專利名稱：：肽穩(wěn)定劑化合物及篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及稱為肽穩(wěn)定劑(peptidestabilizer)的全新化合物，其可以抵抗蛋白水解。尤其是，本發(fā)明涉及包含雜合分子的組合物，該雜合分子包含肽穩(wěn)定劑部分和如生物活性分子的生物活性部分。該活性部分可包括用于診斷或治療目的的分子。
背景技術(shù)：
：生物活性肽是引發(fā)生物活性的小肽類。已經(jīng)確認(rèn)和表征了超過(guò)500個(gè)平均具有20個(gè)氨基酸的此類肽。它們是從許多種自然或非自然系統(tǒng)中分離出來(lái)，表現(xiàn)出廣泛的作用，并在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為治療劑以及在基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中作為診斷工具而使用。在這些肽已經(jīng)確定的作用模式中，發(fā)現(xiàn)其是源于生物活性肽與特定蛋白靶標(biāo)的相互作用。在大多數(shù)情況下，生物活性肽通過(guò)極高特異性地結(jié)合蛋白粑標(biāo)并使其失活而發(fā)抨作用。殿近，由于天然肽具有結(jié)合并調(diào)節(jié)特異蛋白靶標(biāo)活性的優(yōu)異能力，因此對(duì)于應(yīng)用合成的衍生生物活性肽作為全新藥用試劑的興趣大增。在此之前，全新的生物活性肽己經(jīng)通過(guò)兩種不同的休外方法被工程化應(yīng)用。第一種方法通過(guò)由化學(xué)合成的6-10個(gè)氨基酸肽組成的隨機(jī)文庫(kù)來(lái)生產(chǎn)f疾選肽(J.Eichleretal.，Med.Res.Rev.15:481-496(1995);K.Lam，AnticancerDrugDes.12:145-167(1996);M.Lebletal.，MethodsEnzymol.289:336-392(1997))。另一種方法通過(guò)將隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)克隆入Ff絲狀噬菌體基因中來(lái)合成候選肽，其可在細(xì)菌噬菌體表面表達(dá)更長(zhǎng)的肽(H.Lowman，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:401-424(1997);G.Smithetal.，etal.Meth.Enz.217:228-257(1993))。如今，已經(jīng)制成長(zhǎng)度達(dá)到38個(gè)氨基酸的隨機(jī)肽文庫(kù)，而且使用此系統(tǒng)似乎也可制成更長(zhǎng)的肽。使用這兩種策略中任一種制成的肽庫(kù)通常再與預(yù)選的與基質(zhì)結(jié)合的蛋白靶標(biāo)相混合。洗脫結(jié)合的肽，并對(duì)其測(cè)序。通過(guò)此信息，合成新的肽并確定其生物特性。噬菌體展示提供了產(chǎn)生限制性(constrained)和非限制性(unconstrained)肽庫(kù)的方法(Devlinetal.，(19卯)Science249:404-406;Cwirlaetal.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-6382;Lowman(1997)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:401-424)。這些文庫(kù)可用于鑒定和篩選那些可以結(jié)合預(yù)定靶分子的合成肽。噬菌體展示文庫(kù)和化學(xué)合成文庫(kù)都受到文庫(kù)容量的限制，它們可產(chǎn)生的文庫(kù)大小在106-109范圍內(nèi)。這一限制導(dǎo)致分離到親和力相對(duì)較低且不耗時(shí)的后續(xù)成熟的肽。這一限制導(dǎo)致了體外產(chǎn)生文庫(kù)技術(shù)的發(fā)展，其中包括mRNA展示(Roberts，&Szostak，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94，2297-12302.(1997))、核糖休展示(Ma他eakisetalProc.Natl.Acad.Sci.USA91，卯22-9026(1994))和CIS展示(OdegripetalProc.Natl.Acad.SciUSA1012806-2810(2004))等等。這些文庫(kù)優(yōu)于嗽.菌體展示文庫(kù)的地方在于這些方法產(chǎn)生的文庫(kù)容量比噬菌休展示的可能容量大2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。然而，與噬菌體展示相比，這些文庫(kù)在分離得到同吋具有蛋白酶抗性和生物活性特性的肽這一方面并不具備優(yōu)越性。盡管這些體外方法被看好，但合成衍生肽的應(yīng)用還沒(méi)有成為制藥工業(yè)的主流。存在的主耍障礙是感興趣的生物系統(tǒng)內(nèi)肽的不穩(wěn)定性，町見(jiàn)亍受體中蛋白酶和/或肽酶對(duì)具有潛力的肽的有害降解。用來(lái)處理肽降解問(wèn)題的方法包括與天然的L-氨基酸相對(duì)應(yīng)的D-氨基酸或被修飾的氨基酸的應(yīng)用(例如,J.Eichleretal"MedResRev.15:481-496(1995);L.Sanders,Eur.J.DrugMetabol.Pharmacokinetics15:95-102(19卯))，環(huán)化肽的應(yīng)用(e.g.,R.Egleton,etal.，Peptides18:1431-1439(1997))，分離具有蛋白酶抗性的病毒顆粒(W09958655)和開(kāi)發(fā)能夠在肽到達(dá)患者靶點(diǎn)甜阻止其降解的增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(例如，L.Wearley，Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.8:331-394(1991);L.Sanders,Eur.J.DrugMetabol.Pharmacokinetics15:95-102(19卯))。盡管這些用于穩(wěn)定肽并從而阻止其在所選生物系統(tǒng)(例如患者)內(nèi)發(fā)生有害降解的方法具有前景，但仍然沒(méi)有辦法可以常規(guī)地、可靠地穩(wěn)定肽類藥物和候選藥物。而且，許多現(xiàn)存的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)方法不能直接應(yīng)用于篩選和幵發(fā)全新的生物活性肽。因此，需要穩(wěn)定生物活性肽以及鑒定全新肽穩(wěn)定劑化合物的方法。這樣的方法可為肽類藥物研發(fā)領(lǐng)域提供十分需耍的進(jìn)展。本發(fā)明的這些和其他應(yīng)用、特征和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)在此提供的內(nèi)容使本領(lǐng)域技術(shù)人員將更清晰。
