專利名稱：脈絡叢制品及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基領域和在體外或離體培養(yǎng)細胞的方法。本發(fā)明應用于細胞培養(yǎng)和組織移植領域。

背景技術：
為了成功地在體外或離體培養(yǎng)細胞，細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基必須包括能支持細胞生長和增殖所需的所有營養(yǎng)，包括糖、氨基酸、維生素、鹽，和在某些情況下的痕量金屬離子、嘌呤及嘧啶。這些培養(yǎng)基也通常補充有動物血清。
血清通常源自胎牛、初生小牛或馬，并被以0.5至20％v/v的濃度加入到細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。血清除了提供促進生長的組分外，還對不穩(wěn)定的或水不溶性的分子以及毒素中和劑、蛋白酶抑制劑、細胞粘附促進劑起載體/緩沖液/螯合劑的作用，并且作為攪拌的混懸液培養(yǎng)物的保護劑。
然而，血清在細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的用途具有幾個缺點。其相對較昂貴，其組分不確定，不同批次的血清可能在存在的化合物的濃度方面不同，因此導致不可預見的培養(yǎng)物生長和生產力。血清也可以是污染比如支原體、噬菌體、病毒和毒素的來源。另外，血清中的蛋白質可使細胞產物從細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的純化復雜化。
在努力克服包含血清的培養(yǎng)基的缺點方面，已經研究了不含血清的培養(yǎng)基，其中血清被較好規(guī)定的或更特征化的組分代替。由于血清的復雜性和不同類型的細胞生長所需條件不同，這導致多種不同的培養(yǎng)基組合物。在大多數這樣的不含血清的培養(yǎng)基中，血清被微量元素、脂質、激素、生長因子以及純化的蛋白質的“混合物(cocktails)”代替。不幸地是，這樣的純化的蛋白質，比如人血清白蛋白，具有許多血清的缺點。例如，人血清白蛋白很昂貴和定期缺乏，不同的來源可能在化合物存在的濃度方面不同，因此，導致不可預見的培養(yǎng)物生長和生產力。血清白蛋白也可能是未知污染包括病毒的來源。血清和血清白蛋白也是未明確的分化因子的主要來源，其防止了培養(yǎng)物中特定的細胞類型的受控生長和分化。
已經研究了“飼養(yǎng)細胞”在某些細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的用途，通過釋放(或吸收)組分進入(或來自)其來增強培養(yǎng)基。這樣的“飼養(yǎng)細胞”通常由粘附生長抑制(adherent growth arrested)但有活力的和生物活性的細胞組成，其用作基質，其他細胞在其上進行共培養(yǎng)系統(tǒng)生長。條件培養(yǎng)基(或不含細胞的培養(yǎng)基的上清液)也可用于補充標準細胞培養(yǎng)基，因為其包含許多(不明確的)介質物質(包括細胞因子和生長因子)，所述介質物質為之前在其中培養(yǎng)的細胞釋放進入其中的。
血清和不含血清白蛋白的培養(yǎng)基主要對特定的細胞類型有效，比如干細胞。飼養(yǎng)細胞和條件培養(yǎng)基也靶向于需要復雜營養(yǎng)的(fastidious)細胞和細胞系，比如胚胎干細胞。
預期提供一種細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其用于較短期和延長的時期的支持在培養(yǎng)基中生長的多種細胞類型的生長和功能，所述細胞類型包括離體和體外生長的細胞和組織。本發(fā)明的一個目的是意在實現該迫切需要和/或提供給公眾有用的選擇。


發(fā)明內容
本發(fā)明涉及脈絡叢(CP)細胞和/或CP條件培養(yǎng)基用于增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中生長、存活和/或保持其功能的用途。
已知CP條件培養(yǎng)基用于提高體外SKs(成神經細胞瘤)細胞的生長率和增加體外中腦細胞攝取多巴胺的速率(WO00/66188)。然而，將這樣的CP條件培養(yǎng)基用作“一般的”細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其是否能增加在長期或短期培養(yǎng)中多種非CP細胞的生長、存活和/或保持其功能是未知的。
而且，因為CP細胞不一定在培養(yǎng)物的片或層中生長，CP細胞是否可以與非CP細胞共同培養(yǎng)以充當“飼養(yǎng)”細胞群來增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中的生長、存活和/或保持其功能是未知的。
本發(fā)明人出人意外地發(fā)現CP制品，包括CP細胞或CP條件培養(yǎng)基，對增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中的生長、存活和/或保持其功能有用。
