專利名稱：：新β-半乳糖苷-α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新β-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、編碼該酶的基因、生產(chǎn)該酶的孩i生物和該酶的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：糖轉(zhuǎn)移酶是與生物體內(nèi)的糖蛋白、糖脂等的糖鏈的生物合成相關(guān)的酶。而且，其反應(yīng)生成物即糖蛋白、糖脂等的糖鏈(以下稱復(fù)合糖糖鏈)在生物體內(nèi)具有非常重要的功能。例如，已知糖鏈?zhǔn)且环N重要的分子，其主要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中作為處于分化、發(fā)育的細(xì)胞間及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)、復(fù)合糖的靶標(biāo)而發(fā)揮作用。如上述，糖鏈有著非常重要的功能，與此相應(yīng)的具體例子是促紅細(xì)胞生成素。促紅細(xì)胞生成素是一種糖蛋白，人們制備了增加糖鏈的數(shù)目重組促紅細(xì)胞生成素，從而提高了其壽命，現(xiàn)在已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化。今后，像這樣利用糖鏈的醫(yī)藥產(chǎn)品、功能性食品等的開發(fā)是可以預(yù)期的。因此，作為糖鏈的合成、生產(chǎn)手段，糖轉(zhuǎn)移酶的重要性正在提高。至今為止，已經(jīng)從人、小鼠、大鼠和酵母等真核生物中分離出約150種以上的糖轉(zhuǎn)移酶基因，并已進(jìn)一步在以CHO細(xì)胞、大腸桿菌等為宿主細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)中表達(dá)具有糖轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。另一方面，從原核生物細(xì)菌中也分離出數(shù)種糖轉(zhuǎn)移酶基因，并已進(jìn)一步在使用大腸桿菌的重組生產(chǎn)系統(tǒng)中表達(dá)具有糖轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)，還闡明了其底物特性、各種酶化學(xué)性質(zhì)。在構(gòu)成糖鏈的糖中，從糖鏈功能的觀點(diǎn)來看，多存在于非還原末端的唾液酸是極其重要的糖，因而，在現(xiàn)在越來越重要的糖轉(zhuǎn)移酶中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶是需求最高的酶之一。關(guān)于a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其基因，已有許多動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物來源的產(chǎn)物的報(bào)道(例如參見Harduin-Lepers,A.etal.,Biochem.J.,15;352Pt1:37-48(2000);Young-ChoonLeeetal.,J.Biol.Chem.,23;274(17):11958-67(1999);Lee,Y-C.etal.,J.Biochem"216,377-385(1993);Chang,M-L.etal"Glycobiology,5，319-325(1995);Gillespie,W.etal.,J.Biol.Chem.,267，21004-21010(1999))。但是，這些動(dòng)物來源的酶的問題是純化困難、無法大量獲得因此價(jià)格非常高，而且作為酶、其穩(wěn)定性不好。與此相對(duì)，有報(bào)導(dǎo)稱已從屬于奈瑟(氏)菌屬(Neisseria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、嗜血桿菌屬(Hemophilus)禾口巴斯德氏菌屬(Pasteurella)的微生物中獲得了微生物來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其基因(例如參見WO97/047749、WO99/049051、WO0脂7314、WO03/027297)。但是，尚未有從屬于弧菌科的微生物獲取的報(bào)導(dǎo)，也未有屬于弧菌科的微生物中存在具有a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的報(bào)導(dǎo)。專利文獻(xiàn)1國際公開第WO97/047749A號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)2國際公開第WO99/049051A號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)3國際公開第WO01/077314A號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)4國際公開第WO03/027297A號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn)1:Harduin-Lepers,A.etal.,Biochem.J"15;352Pt1:37-48(2000)非專利文獻(xiàn)2:Young-ChoonLeeetal.,(1999)非專利文獻(xiàn)3Lee,Y-C.etal.,J.Biochem.,216，377-385(1993)非專利文獻(xiàn)4Chang,M-L.etal.,Glycobiology，5，319-325(1995)非專利文獻(xiàn)5Gillespie,W.etal.，J.Biol.Chem.,267,21004-21010(1992)
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的課題是提供來源于弧菌科微生物的新(3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因。此外，本發(fā)明的課題是提供利用編碼本發(fā)明的P-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因采用基因重組技術(shù)高效生產(chǎn)該酶的方法。解決課題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明人等進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)屬于弧菌科(Vibrionaceae)的微生物產(chǎn)生一種新酶，該酶使唾液酸以(x2,34定轉(zhuǎn)移到糖鏈中的半乳糖殘基、葡萄糖殘基、甘露糖殘基、果糖殘基、N-乙酰葡萄糖胺殘基或N-乙酰半乳糖胺殘基上，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供新[3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼核酸、以及生產(chǎn)該唾液酸轉(zhuǎn)移酶的方法。以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。β-半乳糖苷-α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶本發(fā)明提供新α-半乳糖苷-α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。在本說明書中，"P-半乳糖苦-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶"是指具有使唾液酸由一磷酸胞苷(CMP)轉(zhuǎn)移至復(fù)合糖糖鏈或游離糖鏈中的半乳糖殘基的3位，存在于乳糖或N-乙酰乳糖胺等寡糖中的半乳糖殘基的3位，或者半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺等可構(gòu)成復(fù)合糖且3位的碳上有羥基的單糖的3位的活性的蛋白質(zhì)。在本說明書中，"(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性"指β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的上述活性。此外，這里所述的唾液酸是指屬于唾液酸家族的神經(jīng)氨酸的衍生物。具體地是指N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)、5-脫氨基-5羥基神經(jīng)氨酸(KDN)、夕少7》酸等。本發(fā)明的P-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶是含有序列號(hào)2、序列號(hào)29或序列號(hào)31的氨基酸序列蛋白質(zhì)。本發(fā)明的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶是由含序列號(hào)1、序列號(hào)28或序列號(hào)30的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的含有序列號(hào)2的氨基酸序列的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶中，序列號(hào)2的氨基酸1-21為信號(hào)序列。因此，本發(fā)明的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以是包含序列號(hào)2的氨基酸22-409的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明的P-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以是由包含序列號(hào)1中堿基64-1230的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的包含序列號(hào)29的氨基酸序列的(3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶中，估計(jì)序列號(hào)29的氨基酸l-24為信號(hào)序列。因此，本發(fā)明的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以是含有序列號(hào)29的氨基酸25-409的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明的(3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以是由含有序列號(hào)28中堿基73-1230的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的含有序列號(hào)31的氨基酸序列的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶中，估計(jì)序列號(hào)31的氨基酸1-22為信號(hào)序列。因此，本發(fā)明的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以是含有序列號(hào)31的氨基酸23-402的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明的P-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以是由包含序列號(hào)30的堿基67-1209的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括上述本發(fā)明的f3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的變體，其為具有p-半乳糖苷—a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。這樣的變體蛋白也包含于本發(fā)明的P-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶中。本發(fā)明的變體蛋白可以是含有下述氨基酸序列，且具有(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)所述氨基酸序列在選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸23-402的氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入和/或添加。取代可以是保守取代，即將特定的氨基酸殘基替換為具有相似物理化學(xué)特征的殘基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基團(tuán)氨基酸殘基之間的取代(例如Ile、Val、Leu或AIa間的相互取代)、才及性殘基之間的耳又代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之間的相互取代)等。氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的突變體可以通過對(duì)編碼野生型蛋白質(zhì)的DNA實(shí)施例如公知的定點(diǎn)誘變(例如參見NucleicAcidResearch,Vol.lO，No.20，p.6487-6500,1982,通過引用其全文引入本說明書)來產(chǎn)生。在本說明書中，"一個(gè)或多個(gè)氨基酸"指通過定點(diǎn)誘變方法能夠缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。就定點(diǎn)誘變方法而言，例如，除希望的變異即特定的不一致之外，還可以使用與要突變的單鏈?zhǔn)删wDNA互補(bǔ)的合成寡核苷酸引物按如下方式進(jìn)行。即，以上述合成寡核苷酸為引物合成與噬菌體互補(bǔ)的鏈，用得到的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化細(xì)菌的培養(yǎng)物鋪在瓊脂上，由含噬菌體的單個(gè)細(xì)胞形成噬菌斑。這樣，理論上有50%的新菌落含有作為單鏈的具有突變的噬菌體，其余的50%攜帶原序列。在合適的溫度下，使獲得的噬菌斑與通過激酶而標(biāo)記的合成探針雜交，所述合適的溫度指該溫度下所述探針與和帶有目的突變的DNA完全一致的噬菌斑雜交，而不與攜帶原有鏈的噬菌斑雜交。然后，收集與該探針雜交的噬菌斑，進(jìn)行培養(yǎng)，回收DNA。另外，在保持其活性的同時(shí)對(duì)酶等生物活性多肽的氨基酸序列施加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定點(diǎn)突變外，還有用誘變物處理基因的方法，以及選擇性地?cái)嚅_基因，刪除、然后取代插入或添加選定核苷酸，再進(jìn)行連接的方法。本發(fā)明的變體蛋白可以是由下述核酸編碼、且具有P-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)其中所述核酸包含在嚴(yán)緊條件或高度嚴(yán)緊條件下與選自序列號(hào)1、序列號(hào)1的堿基64-1230、序列號(hào)28、序列號(hào)28的堿基73-1230、序列號(hào)30和序列號(hào)30的堿基67-1209的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的堿基序列。這里，嚴(yán)緊的雜交條件例如但不限于在0.5M磷酸鈉pH7.2、lmMEDTA、7%SDS、1%BSA中55。C進(jìn)行雜交，然后在40mM磷酸鈉緩沖液pH7.2、lmMEDTA、5%SDS、0.5%BSA中55。C洗滌2次每次15分鐘，在40mM磷酸鈉緩沖液pH7.2、lmMEDTA、1。/。SDS中55。C洗滌2次每次15分鐘；或者按MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版、第1巻、1.101-104頁、ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)(通過引用將其全文引入本文)等的記載在30%去離子化曱酰胺、0.6MNaCI、40mM磷酸鈉pH7.4、2.5mMEDTA、1%SDS中42。C進(jìn)行雜交后，在2xSSC、0.1%SDS中室溫洗滌2次每次10分鐘，再于同樣的緩沖液中55。C洗滌l小時(shí)。此外，在高度嚴(yán)緊條件下進(jìn)行的雜交例如按MolecularCloning(同上)等的記載在0.5M磷酸鈉pH7.2、lmMEDTA、7%SDS、1%BSA中65。C進(jìn)行雜交，然后在40mM磷酸鈉緩沖液pH7.2、lmMEDTA、5%SDS、0.5%BSA中65°C,在40mM磷酸鈉緩沖液pH7.2、lmMEDTA、1%SDS中65。C進(jìn)行洗滌。本發(fā)明的變體蛋白還可以是含有下述氨基酸序列、且具有(3-半乳糖苷-(x2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)所述氨基酸序列與選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸23-402的氨基酸序列具有至少60%、優(yōu)選至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%、更優(yōu)選至少99.5%的氨基酸同源性。此外，本發(fā)明的變體蛋白可以是由下述核酸編碼、且具有(3-半乳糖苷-012,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)所述核酸與選自序列號(hào)1、序列號(hào)1的堿基64-1230、序列號(hào)28、序列號(hào)28的堿基73-1230、序列號(hào)30和序列號(hào)30的堿基67-1209的堿基序列具有至少60%、優(yōu)選至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%、更優(yōu)選至少99.5%的同源性。這里，氨基酸序列或核酸堿基序列的同源性可以通過目測(cè)或數(shù)學(xué)計(jì)算確定。例如，2個(gè)氨基酸序列的同源性％可以用遺傳信息處理軟件GENETYXVer.7(GENETIC制作)等程序或FASTA算法、BLAST算法等，通過比較序列信息來確定。唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性可以采用7>知方法測(cè)定，例如采用J.Biochem.，120,l(M-llO(1996)(通過引用將其全文引入本文)中記載的方法。例如，以CMP-Neu5Ac(N-乙酰神經(jīng)氨酸)為糖供體底物、以乳糖為糖受體底物進(jìn)4亍酶反應(yīng)，通過評(píng)Y介反應(yīng)生成物唾液酸乳糖的量可以評(píng)價(jià)酶活性。作為確定轉(zhuǎn)移至糖受體底物的唾液酸的結(jié)合形式的方法，可以采用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行，例如但不限于使用吡啶氨基化糖鏈的方法、采用核磁共振分光法(NMR)對(duì)反應(yīng)生成物進(jìn)行分析等。使用吡啶氨基化糖鏈的方法中包括以吡啶氨基化糖鏈為糖受體底物進(jìn)行酶反應(yīng)。具體地，以吡啶氨基化乳糖(Gal(31-4Glc-PA，TaKaRaBio產(chǎn)品)為糖受體底物、以CMP-Neu5Ac為糖供體底物進(jìn)行酶反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)生成物進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，由反應(yīng)生成物的保留時(shí)間判斷唾液酸轉(zhuǎn)移的位置。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的酶是源自屬于弧菌科的微生物，優(yōu)選源自屬于弧菌屬(Vibriospp.)的微生物、或者優(yōu)選源自屬于發(fā)光桿菌屬(Photobacteriumspp.)的孩么生物、其中更優(yōu)選源自屬于明亮發(fā)光桿菌種(Photobacteriumphosphoreum)的孩史生物的酵。本發(fā)明的p-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)和理化性質(zhì)，除以具有上述定義的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性為特征外，并非限定，其最適pH在pH5-l1、pH5-10、pH5-9或pH5-7的范圍，其最適溫度為5-35。C、10-35°C、20-35°C或20-30°C，分子量用SDS-PAGE分析為42,000士3000Da左右。編碼(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸本發(fā)明提供編碼P-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸。本發(fā)明的核酸是編碼含有選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸23-402的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸。此外，本發(fā)明的核酸是含有選自序列號(hào)1、序列號(hào)1的堿基64-1230、序列號(hào)28、序列號(hào)28的堿基73-1230、序列號(hào)30和序列號(hào)30的堿基67-1209的堿基序列的核酸。本發(fā)明的核酸可以是上述核酸的變體，所述變體編碼具有p-半乳糖苷-012,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。這樣的核酸也包含于本發(fā)明的編碼(3-半乳糖苦-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸之中。