發(fā)明內(nèi)容第一方面，本發(fā)明提供了從體外產(chǎn)生的包含大量肽的文庫(kù)中選擇抗蛋白水解的全新化合物(稱為肽穩(wěn)定劑)的方法，其包括以下步驟a)表達(dá)大量的核苷酸構(gòu)建體，其中每一個(gè)核苷酸構(gòu)建體都編碼雜合肽，所述雜合肽包括i)生物活性部分；和ii)假定的肽穩(wěn)定劑部分；b)使表達(dá)的雜合肽暴露于一種或多種蛋白嗨；C)使表達(dá)的雜合fl太暴露于靶分子，其能夠以可'檢測(cè)的方式與生物活性部分相互作用；以及d)加i^'吧分子和一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的雜合肽的生物活性部分發(fā)生了可檢測(cè)的相互作用，則將所述的--個(gè)或多個(gè)表達(dá)的雜合肽確定為包含肽穩(wěn)定劑化合物。本發(fā)明的肽穩(wěn)定劑文庫(kù)由例如欣或肽衍生物組成，所述肽衍生物如為天然或非天然氮基酸組成的擬Bt和肽類似物。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所分離的肽穩(wěn)定劑不是天然的氣基酸序列，其對(duì)例如胰蛋白酶或凝血酶這樣的酶產(chǎn)生的蛋白水解具^(guò)亢性。優(yōu)選地，該肽穩(wěn)定劑是具有約6到約30個(gè)但〔基酸殘基，優(yōu)選約7到約25個(gè)氨基酸殘基，鼓優(yōu)選約8到20個(gè)氮被酸殘基的非天然氨基酸序列。任選地，木發(fā)明針對(duì)肽穩(wěn)定劑與生物活性肽的組合從而形成包含肽穩(wěn)定劑部分和生物活性部分的雜合分子的選扦。肽穩(wěn)定劑部分的蛋白酶抗性提高了雜合分子的蛋白梅消除時(shí)間的半程時(shí)間(或半衰期)。在本發(fā)明中，優(yōu)選通過(guò)預(yù)定蛋白酶或肽酶選擇具有蛋白水解抗性的化合物，即其蛋&H消除半衰期在預(yù)定酶最佳活性條fKF大于30分鐘，優(yōu)選大于3個(gè)小Ht,并且優(yōu)選地對(duì)其它酶類(incidentalenzyme)的蛋白水解也有抗性。這樣化合物的特別實(shí)例包括線性或環(huán)狀的肽，長(zhǎng)度優(yōu)選地在大約8到20個(gè)氨基酸殘基之間，及其組合，任選地在這些肽的N端或C端或兩端有修飾，也包括它們的鹽類和衍生物、其功能類似物和在序列末端攜帶氨基酸或多肽的延長(zhǎng)狄鏈。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，體外產(chǎn)生核苷酸-肽穩(wěn)定劑的文庫(kù)通過(guò)合適的方法產(chǎn)生，與生物活性部分融合，并在預(yù)定肽酶或蛋白酶存在下篩選與生物活性分子靶標(biāo)的結(jié)合。對(duì)能夠結(jié)合靶標(biāo)并對(duì)預(yù)定蛋白酶或肽酶有抗性的文庫(kù)成員回收并對(duì)其進(jìn)行表征。根據(jù)本發(fā)明，預(yù)定肽酶或蛋白酶在結(jié)合到生物活性分子靶標(biāo)之前、之中或之后添加到文庫(kù)中。任選地，本發(fā)明提供了可以與不同的生物活性部分結(jié)合從而提高每個(gè)雜合分子的消除半衰期的肽穩(wěn)定劑部分。本發(fā)明也提供了對(duì)具有兩個(gè)或多個(gè)肽穩(wěn)定劑部分和一個(gè)生物活性部分或其他任何本領(lǐng)域技術(shù)人員可想到的組合的雜合配體進(jìn)行的選擇。根據(jù)本發(fā)明，還可篩選其中肽穩(wěn)定劑部分并入到生物活性部分序列內(nèi)的雜合分子。這樣，在木發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，蛋白水解抗性雜合分子可以選自由生物活性部分肽序列衍生所得的序列組成的文庫(kù)，所釆用的篩選方法如下a)表達(dá)大量的核苷酸構(gòu)建休，其中每一個(gè)核苷酸構(gòu)建休編碼由生物活性肽序列衍生得來(lái)的雜合肽，其包括i)生物活性部分；和ii)假定的肽穩(wěn)定劑部分；b)使表達(dá)的雜合肽暴露于一種或多種蛋白酶；c)使表達(dá)的雜合肽暴露于靶分子，其能夠以可檢測(cè)的方式與生物活性部分相互作用；以及d)如果靶分子和一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的雜合肽的生物活性部分發(fā)生可檢測(cè)的相互作用，則將所述的--個(gè)或多個(gè)表達(dá)的雜合肽確定為包含肽穩(wěn)定劑化合物。木發(fā)明的生物活性肽包括任何可用作治療劑或'診斷劑的化合物，其可以包括在體外合成的核苷酸編碼的文庫(kù)中。生物活性肽的非限制實(shí)例包括酶、激素、細(xì)胞因子、抗體或抗休片段、抗體所識(shí)別的肽片段、鎮(zhèn)癇劑、解熱劑、抗炎劑、抗生素、抗病毒劑、抗真菌藥物、心rfn.管藥物、影響腎臟功能和電解質(zhì)代謝的藥物、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物和化療藥物，僅舉幾例。根據(jù)本發(fā)明，與包含活性部分但缺少肽穩(wěn)定劑部分的相同生物活性肽相比，包含肽穩(wěn)定劑部分和生物活性部分的雜合分子提高了藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)。雜合體提高了藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)從而提供了低劑量的藥物制劑和全新的藥物組合物。本發(fā)明提供了使用該全新組合物的方法，其包括該雜合分子的治療或診斷性應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)肽穩(wěn)定劑與生物活性肽的組合，其提高了具有相對(duì)較短的蛋白酶消除半袞期的生物活性肽的蛋白酶消除半衰期。該組合根據(jù)多種設(shè)想的目的所選擇，其中包括當(dāng)木發(fā)明涉及該生物活性肽在休內(nèi)應(yīng)用吋則提髙生物活性肽的治療或診斷功效，例如提高生物活性化合物的蛋白酶消除半衰期。通常，將肽穩(wěn)定劑融合或化學(xué)連接(例如"偶聯(lián)")到生物活性肽上為組合物提供了延長(zhǎng)的蛋白酶消除半衰期。因此，木發(fā)明的另一方面提供了一種藥物組合物，其包括至少一種上述方法所鑒定的肽穩(wěn)定劑化合物，生物活性分子和合適的載休。本發(fā)明的藥物組合物根據(jù)常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)制成，可以通過(guò)口腔、靜脈、fr腔、眼部或其他標(biāo)準(zhǔn)途徑施用。