也出人意外地發(fā)現CP細胞或CP條件培養(yǎng)基對于保護培養(yǎng)物中的非CP細胞免于撤除血清誘導的細胞死亡有用。
根據本發(fā)明，提供CP細胞和/或CP條件培養(yǎng)基在制備用于增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中的生長、存活率和/或保持其功能的CP制品中的用途，其中所述CP制品包括 a)CP細胞群，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子。
所述非CP細胞可以是神經元細胞或非神經元細胞，選自包括原發(fā)皮層神經元細胞(primary corticoid neuronal cells)、胰島β細胞、能夠生成或分泌因子VIII的細胞、能夠生成因子VIII和和血管假性血友病因子的細胞、心肌細胞、心臟傳導系統(tǒng)的細胞比如竇房結、房室的節(jié)細胞和房室束，及參與修復新生兒畸形的細胞的群體。
優(yōu)選地，在移植進入接受者之前，短期培養(yǎng)所述非CP細胞。例如，在植入治療糖尿病中的接受者之前，可以根據本發(fā)明培養(yǎng)胰島β細胞。
所述非CP細胞可包括從不同種類的細胞獲得的細胞，并用于CP制品的。因此，本發(fā)明可能對增加在異種移植中使用的非CP細胞的生長和存活有用。
在用本發(fā)明的CP制品培養(yǎng)之前，所述非CP細胞可以是休眠狀態(tài)，比如冷凍干燥的或冷凍的。
一個或多個能支持非CP細胞存活和生長的因子可包括神經營養(yǎng)因子、生長因子、營養(yǎng)因子、細胞因子、促細胞分裂劑、基質細胞支持因子、能降解有毒蛋白質沉淀的蛋白酶類(比如淀粉狀蛋白和huntingtin)，及能絡合有毒金屬離子的蛋白質(比如轉鐵蛋白和血漿銅藍蛋白)。
所述a)和/或b)的CP細胞可包括純化的CP細胞群，或者它們還可以或可選地包括CP衍生的細胞，選自包括神經膠質或神經膠質衍生細胞、上皮細胞、多能神經元前體細胞、祖細胞、和對神經元前體細胞標記物為陽性的細胞(比如neu-N)的群組。
所述CP細胞可以直接從適宜的哺乳動物供體獲得或可以從第一代或第二代CP細胞培養(yǎng)物或從包括永生的CP細胞系的CP細胞系或從任意上述來源的組合獲得。在培養(yǎng)物中的所述CP細胞可以被遺傳修飾。所述從供體直接獲得的CP細胞可包括包含一種或多種CP細胞的腦脊液。
所述CP和/或非CP細胞可包括分離細胞或細胞培養(yǎng)物，并可以是“裸露的”或包封的(encapsulated)，例如包封在海藻酸鹽中。當所述CP和非CP細胞是“裸露的”時，它們可以“自由地”進行彼此直接接觸，或者它們可以是通過生物相容的分離工具分離，所述分離工具能使分泌的因子從CP細胞擴散到非CP細胞。所述CP和/或非CP細胞的包封可以起這樣的生物相容的分離工具的作用。
所述非CP細胞優(yōu)選地為非神經元細胞，本發(fā)明優(yōu)選地提供CP細胞和/或CP條件培養(yǎng)基在制備用于增加非神經元細胞在長期或短期培養(yǎng)中的生長、存活率和/或保持其功能的CP制品中的用途，其中所述CP制品包括 a)能產生一種或多種支持非神經元細胞存活和生長的因子的CP細胞群；和/或 b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非神經元細胞存活和生長的因子；和/或 c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非神經元細胞存活和生長的因子。
本發(fā)明進一步提供增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中的生長、存活和/或保持其功能的方法，其包括用CP制品培養(yǎng)非CP細胞的步驟，所述CP制品包括 a)CP細胞群，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子。
優(yōu)選地，所述非CP細胞為非神經元細胞。
本發(fā)明還提供保護在培養(yǎng)物中的非CP細胞免于撤除血清誘導的細胞死亡的方法，其包括將非CP細胞培養(yǎng)在不含血清而含有CP制品的培養(yǎng)基中的步驟，所述CP制品包括 a)CP細胞群，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子。
優(yōu)選地，所述非CP細胞為非神經元細胞。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的CP制品培養(yǎng)的非CP細胞。
如在本說明書和權利要求書中使用的術語“包括”指“由至少部分組成”，即當解釋包括該術語的獨立權利要求時，需要存在于各個權利要求中所有以該術語開始描述的特征，還可以存在其他特征。