這樣的核酸的變體是編碼含有下述氨基酸序列且具有P-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的核酸所述氨基酸序列是在選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸23-402的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列。這樣的核酸的變體還可以是含有下述石成基序列、且編碼具有P-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的前述核酸所述堿基序列在嚴(yán)緊條件或高度嚴(yán)緊條件下與選自序列號(hào)1、序列號(hào)1的堿基64-1230、序列號(hào)28、序列號(hào)28的堿基73-1230、序列號(hào)30和序列號(hào)30的堿基67-1209的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交。這里，嚴(yán)緊條件或高度嚴(yán)緊條件的定義同上。這樣的核酸的變體還可以是與如下所述的;咸基序列具有至少60%、優(yōu)選至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95。/。、至少98%或者至少99%、更優(yōu)選至少99.5%的同源性，且編碼具有p-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的前述核酸所述堿基序列選自序列號(hào)1、序列號(hào)1的堿基64-1230、序列號(hào)28、序列號(hào)28的堿基73-1230、序列號(hào)30和序列號(hào)30的堿基67-1209。這里，核酸堿基序列的同源性可以用前面描述的方法確定。這樣的核酸的變體還可以是編碼含有如下所述的氨基酸序列且具有卩-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的核酸所述氨基酸序列與選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸23-402的氨基酸序列具有至少60%、優(yōu)選至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%、更優(yōu)選至少99.5%的同源性。這里，氨基酸序列的同源性可以用前面描述的方法確定。表達(dá)B-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的微生物本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，屬于弧菌科的微生物表達(dá)新的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。因而，本發(fā)明提供表達(dá)p-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的微生物。本發(fā)明的微生物是屬于弧菌科且具有產(chǎn)(3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶能力的孩i生物，其優(yōu)選為屬于弧菌屬(Vibriospp.)的微生物、或者優(yōu)選為屬于發(fā)光桿菌屬(photobacteriumspp.)的微生物、其中更優(yōu)選為屬于明亮發(fā)光桿菌(photobacteriumphosphoreum)的孩i生物。具有產(chǎn)(3-半乳糖普-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶能力的屬于弧菌科的微生物例如明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹(保藏編號(hào)NITEBP-88)、發(fā)光桿菌屬JT-ISH-224抹(保藏編號(hào)NITEBP-87)和弧菌屬汀-FAJ-16抹(保藏編號(hào)MTEBP-98)。而且，上述弧菌科微生物為海洋性細(xì)菌，其是從海水中或海產(chǎn)魚貝類(魚類和貝類)分離的。例如，本發(fā)明的明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467株、發(fā)光桿菌屬JT-ISH-224抹和弧菌屬JT-FAJ-16抹分別是從石川縣產(chǎn)的烏賊、石川縣產(chǎn)的梭子魚和福岡縣產(chǎn)的竹莢魚分離的。本發(fā)明的微生物例如可以采用諸如以下說明的篩選方法進(jìn)行分離。以海水、海砂石、海泥或海產(chǎn)魚貝類作為微生物源。將海水、海砂石或海泥直接或用滅菌海水稀釋后作為接種源。對(duì)于海產(chǎn)魚貝類，可以用接種環(huán)擦取其表面粘液等作為接種源，或者以在滅菌海水中磨碎其內(nèi)臟而得的液體作為接種源。將這些涂布在MarineBrothAgar2216培養(yǎng)基(BectorvDickinson產(chǎn))、添加了氯化鈉的NutrientAgar培養(yǎng)基(BectorvDickinson產(chǎn))等平板培養(yǎng)基上，獲得在各種溫度條件下生長的海洋微生物。按常規(guī)方法對(duì)所得的微生物進(jìn)行純培養(yǎng)后，使用MarineBroth2216培養(yǎng)基(BectorvDickinson產(chǎn))、添加了氯化鈉的NutrientBroth(BectorvDickinson產(chǎn))等液體培養(yǎng)基對(duì)各微生物進(jìn)行培養(yǎng)。在微生物充分生長后，由培養(yǎng)液通過離心分離收集菌體。向收集的菌體加入含表面活性劑0.2%TritonX-100(關(guān)東化學(xué)產(chǎn))的20mM卡可基酸鹽緩沖液(pH6.0),懸浮菌體。在水冷卻條件下對(duì)該菌體懸液進(jìn)行超聲波處理，破碎細(xì)胞。以此細(xì)胞破碎液為酶溶液，按常規(guī)方法測(cè)定唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性，可以獲得具有唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的菌抹。本發(fā)明的明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467株、發(fā)光桿菌屬JT-ISH-224抹和弧菌屬JT-FAJ-16抹也是使用上述的篩選方法獲得的。關(guān)于所獲上述菌抹的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)和生理生化性質(zhì)以及通過16SrRNA基因的堿基序列分析進(jìn)行的菌種鑒定將在實(shí)施例1中詳細(xì)描述。上述菌種均保藏于獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(NPMD:NationalInstituteofTechnologyandEvaluation,PatentMicroorganismsDepositary;日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)。其中，明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)JT-ISH-467才朱的4呆藏編號(hào)為NITEBP-SS，保藏日為2005年3月14日；發(fā)光桿菌屬(Photobacteriumsp.)JT-ISH-224株的保藏編號(hào)為NITEBP-87,保藏日為2005年3月11日；弧菌屬(Vibriosp.)JT-FAJ-16株的保藏編號(hào)為NITEBP-98,保藏日為2005年5月23日。生產(chǎn)β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的方法(1)通過培養(yǎng)表達(dá)β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的微生物生產(chǎn)該酶的方法在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶來自屬于弧菌科的微生物；通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶能力的微生物，使之產(chǎn)生β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，并將其提取而獲得。作為此處使用的微生物，只要是屬于弧菌科且具有產(chǎn)β-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶能力的微生物，可以使用任何菌抹。在弧菌科微生物中優(yōu)選屬于弧菌屬的微生物，或者優(yōu)選屬于發(fā)光桿菌屬的微生物、其中更優(yōu)選屬于明亮發(fā)光桿菌的微生物。在本發(fā)明的方法中使用的微生物例如有明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹(保藏編號(hào)NITEBP-88)、發(fā)光桿菌屬(Photobacteriumsp.)JT-ISH-224抹(保藏編號(hào)NITEBP-87)和弧菌屬(Vibriosp.)JT-FAJ-16株(保藏編號(hào)NITEBP-98)。作為用于培養(yǎng)上述微生物的培養(yǎng)基，使用含有這些微生物可利用的碳源、氮源、無機(jī)物等的培養(yǎng)基。碳源例如蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白分解物、肉浸膏、葡萄糖等，優(yōu)選使用蛋白胨。作為氮源，優(yōu)選使用酵母提取物。作為鹽類，優(yōu)選適當(dāng)組合使用氯化鈉、檸檬酸鐵、氯化鎂、硫酸鈉、氯化釣、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、溴化鉀、氯化鍶、硼酸鈉、硅酸鈉、氟化鈉、硝酸銨、磷酸氫二鈉等。此外，可以使用含上述成分的MarineBroth2216培養(yǎng)基(Becton-Dickinson產(chǎn))。而且，還可以使用適度含有上述鹽類的人工海水、及向其中添加了蛋白胨、酵母提取物等的培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件因培養(yǎng)基的組成、菌抹而多少會(huì)有些差別，例如培養(yǎng)明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹時(shí)培養(yǎng)溫度為10-28°C、優(yōu)選為20-25。C,培養(yǎng)時(shí)間為8-48小時(shí)、優(yōu)選為16-24小時(shí)。由于目的酶存在于菌體內(nèi)，可以釆取例如超聲波破碎法、弗氏細(xì)胞壓碎器破碎法、玻璃珠破碎法、DynoMill(夕'4乂；、》)破碎法等任何公知的菌體破碎方法，并由菌體破碎物分離純化目的酶。在本發(fā)明的方法中優(yōu)選的菌體破碎方法是超聲波破碎法。例如，通過離心分離從菌體破碎物中除去固形物后，所得的菌體破碎液上清通過適當(dāng)組合市售陰離子交換柱、陽離子交換柱、凝膠過濾柱、羥基磷灰石柱、CDP-己醇胺Agarose柱、CMP-己醇胺Agarose柱、疏水柱等柱層析和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(氺一x^:Z-PAGE)等，可以純化至電泳單一條帶。此外，(3-半乳糖苦-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以完全純化，但部分純化品也有充分的活性，因此本發(fā)明的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以是純化品，也可以是部分純化品。(2)生產(chǎn)重組j3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的方法本發(fā)明提供包含編碼(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸的表達(dá)載體以及包含該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明還提供通過在適合重組蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞并回收表達(dá)的重組蛋白來生產(chǎn)重組(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白的方法。為了生產(chǎn)本發(fā)明的重組p-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白，根據(jù)使用的宿主選^^表達(dá)載體，在該載體上插入編碼(3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸序列，其中所述編碼(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸序列可操作地連接于衍生自哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲基因等的適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控核苷酸序列。調(diào)控序列例如有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操縱基因或增強(qiáng)子、mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始和終止的適宜序列。插入本發(fā)明的載體的編碼(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸序列中可以含有也可以不含有相當(dāng)于序列號(hào)1的堿基1-63、序列號(hào)28的堿基1-72或序列號(hào)30的堿基1-66的前導(dǎo)序列，此外上述前導(dǎo)序列還可以替換為其它生物來源的前導(dǎo)序列。通過對(duì)前導(dǎo)序列進(jìn)行替換，可以設(shè)計(jì)表達(dá)系統(tǒng)使得表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌至宿主細(xì)胞外。此外，本發(fā)明的重組β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白還可以表達(dá)為融合蛋白的形式，這是通過在載體上插入下述核酸而實(shí)現(xiàn)的該核酸中在編碼該酶的核酸之后連接了編碼His標(biāo)簽、FLAGTM標(biāo)簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等的核酸。以這樣的融合蛋白的形式表達(dá)本發(fā)明的酶，可以使該酶易于純化和檢測(cè)。適于β-半乳糖香-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白的表達(dá)的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。可在細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主中使用的適宜克隆和表達(dá)載體記載于例如Pouwels等、CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,NewYork,(1985)(通過引用將其全部內(nèi)容并入本文)。原核生物中包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，例如大腸桿菌或枯草桿菌。當(dāng)用大腸桿菌這樣的原核細(xì)胞作為宿主時(shí)，為了易于原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組多肽，可以使β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白包含N末端曱硫氨酸殘基。這個(gè)N末端甲硫氨酸殘基可以在表達(dá)后從重組β-半乳糖苷-012,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白上切除。在原核宿主細(xì)胞內(nèi)使用的表達(dá)載體一般含有1個(gè)或2個(gè)以上可以進(jìn)行表型選擇的標(biāo)記基因?？梢赃M(jìn)行表型選擇的標(biāo)記基因例如賦予抗生素抗性或獨(dú)立營養(yǎng)缺陷型(獨(dú)立栄養(yǎng)要求性)的基因。適于原核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體的例子包括pBR322(ATCC37017)這樣的商品化質(zhì)?；蛘咚鼈兊难苌铩BR322攜帶氨千青霉素抗性和四環(huán)素抗性基因，易于對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行鑒定。該pBR322載體內(nèi)可以插入合適的啟動(dòng)子和編碼β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸的DNA序列。其它的商品化載體還包括例如pKK223-3(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden)禾口pGEMl(PromegaBiotech.,Madison,Wisconsin,America)等。在用于原核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體中通常使用的啟動(dòng)子序列包括tac啟動(dòng)子、p-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)啟動(dòng)子、乳糖啟動(dòng)子(Chang等、Nature275:615,1978;和Goeddel等、Nature281:544,1979;通過引用，其全文引入本說明書)等。此外，可以在酵母宿主內(nèi)表達(dá)重組β-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白。優(yōu)選使用酵母屬(Saccharomyces，例如釀酒酵母(S.Cerevisiae)),也可以使用畢赤酵母屬(pichia)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)等其它酵母屬。酵母載體大多含有來自2p酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)序列、自主復(fù)制序歹'j(ARS)、啟動(dòng)子區(qū)、用于聚腺香酸化的序列、用于轉(zhuǎn)錄終止的序列以及可選擇的標(biāo)記基因。使用酵母a因子前導(dǎo)序列可以促使重組(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白分泌。適于用來促進(jìn)重組多肽從酵母宿主中分泌的其它前導(dǎo)序列也是公知的。轉(zhuǎn)染酵母的方法記載于例如Hinnen等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:1929-1933,1978(通過引用將其全部內(nèi)容并入本文)。使用哺乳動(dòng)物或昆蟲宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以表達(dá)重組P-半乳糖苷-(12,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白。也可以使用哺乳動(dòng)物起源的確立細(xì)胞系。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列可以從病毒基因組獲得。常用的啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列源自多瘤病毒、腺病毒2等?？梢允褂糜蒘V40病毒基因組例如SV40起點(diǎn)、早期和晚期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接位點(diǎn)和聚腺芬酸化位點(diǎn)衍生的DNA序列，賦予哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)基因序列表達(dá)所需的其它基因元件。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)使用的載體可以采用例如Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.,3:280，1983,通過引用將其全部內(nèi)容并入本文)的方法構(gòu)建。生產(chǎn)本發(fā)明的P-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白的一種方法包括在該蛋白質(zhì)得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體包含編碼(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白的核酸序列。然后，根據(jù)使用的表達(dá)系統(tǒng)，由培養(yǎng)培養(yǎng)基或細(xì)胞提耳又液回收(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白。純化重組(3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白的操作根據(jù)使用的宿主的形式以及本發(fā)明的蛋白質(zhì)是否分泌至培養(yǎng)基中等重要因素適宜地選擇。例如純化重組(3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白的操作包括陰離子交換柱、陽離子交換柱、凝膠過濾柱、羥基磷灰石柱、CDP-己醇胺Agarose柱、CMP-己醇胺Agarose柱、疏水柱等柱層析和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等，或者它們的組合。此外，當(dāng)與易化重組p-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶純化的標(biāo)簽等融合表達(dá)時(shí)，可以利用采用親和層析的純化方法。例如，當(dāng)與組氨酸標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等融合時(shí)，可以分別使用Ni-NTA(次氨基三乙酸)柱、結(jié)合有抗FLAG抗體的柱子或結(jié)合有谷胱甘肽的柱子等、通過親和層析進(jìn)行純化。重組(3-半乳糖苦-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以純化至電泳單一條帶，但由于部分純化品也具有充分的活性，所以本發(fā)明的β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以是純化品，也可以是部分純化品?？贵w本發(fā)明提供抗本發(fā)明的β-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白的抗體。本發(fā)明的抗體可以針對(duì)本發(fā)明的β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白或其片段進(jìn)行制備。這里，本發(fā)明的β-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的片段是具有下述序列的片段所述序列包含該酶的氨基酸序列中至少6個(gè)氨基酸、至少10個(gè)氨基酸、至少20個(gè)氨基酸或至少30個(gè)氨基酸?？贵w可以用本發(fā)明的β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶或其片段免疫本