該藥物組合物的劑型可以是片劑、丸劑、洗劑、凝膠劑、液休、散劑、栓劑、混懸劑、噴霧劑、脂質(zhì)休、微粒或其他木領(lǐng)域已知的合適劑型。木發(fā)明的另一方面提供了賦子生物活性肽分子以蛋白水解抗性的方法，、、、--、'、、，、—-'、-乂-、、'-—在此引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)弓I用將其全部?jī)?nèi)容納入本文。除非其他說(shuō)明，在此使用的所用技術(shù)和科學(xué)名詞與木發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)普通技術(shù)人員常識(shí)相同的意思。圖1顯示了在實(shí)施例1的凝血酶抗性肽庫(kù)中鑒定肽穩(wěn)定劑序列所使用的構(gòu)建休的圖示說(shuō)明。X-X-X代表了分離FLAG農(nóng)位和凝血酶裂解位點(diǎn)的隨機(jī)12mer肽庫(kù)。箭頭顯示了潛在的凝血酶(Pro-Arg)和胰蛋白酶裂解位點(diǎn)(Lys或Arg)。圖2顯示了5輪篩選后的凝ltlL酶抗性肽。數(shù)值以百分比表示((與凝lfiL酶溫育后讀取的OD450nm)/(無(wú)凝rfll酶的溫育虔取的OD450nm))。100°/。表示對(duì)凝血酶裂解的完全保護(hù)。對(duì)照棒圖是SEQNO:002所示的肽所觀察到的抗性。圖3顯示了胰蛋白酶抗性肽。A.含胰蛋白酶溫育的非選擇文庫(kù)肽。B.不含胰蛋白酶溫育的非選擇文庫(kù)肽。C.含胰蛋白酶溫育的5輪凝血酶篩選肽。D.不含胰蛋白酶溫育的5輪凝血酶篩選肽。圖4顯示了在實(shí)施例2的胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抗性肽庫(kù)中鑒定肽穩(wěn)定劑序列所使用的構(gòu)建休的圖示說(shuō)明。圖5顯示了實(shí)施例2中1-4輪的PCR回收物的溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠電泳圖，并使用抗FLAG抗休與胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶處理(CT)或無(wú)蛋白酶處理(NP)進(jìn)行選擇。圖6顯示/PCR引物的核苷酸序列，這i^序列用于實(shí)施例2的文庫(kù)構(gòu)建。
發(fā)明內(nèi)容在此使用的名詞"肽"、"肽穩(wěn)定劑"、"生物活性肽"和"雜合分子"是指大量的氨基酸在線性鏈上連接在一起。因此，此使用的名詞"肽"、"肽穩(wěn)定劑"、"生物活性肽"和"雜合分子"包括二肽、三肽、寡聚肽和多聚肽。一個(gè)二肽包含2個(gè)氨基酸；一個(gè)三狀包含3個(gè)氨基酸；名訶寡聚肽通常用來(lái)描述具有2到大約50或更多氮基酸的肽。大于大約50的肽通常指多聚肽或蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的目的，名詞"肽"、"肽穩(wěn)定劑"、"生物活性肽"和"雜合分子"不限于任何特定數(shù)目的氨基酸。然而優(yōu)選地，它們包含約2到約50個(gè)氣基酸，更優(yōu)選地約2到約40個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地約2到約20個(gè)氨基酸。在此使用的"肽穩(wěn)定劑"、"生物活性肽"和"雜合分子"是上述的氨基酸序列，所述氨基酸序列可包含天然和非天然的氨基酸殘基。因此，包括模擬特定氨基酸或肽的非氨基酸化學(xué)結(jié)構(gòu)的所謂的"擬肽"和"肽類似物"，在木發(fā)明文中也可以是肽穩(wěn)定劑。這樣的模擬物或類似物的特征通常表現(xiàn)為相似的物理特征，例如其肽對(duì)應(yīng)休中發(fā)現(xiàn)的在適當(dāng)空間方向中的大小、電荷或疏水性。擬肽化合物的一個(gè)特定實(shí)例是一個(gè)化合物，其一個(gè)或多個(gè)氨基酸間的酰胺鍵被碳-碳鍵或其他本領(lǐng)域已知的鍵所取代(可見(jiàn)，例如Sawyer,inPeptideBasedDrugDesignpp.378-422(ACS,WashingtonD.C.1995))。因此，名詞本發(fā)明范圍內(nèi)的"氨基酸"使用了其最廣泛的涵義，且其意包括天然的L.a-氨基酸或殘基。在此使用常用的天然氨基酸的一個(gè)和三個(gè)字母簡(jiǎn)寫(Lehninger,A.L.，Biochemistry,2ded"pp.71-92，(1975),WorthPublishers,NewYork)。標(biāo)準(zhǔn)單字母編碼和標(biāo)準(zhǔn)三字母編碼之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系足本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，在此復(fù)述如下A=Ala;C=Cys;D=Asp;E-Glu;FPhe;OGly;HHis;I=Ile;K=Lys;L=Leu;IVHVTet;N=Asn;P=Pro;Q=Gln;R=Arg;S=Ser;T=Thr,V=Val;W=Trp;Y=Tyr。該術(shù)語(yǔ)包括D-氨基酸以及化學(xué)修飾的氮基酸例如氨基酸類似物、那些通常不包含在蛋白質(zhì)中的天然氨基酸(如己氨酸)和具有本領(lǐng)域內(nèi)已知的氨基酸特征的化學(xué)合成化合物。例如，苯基丙氨酸或肺氨酸的類似物或者校擬物，其具有與自然Phe或Pra相同的肽化合物構(gòu)象限制性，它們包括在氨基酸的定義之內(nèi)。這樣的類似物和模擬物在此稱為氨基酸的"功能等同物"。氨基酸的其他實(shí)例可見(jiàn)RobertsandVellaccioThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology,GrossandMeiehofer，eds.，Vol.5p.341，AcademicPress,Inc.,N.Y.1983，-凡:通過(guò)引用的方式納入本文。在木發(fā)明文中使用的肽穩(wěn)定劑可與生物活性肽"偶聯(lián)"。名詞"偶聯(lián)"使用其最廣泛的意思以包括本領(lǐng)域內(nèi)已知的所有附宥和連接方法。例如，肽穩(wěn)定劑可以是生物活性肽C-或N-末端的氨基酸延長(zhǎng)。另外，可以在與生物活性肽和肽穩(wěn)定劑之間有短的氨基酸連接序列。在這種情況下，肽穩(wěn)定劑、任選的連接子和生物活性肽通過(guò)核酸編碼，該核酸包含編碼生物活性肽的序列和編碼肽穩(wěn)定劑的序列，所述的編碼生物活性肽的序列可操作地連接于任選的編碼短多聚肽的連接子序列(意思是該核酸序列是連續(xù)的且在閱讀框架內(nèi))。