM至5M，或0.5M至2M，或O.lmM至250mM，或1M至3M。依據(jù)不同的實施方式，表面活性劑可包括辛基苯酚乙氧基化物(TritonX-IOO)、聚氧乙烯二醇十二烷基醚(Brij35)、聚乙二醇十六烷基醚(Brij58)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、Brij97、聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酉旨(polyoxythylnesorbitanmonolaurate)(Tween20,Tween80)、3-(癸基二甲基銨)丙磺酸內(nèi)鹽(Zwittergent3-8，3-12,3-14)、3-[3-(膽酰氨基丙基)-二甲基銨]丙磺酸鹽(CHAPS)、3-[3-(膽酰氨基丙基)-二甲基銨]-2-羥基-l-丙磺酸鹽(CHAPSO)、N,N-二[3-D-葡糖酰氨基)丙基]膽胺(BigCHAP)、洗滌劑磺基甜菜堿(C7BzO)、Tergitol(NP7,9,11，13，15)、N-(烷基C10-C16)曙N,N-二甲基甘氨酸甜菜堿(EmpigenBB)、正十二垸基麥芽苷、LuberolPX、正辛基葡糖苷、3-(4-庚基)苯基-3-羥基-丙基-二甲基銨-丙磺酸鹽(C7BzO)、非洗滌劑磺基甜菜堿或它們的組合。依據(jù)不同的實施方式，穩(wěn)定添加劑可包括氫氧化l-羧甲基-N,N,N,-三甲基-甲垸銨(甜菜堿)、甲基甘氨酸、二甲基甘氨酸、4-(2-羥乙基)哌嗪-l-丙磺酸(EPPS)、N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(tricine)、N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸(bicine)、N-[tris(羥甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸(TAPS)、Good's緩沖液、2-巰基乙醇、DTT、三(2-羧乙基)膦氫氯化物(TCEP)、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇和它們的組合。圖23A-23C和24A-24C顯示了通過ABIPRISM3100基因分析儀(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)和說明本發(fā)明的實驗得到的DNA測序儀電泳圖結(jié)果。圖23A顯示了在沒有表面活性劑的情況下純化的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物與1M甜菜堿和2.5mMDTT的電泳圖。在接近堿70的位置觀察到會干擾基線呼叫(basecalling)的不良染料假象。圖23B顯示了除了穩(wěn)定添加劑、甜菜堿和DTT之外還使用3XTritonX-100純化的相同反應(yīng)產(chǎn)物。添加TritonX-100得到無染料假象的電泳圖。圖23C顯示了除穩(wěn)定添加劑、甜菜堿和DTT之外還使用3%Brij35純化的相同反應(yīng)產(chǎn)物。添加Brij35得到無染料假象的電泳圖。其它實驗已經(jīng)顯示在不加入DTT的情況下與加入DTT類似的結(jié)果。圖24A-24C顯示了在DAN測序反應(yīng)產(chǎn)物與1.5M甜菜堿、2.5mMDTT和3XCHAPS混合，同時該溶液保持與用作純化介質(zhì)的聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒接觸時的電泳圖。將該溶液培育不同時間。圖22B顯示了在無添加劑的情況下，DNA測序電泳圖的品質(zhì)下降。圖24A顯示了由在室溫下(2(TC)培育六小時的溶液得到的電泳圖。與圖22B觀察到的降解相比，圖24A中直到800個核苷酸的可讀序列中峰的分辨度良好，并且在該序列的早期部分中沒有觀察到染料假象。圖24B和24C顯示了分別培育24和48小時的相同反應(yīng)。即使在24小時和48小時，測序反應(yīng)產(chǎn)物檢測的品質(zhì)仍然沒有明顯的下降。這些實施例表明穩(wěn)定添加劑能夠提高染料假象的除去和穩(wěn)定去離子水溶液中的DNA測序反應(yīng)，即使在聚電解質(zhì)涂布的離子交換顆粒存在的情況下也是如此。依據(jù)不同的實施方式，用聚電解質(zhì)涂布的交換顆粒純化的方法可包括向測序反應(yīng)產(chǎn)物中添加CHAPS和甜菜堿，添加聚電解質(zhì)涂布的交換顆粒和未涂布的離子交換顆粒的混合物，密封溶液，混合30-60分鐘，離心，注射上清液。對于該說明書和所附權(quán)利要求，除非另有指示，說明書和權(quán)利要求書中所用的所有表示組分的量、材料的百分?jǐn)?shù)或比例、反應(yīng)條件和其它數(shù)值的數(shù)字在所有情況中都應(yīng)理解為前有詞"約"修飾。因此，除非另有指示，以下說明書和所附權(quán)利要求書中所述的參數(shù)是近似值，可根據(jù)本發(fā)明希望得到的所需性質(zhì)而變化。根據(jù)大量已報導(dǎo)的有效數(shù)字和通過應(yīng)用普通舍入技術(shù)，各參數(shù)至少應(yīng)該解釋為無論如何不試圖應(yīng)用等同物學(xué)說來限制權(quán)利要求的范圍。盡管陳述本發(fā)明廣泛范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，具體實施例中陳述的數(shù)值是盡可能精確的。但是，任何數(shù)值本身含有一定的必然誤差，該種誤差是它們各自檢測測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差所致的。