技術(shù)領(lǐng)域：
中用于抗體制備的動(dòng)物進(jìn)行制備，所述動(dòng)物例如但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊等?？贵w可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。抗體可以基于本領(lǐng)域一支術(shù)人員公知的抗體制備方法進(jìn)行制備。本發(fā)明的抗體可以用于親和純化回收本發(fā)明的β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白。本發(fā)明的抗體可以用于在Western印跡、ELISA等測(cè)定法中檢測(cè)本發(fā)明的β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白。唾液酸糖鏈的生產(chǎn)方法在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供利用本發(fā)明的唾液酸轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)唾液酸糖鏈的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的方法是唾液酸糖鏈的生產(chǎn)方法，所述方法包括(i)制備含有本發(fā)明的β-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、糖供體底物和糖受體底物的溶液；(ii)在該溶液中進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)；(iii)從反應(yīng)溶液中獲取生成的唾液酸糖鏈。在本說明書中，唾液酸糖鏈?zhǔn)侵妇哂型僖核岬奶擎湣Ｔ诒景l(fā)明的方法中，借助本發(fā)明的酶進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)，通過該反應(yīng)將糖供體底物的唾液酸轉(zhuǎn)移至糖受體底物，得到唾液酸糖鏈。可以在本發(fā)明的方法中使用的糖供體底物沒有特別的限制，只要其是可以成為通過本發(fā)明的唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)的糖供體的底物。優(yōu)選的可以在發(fā)明的方法中使用的糖供體底物是CMP-唾液酸，更優(yōu)選的是CMP-Neu5Ac?？梢栽诒景l(fā)明的方法中使用的糖受體底物沒有特別的限制，可以是具有半乳糖殘基、葡萄糖殘基、甘露糖殘基、巖藻糖殘基、N-乙酰葡萄糖胺殘基或N-乙酰半乳糖胺殘基等的復(fù)合糖糖鏈或寡糖，或者是半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺等單糖。這里，"復(fù)合糖"是含糖生物分子的統(tǒng)稱，包括糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂。在本說明書中，"復(fù)合糖糖鏈"可以指糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂等復(fù)合糖本身，也可以指其糖鏈部分。"寡糖"是指2個(gè)或2個(gè)以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的糖。對(duì)于構(gòu)成寡糖的單糖的數(shù)目沒有特別的限制。此外，單糖或寡糖的還原末端可以用烷基、吡啶氨基、苯曱?；⑵S基、對(duì)硝基苯基、4-甲基傘形酮基(4->f^々>《'J7工卩乂L基)等修飾。在本發(fā)明的方法中，含有本發(fā)明的酶、糖供體底物和糖受體底物的溶液是緩沖液，例如包括但不限于醋酸緩沖液、卡可基酸緩沖液、磷酸緩沖液、TAPS緩沖液、Bis-Tris緩沖液、Tris緩沖液、CHES緩沖液、CAPS緩沖液、MOPS緩沖液、MES緩沖液、ADA緩沖液、PIPES緩沖液、ACES緩沖液、MOPSO緩沖液、HEPES緩沖液等。本發(fā)明的方法中含有本發(fā)明的酶、糖供體底物和糖受體底物的溶液的pH只要是本發(fā)明的酶具有酶活性的pH,沒有特別限制，優(yōu)選為pH5-11、pH5-10、pH5-9、pH5-7。在本發(fā)明的方法中，進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)的溫度只要是本發(fā)明的酶具有酶活性的溫度，沒有特別限制，優(yōu)選在5-35。C、10-35°C、20-35°C、20-3CTC的范圍內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明的方法中的從反應(yīng)溶液中獲取生成的唾液酸糖鏈的步驟，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的純化復(fù)合糖糖鏈、寡糖的方法進(jìn)行。例如，層析有反相層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、羥基磷灰石層析、親和層析、凝集素層析、活性碳層析、硅膠層析等，其它方法有采用超濾對(duì)糖鏈進(jìn)行分級(jí).濃縮、糖鏈的結(jié)晶等，或者這些方法的組合，但不限于上述。如后述的實(shí)施例4、11、12和13所示，本發(fā)明的酶可以通過a2,34建使唾液酸轉(zhuǎn)移到多種糖受體底物。采用本發(fā)明的唾液酸糖鏈的生產(chǎn)方法，可以容易地生產(chǎn)一般使用高底物特異性的公知唾液酸轉(zhuǎn)移酶無法生產(chǎn)的糖鏈。特別是由于尚未發(fā)現(xiàn)具有高效地向a-吡喃半乳糖苷、a-吡喃葡萄糖苷、a-吡喃甘露糖苷、a-吡喃巖藻糖苷、卩-吡喃巖藻糖苷等糖轉(zhuǎn)移唾液酸的活性的酶，本發(fā)明的方法提供容易地生產(chǎn)在這些糖上添加了唾液酸的糖鏈的方法。發(fā)明的效果本發(fā)明提供新的P-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼核酸，在提供已逐漸明確在生物體內(nèi)具有重要功能的糖鏈的合成'生產(chǎn)手段的觀點(diǎn)上做出了貢獻(xiàn)。特別是唾液酸在生物體內(nèi)多存在于復(fù)合糖糖鏈中的非還原末端，從糖鏈功能的觀點(diǎn)來看是極為重要的糖，因此唾液酸轉(zhuǎn)移酶是糖轉(zhuǎn)移酶中需求最高的酶之一，而本發(fā)明提供新的唾液酸轉(zhuǎn)移酶正回應(yīng)了這樣的高需求。(圖1-1)圖1-1為顯示JT-ISH-467抹來源的重組P-半乳糖芬-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶活性確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)品(失活的粗酶液、吡啶氨基化乳糖和吡啶氨基化a2,3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3，-唾液酸乳糖)的混合物)的HPLC分析結(jié)果的圖。(圖1-2)圖1-2為顯示JT-ISH-467抹來源的重組(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶活性確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的HPLC分析結(jié)果的圖。(圖1-3)圖1-3為顯示JT-ISH-467抹來源的重組(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶活性確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照實(shí)驗(yàn)(使用不含糖供體即CMP-唾液酸的反應(yīng)液進(jìn)行的反應(yīng))的HPLC分析結(jié)果的圖。(圖2)圖2為顯示明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹來源、發(fā)光桿菌屬JT-ISH-224抹來源和弧菌屬JT-FAJ-16抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(分別為序列號(hào)2、9、31)、美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)的a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(JC5898)以及多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)多殺亞種Pm70株的假設(shè)蛋白PM0188(AKK02272)的氨基酸序列間的比對(duì)的圖。JT-ISH-467株來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的下劃線顯示由純化蛋白測(cè)定的氨基酸序列。(圖3-1)圖3-1為顯示JT-ISH-467抹產(chǎn)生的卩-半乳糖苦-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶活性中反應(yīng)pH的影響的圖表。圖中，黑方塊、黑圓圈、黑三角、黑菱形、白方塊和白圓圈的圖線(plot)分別表示在醋酸緩沖液、卡可基酸緩沖液、磷酸緩沖液、TAPS緩沖液、CHES緩沖液和CAPS緩沖液中的測(cè)定結(jié)果。(圖3-2)圖3-2為顯示重組(3-半乳糖香-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶活性中反應(yīng)pH的影響的圖表。圖3-2a、圖3-2b和圖3-2c分別為顯示針對(duì)JT-ISH-467抹來源、JT-ISH-224抹來源和JT-FAJ-16抹來源的重組p-半乳糖香-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的結(jié)果的圖表。圖中，黑方塊、黑圓圈、黑三角、黑菱形、白方塊和白圓圈的圖線分別表示在醋酸緩沖液、卡可基酸緩沖液、磷酸緩沖液、TAPS緩沖液、CHES緩沖液和CAPS緩沖液中的測(cè)定結(jié)果。(圖4-1)圖4-1為顯示JT-ISH-467林產(chǎn)生的卩-半乳糖苦-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶活性中反應(yīng)溫度的影響的圖表。(圖4-2)圖4-2為顯示重組(3-半乳糖苦-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶活性中反應(yīng)溫度的影響的圖表。圖4-2a、圖4-2b和圖4-2c分別為顯示關(guān)于JT-ISH-467林來源、JT-ISH-224抹來源和JT-FAJ-16株來源的重組p-半乳糖苦-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的結(jié)果的圖表。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更具體的說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例實(shí)施例1:表達(dá)[3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的微生物的篩選及菌抹的鑒以海水、海砂、海泥或海產(chǎn)魚貝類作為接種源。將該接種源涂布在由MarineBrothAgar2216培養(yǎng)基(Becton.Dickinson產(chǎn))構(gòu)成的平板培養(yǎng)基上，獲取在15℃、25℃或30℃生長的微生物。按常規(guī)方法對(duì)所得的微生物進(jìn)行純培養(yǎng)后，使用由MarineBroth2216培養(yǎng)基(BectorvDickinson產(chǎn))構(gòu)成的液體培養(yǎng)基對(duì)各微生物進(jìn)行培養(yǎng)。在微生物充分生長后，由培養(yǎng)液通過離心分離收集菌體。向收集的菌體加入含表面活性劑0.2%TritonX-100(關(guān)東化學(xué)產(chǎn))的20mM卡可基酸緩沖液(pH6.0),懸浮菌體。在冰冷卻條件下對(duì)該菌體懸液進(jìn)行超聲波處理，破碎細(xì)胞。以此細(xì)胞破碎液為酶溶液測(cè)定唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性，得到具有唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的菌抹JT-ISH-467抹、JT-ISH-224株和JT-FAJ-16抹。此外，JT-ISH-467株、JT-ISH-224抹和JT-FAJ-16抹分別是從烏賊的表皮、梭子魚的內(nèi)臟和竹莢魚的內(nèi)臟獲得的。唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性采用J.Biochem.,120,104-110(1996)(通過引用將其全部內(nèi)容并入本文)中記載的方法測(cè)定。具體地說，使用反應(yīng)溶液(30(il)進(jìn)行酶反應(yīng)，所述反應(yīng)溶液中添加了糖供體底物CMP-Neu5Ac(70nmol、含25000cpm用14C標(biāo)記NeuAc的CMP-NeuAc、356cpm/nmol。NeuAc表示N-乙酰神經(jīng)氨酸)、糖受體底物乳糖(1.25|imol)和終濃度為0.5M的NaCl,并含有依照前文所述方法制備的酶。酶反應(yīng)在25。C進(jìn)行10-30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)溶液中加入5mM磷酸緩沖液(pH6.8)L97ml，所得溶液上樣于Dowexlx8(PO-型、0.2x2cm、BIO-RAD產(chǎn))柱。測(cè)定該柱的洗脫液中所含的反應(yīng)生成物，即唾液酸乳糖中所含的放射活性，可以計(jì)算出酶活性。(i)JT-ISH-467抹獲得的JT-ISH-467抹的性質(zhì)如下(細(xì)菌學(xué)性質(zhì))(1)細(xì)胞形態(tài)為桿菌，大小為0.7-0.8(imx1.5~2.0pm。(2)運(yùn)動(dòng)性-(3)革蘭氏染色性-(4)有無孢子-(生理生化性質(zhì))(1)生長溫度4。C為+、25。C為+、3(TC為-(2)菌落顏色不產(chǎn)生特征性菌落色素(3)0/F檢驗(yàn)+/-(4)過氧化氫酶試驗(yàn)-(5)氧化酶試驗(yàn)+(6)由葡萄糖產(chǎn)酸-(7)由葡萄糖產(chǎn)氣-(8)發(fā)光性+(9)硝酸鹽還原+(10)產(chǎn)吲咮+(11)葡萄糖酸化-(12)精氨酸雙水解酶+(13)脲酶-(14〕七葉苷水解-(15〕明膠水解性-(16〕p-半乳糖苷酶+(17〕葡萄糖同化性-(18)L-阿拉伯糖同化性-(19〕D-甘露糖同化性-(20〕D-甘露醇同化性-(21〕N-乙酰-D-葡糖胺同化性-(22〕麥芽糖同化性-(23〕葡糖酸鐘同化性-(24)正癸酸同化性-(25〕己二酸同化性-(26〕dl-蘋果酸同化性-(27〕檸檬酸鈉同化性-(28〕乙酸苯酯同化性-(29;細(xì)胞色素氧化酶+(30〕菌體內(nèi)DNA的GC含量(摩爾％)39.7%(通過16SrRNA基因堿基序列分析和DNA-DNA雜交進(jìn)行種的鑒定)以采用常規(guī)方法從JT-ISH-467抹提取的基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增16SrRNA基因的全堿基序列，并測(cè)定堿基序列。該堿基序列示于序列號(hào)3。將該石威基序列與明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)才莫式才朱ATCC11040抹的16SrRNA基因的堿基序列相比較，顯示同源率為100%的高同源性。該結(jié)果表明，JT-ISH-467株屬于發(fā)光桿菌屬。然而，16SrRNA基因僅為細(xì)菌全基因組的一部分，據(jù)稱對(duì)于種水平的極近親生物間的距離，根據(jù)16SrRNA基因的堿基序列的鑒定分析在很大的誤差。因而，采用在屬內(nèi)菌林親緣關(guān)系定量評(píng)定中一般采用的DNA-DNA雜交試驗(yàn)法進(jìn)行了種的鑒定。提取汀-ISH-467抹和明亮發(fā)光桿菌模式株NCIMB1282株(與ATCC11040抹為同一抹)的全DNA,用于試驗(yàn)。其結(jié)果，獲得了84.7%的高同源值(DNA-DNA親緣性)。一般地，同種間DNA-DNA同源值為60%以上，因此JT-ISH-467抹被鑒定為明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)。此外，DNA-DNA雜交試驗(yàn)按《微生物的分類'鑒定實(shí)驗(yàn)方法》(鈴木健一郎平石明橫田明編著、〉工7°卩乂方、一7工7，一夕東京抹式會(huì)社，2001年9月；將其全部內(nèi)容引入本文)采用使用微量滴定板的光生物素標(biāo)記法進(jìn)4亍。(ii)JT-ISH-224抹獲得的JT-ISH-224抹的性質(zhì)如下(細(xì)菌學(xué)性質(zhì))(1)細(xì)胞形態(tài)為桿菌，大小為0.7-0.^mxl.0-1.5(im。(2)運(yùn)動(dòng)性+(3)革蘭氏染色性-(4)有無孢子-(生理生化性質(zhì))(1)生長溫度4。C為一、25。C為+、30。C為+、37。C為一(2)菌落顏色不產(chǎn)生特征性菌落色素(3)O/F檢驗(yàn)+/-(4)過氧化氬酶試驗(yàn)+(5)氧化酶試驗(yàn)+(6)由葡萄糖產(chǎn)酸+(7)由葡萄糖產(chǎn)氣+(8)發(fā)光性-(9)硝酸鹽還原+(10)產(chǎn)吲咮+(11)葡萄糖酸化-(12)精氨酸雙水解酶+(13)脲酶-(14)七葉苷水解-(15)明膠水解性-(16)(3-半乳糖苷酶+(17)葡萄糖同化性-(18)L-阿拉伯糖同化性-(19)D-甘露糖同化性-(20)D-甘露醇同化性-(21)N-乙酰-D-葡糖胺同化性-(22)麥芽糖同化性-(23)葡糖酸鉀同化性-(24)正癸酸同化性-(25)己二酸同化性-(26)dl—蘋果酸同化性-(27)檸檬酸鈉同化性-(28)乙酸苯酯同化性-(29)細(xì)胞色素氧化酶+(30)0/129敏感性10嗎-、15嗎+(31)菌體內(nèi)DNA的GC含量(摩爾％)39.4%(16SrRNA基因堿基序列分析)以采用常規(guī)方法從汀-ISH-224抹提取的基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增16SrRNA基因的全堿基序列，并測(cè)定堿基序列。該堿基序列示于序列號(hào)32。JT-ISH-224抹在MarineAgar上的生長性、桿菌、革蘭氏染色性、葡萄糖發(fā)酵分解性、0/129敏感性等形態(tài)學(xué)觀察和生理生化性狀試驗(yàn)結(jié)果顯示，其屬于弧菌科。更進(jìn)一步，明確了JT-ISH-224林的16SrRNA基因的DNA堿基序列對(duì)明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)才莫式抹ATCC11040的16SrRNA基因序列的同源性最高，其同源率為99.2%;其次是對(duì)Photobacteriumiliopiscarium模式抹ATCC51760的16SrRNA基因的序列的同源性較高，其同源率為99.1%。由這些結(jié)果，可以明確JT-ISH-224抹是屬于發(fā)光桿菌屬(Photobacteriumsp.)的孩i生物。(iii)JT-FAJ-16株獲得的JT-FAJ-16抹的性質(zhì)如下(細(xì)菌學(xué)性質(zhì))(1)細(xì)胞形態(tài)為桿菌，大小為0.7~0.8pmxl.2~1.5pm。(2)運(yùn)動(dòng)性-(3)革蘭氏染色性-(4)有無孢子-(生理生化性質(zhì))1)生長溫度4。C為+w、25。C為+、3CTC為+、37。C為十2)菌落顏色淡黃色奶油色3)0/F檢驗(yàn)+/+4)過氧化氫酶試驗(yàn)+5)氧化酶試-驗(yàn)+6)由葡萄糖產(chǎn)酸+7)由葡萄糖產(chǎn)氣-8)硝酸鹽還原+9)產(chǎn)口引哚—10)葡萄糖酸化+11)精氨酸雙水解酶-12)脲酶-13)七葉苷水解+14)明膠水解性-15)(3-半乳糖苦酶+16)葡萄糖同化性-17)L-阿拉伯糖同化性-18)D-甘露糖同化性-19)D-甘露醇同化性-20)N-乙酰-D-葡糖胺同化性21)麥芽糖同化性-22)葡糖酸鉀同化性-23)正癸酸同化性-24)己二酸同化性-25)dl-蘋果酸同化性-26)檸檬酸鈉同化性-27)乙酸苯酯同化性-28)細(xì)胞色素氧化酶+29)0/129敏感性-30)^74卜一A發(fā)酵性+(31)肌醇發(fā)酵性+(32)阿拉伯糖發(fā)酵性+(33)鼠李糖發(fā)酵性-(34)蔗糖發(fā)酵性-(35)生長性(NaCl)3%NaCl+、4%NaCl+、6%NaCl+(36)淀粉水解-(37)Tween80分解-(38)產(chǎn)HzS—(39)產(chǎn)3-雍基丁酮(VP檢驗(yàn))-(16SrRNA基因堿基序列分析)以采用常規(guī)方法從JT-FAJ-16抹提取的基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增16SrRNA基因的全堿基序列，并測(cè)定堿基序列。