在這一典型情況下，認(rèn)為肽穩(wěn)定劑任選地通過(guò)一個(gè)連接序列與生物活性肽"偶聯(lián)"。根據(jù)木發(fā)明，只耍該肽穩(wěn)定劑^C基酸序列的插入不千擾生物活性肽的功能，該肽穩(wěn)定劑氨基酸序列就可以打斷或替換生物活性肽氨基酸序列的一部分。任選地，木發(fā)明提供了一種"偶聯(lián)物"，其由核酸編碼，該核酸包括編碼生物活性肽的序列，所i&序列編碼生物活性肽的序列被編碼肽穩(wěn)定劑的序列打斷并可操作地連接至編碼狄穩(wěn)定劑的序列。木發(fā)明進(jìn)一步提供了雜合分子，其中肽通過(guò)任選的連接子序列化學(xué)偶聯(lián)到生物活性肽或者其他治療性化合物。通常，肽穩(wěn)定劑可以通過(guò)氨基酸側(cè)鏈(在生物活性肽中間的某些不干擾生物活性肽活性的位置)連接到生物活性肽上。此時(shí)再次認(rèn)為該肽"偶聯(lián)"到生物活性肽上。"蛋白酶消除半程時(shí)間/半衰期"根據(jù)GoodmanandGillman'sThePharmaceuticalBasisofTherapeutics21-25(AlfredGoodmanGilman，LouisS.Goodman,andAlfredGilman，eds.，6thed.1980)的描述來(lái)使用。簡(jiǎn)耍地說(shuō)，該名詞意指包括藥物被蛋白水解活性消除的吋程的定量測(cè)定。l到為藥物濃度經(jīng)常不接近消除過(guò)程滿足所需耍的濃度，所以大多數(shù)藥物的消除是指數(shù)式的(即符合一階動(dòng)力學(xué))。指數(shù)過(guò)程的比率可以用其比率常數(shù)K表示，其表示了毎單位吋間的微量變化，或者用其半衰期tl/2，表示，其是該過(guò)程完成50%所需的時(shí)間。這兩個(gè)系數(shù)的單位分別是時(shí)間"和時(shí)間。反應(yīng)的一階比率常數(shù)和半袞期是簡(jiǎn)單相關(guān)的(k.timeSt1/2=0.693)并且町以做相應(yīng)的互換。因?yàn)橐浑A消除動(dòng)力學(xué)顯示了每單位時(shí)間內(nèi)喪失固定量的藥物，藥物濃度的對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間的圖在起始分布期之后(即，藥物吸收和分布完成后)的所有時(shí)間內(nèi)都是線性的。蛋白鵬或狄酶活性的藥物消除半衰期可以從這樣的閣形中準(zhǔn)確地確定。木發(fā)明描繪了通過(guò)對(duì)休外產(chǎn)生的文庫(kù)同時(shí)篩選具生物活性和穩(wěn)定性的肽，從而在肽藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域內(nèi)產(chǎn)生的顯著進(jìn)步。合成編碼大量肽的體外產(chǎn)生的核酸文庫(kù)，并在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定蛋白酶或肽酶存在下篩選其對(duì)耙標(biāo)的結(jié)合。不能結(jié)合靶標(biāo)，或更笟耍的，不能在預(yù)定蛋白酶或肽酶存在T結(jié)合靶標(biāo)的文庫(kù)成員通過(guò)洗脫或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法去除。編碼肽穩(wěn)定劑部分和生物活性肽部分的文庫(kù)成員會(huì)保持對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。這些編碼肽穩(wěn)定劑和生物活性肽文痄成員并結(jié)合靶標(biāo)的雜合分子其后被回收，并通過(guò)相關(guān)核酸的測(cè)序、所編碼的雜合分子的表達(dá)或合成分別對(duì)其進(jìn)行表征，以確認(rèn)肽穩(wěn)定劑部分上的生物活性狄粑標(biāo)的結(jié)合和預(yù)定蛋白酶或肽酶的抗性。任選地，本發(fā)明提供了雜合分子，其驚人地效果在于仍具有一個(gè)或多個(gè)預(yù)定蛋白酶或肽酶的已知裂解位點(diǎn)，但通過(guò)肽穩(wěn)定劑部分可以保持對(duì)該蛋白酶或肽酶裂解的抗性。根據(jù)本發(fā)明，編碼多個(gè)肽以及一種獨(dú)立的生物活性肽的體外產(chǎn)生的核酸文庫(kù)是以這樣的方式合成的，即使得生物活性肽的蛋白酶裂解可以打斷編碼核酸和生物活性肽以及文庫(kù)肽之間的連接。該文庫(kù)在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定蛋白酶或肽酶存在下用來(lái)篩選對(duì)生物活性肽靶標(biāo)的結(jié)合。不能結(jié)合靶標(biāo)的文庫(kù)成員，或更寬耍的，在預(yù)定蛋白酶或肽酶存在F不能保護(hù)生物活性肽以免降解的文庫(kù)成員通過(guò)洗脫或其他木領(lǐng)域技術(shù)人員已知的力'法去除。這些編碼肽穩(wěn)定劑和生物活性肽文庫(kù)成員的靶標(biāo)結(jié)合雜合分子其后被冋收，并通過(guò)對(duì)相關(guān)核酸的測(cè)序、所編碼的雜合分子的農(nóng)達(dá)或合成來(lái)對(duì)幾分別進(jìn)行表征，以確認(rèn)肽穩(wěn)定劑部分上的生物活性肽靶標(biāo)的結(jié)合和預(yù)定蛋白酶成肽酶的抗性。根據(jù)本發(fā)明，分離符到的肽穩(wěn)定劑部分預(yù)訃可以保護(hù)其他未在篩選中使片j的生物活性肽。任選地，根據(jù)本發(fā)明分離招到的肽穩(wěn)定劑部分預(yù)計(jì)可以保護(hù)此或其他生物活性肽對(duì)抗沒(méi)打在篩選中使用的欣酶和蛋白酶，如同實(shí)施例1中描述的凝血酶抗性肽穩(wěn)定劑部分另外具冇抗)1^蛋白酶的能力。實(shí)施例1屮描述的肽穩(wěn)定劑部分在阻i匕生物、sn肽的蛋白水解降解方面有用。通過(guò)實(shí)施例的方法，木發(fā)明的肽穩(wěn)定劑邰分可以與生物活性肽副甲狀腺鉍素相連從而產(chǎn)牛木發(fā)明的具有提高了的蛋白酶抗性的雜合分于。這樣的雜合分于用做治療骨質(zhì)疏松的改進(jìn)藥物化合物，這種改進(jìn)是由升"的蛋白l'魁抗件.和延長(zhǎng)的生物活性所產(chǎn)生的。任選地，根據(jù)木發(fā)叨分離的編碼肽穩(wěn)定劑部分的某些核酸庫(kù)，例如實(shí)施例1中描述的那^^，—nj以用于阻lh生物活性肽的蛋白水解降解。通過(guò)實(shí)施例的方法，從實(shí)施例1中描述的笫4或笫5輪篩選而宮柒的木發(fā)明肽穩(wěn)定劑部分的核酸庫(kù)可以與編碼仟何生物活性欣的核酸融合，從而產(chǎn)生木發(fā)明的雜合一步篩選、，得到對(duì)預(yù)定生物活性肽敁合'適的肽穩(wěn)定劑部分。