而且，文中所揭示的所有范圍都應(yīng)理解為包括其中包含的任何和全部亞范圍。例如范圍"l至10"包括在最小值1和最大值IO之間的任何和所有亞范圍，包括該最小值和最大值，也就是說，最小值等于或大于l，最大值等于或小于IO的任何和全部亞范圍，例如5.5至10。注意，如說明書和所附權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式"一"、"一個"、"一種"包括復(fù)數(shù)相關(guān)詞，除非明確不含糊的限定于一個相關(guān)詞。因此，例如，"一種單體"的表示包括兩種或多種單體。此外，使用術(shù)語"包括'以及其它形式(例如"包含"和"含有")是非限制性的。顯然對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可以對文中所述的不同實施方式進行各種修改和變化。因此，文中所述的不同實施方式旨在覆蓋所附權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)的各種修改和變化。權(quán)利要求1.一種溶液，其包含顆粒，所述顆粒包含包含離子交換材料的核，包含聚電解質(zhì)材料的涂層，其中所述核和所述涂層適于分離DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物；和非離子型表面活性劑。2.如權(quán)利要求1所述的溶液，其特征在于，所述非離子型表面活性劑是兩性離子表面活性劑。3.如權(quán)利要求2所述的溶液，其特征在于，所述兩性離子表面活性劑是CHAPS。4.如權(quán)利要求1所述的溶液，其特征在于，所述溶液還包含穩(wěn)定添加劑。5.如權(quán)利要求4所述的溶液，其特征在于，所述穩(wěn)定添加劑是兩性離子化合物。6.如權(quán)利要求5所述的溶液，其特征在于，所述兩性離子化合物是甜菜堿。7.如權(quán)利要求1所述的溶液，其特征在于，所述非離子型離子表面活性劑適于促進從DNA測序反應(yīng)中除去未結(jié)合的染料終止子。8.如權(quán)利要求7所述的溶液，其特征在于，所述非離子型表面活性劑在不加熱時是有效的。9.如權(quán)利要求1所述的溶液，其特征在于，所述離子交換材料是陽離子性的。10.如權(quán)利要求9所述的溶液，其特征在于，所述溶液還包含陰離子交換顆粒。11.如權(quán)利要求l所述的溶液，其特征在于，所述離子交換材料是陰離子性的。12.如權(quán)利要求ll所述的溶液，其特征在于，所述溶液還包含陽離子交換顆粒。13.—種用于DNA測序的方法，所述方法包括提供純化介質(zhì)，使純化介質(zhì)與DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物接觸，以除去未結(jié)合的染料終止子和鹽；分離純化介質(zhì)；在沒有純化介質(zhì)干擾的情況下，由DNA測序產(chǎn)物加載用于毛細(xì)管電泳的樣品。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述純化介質(zhì)包含多個顆粒，其中各顆粒包含包含離子交換材料的核和包含聚電解質(zhì)材料的涂層。15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述加載包括電動注射。16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述純化介質(zhì)包含多個顆粒，其中分離包括對多個顆粒進行磁處理，使多個顆粒漂浮，或者向多個顆粒施加離心力或重力。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述加載在多個顆粒上方或下方發(fā)生。18.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括調(diào)節(jié)樣品注入位置，從多個顆粒上方的DNA測序產(chǎn)物加載用于毛細(xì)管電泳的樣叩o19.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括提供非離子型洗滌劑。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述非離子型洗滌劑是CHAPS。21.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括用兩性離子化合物穩(wěn)定所述溶液。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述兩性離子化合物是甜菜堿。23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物、純化介質(zhì)和兩性離子化合物儲存至少8小時，而DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物不會失去穩(wěn)定性。全文摘要用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物和/或DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物的方法，以及用于這種純化的材料。文檔編號C12P19/34GK101287536SQ200680004713公開日2008年10月15日申請日期2006年2月15日優(yōu)先權(quán)日2005年2月15日發(fā)明者A·N·K·勞,B·F·約翰遜,F·W·莫瑟,G·P·阿姆帕羅,M·P·哈爾多申請人:阿普里拉股份有限公司