堿基序列示于序列號(hào)33。JT-FAJ-16抹在MarineAgar上的生長性、桿菌、革蘭氏染色性、葡萄糖發(fā)酵分解性、OA29敏感性等形態(tài)學(xué)觀察和生理生化性狀試驗(yàn)結(jié)果顯示，其屬于弧菌科。更進(jìn)一步，明確了JT-FAJ-16抹的16SrRNA基因的DNA堿基序列對(duì)Vibriorumoiensis模式抹的16SrRNA基因的序列的同源性最高，其同源率為99.5%。由這些結(jié)果，可以明確JT-FAJ-16林是屬于弧菌屬(Vibriosp.)的微生物。實(shí)施例2:由明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)JT-ISH-467抹提取和純化(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶由在MarineAgar2216平板培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)的明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467才朱的菌落用接種環(huán)采取菌體，接種在10mlMarineBroth2216液體培養(yǎng)基中，25°C、180轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。主培養(yǎng)按以下程序進(jìn)行。向容積為1000ml的帶擋板燒瓶(3:/付7，,-)中注入300ml含20g/LBactoPeptone和4g/LBactoYeastExtract的MarineBroth2216培養(yǎng)基，用高壓滅菌器滅菌(121°C、15分鐘)。共準(zhǔn)備36瓶(合計(jì)10.8L)培養(yǎng)基。向各燒瓶中接種10ml前培養(yǎng)液，25°C、180轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。離心分離培養(yǎng)液，收集菌體。獲得的菌體濕重約為60g。將該菌體懸浮于990ml的含0.2%TritonX-100和3M氯化鈉的20mM卡可基酸緩沖液(pH6.0)中，在冰冷卻條件下進(jìn)行超聲波破碎。4°C、lOO,OOOxg離心分離菌體破碎液l小時(shí)，獲得上清。將所得的上清裝入透析袋中，在含0.2%TritonX-100的20mM卡可基酸緩沖液(pH6.0)中于4。C透析至氯化鈉濃度為20mM左右。透析后，由于溶液中出現(xiàn)沉淀，4°C、lOO,OOOxg離心1小時(shí)，除去沉淀。使該粗酶液吸附于用含表面活性劑即0.2%TritonX-lOO的20mM卡可基酸緩沖液(pH6.0)平衡的HiPrepl6/10DEAEFF(AmershamBiosciences產(chǎn))陰離子交換柱，從含0.2%TritonX-100的20mM卡可基酸緩沖液(pH6.0)至另含1M氯化鈉的相同緩沖液用直線濃度梯度法進(jìn)行洗脫。其結(jié)果，收集氯化鈉濃度0.25M附近處洗脫的具有酶活性的級(jí)分。收集的級(jí)分用20mM磷酸緩沖液(pH6.0)稀釋，使之吸附于預(yù)先用含0.2%TritonX-100的20mM磷酸緩沖液(pH6.0)平衡的羥基磷灰石(Bio-Rad產(chǎn))，從含0.2%TritonX-100的20mM磷酸緩沖液(pH6.0)至含0.2%TritonX-100的500mM磷酸緩沖液(pH6.0)用直線濃度梯度法進(jìn)行洗脫。其結(jié)果，收集磷酸緩沖液濃度125mM左右洗脫的具有酶活性的級(jí)分。使該級(jí)分吸附于MonoQ5/50GL(AmershamBiosciences產(chǎn))陰離子交換柱，從含0.2%TritonX-100的20mM卡可基酸緩沖液(pH6.0)至另含1M氯化鈉的相同緩沖液用直線濃度梯度法進(jìn)行洗脫。其結(jié)果，收集氯化鈉濃度300mM左右洗脫的具有酶活性的級(jí)分。將該級(jí)分用含0.2%TritonX-100的20mM卡可基酸緩沖液(pH7.0)稀釋10倍，孑吏之吸附于MonoQ5/50GL(Pharmacia產(chǎn))陰離子交換柱。從含0.2%TritonX-100的20mM卡可基酸緩沖液(pH7.0)至另含1M氯化鈉的相同緩沖液用直線濃度梯度法進(jìn)行洗脫。收集氯化鈉濃度300mM左右洗脫的具有酶活性的級(jí)分。將該級(jí)分用含0.2%TritonX-100和0.2M氯化鈉的20mM卡可基酸緩沖液(pH7.0)稀釋2倍，用HiLoad16/60Superdex200prepgrade(AmershamBiosciences產(chǎn))凝膠過濾柱進(jìn)行分級(jí)。用含0.2%TritonX-100和0.2M氯化鈉的20mM卡可基酸緩沖液(pH7.0)進(jìn)行洗脫。將有活性的級(jí)分進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(丙烯酰胺的濃度為12.5%),結(jié)果表明，目的酶顯示單一條帶，分子量約39,000。與菌體破碎時(shí)的比活性相比，該級(jí)分的比活性約提高了350倍(表l)。表1顯示了由粗酶液純化JT-ISH-467抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，經(jīng)過上述各純化步驟后的樣品的酶活性。酶活性采用與前述實(shí)施例1中相同的J.Biochem.,120,104-110(1996)中記載的方法測(cè)定。此外，蛋白質(zhì)的定量使用CoomassieProteinAssayReagent(PIERCE產(chǎn))，4妄其中的說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。酶的1個(gè)單位(1U)設(shè)定為在1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移1微摩爾唾液酸的酶量。表1從粗酶液純化JT-ISH-467抹來源的cc2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的純化表<table><row><column>純化步驟</column><column>體積</column><column>總蛋白</column><column>總活性</column><column>比活性</column><column>收率</column><column>純化度(ml)(mg)(U)(U/mg)(%)(倍)</column></row><row><column>粗酶液</column><column>950</column><column>2,930</column><column>21.3</column><column>0.0073100</column><column>1</column></row><row><column>DEAE</column><column>90</column><column>468</column><column>4.0</column><column>0.5</column><column>19</column><column>1.2</column></row><row><column>基磷灰石</column><column>85</column><column>129</column><column>2.7</column><column>0.0212</column><column>13</column><column>2.9</column></row><row><column>MonoQ(p恥)</column><column>1</column><column>1.64</column><column>0.073</column><column>0.0448</column><column>0.34</column><column>6.2</column></row><row><column>MonoQ(pH7)</column><column>0.5</column><column>0.138</column><column>0.023</column><column>0.164</column><column>0.11</column><column>22.5</column></row><row><column>Superdex200</column><column>1.5</column><column>0.0047</column><column>0.012</column><column>2.50</column><column>0.044</column><column>343.6</column></row><table>使用吡啶氨基化糖鏈確定唾液酸連接方式使用實(shí)施例2獲得的酶，以吡啶氨基化糖鏈為糖受體底物進(jìn)行酶反應(yīng)。以吡啶氨基化乳糖(Gal卩1-4Glc-PA,TaKaRaBio產(chǎn)品)作為吡啶氨基化糖鏈進(jìn)行分析。將糖受體底物、CMP-NeuAc和酶溶于25^1的20mM卡可基酸緩沖液(pH6.0)中，其終濃度分別為2.0jjM、5.7|iM和20mU/ml,25。C反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，100。C處理反應(yīng)溶液2分鐘以使酶失活。然后用HPLC對(duì)反應(yīng)生成物進(jìn)行分析。HPLC系統(tǒng)使用ShimadzuLC10A(島津制作所)，分析柱使用TakaraPALPAKTypeR(TaKaRaBio產(chǎn)品)。將用洗脫液A(lOOmM醋酸-三乙胺，pH5.0)稀釋的反應(yīng)液注入用含0.15。/。正丁醇的lOOmM醋酸-三乙胺(pH5.0)平衡的柱中。吡咬氨基化糖鏈的洗脫使用洗脫液A(1OOmM醋酸-三乙胺，pH5.0)和洗脫液B(含0.5%正丁醇的lOOmM醋酸-三乙胺，pH5.0),通過30~100。/o的洗脫液B的直線濃度梯度法(0-35分鐘)和100%的洗脫液B(3550分鐘)，依次洗脫吡啶氨基化糖鏈。此外，分析采用以下的條件進(jìn)行(流速1ml/min、柱溫40。C、檢測(cè):熒光(Ex:320nm、Em:400nm))。結(jié)果表明使用該酶由吡啶胺化乳糖合成了吡啶氨基化a2,3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3，-唾液酸乳糖)。實(shí)施例4:使用JT-ISH-467菌抹產(chǎn)生的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行向單糖.二糖類的唾液酸轉(zhuǎn)移(含唾液酸糖鏈的生產(chǎn))(材料與方法)使用離子交換層析柱、羥基磷灰石層析柱、凝膠過濾層析柱對(duì)由JT-ISH-467菌抹制備的菌體破碎液進(jìn)行部分純化而得到a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。使用該酶進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)向各種單糖'二糖類的唾液酸轉(zhuǎn)移。使用各種糖受體底物進(jìn)行的唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)制備24^1的反應(yīng)溶液，該反應(yīng)溶液中含有糖供體底物CMP-"C-NeuAc(400nmol(15600cpm)、在反應(yīng)液中的終濃度為16.6mM)、各種糖受體底物(lO[imol、在反應(yīng)液中的終濃度為200mM)、唾液酸轉(zhuǎn)移酶(0.13mU)、NaCl(在反應(yīng)液中的終濃度為500mM),25。C酶反應(yīng)4小時(shí)。使用6種單糖-二糖類作為糖受體底物，即曱基-a-D-p比喃半乳糖苷(Gal-a-OMe)、曱基-卩-D-吡喃半乳糖苷(Gal-卩-OMe)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、乳糖(Gai-卩1,4-Glc)、N-乙酰乳糖胺(Gal-(31，4-GlcNAc)和甲基-卩-D-口比喃半乳糖基-卩l(xiāng),3-N-乙酰氨基葡萄糖苷(Gal-卩l(xiāng),3-GlcNAc-卩-OMe)。酶反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)溶液中加入1.98ml的5mM磷酸緩沖液(pH6.8)以終止酶反應(yīng)。然后，將用5mM磷酸緩沖液(pH6.8)稀釋的酶反應(yīng)溶液(2ml)上樣于AGl-x2Resin(P04^型、0.2x2cm)柱。該柱的制作是將AGl-x2Resin(OH—型、BIO-RAD公司產(chǎn))懸浮于1M磷酸緩沖液(pH6.8)，30分鐘后用蒸餾水清洗樹脂，然后再將樹脂懸浮在蒸餾水中。測(cè)定該柱的洗脫液(0-2ml)的》文射活性。該柱的洗脫液中含有反應(yīng)生成的結(jié)合有"C-NeuAc(N-乙酰神經(jīng)氨酸)的反應(yīng)生成物和未反應(yīng)的糖受體底物，而未反應(yīng)的CMP-"C-NeuAc保留在柱上。因而，酶反應(yīng)結(jié)果生成的各種含唾液酸糖鏈來源的"C放射活性全部來自反應(yīng)生成物，由該級(jí)分的放射活性可以計(jì)算出酶活性。采用上述方法測(cè)定轉(zhuǎn)移至各種糖受體底物的NeuAc的放射活性，并計(jì)算出發(fā)生轉(zhuǎn)移的唾液酸。(結(jié)果)結(jié)果表明對(duì)此次作為糖受體底物使用的6種單糖.二糖類均發(fā)生了唾液酸轉(zhuǎn)移(參見表2);在此次作為糖受體底物使用的糖類中，轉(zhuǎn)移到N-乙酰乳糖胺的唾液酸最多。表2JT-ISH-467林來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶向各種糖受體底物的唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性<table><row><column>受體底物</column><column>轉(zhuǎn)移的唾液酸的量</column></row><row><column>Gal-a-OMe</column><column>60.0nmol</column></row><row><column>Gal-p-OMe</column><column>50.2nmol</column></row><row><column>GalNAc</column><column>37.8nmol</column></row><row><column>Gal-pi,4-Glc</column><column>57.9nmo1</column></row><row><column>Gal-(31，4-GlcNAc</column><column>74.9nmo1</column></row><row><column>Gal-(31，3-GlcNAc-β-OMe</column><column>71.1nmol</column></row><table>實(shí)施例5:編碼明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹產(chǎn)生的[3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因的堿基序列分析和該基因的轉(zhuǎn)化(1)基因組DNA的純化和基因組文庫的制作使用QiagenGenomic-tip100/G(Qiagen公司),按試劑盒的說明書由JT-ISH-467抹的菌體離心沉淀物(<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage30</formula>)約0.5g制備約lOO(ig的基因組DNA。對(duì)于l-2嗎的DNA,使用0.1-0.2單位的識(shí)別四堿基的限制酶Sau3AI進(jìn)行部分降解。使用的反應(yīng)緩沖液是與酶配套的緩沖液，反應(yīng)條件為37。C、30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入終濃度為25mM的EDTApH8.0,用苯酚.氯仿進(jìn)行處理。乙醇沉淀回收基因組DNA，溶于400^1的TE中。使用梯度制作裝置，在離心管(日立制作所生產(chǎn)40PA)中由40%的蔗糖(<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage30</formula>)緩沖液(20mMTrispH8.0，5mMEDTApH8.0'1MNaCl)和10%的蔗糖緩沖液制作40-10%的梯度，并在其上疊加上述部分分解的DNA溶液層。使用超離心機(jī)(日立制作所生產(chǎn)SCP70H,轉(zhuǎn)子SRP28SA)，26,000rpm、20°C離心15分鐘。離心后，在管底用25G的針扎開小孔，從底部液體以每次lml回收。將收集的含基因組DNA的樣品的一部分使用潛水電泳槽在0.5-0.6%瓊脂糖凝膠/TAE緩沖液中26V電泳20小時(shí)，收集含大小為9-16kb的DNA的級(jí)分。分子量標(biāo)準(zhǔn)使用A7ffindin。向含大小為9-16kb的DNA片段的級(jí)分中加入2.5ml的TE降低蔗糖濃度后，進(jìn)行乙醇沉淀和洗滌，將其溶解于少量TE中。用于制作JT-ISH-467抹的基因組文庫的載體使用人DASHII(Stratagene產(chǎn))。入DASHII/BamHI載體與基因組DNA片段的連接反應(yīng)使用Stratagene產(chǎn)的連接試劑盒，〗2。C反應(yīng)過夜。反應(yīng)后，使反應(yīng)液與GigaPackIIIGoldPackagingextract反應(yīng)，使整合了基因組DNA的X載體納入到噬菌體顆粒中。噬菌體液在500|ilSM緩沖液和20[il的氯仿中4'C保存。將大腸桿菌XL1-BlueMRA(P2)(Stratagene產(chǎn))在LBMM(LB+0.2。/。麥芽糖+10mMMgS04)中培養(yǎng)至A66Q=0.5,向200^1該培養(yǎng)液中加入適量的噬菌體溶液，37。C培養(yǎng)15分鐘。向其中加入48。C保溫的NZY頂層瓊脂糖4ml,混合，鋪于NZY瓊脂平板上(直徑9cm的塑料平皿)。平板于37'C培養(yǎng)過夜，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算滴度，結(jié)果算出文庫的大小為約30萬pfu(噬斑形成單位,plaqueformingunit)(2)引物設(shè)計(jì)和探針制作使用Procise494cLCProteinSequencingSystem(AppliedBiosystems產(chǎn))，測(cè)定JT-ISH-467抹來源的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的氨基末端(N末端)氨基酸序列及內(nèi)部氨基酸序列。N末端的氨基酸序列的測(cè)定按如下進(jìn)行。將該唾液酸轉(zhuǎn)移酶用5/20%的梯度凝膠(ATTO產(chǎn))進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后將該酶吸附于PVDF膜上，利用氨基酸序列分析裝置分析氨基末端10個(gè)氨基酸的序列。其結(jié)果該酶的N末端氨基酸序列為XNSDSKHNNS(序列號(hào)4)。此外，內(nèi)部氨基酸序列的測(cè)定按如下進(jìn)行。用5/20。/。的梯度凝膠(ATTO產(chǎn))對(duì)該唾液酸轉(zhuǎn)移酶實(shí)施SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。對(duì)凝膠進(jìn)行染色后，切分出目標(biāo)條帶，加入含賴氨酰內(nèi)肽酶的Tris緩沖液(pH8.5),35。C處理20小時(shí)。然后，將全部溶液上樣于反相HPLC(柱SymmetryCI83.5(xm),分離肽片段。利用氨基酸序列分析裝置確定該酶的內(nèi)部氨基酸序列包括SLDSMILTNEIK(序歹'J號(hào)5)、FYNFTGFNPE(序歹'J號(hào)6)和GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(序列號(hào)7)?；谌缟蠝y(cè)定的發(fā)光明亮桿菌JT-ISH-467抹來源的oc2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的部分氨基酸序列，即N末端氨基酸序列XNSDSKHNNS(序列號(hào)4)及三個(gè)內(nèi)部氨基酸序列中的兩個(gè)FYNFTGFNPE(序歹'J號(hào)6)和GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(序列號(hào)7)，設(shè)計(jì)、合成了以下的簡并引物。即由N末端的氨基酸序列XNSDSKHNNS(序列號(hào)4)合成了下面表3所示的3條引物(I為次黃噤呤核苷)。表3<table><row><column>名稱</column><column>序列5'-3'</column><column>混合度</column><column>長度</column></row><row><column>467N-RV</column><column>AAYWSIGAYWSIAARCAYAAYAA(序列號(hào)8)</column><column>256</column><column>23mer</column></row><row><column>467N-RV2</column><column>GAYWSIAARCAYAAYAAYWS(序列號(hào)9)</column><column>512</column><column>20mer</column></row><row><column>467N-RV3</column><column>AAYWSNGAYWSIAARCAYAAYAA(序列號(hào)10)</column><column>1024</column><column>23mer表中Y表示胸腺嘧啶或胞嘧啶；W表示胸腺嘧啶或腺嘌呤；S表示胞嘧。定或鳥嘌呤；R表示腺噪呤或鳥嘌呤；N表示腺噪呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；I表示次黃嘌呤。此外，由內(nèi)部氨基酸序列GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(序列號(hào)7)合成了下面表4所示的4條引物。