^、、、木發(fā)明提供了基于己冇的生物活性欣序列的偏愛(ài)性休外核—W酸-肽文庫(kù)，這樣在該生物活性肽上的l壬何位點(diǎn)，大部分義庫(kù)將編碼生物活性肽上存在的氨基酸。使用化學(xué)DNA寡聚核苷酸合成和PCR產(chǎn)生這種文庫(kù)的許多方法是木領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員己知的，如利用三核苷酸密碼子突變(Sondek&Shortle，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3581-3585)的偏件核苷酸的應(yīng)用(biasingnucleotideusage)(Wolf&Kim，ProteinSci.8:680-688(1999))，并且這些可以用于所有的體外展示文庫(kù)方法。在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定蛋白酶或肽酶存在下，篩選文庫(kù)與生物活性肽靶標(biāo)的結(jié)合。不能結(jié)合靶標(biāo)的文庫(kù)成員，或更重要的，在預(yù)定蛋白酶或肽酶存在下不能保護(hù)生物活性肽以免降解的文庫(kù)成員通過(guò)洗脫或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法去除。這些編碼肽穩(wěn)定劑和生物活性肽文庫(kù)成員的耙標(biāo)結(jié)合雜合分子其后被回收，并通過(guò)對(duì)相關(guān)核酸的測(cè)序、編碼雜合分子的表達(dá)或合成來(lái)分別表征，以確認(rèn)肽穩(wěn)定劑部分上的生物活性肽靶標(biāo)的結(jié)合和預(yù)定蛋白酶或肽酶的抗性。根據(jù)木發(fā)明，發(fā)現(xiàn)該肽穩(wěn)定劑部分或者在生物活性部分的內(nèi)部或者與其偶聯(lián)。仆選地，兩個(gè)或更多的肽穩(wěn)定劑部分是在生物活性肽部分內(nèi)被編碼。因此，木發(fā)明提供了肽穩(wěn)定劑部分，其可以保護(hù)或增強(qiáng)生物活性部分的斗:物活性而沒(méi)有改變雜合分了-的大小，即沒(méi)有使雜合分子與原始生物活性部分的大小有所不同。從生物活性部分衍生得到的木發(fā)明的雜合分了-可以通過(guò)延K或增強(qiáng)忠者休內(nèi)的牛:物活性而用作改進(jìn)的治療劑。所述延長(zhǎng)或增強(qiáng)的生物活性來(lái)源—尸肽穩(wěn)定劑部分。仟選地，木發(fā)明提供了木文分離出的蛋白酶抗性的雜合分子，并且，該并入了肽穩(wěn)定劑部分的雜合分子邁用于口服施用。優(yōu)選地，該口服施用的雜合分子只包含大然的L-氮基酸。所述的雜合分子可仟選地通過(guò)酰胺化或羧化或者本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的其他方法在N-和c-端修飾。通過(guò)實(shí)施例的方式，也不排除其它方式，如WO-A-0215923(用于治療動(dòng)脈碩化)中描述的生物活性肽，其只包含L-氨基酸，當(dāng)其包含于木發(fā)明的雜合分子中時(shí)，將適用于口服施用。由WO-A-0215923的生物活性部分衍生符到的木發(fā)明的雜生物活性從本發(fā)^的狄穩(wěn)定劑部分衍生^到。這樣，木口發(fā)明所確:的^:分子可以用作阻止心臟疾病的藥物化合物，并且可以靜脈、肌肉注射施用，或更優(yōu)選地口服施用。也有可以使用在此描述的"肽穩(wěn)定劑"的變休。有一些變休是可行的。變體可以制各并測(cè)試其蛋白酶抗性，例如，使用如ELISA這樣的結(jié)合測(cè)試。變體的一個(gè)類型是在此描述的"肽穩(wěn)定劑"的截?cái)嘧凅w。在此實(shí)施例中，變體通過(guò)從"肽穩(wěn)定劑"的N或C端去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基來(lái)制備。在一些實(shí)例中，制備并測(cè)試了一系列此種變休。測(cè)試該系列得到的信息用于確定對(duì)蛋白酶抗性必須的"肽穩(wěn)定劑"的區(qū)域。內(nèi)部刪除或插入的系列可以相似地構(gòu)建和測(cè)試。變體的另一種類型是取代。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)"肽穩(wěn)定劑"進(jìn)行丙氨酸掃描以確定有利于穩(wěn)定活性的殘基。在另一個(gè)實(shí)施例中，構(gòu)建在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)取代的文庫(kù)。該文庫(kù)對(duì)原始?xì)埢梢允欠瞧珢?ài)性的，或如果多位點(diǎn)是變化的，則可為偏愛(ài)性的。在--^^實(shí)例中，取代局限于保守取代。變體的一個(gè)相關(guān)類型是"肽穩(wěn)定劑"，其包括一個(gè)或多個(gè)非天然的氨基酸。這樣的變體配體可以通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生。一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)可以用非天然的氨基酸取代。在一些實(shí)例中，取代的氨基酸可以與原始夭然殘基化學(xué)相關(guān)(例如，脂肪族、帶電的、堿性、酸性、芳香的、親水的)成足原始?xì)埢碾娮拥扰盼?。也可以包括非肽連接和-K:他化學(xué)修飾。例如，"肽穩(wěn)定劑"的部分或全部町以合成為肽稅擬物，例如類肽(町見(jiàn)，例如Simonetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9367-71andHorwell(1995)TrendsBiotechnol.13:132-4)。肽可以包括一個(gè)或多個(gè)(例如全部)不可水解鍵。許多不町水解肽鍵，以及合成含這些鍵的肽的工藝是木領(lǐng)域已知的。示例性的不可水解鍵包括—[CH.sub.2NH]—還原氨ffi欣鍵，—[COCH2]—S亞甲基肽鍵(ketomethylenepeptidebond)，—[CH(CN)NH]—(氰亞甲基)每(基肽鍵，—[CI-I2CH(OH)]—羥基亞乙基肽鍵，—[CH20]—肽鍵，和—[CH2S]—硫亞甲基肽鍵(可見(jiàn)例如，U.S.PatNo.6,172,043)。實(shí)施例本申請(qǐng)使用的以下工藝在Sambrook，J.，etal.，1989supra.:analysisofrestrictionenzymedigestionproductsonagarosegelsandpreparationofphosphatebufferedsaline中有描述。通用試劑購(gòu)自SIGMA-AldrichLtd(Poole，Dorset,U.K.)。寡聚核苷酸來(lái)自EurogentecLtd(Southampton,U.K.)