表4</column></row><row><column></column></row><row><column>名稱</column><column>序列5'-3'</column><column>混合度</column><column>長度</column></row><row><column>467inlRV</column><column>ATHATHGAYGCNCAYAAYATG(序列號(hào)1)</column><column>288</column><column>21mer</column></row><row><column>467inlFW</column><column>CATRTTRTGNGCRTCDATDAT(序列號(hào)12)</column><column>288</column><column>21mer</column></row><row><column>467inlRV2</column><column>TAYAAYCARCARATHATHGAYGC(序列號(hào)13)</column><column>288</column><column>23mer</column></row><row><column>467inFW2</column><column>GCRTCDATDATYTGYTGRTTRTA(序列號(hào)14)</column><column>288</column><column>23mer</column></row><table>表中H表示胸腺嘧啶、胞嘧啶或腺嘌呤；Y表示胸腺嘧啶或胞嘧啶；R表示腺嘌呤或鳥嘌呤；D表示腺噪呤、鳥噪呤或胸腺嘧啶；N表示腺嘌呤、鳥噪呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶。此外，由內(nèi)部氨基酸序列FYNFTGFNPE(序列號(hào)6)合成了下面表5所示的2條引物。表5<table><row><column>名稱</column><column>序列5'-3'</column><column>mix度</column><column>長度</column></row><row><column>467in2RV</column><column>TAYAAYTTYACNGGNTTYAAYCC(序列號(hào)15)</column><column>512</column><column>23mer</column></row><row><column>467in2FW</column><column>GGRTTRAANCCNGTRAARTTRTA(序列號(hào)16)</column><column>512</column><column>23mer</column></row><table>表中Y表示胸腺嘧啶或胞嘧啶；R表示腺嘌呤或鳥嘌呤；N表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶。使用這些引物，以上述(1)中提取'純化的JT-ISH-467抹的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出JT-ISH-467抹來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的部分DNA作為用于篩選文庫的4笨針。引物組合共有13組，即來自N末端序列的3條引物分別與467inlFW(序列號(hào)12)、467inlFW2(序列號(hào)14)或467in2FW(序列號(hào)16)形成的9個(gè)組合，467inlRV(序列號(hào)11)或467inlRV2(序列號(hào)13)與467in2FW(序列號(hào)16)形成的2個(gè)組合，以及467in2RV(序列號(hào)15)與467inlFW(序列號(hào)12)或467inlFW2(序列號(hào)14)形成的2個(gè)組合。PCR反應(yīng)按如下進(jìn)行50μL的反應(yīng)液中含有基因組DNA250ng、10xExtaq緩沖液5μL、2.5mM的每種dNTPs4μL、每種序列的引物5pmole、Extaq(TakaraBio產(chǎn))0.5μL。使用程序溫度控制系統(tǒng)PC-700(ASTEK公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為1個(gè)循環(huán)的96℃3分鐘；40個(gè)循環(huán)的96℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃2分鐘；1個(gè)循環(huán)的72℃6分鐘。結(jié)果是使用9個(gè)引物組合(除467N-RV(序列號(hào)8)和467inlFW(序列號(hào)12)、467N-RV(序列號(hào)8)和467in2FW(序列號(hào)16)、467inlRV(序列號(hào)11)和467in2FW(序列號(hào)16)、467in2RV(序列號(hào)15)和467inlFW(序列號(hào)12)的組合以外的9個(gè)組合)擴(kuò)增得到了PCR產(chǎn)物。在所有PCR產(chǎn)物中，將來自獲得特異性且高效率擴(kuò)增的組合(467N-RV3(序列號(hào)10)與467inlFW(序列號(hào)12))的PCR產(chǎn)物克隆至pCR2.1TOPO載體(Invitrogen產(chǎn))。連接反應(yīng)按載體試劑盒所附說明進(jìn)行。采用電穿孔法將DNA導(dǎo)入大腸桿菌TB1，按常規(guī)方法(Sambrooketal.1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版(通過引用將其全部內(nèi)容并入本文))提取質(zhì)粒DNA。對(duì)于該克隆，使用M13引物(TakaraBio產(chǎn))用ABIPRISM熒光測(cè)序儀(Model310GeneticAnalyzer,PerkinElmer產(chǎn))從PCR產(chǎn)物的兩端開始測(cè)定其序列。對(duì)于測(cè)定的DNA堿基序列(929bp:序列號(hào)17),通過BLAST程序?qū)ationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)的GeneBank凄t才居庫進(jìn)4亍同源性檢索。結(jié)果未檢索出顯示顯著同源性的DNA序列。這意味著本發(fā)明揭示的發(fā)光明亮桿菌JT-ISH-467林來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的DNA堿基序列是新序列。接下來，將該堿基序列翻譯成氨基酸，再次進(jìn)行BLAST檢索，斗企索出其與美人魚發(fā)光桿菌(photobacteriumdamselae)的a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(JC5898)具有30%的同源性，與多殺巴斯德氏菌多殺亞種(Paste腦llamultocidasubsp.multocida)Pm70抹的假設(shè)蛋白PM0188(AKK02272)具有26%的同源性，與杜克雷氏嗜血桿菌(Haemophilusducreyi)35000HP株的布設(shè)蛋白HD0053(AAP95068)具有21%的同源性。而且，翻譯的氨基酸序列包含從上述純化的酶直接測(cè)定的內(nèi)部氨基酸序列FYNFTGFNPE(序列號(hào)6)和SLDSMILTNEIK(序列號(hào)5)的全部、以及N末端氨基酸序列XNSDSKHNNS(序歹'J號(hào)4)和內(nèi)部氨基酸序列GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(序列號(hào)7)的一部分。由以上結(jié)果可知，所克隆的DNA是來源于發(fā)光明亮桿菌JT-ISH-467抹的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的一部分，而且本發(fā)明的發(fā)光明亮桿菌JT-ISH-467抹來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列是與已報(bào)導(dǎo)的序列僅有30%左右同源性的新氨基酸序列。(3)篩選和基因克隆用限制性酶EcoRI從pCR2.1TOPO載體上切出由(2)中克隆的發(fā)光明亮桿菌JT-ISH-467抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的一部分構(gòu)成的DNA片段，以這些DNA片段為探針，對(duì)上述(1)制作的發(fā)光明亮桿菌JT-ISH-467抹來源的基因組DNA文庫進(jìn)行篩選。按人DASHII/BamHI載體試劑盒(Stratagene產(chǎn))的說明書，將約300-500pfu的噬菌體與宿主菌XL1-blueMRA(P2)—起鋪在直徑9cm的圓形平皿上。使噬菌斑與Hybond-K"尼龍濾膜接觸(Amersham產(chǎn))，按膜所附的說明書進(jìn)行堿處理，使DNA變性并固定在膜上。使用rediprimeIITMDNAlabelingsystem(Amersham公司產(chǎn))對(duì)探針進(jìn)行"P標(biāo)記。雜交是在0.5M磷酸鈉緩沖液pH7.2、7。/。SDS、lmMEDTA中65。C過夜；洗滌條件為40mM石壽酸鈉緩沖液pH7.2、lmMEDTA、5°/。SDS中65。C洗滌2次、每次15分鐘，在40mM磷酸鈉緩沖液pH7.2、1%SDS、lmMEDTA中65。C洗滌2次、每次15分鐘。第一輪篩選從約5000pfu的噬菌體中獲得了24個(gè)陽性克隆。對(duì)其中的18個(gè)克隆進(jìn)行第二輪篩選同時(shí)純化噬菌斑。結(jié)果可以獲得6種經(jīng)選4奪.純化的噬菌斑。回收這些噬菌斑，將它們分別與大腸桿菌XL1-blueMRA(P2)—起鋪在NZY平板上，使噬菌體量為每個(gè)平板數(shù)萬pfo,然后37。C保溫過夜。向一面長出噬菌斑的6個(gè)平板各加入4mlSM緩沖液、4。C靜置過夜。用巴斯德吸管回收噬菌體平板裂解物，用QIAGENLambdaMiniKit(QIAGEN產(chǎn))提取、純化XDNA。將這6種XDNA和(1)中純化的JT-ISH-467抹的全基因組DNA用限制性酶EcoRI、HindIII消化，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳分級(jí)，使用0.4MNaOH進(jìn)行堿印跡將凝膠轉(zhuǎn)印到Hybond-N"尼龍濾膜(AmershamBiosciences產(chǎn))上。對(duì)于該濾膜，使用上述的929bp的4笨針(序列號(hào)17)，如上進(jìn)行Southern雜交。其結(jié)果用EcoRI消化時(shí)，檢測(cè)出了9kb或9kb以上的條帶。另一方面，用HindIII消化時(shí)，與全長人DNA、基因組DNA一起檢測(cè)出4.6kb的條帶。因而，將人DNA再次用HindIII消化，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收4.6kb的HindIII片段，采用常規(guī)方法將其克隆至質(zhì)粒載體pBluescriptSK(-)的HindIII位點(diǎn)。接下來，為測(cè)定明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的全堿基序列，基于該基因的部分DNA序列(上述929bp:序列號(hào)17)合成了以下表6所示的引物。表6<table><row><column>名稱</column><column>序列5'-3'</column><column>長度</column></row><row><column>467-23STinRVl</column><column>TGTTGATAGAGCAACATTACC(序列號(hào)18)</column><column>21mer</column></row><row><column>467-23STinRV2</column><column>TGGTAATACCTTATGGGCAG(序列號(hào)19)</column><column>20mer</column></row><row><column>467-23STinRV3</column><column>GAACAGCAACGGCAGAGC(序列號(hào)20)</column><column>18mer</column></row><row><column>467-23STinRV4</column><column>CTAATTCAATTCAAGGATTGG(序列號(hào)21)</column><column>21mer</column></row><row><column>467-23STinFWl</column><column>TGGTAATGTTGCTCTATCAAC(序列號(hào)22)</column><column>21mer</column></row><row><column>467-23STinFW2</column><column>ACTGCCCATAAGGTATTACC(序列號(hào)23)</column><column>20mer</column></row><row><column>467-23STinFW3</column><column>GCTCTGCCGTTGCTGTTC(序列號(hào)24)</column><column>18mer</column></row><table>使用這些引物，用ABIPRISM熒光測(cè)序儀(Model310GeneticAnalyzer,PerkinElmer產(chǎn))分析4.6kbHindIII片段的內(nèi)部堿基序列，對(duì)明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467林來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的內(nèi)部及其近鄰的堿基序列進(jìn)行了解析。其結(jié)果，獲得了序列表中的序列號(hào)1的序列。該序列是明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467株來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的開放閱讀框(ORF)的全堿基序列。在第一個(gè)ATG的上游的同一閱讀框內(nèi)出現(xiàn)了翻譯終止密碼子，因而認(rèn)為這個(gè)ATG是該基因的翻譯起始密碼子。明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的ORF由1230個(gè)堿基組成，編碼409個(gè)氨基酸。該氨基酸序列示于序列表的序列號(hào)2。該氨基酸序列中包含從純化酶測(cè)得的全部4個(gè)位置的所有氨基酸序列。N末端氨基酸序列的第一個(gè)氨基酸未能測(cè)出，而由基因推導(dǎo)而來的該位置的氨基酸是Cys(半胱氨酸)。而且，因?yàn)槌墒斓鞍椎腘末端是序列表序列號(hào)2的序列中第22位的Cys,可以認(rèn)為前面的21個(gè)氨基酸的序列經(jīng)過在明亮發(fā)光桿菌中的加工而被去除了。使用遺傳信息處理軟件GENETYXVer.7(GENETYX制作)分析本發(fā)明的明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶全長蛋白及其全長基因與它們的同源物的相應(yīng)全長序列的同源性時(shí)發(fā)現(xiàn)在氨基酸序列方面，其與美人魚發(fā)光桿菌的a2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(JC5898)具有32%的同源性，與多殺巴斯德氏菌多殺亞種Pm70才朱的J叚設(shè)蛋白PMO188(AKK02272)具有28%的同源性；在基因DNA序列方面，其與上述兩者分別具有53%和51%的同源性。(4)表達(dá)載體的構(gòu)建為考察克隆的基因是否具有唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性，將該基因的全長和N末端信號(hào)肽部分刪除型的基因整合入載體，在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)，測(cè)定了該表達(dá)蛋白的活性。對(duì)于明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，使用遺傳信息處理軟件GENETYXVer.7進(jìn)行分析時(shí)，預(yù)測(cè)N末端的24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。因此，設(shè)計(jì)并合成了兩組引物(表7),即467-23ST-NO-Pci(序列號(hào)27)和467-23ST-CO-Bm(序列號(hào)26)，其用于克隆全長基因(在本實(shí)施例中表示為467-N0C0);以及467-23ST-N2-Nco(序列號(hào)25)和467-23ST-C0-Bm(序列號(hào)26),其用于克隆編碼信號(hào)肽部分的氨基酸刪除型蛋白的基因(在本實(shí)施例中表示為467-N2C0)。表7<table>complextableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>下劃線所示為預(yù)先引入引物的克隆用限制酶PciI(467-23ST-N0-Pci)、NcoI(467-23ST-N2-Nco)和BamHI(467-23ST-C0-Bm)的位點(diǎn)用。翻譯起始密碼子ATG和與翻譯終止密碼子相應(yīng)的互補(bǔ)序列TAA加有方框。而且，在引物序列中，限制酶位點(diǎn)3'側(cè)的與模板DNA退火部分的序列用粗體字示出。PCR的模板使用整合了包含全長明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹來源的ct2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的上述4.6kb的HindIII片段的質(zhì)粒。PCR的反應(yīng)條件i殳定如下。50^1的反應(yīng)液中含有模板DNA100ng、10xExtaq緩沖液5^1、2.5mM的每種dNTPs4|il、引物50pmole、Extaq(TakaraBio產(chǎn))0.5^il。使用程序溫度控制系統(tǒng)PC-700(ASTEK公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為1個(gè)循環(huán)的96°C3分鐘；15個(gè)循環(huán)的96°C1分鐘、50°C1分鐘、72°C2分鐘；1個(gè)循環(huán)72°C6分鐘。其結(jié)果467-N0C0擴(kuò)增出約1.2kb的PCR產(chǎn)物，而467-N2C0擴(kuò)增出約l.lkb的PCR產(chǎn)物。在這些PCR產(chǎn)物中，467-N0C0用限制酶PciI(NewEnglandBiolab產(chǎn))和BamHI(TakaraBio產(chǎn))雙重消化，467-N2C0用限制酶NcoI(TakaraBio產(chǎn))和BamHI雙重消化，然后進(jìn)行凝膠純化。大腸桿菌表達(dá)載體使用pTrc99A(PharmaciaLKB產(chǎn))。用相同的限制酶即PciI和BamHI或者NcoI和BamHI雙重消化該載體并進(jìn)行;疑膠純化，然后用TakaraLigationKit(TakaraBio產(chǎn))將其與經(jīng)限制酶處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)染大腸桿菌TB1。按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行限制酶分析，確認(rèn)發(fā)生了插入序列的整合。為考察PCR反應(yīng)所致的堿基變化，測(cè)定了467-N0C0的2個(gè)克隆和467-N2C0的3個(gè)克隆的全堿基序列。其結(jié)果在467-N0C0的1個(gè)克隆(ISH467-N0C0第1克隆)中序列號(hào)1的堿基序列第569位的腺苷酸(A)變?yōu)轼B苷酸(G),因此密碼子由AAC變?yōu)锳GC,序列號(hào)2的氨基酸序列第190位的天冬酰胺(Asn)變?yōu)榻z氨酸(Ser)。Asn和Ser均為極性氨基酸。另一方面，在另一個(gè)克隆(ISH467-N0C0第2克隆)中無堿基的變化，確認(rèn)其為序列號(hào)1的堿基序列。接著，測(cè)定3個(gè)467-N2C0克隆的全堿基序列。其結(jié)果，在第l和第2兩個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn)了伴有氨基酸替換的堿基突變。即，在ISH467-N2C0第l克隆中，序列號(hào)1的堿基序列的第476位的胸腺嘧啶(T)突變?yōu)榘奏?C)，因此密碼子由TTT變?yōu)門CT,第159位的苯丙氨酸(Phe)替換為絲氨酸(Ser)。在ISH467-N2C0第2克隆中，序列號(hào)1的堿基序列的第78位的胸腺嘧啶(T)缺失，因此引起移框，未能翻譯為正確的蛋白質(zhì)。另一方面，在ISH467-N2C0第3克隆中未檢出突變，其含有序列號(hào)1的第73位堿基至第1230位堿基的序列。(5)誘導(dǎo)表達(dá)與活性測(cè)定對(duì)于上述(4)獲得的467-N0C0的2個(gè)克隆和467-N2C0的3個(gè)克隆，進(jìn)行蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。將攜帶整合了各克隆的表達(dá)載體pTrc99A的大腸桿菌TBI的單菌落接種于含抗生素氨卡青霉素(終濃度100叱/mL)的LB培養(yǎng)基(5mi)中，30。C進(jìn)行前培養(yǎng)至A6。Q=0.5左右，然后加入終濃度為lmM的IPTG(異丙基-(3-D(-)-硫代半乳糖普，和光純藥工業(yè)產(chǎn))，30°C進(jìn)一步振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。通過離心分離收集2ml培養(yǎng)液中的菌體，將這些菌體懸浮于200^1含0.336%TritonX-lOO和0.5M氯化鈉的20mMBis-Tris緩沖液(pH7.0)中，在水冷卻下進(jìn)行超聲波破石爭。所得的破碎液作為粗酶液用于酶活性測(cè)定。反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行2次，反應(yīng)組成與實(shí)施例l相同，只是反應(yīng)時(shí)間為15小時(shí)。結(jié)果如下述表8所示，其表明在ISH467-N0C0第1克隆的粗酶液和ISH467-N0C0第2克隆的粗酶液中，存在將糖供體CMP-NeuAc中被"C標(biāo)記的NeuAc轉(zhuǎn)移至糖受體底物即乳糖的因素，即唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。此外，還表明在ISH467-N2C0第1克隆和ISH467-N2C0第3克隆的4且酶液中也存在唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。另一方面，在ISH467-N2C0第2克隆的粗酶液中和不含粗酶液的反應(yīng)液中不含有唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。以上結(jié)果表明，在導(dǎo)入了ISH467-N0C0第1克隆或第2克隆、或者ISH467-N2C0第1克隆或第3克隆的大腸桿菌中有唾液酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。表8:重組了JT-ISH-467抹來源的p-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌的裂解液中的唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性<table>complextableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>ISH467-N2C0第1克隆</column></row><row><column>10514</column><column>9033</column><column>9773.5</column></row><row><column>ISH467-N2C0第2克隆</column><column>685689</column><column>687</column></row><row><column>不含粗酶液</column><column>948</column><column>914</column><column>931</column></row><table>(6)oc2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移活性的確認(rèn)使用上述(5)的粗酶液，考察導(dǎo)入ISH467-N2C0第1克隆的大腸桿菌所表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶是否具有a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。與實(shí)施例3相同，使用吡啶氨基化乳糖(Gal卩l(xiāng)-4Glc-PA，TaKaRaBio公司產(chǎn)PA-SugarChain026)進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，95。C熱處理反應(yīng)溶液5分鐘以使酶失活，用HPLC進(jìn)行分析。酶反應(yīng)是將終濃度為2.0pM的吡啶氨基化乳糖和終濃度為5.7jiM的CMP-唾液酸溶于25(il的20mM卡可基酸緩沖液(pH6.0)中，25。C進(jìn)行6小時(shí)(反應(yīng)l)。另一方面，使用不含CMP-唾液酸的反應(yīng)液進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)(反應(yīng)2)。此外，為了確定標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，進(jìn)行下述測(cè)試該測(cè)試加入了經(jīng)熱處理(95°C、5分鐘)而失活的粗酶液，并添加了吡啶氨基化乳糖和吡咬氨基化a2,3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3，-唾液酸乳糖)(Neu5Aca2-3Gal卩l(xiāng)-4Glc-PA，TaKaRaBio公司產(chǎn)PA-SugarChain029)。標(biāo)準(zhǔn)品的分析結(jié)果(圖1-1)顯示，吡啶氨基化乳糖的保留時(shí)間為4.1分鐘，吡啶氨基化a2，3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3，-唾液酸乳糖)的保留時(shí)間為5.4分鐘。由此可知在反應(yīng)2(圖1-3)中未檢出的保留時(shí)間為5.3分鐘的峰(圖1-2)是吡咬氨基化a2,3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3，-唾液酸乳糖)。即，證明了導(dǎo)入ISH467-N2C0第1克隆的大腸桿菌所表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移活性。此外，同樣對(duì)于ISH467-N0C0第1克隆和第2克隆以及ISH467-N2C0第3克隆考察了導(dǎo)入該克隆的大腸桿菌表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶是否具有a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移活性。其結(jié)果，在由大腸桿菌表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)中，任何一個(gè)克隆均檢測(cè)出了作為反應(yīng)生成物的吡啶氨基化a2,3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3，-唾液酸乳糖)的峰。因此，表明這些酶均具有oc2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移活性。實(shí)施例6:發(fā)光桿菌屬細(xì)菌JT-ISH-224抹來源的B-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、堿基序列分析及該基因在大腸桿菌中的表達(dá)(1)JT-ISH-224抹(3-半乳糖苷-oc2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性和該酶的基因的存在的確認(rèn)為了確認(rèn)已在實(shí)施例1中確認(rèn)具有唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的發(fā)光桿菌屬JT-ISH-224抹中是否存在明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的同源物，實(shí)施了基因組Southern雜交。采用實(shí)施例5(1)中的方法，由JT-ISH-224株的菌體離心沉淀制備基因組DNA。然后采用實(shí)施例5(3)中的方法，用限制性酶EcoRI或HindIII消化JT-ISH-224才朱的基因組DNA,用0.7%瓊脂糖凝膠電泳分級(jí)，然后采用使用0.4MNaOH的堿印跡法將)疑月交轉(zhuǎn)印到Hybond-N""尼龍濾月莫(AmershamBiosciences產(chǎn))上。對(duì)于該濾膜，使用上述的JT-ISH-467林來源的(x2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的部分片段(929bp;序列號(hào)17)作為探針，采用實(shí)施例5(3)中的方法進(jìn)行southern雜交，但雜交溫度和清洗溫度為55°C。其結(jié)果用EcoRI消化時(shí)，檢測(cè)出16kb的條帶。另一方面，用HindIII消化時(shí)，檢測(cè)出5kb和2.7kb的條帶。該結(jié)果表明JT-ISH-224林中存在JT-ISH-467抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的同源物。(2)JT-ISH-224抹來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的克隆接下來，進(jìn)行JT-ISH-224抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的克隆。采用實(shí)施例5(1)中的方法，由JT-ISH-224抹的基因組DNA使用XDASHII(Stratagene產(chǎn))構(gòu)建基因組文庫。以JT-ISH-467抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的部分片段(929bp;序列號(hào)17)為探針，對(duì)JT-ISH-224林的基因組文庫進(jìn)行篩選，但與實(shí)施例6(1)相同，雜交和清洗溫度為55°C。其結(jié)果在兼帶噬菌斑純化的二次篩選之前，獲得了12個(gè)克隆，對(duì)于其中的6種XDNA,如實(shí)施例5(3)那樣使用QIAGENLambdaMiniKit(QIAGEN產(chǎn))進(jìn)行純化。進(jìn)一步，將其中的3個(gè)克隆的XDNA樣品和JT-ISH-224抹的全基因組DNA用限制酶EcoRI或HindIII消化。消化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分級(jí)后，如上述那樣轉(zhuǎn)印至尼龍濾膜上。使用該濾膜，以JT-ISH-467抹來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的部分片段(929bp;序列號(hào)17)為探針，進(jìn)行Southern分析，雜交和清洗溫度為55°C。其結(jié)果用EcoRI消化時(shí)，檢測(cè)出12kb或12kb以上的條帶。與此相對(duì)，用HindIII消化時(shí)，全部3個(gè)XDNA樣品和JT-ISH-224抹的全基因組DNA均檢測(cè)出5kb和2.7kb的兩個(gè)條帶。因而，將人DNA樣品再次用HindIII消化，凝膠純化5kb和2.7kb的兩個(gè)DNA片段，采用常規(guī)方法將其克隆至質(zhì)粒載體pBluescriptSK(-)的HindIII位點(diǎn)。然后，對(duì)于這些克隆，使用M13引物(TarakaBio產(chǎn))，用ABIPRISM熒光測(cè)序儀(Model310GeneticAnalyzer,PerkinElmer公司產(chǎn))測(cè)定5kbHindIII片段和2.7kbHindIII片段兩端的堿基序列。其結(jié)果，由5kb片段的一側(cè)的DNA序列和2.7kb片段的一側(cè)的DNA序列推測(cè)的氨基酸序列，與數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果一道，均顯示了與唾液酸轉(zhuǎn)移酶的同源性。為了測(cè)定JT-ISH-224抹的該酶基因的全長DNA,基于由HindIII2.7kb片段獲得的DNA序列，設(shè)計(jì)、合成了下面表9的引物，用于堿基序列測(cè)定。表9〈table></column></row><row><column>名稱</column><column>序列5'-3，</column><column>長度</column></row><row><column>224-23ST-inRVl</column><column>CAGGAACTGCAACAGCAGAG(序列號(hào)34)</column><column>20mer</column></row><table>其結(jié)果，獲得了序列表中的序列號(hào)28的序列。該序列是JT-ISH-224抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的開放閱讀框(ORF)的全堿基序列。在第一個(gè)ATG的上游，在同一個(gè)閱讀框內(nèi)出現(xiàn)了翻譯終止密碼子，因而認(rèn)為這個(gè)ATG是該基因的翻譯起始密碼子。發(fā)光桿菌屬JT-ISH-224株來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的ORF與明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467枒、來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的ORF—樣，包含1230個(gè)堿基，編碼409個(gè)氨基酸。該氨基酸序列示于序列表的序列號(hào)29?；騼?nèi)部有HindIII位點(diǎn)。使用GENETYXVer.7(GENETIC制作)進(jìn)行核酸和氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，JT-ISH-224株來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因與JT-ISH-467林來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因具有92。/。的同源性。此外，在氨基酸序列也與JT-ISH-467抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有92%的同源性。進(jìn)一步，JT-ISH-224抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列顯示其與美人魚發(fā)光桿菌的a2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(JC5898)具有33%的同源性，與多殺巴斯德氏菌多殺亞種Pm70抹的假設(shè)蛋白PM0188(AKK02272)具有29%的同源性；在基因DNA序列方面，其與上述兩者的同源性分別為54%和50%。(3)表達(dá)載體的構(gòu)建為考察克隆的基因是否具有唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性，將該基因的全長和N末端信號(hào)肽部分刪除型基因整合入載體，在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)，測(cè)定了該表達(dá)蛋白的活性。對(duì)于JT-ISH-224抹來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列使用遺傳信息處理軟件GENETYXVer.7進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)N末端的24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。因此，設(shè)計(jì)并合成了引物224-23ST-N0-Pci(序歹'J號(hào)35)和224-23ST-C0new-Bm(序列號(hào)37)，用于克隆全長基因(在本實(shí)施例中表示為224-N0C0);以及224-23ST-Nl-Nco(序列號(hào)36)和224-23ST-C0new-Bm(序列號(hào)37),用于克隆編碼信號(hào)肽部分氨基酸刪除型蛋白的基因(在本實(shí)施例中表示為224-N1C0)(表IO)。表10<table><row><column>名稱</column><column>序列5，－3</column><column>長度</column></row><row><column></column><column>224-23ST-N0-Pci</column><column>AAGGGAATACATGTTCGTTTTTTGTAAAAAAATG(序列號(hào)35)</column><column>34mer</column></row><row><column></column><column>224-23ST-Nl-Nco</column><column>GGGATGTACCATGGACTCTAATCACAATAACTCAG</column><column>35mer</column></row><row><column></column><column>224-23ST-C0new-Bm</column><column>ATTAAAATGGATCCTTACTGCAAATCACTTATCAAC</column><column>36mer</column></row><table>用下劃線所示是預(yù)先整合入引物供克隆用的限制酶Pcil(224-23ST-N0-Pci)、Ncol(224-23ST-Nl-Nco)和BamHI(224-23ST-C0new-Bm)的位點(diǎn)。翻譯起始密碼子ATG和與翻譯終止密碼子相應(yīng)的互補(bǔ)序列TAA加方框表示。而且，在引物序列中，與模板DNA退火部分的序列用粗體字示出。在引物224-23ST-NO-Pci中導(dǎo)入了用于后續(xù)克隆的Pcil位點(diǎn)，翻譯起始密碼子ATG之后的胞嘧啶(C)被替換為胸腺嘧啶(T)。因此，緊隨翻譯起始的曱硫氨酸之后的氨基酸序列由亮氨酸(Leu)被替換為苯丙氨酸(Phe)。Leu與Phe均為疏水性氨基酸且該部分為信號(hào)肽區(qū)域，因此可以斷定該突變引起酶活性發(fā)生大的變化的可能性低。接著，進(jìn)行PCR,擴(kuò)增用于整合入載體的JT-ISH-224林來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因。PCR的模板使用包含JT-ISH-224才朱來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的上述入DNA。PCR的反應(yīng)條件設(shè)定如下。的反應(yīng)液中含有模板DNA100ng、10xExtaq緩沖液5ji1、2.5mM的每種dNTPs4ji1、引物50pmole、Extaq(TakaraBio產(chǎn))0.5(il。使用程序溫度控制系統(tǒng)PC-700(ASTEK公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為1個(gè)循環(huán)的96°C3分鐘；15個(gè)循環(huán)的96°C1分鐘、50°C1分鐘、72°C2分鐘；1個(gè)循環(huán)的72°C6分鐘。其結(jié)果224-N0C0擴(kuò)增出約1.2kb的PCR產(chǎn)物，224-N1CO擴(kuò)增出約1.1kb的PCR產(chǎn)物。在這些PCR產(chǎn)物中，224-N0C0用限制酶Pcil(NewEnglandBiolab產(chǎn))和Bamffl(TakaraBio產(chǎn))雙重消化，224-N1C0用限制酶NcoI(TakaraBio產(chǎn))和BamHI雙重消化，然后進(jìn)行凝膠純化。大腸桿菌表達(dá)載體使用pTrc99A(PhatmaciaLKB產(chǎn))。用相同的限制酶即Pcil和BamHI(導(dǎo)入224-N0C0時(shí))或者Ncol和BamHI(導(dǎo)入224-N1C0時(shí))雙重消化該載體，并進(jìn)行凝膠純化，然后用TakaraLigationKit(TakaraBio產(chǎn))將其與經(jīng)限制酶處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)染大腸桿菌TB1。按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行限制酶分析，確認(rèn)插入序列的整合，然后測(cè)定了224-N0C0(ISH224-N0C0第1克隆)和224-N1C0(ISH224-N1C0第1克隆)的全部堿基序列。其結(jié)果在ISH224-NOCO第1克隆中確認(rèn)了上述的由Leu至Phe的取代，除此之外沒有堿基序列的突變。同樣，對(duì)于ISH224-N1C0第i克隆，沒有堿基序列的突變，其含有期望的堿基序列即序列號(hào)1的第73位堿基至第1230位堿基。(4)誘導(dǎo)表達(dá)與活性測(cè)定像實(shí)施例5(5)那樣，對(duì)于ISH224-N0C0第1克隆和ISH224-N1C0第1克隆這兩個(gè)克隆進(jìn)行蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定酶活性。其結(jié)果，如下面表11所示，表明在ISH224-N0C0第1克隆和ISH224-N1C0第1克隆的粗酶液中存在唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。表11:重組了JT-ISH-224抹來源的JT-ISH-467p-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因同源物的大腸桿菌的破碎液中的唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性<table>complextableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>(5)a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的確認(rèn)如實(shí)施例5(6)那樣，將ISH224-N0C0第1克隆和ISH224-N1C0第1克隆分別導(dǎo)入大腸桿菌，使之表達(dá)酶，通過以吡啶氨基化乳糖為糖受體的反應(yīng)，考察a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。通過HPLC對(duì)由大腸桿菌表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)生成物進(jìn)行分析，其結(jié)果，使用任一克隆的反應(yīng)均檢測(cè)出了吡啶氨基化a2,3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3'-唾液酸乳糖)的峰。該結(jié)果表明，JT-ISH-224抹來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有(x2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移活性。