。試基酸，和S30提取物來(lái)自PromegaLtd(Southampton,Hampshire,U.K.)。蛋白酶購(gòu)自SIGMA-AldrichLtd(Poole，Dorset,U.K.)或Novagen(Nottingham,UK)。Vent和T叫DNA聚合酶來(lái)白NewEnglandBiolabs(Cambridgeshire,U.K.)。抗人IgK抗休來(lái)自ImmunologicalsDirectLtd(Oxfordshire,U.K.)以及M2抗-FLAG多克隆抗體來(lái)自SIGMA-AldrichLtd(Poole，Dorset,U.K.)。實(shí)施例l.鑒定抵御凝血酶和胰蛋白酶裂解的肽穩(wěn)定劑為例證本發(fā)明，凝血酶蛋白酶抗性肽選自N-末端cis展示文庫(kù)，其通常與RepA融合，并且在tac啟動(dòng)子調(diào)控下，構(gòu)建后包括a.能夠結(jié)合抗-FLAG抗體(生物活性肽1)的FLAG肽部分，和b.12氨基酸的隨機(jī)文庫(kù)，用艽篩選具有凝血酶抗性的肽穩(wěn)定劑部分，和c.能夠被凝血酶蛋白酶(生物活性肽2)裂解的4氨基酸的部分。如圖1所示，文庫(kù)構(gòu)建以及體外轉(zhuǎn)錄和翻譯根據(jù)Odegrip等(Proc.Natl.Acad.SciUSA1012806-2810(2004)的描述進(jìn)行。tac畫(huà)FLAG畫(huà)NNB畫(huà)凝血酶裂解位點(diǎn)-R印A-CIS-oriPCR構(gòu)建體的制備通過(guò)PCR使用引物TRL(SEQIDNO:001)附加FLAG表位和12-mer的NNB文庫(kù)(其中N是核苷，B是C、T或G中一種)及其后連接的一個(gè)凝巾l.嗨裂解序列(編碼GPRS,其屮"R"=P1)到tac啟動(dòng)子后，然后將其連接到RepA-CIS-ori區(qū)域l二，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。休外轉(zhuǎn)求和翻譯在大腸桿齒S-30溶茵液系統(tǒng)(30)中于30。C進(jìn)行30分鐘，H:后使片j封閉緩沖液(含2。/。BSA，0.1mg/ml昔魚(yú)精子DNA的PBS)稀釋。典型地，似50^1溶說(shuō)'液屮添加2嗎線性DNA。加入生物素化的抗-FLAG(M2)(SIGMA)抗休，使其顯終濃度為1單位/ml。加入人凝血酶(SIGMA)抗休，使其最終濃度為0.1牟-位/ml。溶液在篩選步驟的1、2和3輪中于25'C溫育2小時(shí)，在4和5輪屮于37。C溫育2小時(shí)。向溶液中以溶液濃度50jxl/ml添加鏈酶糸和素包裹的DynalM280順磁珠，在室溫下溫育10分鐘，再用PBS/0.1。/。Tween-20盡力洗滌。根據(jù)以卜.描述，洗脫、純化DNA，擴(kuò)增N-末端文庫(kù)區(qū)并與RepA-CIS-ori組裝在一起，為下一步篩選產(chǎn)牛輸入DNA(inputDNA)。為使篩選發(fā)抨作用，生物活性肽的凝血酶底物序列必須用隨機(jī)文庫(kù)區(qū)編碼的肽穩(wěn)定劑保護(hù)以免裂解。從第五輪篩選回收的DNA使/UPCR來(lái)擴(kuò)增，純化并使用Notl和Ncol來(lái)消化。DNA再連接到相似消化的M13gpIII噬—齒休粒載休匕并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1藍(lán)細(xì)胞內(nèi)，涂布到2%瓊脂糖，2xTY，lOOpg/ml氨芐窗霉素的平板上。單個(gè)菌落生長(zhǎng)生產(chǎn)前述的噬菌體顆粒(OdegripetalProc.Natl.Acad.SciUSA1012806-2810(2004))。NUNCMaxisorp平板使用100ng/孔的抗-FLAGM2抗體的PBS在4°C包裹過(guò)夜。使用結(jié)合的噬菌體在含2%88八的？88和+/-人凝血酶(0.1單位/ml)中溫育1小時(shí)來(lái)做ELISA測(cè)試。測(cè)試是通過(guò)使用SureBlueTMB過(guò)氧化酶底物(InsightBiotechnology,Middlesex,UK)進(jìn)行顯色，在450nm處讀取數(shù)值。在五輪篩選后，發(fā)現(xiàn)了對(duì)凝血酶的抗性范闈(閣2)，其中，所有的第五輪篩選到的肽比對(duì)照FLAG發(fā)位-凝f&l酶底物序列DYKDDDRSGGSGLGPRSG(SEQIDNO:002)具有更高的抗性，該底物序列在凝血酶中溫育1小時(shí)沒(méi)有抗-FLAG結(jié)合。序列分析顯示幾、f所冇的肽(70%)保留/凝ffH酶裂解位點(diǎn)(SEQIDNO:003-SEQIDNO:027)，說(shuō)明文庫(kù)成員肽保護(hù)了凝血酶底物肽免丁-裂解。為研究對(duì):it.它蛋白酶的抗性，從未篩選文庫(kù)或.H輪凝『fn.酶抗性篩選后文庫(kù)中來(lái)源的94個(gè)克降與脅蛋白酶-諒脂糖一問(wèn)在25'C溫臺(tái)'2小吋，—ft使用針對(duì)抗-FLAG抗休(該抗休足j說(shuō)蛋白悔敏感的，閃此耍分開(kāi)溫臺(tái)')的ELISA分析。胰蛋白酶在R或K后裂解，這樣在FLAG表位和凝lffl.嗨底物序列上確定有2個(gè)敗'蛋白酶位點(diǎn)。由于未對(duì)腕蛋白酶抗性進(jìn)行篩選，而且FLAG表位易于被胰蛋白酶裂解，所以即使是對(duì)胰蛋白酶的部分抗性也足驚人的。這樣的抗性在凝血酶抗性的第五輪篩選中可見(jiàn)，伹在未篩選文庫(kù)的肽中沒(méi)有(圖3)。驚人的是，特定的肽穩(wěn)定劑組分能夠保護(hù)生物活性肽免于其它蛋白酶(incidentalprotease)的裂解(見(jiàn)農(nóng)l)。實(shí)施例2.顯示對(duì)抵御胰凝乳蛋白酶裂解的肽穩(wěn)定劑的富粲為進(jìn)--步例證本發(fā)明，蛋白酶抗性肽選自混合長(zhǎng)度的N-末端cis展示文庫(kù)，其通常與RepA融合，并且在tac后動(dòng)子調(diào)控下，構(gòu)建后包括a.能夠結(jié)合抗-FLAG抗體(生物活性肽1)的FLAG肽部分，和b.包含12、9和6氨甚酸的混合文庫(kù)，用其篩選蛋白酶抗性肽穩(wěn)定劑部分，和c.能夠被一些蛋白酶，包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(生物活性肽2)所裂解的9氨-某酸的部分，見(jiàn)閣4。文庫(kù)構(gòu)建以及體外轉(zhuǎn)錄和翻譯根據(jù)Odegrip等(Proc.NatI.Acad.SciUSA1012806-2810(2004)的描述進(jìn)行。tac-FLAG-NNB-蛋白酶裂解位點(diǎn)國(guó)RepA畫(huà)CIS-oriPCR構(gòu)建體的制備通過(guò)PCR使用引物309、310或311(SEQIDNOS:034-036)附加FLAG表位和12-mer、9-mer或6-mer的NNB文庫(kù)(其中N是核苷，B是C、T或G屮一種)及其后連接的一個(gè)蛋白酶裂解序列(編碼FSGPRTLTY，其中對(duì)于胰蛋白酶和凝血酶"R"=P1，對(duì)于胰凝乳蛋白酶"Y"=P1)到tac啟動(dòng)子后，然后將毎—個(gè)連接到RepA-CIS-ori區(qū)域上，再使用PCR擴(kuò)增。混合毎種構(gòu)建體的等骨產(chǎn)物以產(chǎn)生在蛋白酶抗性肽穩(wěn)定劑部分內(nèi)編碼12、9或6個(gè)氮基酸的文庫(kù)。如實(shí)施例1那樣進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，并使用封閉緩沖液(含2%BSA和O.lmg/ml青魚(yú)精子DNA的PBS)以1:10稀釋，再加入十分之一休積的10x凝rf(L酶消化緩沖液(200mMTris-HClpH8.4，1.5MNaCl,25mMCaC12)。第'輪篩選在150pJS-30溶菌液中表達(dá)9fig線性DNA，同時(shí)在后續(xù)輪次中使用5嗎DNA和100pil溶齒液。通過(guò)添加腕凝乳蛋白嗨和胰蛋白酶進(jìn)行蛋白嗨消化，每種蛋白嗨已經(jīng)同化在瓊脂糖珠(SIGMA)中，H:后倒背混合，并在室溫下溫臺(tái)'2小吋。在笫一輪中，使用0.8個(gè)單位的脫凝乳蛋白酶和l.O個(gè)單位的胰飯白酶，而在笫二、三和四輪中分別使用0.4和0.5個(gè),，0.6和0.75個(gè)單位，以及0.8和1.0個(gè)單位。通過(guò)離心去除蛋白酶，上淸使用在實(shí)施例1中描述的生物素化的抗FLAG(M2)(SIGMA)抗休和抗生蛋白鏈菌素包^的DynalM280順磁珠進(jìn)行篩選。這些篩選中不考慮凝血酶消化。如實(shí)施例1中描述的，對(duì)DNA洗脫、純化和組裝用亍其后輪次的篩選。1-4輪之后產(chǎn)生的節(jié)量的文庫(kù)DNA在農(nóng)達(dá)和蛋&酶消化之后，對(duì)Jt蛋白酶抗性產(chǎn)物的恢復(fù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示了蛋白酶抗性肽穩(wěn)定劑部分的篩選和富集。l-4輪篩選后產(chǎn)生的等量(3.2嗎)文庫(kù)DNA在100jil溶茼液中表達(dá)并如上所述稀釋。毎一種文庫(kù)分為相等的兩部分，每部分中添加0.4個(gè)單位的胰凝乳蛋白酶和0.5個(gè)單位的膠蛋白酶-瓊脂糖。溫胄后，去除蛋白酶，使用如上所述的生物素化的抗FLAG(M2)(SIGMA)抗休和抗生蛋白鏈菌素包裹的DynalM280順磁珠篩選受保護(hù)的肽，PCR回收的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖5)。在無(wú)蛋白酶消化的情況下，從1-4輪中的DNA中產(chǎn)生了大約等雖的產(chǎn)物，說(shuō)明由此材料而來(lái)的農(nóng)達(dá)、篩選和回收沒(méi)有差異。有蛋白酶消化時(shí)，第一輪產(chǎn)生了相對(duì)不存在時(shí)而言很少的產(chǎn)物。然而，在隨后的輪次中這一差異不那么顯著，第四輪材料產(chǎn)生的產(chǎn)物在有或無(wú)蛋白酶降解時(shí)都大約相等。這證明了文庫(kù)中能夠穩(wěn)定生物活性肽蛋白酶抗性的物質(zhì)的富集。盡管在此詳細(xì)的公開(kāi)了木發(fā)明的特定實(shí)施例，但其只是通過(guò)實(shí)施例的方法完成并僅用于說(shuō)明木發(fā)明。上述實(shí)施例對(duì)后而所附權(quán)利要求的范閨并不構(gòu)成限制。發(fā)明人指出，在不背離本發(fā)明的精祌以及權(quán)利耍求書(shū)利'所限定的本發(fā)明的范闈的前提下，町對(duì)木發(fā)明進(jìn)行多種俜代，改造和修飾。表1-肽穩(wěn)定劑序列<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>權(quán)利要求1.體外鑒定肽穩(wěn)定劑化合物的方法，其包括如下步驟a)表達(dá)大量的核酸構(gòu)建體，其中每個(gè)核酸構(gòu)建體編碼雜合肽，該雜合肽包括i)生物活性部分；和ii)假定的肽穩(wěn)定劑部分；b)使表達(dá)的雜合肽暴露于一種或多種蛋白酶；c)使表達(dá)的雜合肽暴露于靶分子，該靶分子能夠以可檢測(cè)的方式與生物活性部分相互作用；和d)如果靶分子和一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的雜合分子的生物活性部分之間發(fā)生可檢測(cè)的相互作用，確定所述的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的雜合肽包含肽穩(wěn)定劑化合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)--步包括將一個(gè)或多個(gè)步驟(d)中表達(dá)的雜合肽與相應(yīng)的核酸構(gòu)建體相關(guān)聯(lián)，從而確定該肽穩(wěn)定劑化合物的核酸序列。3.根據(jù)權(quán)利耍求1或2所述的方法，其中步驟(b)和(c)以先(c)后(b)的順序進(jìn)行，或者同時(shí)進(jìn)行。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中的肽穩(wěn)定劑部分包括長(zhǎng)度在2到20個(gè)殘基之間的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利耍求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中的肽穩(wěn)定劑部分被包含在生物活性部分之內(nèi)。6.根據(jù)權(quán)利要求l-5中任--項(xiàng)所述的方法，其中的生物活性部分包括以下構(gòu)成的組中的一個(gè)或多個(gè)酶、激素、細(xì)胞因子、抗體、抗體片段、鎮(zhèn)痛劑、解熱劑、抗炎劑、抗生素、抗病毒劑、抗真菌藥物、心血管藥物、影響腎臟功能和電解質(zhì)代謝的藥物、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物和化療藥物。7.由權(quán)利要求l-6任意一項(xiàng)的方法鑒定的肽穩(wěn)定劑化合物。8.