實(shí)施例7:弧菌屬細(xì)菌JT-FAJ-16株來源的3-半乳糖苦-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、堿基序列分析及該基因在大腸桿菌中的表達(dá)(1)JT-FAJ-16抹存在p-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性和該酶的基因的存在的確定為了確定已在實(shí)施例1中認(rèn)定具有唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的弧菌屬JT-FAJ-16抹中是否存在明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467株來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的同源物，實(shí)施了基因組Southern雜交。采用實(shí)施例5(1)中的方法，由JT-FAJ-16抹的菌體離心沉淀制備基因組DNA。然后采用實(shí)施例5(3)中的方法，用限制性酶EcoRI和Hindm進(jìn)行消化，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳分級(jí)，然后采用使用0.4MNaOH的堿印跡法將凝膠轉(zhuǎn)印到Hybond-N+尼龍濾膜(AmershamBiosciences產(chǎn))上。對(duì)于該濾膜，使用上述的929bp的探針(序列號(hào)17),采用實(shí)施例5(3)中的方法進(jìn)行Southern雜交，但雜交溫度和清洗溫度為55℃。其結(jié)果用EcoRI消化時(shí)，檢測(cè)出3.6kb的條帶；用HindIII消化時(shí)，檢測(cè)出7kb的條帶。這表明JT-FAJ-16株中存在JT-ISH-467林來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的同源物。(2)JT-FAJ-16抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的克隆接下來，進(jìn)行JT-FAJ-16抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的克隆。采用實(shí)施例5(1)中的方法，由JT-FAJ-16抹的基因組DNA使用入DASHII(Stratagene產(chǎn))構(gòu)建基因組文庫。以JT-ISH-467枒、來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的部分片段(929bp;序列號(hào)17)為探針，對(duì)JT-FAJ-16株的基因組文庫進(jìn)行篩選。4旦雜交實(shí)-險(xiǎn)使用ECLdirectlabelling&detectionsystem(AmershamBiosciences產(chǎn))。按試劑盒所附的說明書制備4笨針。雜交是在試劑盒的雜交緩沖液中加入終濃度為5%(w/v)的封閉試劑及終濃度為0.5M的NaCl，37℃進(jìn)行4小時(shí)。清洗是在0.4%SDS、0.5xSSC中50℃進(jìn)行2次、每次20分鐘；然后在2xSSC中室溫進(jìn)行1次、5分鐘。信號(hào)的檢測(cè)按試劑盒所附的說明書進(jìn)行。其結(jié)果在兼帶噬菌斑純化的一次篩選中，獲得了12個(gè)克隆，對(duì)于其中的6種XDNA，如實(shí)施例5(3)那樣4吏用QIAGENLambdaMiniKit(QIAGEN產(chǎn))進(jìn)行純化。進(jìn)一步，對(duì)這些XDNA樣品和JT-FAJ-16抹的全基因組DNA用限制酶EcoRI進(jìn)行消化。消化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分級(jí)后，如上述那樣轉(zhuǎn)印至尼龍濾膜上。使用該濾膜，以JT-ISH-467抹來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的部分片段(929bp;序列號(hào)17)為探針，使用ECL系統(tǒng)，在與上述相同的條件下進(jìn)行Southern分析。其結(jié)果全部6個(gè)XDNA樣品和JT-FAJ-16抹的全基因組DNA均檢測(cè)出3.6kb的條帶。因而，將XDNA樣品再次用EcoRI消化，凝膠純化3.6kb的DNA片段，采用常規(guī)方法將其克隆至質(zhì)粒載體pBluescriptSK(-)的EcoRI位點(diǎn)。然后，對(duì)于認(rèn)為包含JT-FAJ-16抹來源的oc2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的EcoRI3.6kb片段，使用M13引物(TarakaBio產(chǎn))，用ABIPRISM熒光測(cè)序儀(Model310GeneticAnalyzer,PerkinElmer公司產(chǎn))測(cè)定兩端的石成基序列。其結(jié)果，從一側(cè)的末端DNA序列推測(cè)的氨基酸序列在數(shù)據(jù)庫檢索中顯示與美人魚發(fā)光桿菌的a2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(JC5898)具有27%的同源性。為了完全測(cè)定JT-FAJ-16抹的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的全堿基序列，基于由EcoRI3.6kb片段獲得的DNA序列合成了下面表12的引物用于堿基序列測(cè)定。表12<table></column></row><row><column>名稱</column><column>序列5'-3'</column><column>長度</column></row><row><column>FAJEc3.6RV1</column><column>TTCAAAACTGCCTGAGTCAG(序列號(hào)38)</column><column>20mer</column></row><row><column>FAJEc3.6RV2</column><column>ATTTCATGGTCTAGATACCC(序列號(hào)39)</column><column>20mer</column></row><table>由獲得的堿基序列數(shù)據(jù)進(jìn)一步設(shè)計(jì)、合成以下表13記載的引物，進(jìn)行全堿基序列測(cè)定。表13<table><row><column>名稱</column><column>序列5'-3'</column><column>長度</column></row><row><column>FAJ23STinFW3</column><column>CTGACTCAGGCAGTTTTGAA(序列號(hào)40)</column><column>20mer</column></row><row><column>FAJ23STinFW4</column><column>GAAAGCAACTCTCTCAATGGG(序列號(hào)41)</column><column>21mer</column></row><table>FAJ23STinRV3ATAAACCCATTGAGAGAGTTG(序列號(hào)42)21mer其結(jié)果，獲得了序列表中的序列號(hào)30的序列。該序列是JT-FAJ-16株來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的開放閱讀框(ORF)的全堿基序列。在第一個(gè)ATG的上游，在同一個(gè)閱讀框內(nèi)出現(xiàn)了翻譯終止密碼子，因而認(rèn)為這個(gè)ATG是該基因的翻譯起始密碼子。JT-FAJ-16株來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的ORF包含1209個(gè)堿基，編碼402個(gè)氨基酸。該氨基酸序列示于序列表的序列號(hào)31。使用GENETYXVer.7(GENETIC制作)進(jìn)行核酸和氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，JT-FAJ-16株來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因與JT-ISH-467抹和JT-ISH-224抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因分別具有69.7%和68%的同源性。此外，氨基酸序列也分別顯示64.7%和64.8%的同源性。進(jìn)一步，JT-FAJ-16抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列顯示與美人魚發(fā)光桿菌的a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(JC5898)具有30.5%的同源性、與多殺巴斯德氏菌多殺亞種Pm70抹的布支設(shè)蛋白PM0188(AKK02272)具有27.3%的同源性；在基因DNA序列方面，其與上述兩者分別具有51.2%和48.3%的同源性。(3)表達(dá)載體的構(gòu)建為考察克隆化基因是否具有唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性，將該基因的全長和N末端信號(hào)肽部分刪除型基因組合入載體，在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)，測(cè)定了該表達(dá)蛋白的活性。對(duì)于JT-FAJ-16株來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列使用遺傳信息處理軟件GENETYXVer.7進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)N末端的22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。因此，設(shè)計(jì)并合成了引物FAJ23STN0-BspHI(序列號(hào)43)和FAJ23STC0-BamHI(序列號(hào)45)，用于克隆全長基因(在本實(shí)施例中表示為FAJ-NOCO);以及引物FAJ23STNl-BspHI(序列號(hào)44)和FAJ23STC0-BamHI(序列號(hào)45)，用于克隆編碼信號(hào)肽部分氨基酸刪除型蛋白的基因(在本實(shí)施例中表示為FAJ-N1C0)(表14)。表14<table><row><column>名稱</column><column>序列5'-3'</column><column>長度</column></row><row><column>FAJ23STN0-BspHI</column><column>TGGATAACTCATGAAAAACATTATAACAAAAAGAATG(序列號(hào)43)</column><column>37mer</column></row><table><table><row><column>FAJ23STN1-Bspffl</column><column>TATTATCGTCATGAACAATGATAACAGCACTACC(序列號(hào)44)</column><column>34mer</column></row><row><column>FAJ23STC0-BamHI</column><column>TCTTTTTAGGATCCTTAAATGTCGCTGATTAGTTTTAT(序列號(hào)45)38mer</column></row><table>下劃線示出的是預(yù)先整合入引物用于克隆的限制酶BspHI(FAJ23STN0-BspHI、FAJ23STNl-BspHI)、BamHI(FAJ23STC0-BamHI)的位點(diǎn)。翻譯起始密碼子ATG和與翻譯終止密碼子相應(yīng)的互補(bǔ)序列TAA加方框表示。而且，在引物序列中，與模板DNA退火部分的序列用粗體字示出。使用這些引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增用于整合入載體的JT-FAJ-16株來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因。PCR的模板使用包含該基因的上述3.6kbDNA片段。PCR的反應(yīng)條件設(shè)定如下。50pl的反應(yīng)液中含有模板DNA300ng、10xExtaq緩沖液5)il、2.5mM的每種dNTPs4(il、引物50pmole、Extaq(TakaraBio產(chǎn))0.5^1。使用程序溫度控制系統(tǒng)PC-700(ASTEK公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為1個(gè)循環(huán)的96°C3分鐘；10個(gè)循環(huán)的96°C1分鐘、50°C1分鐘、72°C2分鐘；1個(gè)循環(huán)的72°C6分鐘。其結(jié)果FAJ-NOCO擴(kuò)增出約1.2kb的PCR產(chǎn)物，而FAJ-N1C0擴(kuò)增出約l.lkb的PCR產(chǎn)物。將這些PCR產(chǎn)物按照TA克隆試劑盒(Invitrogen產(chǎn))的說明書克隆在TA克隆用載體pCR2.1TOPO(Invitrogen產(chǎn))上。大腸桿菌使用TB1。按常規(guī)方法從獲得的菌落純化質(zhì)粒，用限制酶EcoRI確定PCR產(chǎn)物已經(jīng)導(dǎo)入載體。確認(rèn)已發(fā)生導(dǎo)入的質(zhì)粒樣品用限制性酶Bspffl和BamHI雙重消化后，凝膠純化1.2kb(FAJ-N0C0)或l.lkb(FAJ-N1C0)的片,殳。然后將這些DNA樣品用TakaraLigationKit(TakaraBio產(chǎn))與預(yù)先經(jīng)限制酶Ncol和BamHI雙重消化的大腸桿菌表達(dá)載體pTrc99A進(jìn)行連接，導(dǎo)入大腸桿菌TB1。按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA,進(jìn)行限制酶分析，確認(rèn)插入序列的整合，測(cè)定了1個(gè)FAJ-N0C0代表克隆(FAJ-N0C0第1克隆)和2個(gè)FAJ-N1C0代表克隆(FAJ-N1C0第1克隆和第2克隆)的全堿基序列。其結(jié)果FAJ-N0C0第1克隆沒有堿基序列的變異，其含有期望的堿基序列即序列表中序列號(hào)30的第l位堿基至第1209位堿基。另一方面，對(duì)于FAJ-N1C0，其第1克隆沒有堿基序列的變異，其含有期望的堿基序列即序列表中序列號(hào)30的第67位堿基至第1209位堿基；而在其第2克隆中，序列號(hào)30中第631位堿基的腺。票呤(A)變?yōu)榱锁B嘌呤(G)。因此，密碼子由ACA變?yōu)镚CA,氨基酸由蘇氨酸(Thr)變?yōu)楸彼?Ala)。除此之外不存在堿基取代。(4)誘導(dǎo)表達(dá)與活性測(cè)定像實(shí)施例5(5)那樣，對(duì)于FAJ-N0C0第1克隆、FAJ-N1C0第1克隆和第2克隆這三個(gè)克隆進(jìn)行蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定酶活性。其結(jié)果，如下面表15所示，表明在FAJ-N0C0第1克隆、FAJ-N1C0第1克隆和第2克隆的粗酶液中存在唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。表11:重組了JT-FAJ-16抹來源的JT-ISH-467(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因同源物的大腸桿菌的破碎液中的唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性<table>complextableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>(5)a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移活性的確認(rèn)如實(shí)施例5(6)那樣，將FAJ-N0C0第1克隆、FAJ-N1C0第1克隆和第2克隆這三個(gè)克隆分別導(dǎo)入大腸桿菌使之表達(dá)酶，通過以吡啶氨基化乳糖為糖受體的反應(yīng)考察oc2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。通過HPLC對(duì)由大腸桿菌表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)生成物進(jìn)行分析，結(jié)果，使用任一克隆的反應(yīng)均檢測(cè)出了葉匕咬氨基化(x2,3-唾液酸乳糖(卩比咬氨基化3'-唾液酸乳糖)的峰。該結(jié)果表明，JT-FAJ-16抹來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。實(shí)施例8:各種唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白的氨基酸序列的多重比對(duì)分析使用遺傳信息處理軟件GENETYXVer.7(GENETYX制作)進(jìn)行多重比對(duì)分析。其結(jié)果，明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467株來源、發(fā)光桿菌JT-ISH-224抹來源、以及弧菌屬JT-FAJ-16抹來源的a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(分別為序列號(hào)2、29、31),美人魚發(fā)光桿菌的a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(JC5898)以及多殺巴斯德氏菌多殺亞種Pm70抹的假設(shè)蛋白PM0188(AKK02272)顯示如圖2的比對(duì)。此外，JT-ISH-467抹來源的a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的下劃線表示從純化蛋白測(cè)定的氨基酸序列。實(shí)施例9:β-半乳4唐香-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶活性的最適pH和最適溫度使用制備的純化酶，考察了JT-ISH-467抹產(chǎn)生的β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，ISH467-N2C0第3克隆、ISH224-N1C0第1克隆和FAJ-N1C0第1克隆產(chǎn)生的重組β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的最適pH和最適溫度。(1)酶活性的最適pH配制醋酸緩沖液(pH4.0、pH4.5和pH5.0)、卡可基酸緩沖液(pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6,5和pH7.0)、磷酸緩沖液(pH7.0、pH7.5和pH8.0)、TAPS緩沖液(pH8.0、pH8.5、pH9.0)、CHES緩沖液(pH9.0、pH9.5和pH10.0)和CAPS緩沖液(pH10.0、pH10.5和pHll.O)，使用這些緩沖液在25℃測(cè)定各pH條件下的酶活性。結(jié)果如圖3-1和圖3-2所示，JT-ISH-467抹產(chǎn)生的β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶在pH5.0、ISH467-N2C0第3克隆在pH5,5、ISH224-N1C0第1克隆在pH5.0、FAJ-N1C0第1克隆在pH5.5時(shí)，酶活性最大。而且，所有酶均在pH5.0至pH7.0或乃至pH9.0具有高活性。此外，各pH條件下的酶活性是以顯示最大活性的pH條件下的酶活性為100而得到的相對(duì)活性。(2)酶活性的最適溫度對(duì)于各種酶在從5℃到45℃，依次相隔5℃的各反應(yīng)溫度下測(cè)定酶活性，其中對(duì)于JT-ISH-467抹產(chǎn)生的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶在pH5.0、對(duì)于ISH467-N2C0第3克隆使用卡可基酸緩沖液(pH5.5)、對(duì)于ISH224-N1C0第1克隆使用卡可基酸緩沖液(pH5.0)、對(duì)于FAJ-N1C0第1克隆使用卡可基酸緩沖液(pH5.5)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖4-1和圖4-2所示，JT-ISH-467抹產(chǎn)生的β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶在25℃、ISH467-N2C0第3克隆在25℃、ISH224-N1C0第1克隆在30℃、FAJ-N1C0第1克隆在20℃時(shí)，酶活性最大。而且，所有酶均在15。C或20℃-30℃或乃至35℃具有高活性。此外，各溫度下的酶活性是以顯示最大活性的溫度條件下的酶活性為100而得到的相對(duì)活性。實(shí)施例10:p-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)譜分析通過激光離子化飛行時(shí)間型質(zhì)譜分析裝置(抹式會(huì)社島津制作所MALDI-TOFMSAXIMA-CFR)對(duì)JT-ISH-467抹產(chǎn)生的卩-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶以及ISH467-N0C0第2克隆、ISH467-N2C0第3克隆、ISH224-N1C0第1克隆和FAJ-N1C0第1克隆所產(chǎn)生的重組(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的純化酶進(jìn)行質(zhì)語分析，其結(jié)果，它們的分子量分別為45，026Da、45,023Da、44,075Da、43,996Da和43,921Da。對(duì)于SH467-N2C0第3克隆、ISH224-N1C0第1克隆和FAJ-N1C0第1克隆，質(zhì)鐠分析結(jié)果與從氨基酸序列推測(cè)的分子量一致。然而，對(duì)于明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹產(chǎn)生的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶以及ISH467-N0C0第2克隆，質(zhì)譜分析結(jié)果與從氨基酸序列推測(cè)的分子量不一致?？梢哉J(rèn)為其原因是這兩個(gè)酶的氨基酸序列中包含稱為脂盒(U求求'、乂夕7)的共有序列(Leu-Gly-Gly陽Cys:序列號(hào)2的氨基酸殘基19-22)，在細(xì)菌內(nèi)，其在該共有序列的Cys的氨基末端一側(cè)被切斷，而在脂盒中的Cys上P付力口月旨質(zhì)(MadanBabu，M.andSankaran，K.，Bioinformatics.,18,641-643(2002))。實(shí)施例11:重組3-半乳糖苷-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體底物特異性(單糖二糖類三糖類]的比較(材料與方法)使用離子交換層析和羥基磷灰石層析，將從ISH467-N2C0第3克隆重組大腸桿菌、ISH224-N1C0第1克隆重組大腸桿菌和FAJ-N1C0第1克隆重組大腸桿菌制備的菌體破碎液純化至電泳單一條帶，使用這樣純化的(3-半乳糖苷-oc2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，以考察其是否具有向各種單糖、二糖類和三糖類轉(zhuǎn)移唾液酸活性。使用各種糖受體底物的唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)制備反應(yīng)溶液，其中24|il該反應(yīng)溶液中包含糖供體底物即含CMP-14C-NeuAc的CMP-NeuAc(21.9nmol、在反應(yīng)溶液中的終濃度為0.874mM)、用20mM卡可基酸緩沖液(pH5.0)溶解的各種糖受體底物(l(imol、在反應(yīng)液中的終濃度為42mM)、唾液酸轉(zhuǎn)移酶(酶量如表腳注所示)、NaCl(在反應(yīng)溶液中的終濃度為500mM),按表腳注的條件進(jìn)行反應(yīng)。而且，作為糖受體底物使用IO種單糖，即'.曱基-a-D-p比喃半乳糖苷(Gal-a-OMe)、曱基-(3-D-吡喃半乳糖苷(Gal-(3-OMe)、曱基-a-D-吡喃葡萄糖苷(Glc-a-OMe)、曱基-卩-D-p比喃葡萄糖苷(Glc-卩-OMe)、曱基-a-D-口比喃甘露糖苷(Man-a-OMe)、曱基-(3-D-吡喃甘露糖苷(Man-(3-OMe)、甲基-ot-D-吡喃巖藻糖香(Fuc-a-OMe)、曱基-(3-D-吡喃巖藻糖普(Fuc-(3-OMe)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc);使用5種二糖類，即乳糖(Gal-卩1，4-Glc)、N-乙酰乳糖胺(Gal-(31,4-GlcNAc)、曱基-卩-D-吡喃半乳糖基-(31,3-N-乙酰氨基葡萄糖苷(Gal-(31,3-GlcNAc-P-OMe)、曱基-a-D-吡喃半乳糖基-(xl,3-吡喃半乳糖苷(Gal-al，3-Gal-a-OMe)和甲基-卩-D-吡喃半乳糖基-(31,3-吡喃半乳糖苷(Gal-(31,3-Gal-P-OMe);使用l種三糖類，即2，-巖藻糖基乳糖(Fuc-al,2-Gaipi,4-Glc)。表18所示的糖鏈、曱基-a-D-吡喃半乳糖基-al,3-吡喃半乳糖芬(Gal-al,3-Gal-a-OMe)、甲基-卩-D-p比喃半乳糖基-(31,3-吡喃半乳糖苷(Gal-(31，3-Gal-(3-OMe)和2，-巖藻糖基乳糖(Fuc-al,2-Gal(31,4-Glc)以8.4mM的終濃度反應(yīng)。酶反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)溶液中加入1.98ml的5mM磷酸緩沖液(pH6.8)以終止酶反應(yīng)。然后，將用5mM磷酸緩沖液(pH6.8)稀釋的酶反應(yīng)溶液(2ml)上樣于AGl-x2Resin(P043-型、0.2x2cm)柱。該柱是將AGl-x2Resin(OH—型、BIO-RAD公司產(chǎn))懸浮于1M磷酸緩沖液(pH6.8)，30分鐘后用蒸餾水清洗樹脂，然后再將樹脂懸浮在蒸餾水中而制備的。測(cè)定該柱的洗脫液(0-2ml)的放射活性。該柱的洗脫液中含有反應(yīng)生成的結(jié)合有"C-NeuAc(N-乙酰神經(jīng)氨酸)的反應(yīng)生成物和未反應(yīng)的糖受體底物，而未反應(yīng)的CMP-"C-NeuAc保留在柱上。因而，酶反應(yīng)最終生成的各種含唾液酸糖鏈來源的"C放射活性，全部來自反應(yīng)生成物，由該級(jí)分的放射活性可以計(jì)算出酶活性。采用上述方法測(cè)定轉(zhuǎn)移至各種糖受體底物的NeuAc的力文射活性，并計(jì)算出發(fā)生轉(zhuǎn)移的唾液酸。(結(jié)果)表明唾液酸可以高效地轉(zhuǎn)移至此次作為糖受體底物爿使用的16種單糖、二糖、三糖中的任何一種(表16、表17和表18)。此外，對(duì)于各種受體底物的相對(duì)活性是以對(duì)乳糖的唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性為100而得到的值。<table>complextableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>反應(yīng)條件反應(yīng)組成lpmol受體底物(20mM卡可基酸緩沖液，pH5.0)ll.Spl含CMP-"C-NeuAc的CMP-NeuAc(21.9nmol(約20000cpm))4.8ul酶液5ul(約2.5mU)5MNaCl2.4ul反應(yīng)溫度20℃反應(yīng)時(shí)間14小時(shí)表17:受體底物特異性(2)<table>complextableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>反應(yīng)條件反應(yīng)組成lpmol受體底物(20mM卡可基酸緩沖液，pH5.0)11.8ul含CMP-14C墨NeuAc的CMP-NeuAc(21.9nmol(約18500cpm))4.8ul酶液5ul5MNaC)2.4ul反應(yīng)溫度30°C反應(yīng)時(shí)間0.5分鐘或2分鐘酶量對(duì)于ISH467-N2C0,每個(gè)反應(yīng)為2.3mU;對(duì)于ISH224-N1C0,每個(gè)反應(yīng)為l.OmU。表18:受體底物特異性(3)<table>complextableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>反應(yīng)條件反應(yīng)組成0.2pmol受體底物(20mM卡可基酸緩沖液，pH5.0)11.8ul含CMP-"C-NeuAc的CMP-NeuAc(21.9nmo1(纟々18500cpm))4.8ul酶液5ul5MNaCl2,反應(yīng)溫度30'C反應(yīng)時(shí)間2分鐘酶量對(duì)于ISH467-N2C0,每個(gè)反應(yīng)為2.3mU;對(duì)于ISH224-N1C0,每個(gè)反應(yīng)為l.OmU。實(shí)施例12:重組(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)糖蛋白的受體底物特異性使用離子交換層析和羥基磷灰石層析，將從ISH467-N2C0第3克隆重組的大腸桿菌、ISH224-N1C0第1克隆重組的大腸桿菌和FAJ-N1C0第1克隆重組的大腸桿菌制備的菌體破碎液純化至電泳單一條帶，使用這樣純化的p-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，以考察其是否具有向糖蛋白轉(zhuǎn)移唾液酸的活性。糖受體底物使用脫唾液酸胎球蛋白。將2mg的脫唾液酸胎球蛋白溶于lml的20mMBis-Tris緩沖液(pH6.0)，作為糖受體底物溶液。糖供體底物使用含CMP-"C-NeuAc的CMP-NeuAc?；旌咸鞘荏w底物溶液40]il、糖供體底物5pl(22.8nmo1(約19,000cpm))和酶溶液5(al(各10mU),25。C保溫2小時(shí)，進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶液上樣于用0.1M氯化鈉平ff的SephadexG-50superfme(0.8xi8.0cm),進(jìn)4亍凝月交過濾。收集含糖蛋白的凝膠過濾洗脫液級(jí)分(2-4ml的級(jí)分)，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定該級(jí)分的放射活性，對(duì)轉(zhuǎn)移至糖受體底物的唾液酸進(jìn)行定量。結(jié)果如表19所示，表明任何一種酶均向脫唾液酸胎球蛋白轉(zhuǎn)移唾液酸。表19:受體底物特異性(4)<table><row><column>酶液</column><column>放射活性(cpm)</column></row><row><column>ISH467-N2C0</column><column>1729</column></row><row><column>ISH224-N1C0</column><column>3301</column></row><row><column>FAJ-N1C0</column><column>2865</column></row><row><column>不含酶</column><column>9</column></row><table>反應(yīng)條件反應(yīng)組成無唾液酸胎球蛋白溶液10u1酶液5ul5mMCMP-唾液酸(20mM卡可基酸緩沖液(pH5)中)+CMP，C-唾液酸5uJ實(shí)施例13:重組P-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)PA糖鏈的受體底物特異性使用離子交換層析和羥基磷灰石層析，將從ISH467-N2C0第3克隆重組的大腸桿菌、ISH224-N1C0第1克隆重組的大腸桿菌和FAJ-N1C0第1克隆重組的大腸桿菌制備的菌體破碎液純化至電泳單一條帶，使用這樣純化的(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，以考察其是否具有向PA糖鏈轉(zhuǎn)移唾液酸的活性。與實(shí)施例3相同，使用吡啶氨基化乳糖(Gal(31-4Glc-PA,TaKaRaBio公司產(chǎn)PA-SugarChain026)、吡啶氨基化GMl-戊多糖(Gal卩l(xiāng)-3GalNAc|31-4(Neu5Aca2-3)Gal(31-4Glc-PA,TaKaRaBio公司產(chǎn)PA-SugarChain032)和吡咬氨基化GDlb-己多糖(Gal(31-3GalNAc(31-4(Neu5Aca2-8Neu5Aca2-3)Gal(31-4Glc-PA,TaKaRaBio公司產(chǎn)PA-SugarChain034)按表腳注的條件進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，95。C熱處理反應(yīng)溶液5分鐘以使酶失活，用HPLC進(jìn)行分析。其結(jié)果，以PA-SugarChain026為受體底物時(shí)，任何一種酶均檢測(cè)出與PA-SugarChain029標(biāo)準(zhǔn)品具有相同洗脫時(shí)間的峰。同樣地，以PA-SugarChain032為受體底物時(shí)，可以檢測(cè)出與PA-SugarChain033標(biāo)準(zhǔn)品具有相同洗脫時(shí)間的峰；而以PA-SugarChain034為受體底物時(shí)，可以檢測(cè)出與PA-SugarChain036標(biāo)準(zhǔn)品具有相同洗脫時(shí)間的峰。因此，這表明JT-ISH-467林、JT-ISH-224抹和JT-FAJ-16抹來源的重組(3-半乳糖苦-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有以a2,3鍵連接方式向位于受試PA糖鏈非還原末端的半乳糖轉(zhuǎn)移唾液酸的活性。表20:受體底物特異性(5)<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage56</formula>反應(yīng)條件反應(yīng)組成:PA糖鏈(10pmol/(al)2.5|J5mMCMP-唾液酸(20mM卡可基酸緩沖液(pH5)中)5pi3MNaCl2.5ul酶液5nI(0.1mU)反應(yīng)溫度20'C反應(yīng)時(shí)間ISH467-N2C0為3小時(shí)；ISH224-N1C0為16小時(shí)；FAJ-N1C0為24小時(shí)。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供新的p-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼核酸，從而提供已明確在生物體內(nèi)具有重要功能的糖鏈的合成生產(chǎn)手段。特別是唾液酸在生物體內(nèi)的復(fù)合糖鏈中多存在于非還原末端，從糖鏈功能的觀點(diǎn)來看是極為重要的糖，因此唾液酸轉(zhuǎn)移酶是糖轉(zhuǎn)移酶中需求最高的酶之一。本發(fā)明的新唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以用于開發(fā)利用糖鏈的醫(yī)藥產(chǎn)品、功能性食品等。權(quán)利要求1.一種分離的蛋白質(zhì)，其含有選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸殘基22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸殘基25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸殘基23-402的氨基酸序列。2.—種分離的蛋白質(zhì)，其含有在選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸殘基22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸殘基25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸殘基23-402的氨基酸序列中發(fā)生1個(gè)或多于1個(gè)氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。3.—種分離的蛋白質(zhì)，其含有如下所述的氨基酸序列，且具有p-半乳糖苦-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性該氨基酸序列與選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸殘基22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸殘基25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸殘基23-402的氨基酸序列具有至少60%的氨基酸同源性。4.一種分離的蛋白質(zhì)，其由含有選自序列號(hào)1、序列號(hào)1的堿基64-1230、序列號(hào)28、序列號(hào)28的堿基73-1230、序列號(hào)30和序列號(hào)30的堿基67-1209的堿基序列的核酸編碼，且具有(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。5.—種分離的蛋白質(zhì)，其由含有如下所述的堿基序列的核酸編碼，且具有(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性該堿基序列在嚴(yán)緊條件下與選自序列號(hào)1、序列號(hào)1的堿基64-1230、序列號(hào)28、序列號(hào)28的堿基73-1230、序列號(hào)30和序列號(hào)30的堿基67-1209的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交。6.權(quán)利要求l-5任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)，其來自弧菌科微生物。7.—種分離的核酸，其編碼如下所述的蛋白質(zhì)該蛋白質(zhì)含有選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸殘基22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸殘基25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸殘基23-402的氨基酸序列。8.—種分離的核酸，其編碼如下所述的具有(3-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)該蛋白質(zhì)含有在選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸殘基22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸殘基25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸殘基23-402的氨基酸序列中發(fā)生1個(gè)或多于1個(gè)氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列。9.一種分離的核酸，其編碼含有如下所述的氨基酸序列，且具有(β-半乳糖香-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)該氨基酸序列與選自序列號(hào)2、序列號(hào)2的氨基酸殘基22-409、序列號(hào)29、序列號(hào)29的氨基酸殘基25-409、序列號(hào)31和序列號(hào)31的氨基酸殘基23-402的氨基酸序列具有至少60%的同源性。10.—種分離的核酸，其含有選自序列號(hào)l、序列號(hào)1的堿基64-1230、序列號(hào)28、序列號(hào)28的堿基73-1230、序列號(hào)30和序列號(hào)30的堿基67-1209的堿基序列。11.一種分離的核酸，其含有如下所述的堿基序列，并且編碼具有p-半乳糖苦-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)該堿基序列在嚴(yán)緊條件下與選自序列號(hào)1、序列號(hào)1的堿基64-1230、序列號(hào)28、序列號(hào)28的堿基73-1230、序列號(hào)30和序列號(hào)30的堿基67-1209的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交。12.含有權(quán)利要求7-11任一項(xiàng)所述核酸的重組載體。13.用權(quán)利要求12所述的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。14.一種弧菌科的分離的微生物，其表達(dá)權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)。15.權(quán)利要求14所述的微生物，其為明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-467抹(保藏號(hào)NITEBP-88)、發(fā)光桿菌屬(Photobacteriumsp.)JT-ISH-224抹(保藏號(hào)NITEBP-87)或弧菌屬(Vibriosp.)JT-FAJ-16株(保藏號(hào)NITEBP-98)。16.—種生產(chǎn)具有(β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟1)培養(yǎng)產(chǎn)生(β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的微生物；2)從培養(yǎng)的微生物或培養(yǎng)上清分離β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。17.—種生產(chǎn)具有β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的重組蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟1)用含有權(quán)利要求7-11任一項(xiàng)的核酸的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；2)培養(yǎng)經(jīng)過轉(zhuǎn)化的所述宿主細(xì)胞；3)從培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)上清分離具有β-半乳糖苷-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。18.—種生產(chǎn)唾液酸糖鏈的方法，包括(i)制備含有權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)、糖供體底物及糖受體底物的溶液；(ii)在該溶液中進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)；(iii)從反應(yīng)溶液獲得生成的唾液酸糖鏈。全文摘要本發(fā)明提供新β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及編碼該唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸。本發(fā)明還在提供生產(chǎn)該唾液酸轉(zhuǎn)移酶的微生物的同時(shí)，提供使用這樣的微生物生產(chǎn)該唾液酸轉(zhuǎn)移酶的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供含有編碼該唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸的載體和用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，同時(shí)本發(fā)明還提供生產(chǎn)重組β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供利用本發(fā)明的唾液酸轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)唾液酸糖鏈的方法。文檔編號(hào)C12N15/00GK101203606SQ20068001254公開日2008年6月18日申請(qǐng)日期2006年3月31日優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日發(fā)明者塚本浩史,山本岳,高倉由光申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社