肽穩(wěn)定劑化合物，其選自如下構(gòu)成的組HYPPPSTPYTTD(SEQIDNO:003)，PTPTNPPQSAAD(SEQIDNO:004)，ESPRPPARPPND(SEQIDNO:005)，NHPTTNDGPSVK(SEQIDNO:006)，PNRNFQQNTNHN(SEQIDNO:007)，PATNPHTNSNAN(SEQIDNO:008)，HNVNPNQPHNDT(SEQIDNO:009)，VPTSTYAITDPT(SEQIDNO:010)，PTMTRPSNTEAE(SEQIDNO:011)，PTPSHSTHRDPE(SEQIDNO:012)，HPHHPSNQAPTD(SEQIDNO:013)，AAPDETTTPNRD(SEQIDNO:014)，VNFAATSSNDRD(SEQIDNO:015)，HDGRPPQHHHPH(SEQIDNO:016)，MTMGTRPTRDTH(SEQIDNO:017)，VNKQTTASQAHH(SEQIDNO:018)，TNFSKDEQPTPD(SEQIDNO:019)，GRPATAPCTHGN(SEQIDNO:020)，DRSRASTRRDRH(SEQIDNO:021)，SRHRTNAGETDH(SEQIDNO:022)，ATGPIPHTPQGS(SEQIDNO:023)，TDPPANDNAQPH(SEQIDNO:024)，RFVSD麗TAAD(SEQIDNO:025),QPHNHPRPTKQH(SEQIDNO:026)，ITPPDNSHTPDE(SEQIDNO:027)，HGHSPSDNANTR(SEQIDNO:028)，HCVHEPQTKHES(SEQIDNO:029)，PSCPNKQDPTHD(SEQIDNO:030),TDCSHNPTDPCE(SEQIDNO:031)，RAGELGAPADPD(SEQIDNO:032)，和QKPNHDTERELD(SEQIDNO:033)。9.生物活性肽，其包括生物活性部分和肽穩(wěn)定劑化合物，該肽穩(wěn)定劑化合物選自權(quán)利要求7或8中任一項(xiàng)所列的肽穩(wěn)定劑化合物中的一種或多種。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物活性肽，其中的生物活性部分選向如下構(gòu)成的組酶、激素、細(xì)胞因子、抗體、抗體片段、鎮(zhèn)癇劑、解熱劑、抗炎劑、抗生素、抗病毒劑、抗真菌藥物、心血管藥物、影響腎臟功能和電解質(zhì)代謝的藥物、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物和化療藥物。11.藥物組合物，其包括至少一種權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)的方法所鑒定的肽穩(wěn)定劑化合物、生物活性分子和合適的載體。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其屮的肽穩(wěn)定劑化合物選自如下構(gòu)成的組HYPPPSTPYTTD(SEQIDNO:003)，PTPTNPPQSAAD(SEQIDNO:004)，ESPRPPARPPND(SEQIDNO:005)，NHPTTNDGPSVK(SEQIDNO:006)，PNRNFQQNTNHN(SEQIDNO:007)，PATNPHTNSNAN(SEQIDNO:008)，HNVNPNQPHNDT(SEQIDNO:009)，VPTSTYAITDPT(SEQIDNO:010)，PTMTRPSNTEAE(SEQIDNO:011)，PTPSHSTHRDPE(SEQIDNO:012)，HPHHPSNQAPTD(SEQIDNO:013)，AAPDETTTPNRD(SEQIDNO:014)，VNFAATSSNDRD(SEQIDNO:015)，HDGRPPQHHHPH(SEQIDNO:016)，MTMGTRPTRDTH(SEQIDNO:017)，VNKQTTASQAHH(SEQIDNO:018)，TNFSKDEQPTPD(SEQIDNO:019),GRPATAPCTHGN(SEQIDNO:020)，DRSRASTRRDRH(SEQIDNO:021)，SRHRTNAGETDH(SEQIDNO:022)，ATGPIPHTPQGS(SEQIDNO:023),TDPPANDNAQPH(SEQIDNO:024)，RFVSDHNITAAD(SEQIDNO:025)，QPHNHPRPIKQH(SEQIDNO:026)，ITPPDNSHTPDE(SEQIDNO:027)，HGHSPSDNANTR(SEQIDNO:028)，HCVHEPQTKHES(SEQIDNO:029)，PSCPNKQDPTHD(SEQIDNO:030)，TDCSHNPTDPCE(SEQIDNO:031)，RAGELGAPADPD(SEQIDNO:032)，和QKPNHDTERELD(SEQIDNO:033)。13.根據(jù)權(quán)利耍求11或12中任一項(xiàng)所述的藥物組_合物，其中的生物活性分子選自如下構(gòu)成的組酶、激素、細(xì)胞因子、抗體、抗休片段、鎮(zhèn)痛劑、解熱劑、抗炎劑、抗生素、抗病毒劑、抗攻:茵藥物、心血管藥物、影響腎臟功能和電解質(zhì)代謝的藥物、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物和化療藥物。14.根據(jù)權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中的肽穩(wěn)定劑連接到生物活性分子上。15.根據(jù)權(quán)利要求ii-n任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中的肽穩(wěn)定劑被包含在生物活性分子內(nèi)。16.根據(jù)權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中的組合物適于口服施用。17.賦予生物活性肽分子蛋白水解抗性的方法，其包括將權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法所鑒定的肽穩(wěn)定劑化合物連接到生物活性肽分子上。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中的肽穩(wěn)定劑化合物偶聯(lián)到生物活性分子上。19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中的肽穩(wěn)定劑化合物與生物活性分子為遺傳學(xué)上的融合。全文摘要本發(fā)明提供了肽穩(wěn)定劑化合物，該化合物與生物活性肽的聯(lián)合能夠提高生物活性肽在體內(nèi)的蛋白酶消除半衰期。該肽穩(wěn)定劑化合物優(yōu)選地是肽序列的形式，其賦予所偶聯(lián)的生物活性肽蛋白水解抗性。本發(fā)明也提供了從體外產(chǎn)生的文庫(kù)中篩選全新蛋白水解抗性化合物的方法，以及包括以此鑒定的穩(wěn)定劑化合物的藥物組合物。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101163799SQ200680012072公開(kāi)日2008年4月16日申請(qǐng)日期2006年3月16日優(yōu)先權(quán)日2005年3月16日發(fā)明者凱文·菲茨杰拉德,威廉·埃爾德里奇,尼爾·庫(kù)利,鄧肯·麥格雷戈申請(qǐng)人:伊索杰尼卡有限公司