現在，本發(fā)明將通過參照附圖進行更詳細地描述，其中 圖1顯示了一組于不存在脈絡叢細胞的情況下生長的胰島細胞(對照)或在與脈絡叢細胞以1∶3(1∶3)的比例共培養(yǎng)的胰島細胞的免疫過氧化酶染色的顯微照片。對于胰島素染色的細胞存在于頂行，而對于胰高血糖素染色的細胞出現在底行。這些顯微照片顯示出CP細胞制品增加了胰島中胰島素和胰高血糖素的生成。
圖2顯示了來自CP制品的條件培養(yǎng)基(CM)增加了神經元的生存力。顯示了來自培養(yǎng)的脈絡叢的不同濃度的不含血清的CM對神經元細胞生存力的影響，其中對于10％和30％與0％相比，*＝P＜0.0001，對于0％、1％和3％，**＝P＜0.0001 圖3顯示了來自培養(yǎng)的脈絡叢的條件培養(yǎng)基對在補充有胎牛血清的培養(yǎng)基(對照)、不補充的培養(yǎng)基(沒有補充)和在補充有脈絡叢條件培養(yǎng)基(CP-CM補充)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經元細胞的軸突突起(processes)數的影響，其中CP條件培養(yǎng)基增加了神經元細胞上軸突的數量。
圖4顯示了來自培養(yǎng)的脈絡叢的條件培養(yǎng)基對在補充有胎牛血清的培養(yǎng)基(對照)、不補充的培養(yǎng)基(沒有補充)和在補充有脈絡叢條件培養(yǎng)基(CP-CM補充)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經元細胞的軸突突起向外生長的長度的影響，其中CP條件培養(yǎng)基增加了神經元細胞的軸突的長度。
圖5顯示了包封的CP細胞的共培養(yǎng)對人類臍帶血管內皮細胞(HUVEC)增殖的影響，和對VEGF分泌進入培養(yǎng)基的影響，其中包封的CP細胞和HUVEC的共培養(yǎng)導致HUVEC增殖增加。

具體實施例方式 本發(fā)明涉及CP細胞或CP條件培養(yǎng)基用于增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中的生長、存活和/或保持其功能的用途。
所述CP為分葉結構(lobulated structures)，包括源自腦室的室管膜層的單個連續(xù)層的細胞。脈絡叢的一個功能是分泌腦脊液(CSF)。腦脊液填充四個腦室，在脊髓周圍和腦的凸面上循環(huán)。CSF與腦細胞間質液(細胞外)相通，包括大分子的溶質可在CSF和細胞間質液之間自由地交換。除了CSF的生成之外，脈絡叢與CSF-血屏障的形成有關(Aleshire SL等人，“Choroid plexus as a barrier toimmunoglobulin delivery into cerebrospinal fluid.”J Neurosurg.63593-7，1985)。然而，其更寬的功能為建立和保持整個腦和脊髓的細胞外環(huán)境的基準水平，特別是通過將大量生長因子分泌進入CSF中。研究已經報道了在脈絡叢內存在大量有效的營養(yǎng)因子，包括TGFb、GDF-15、GDNF、IGF2、NGF、NT-3、NT-4、BDNF、VEGF和FGF2(參見評述Johanson CE等人，“Choroid plexus recovery after transient forebrainischemiarole of growth factors and other repair mechanisms.”Cell MoINeurobiol.20197-216，2000)。
本發(fā)明認識到脈絡叢(CP)細胞能夠分泌因子，比如神經營養(yǎng)因子、生長因子、血管內皮生長因子、營養(yǎng)因子、細胞因子、促細胞分裂劑、基質細胞支持因子、酶比如蛋白酶類、α-1抗胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶、乳糖酶或麥芽糖酶及其它可在增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中的生長、存活和保持其功能中有用的蛋白質。
特別地，本發(fā)明提供CP制品用于增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中生長、存活和保持其功能中的用途，其中所述制品包括 a)CP細胞群，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子。
所述非CP細胞可以是神經元或非神經元細胞，選自包括原發(fā)皮層神經元細胞、胰島β細胞、成纖維細胞；能生成或分泌因子VIII的細胞，比如肝細胞、膽囊上皮細胞、膽囊內皮細胞、膽管上皮細胞、膽管內皮細胞、肝臟血管上皮細胞、肝臟血管內皮細胞、血竇細胞(sinusoid cells)、非肝實質細胞和臍帶內皮細胞；能生成因子VIII和血管假性血友病因子的細胞，比如內皮細胞、肝臟內皮細胞和臍帶內皮細胞；心肌細胞；心臟傳導系統(tǒng)的細胞，比如竇房結、房室的節(jié)細胞和房室束；和參與修復新生兒畸形和遺傳性代謝缺陷的細胞，所述遺傳性代謝缺陷比如氨基酸代謝病、有機酸尿癥、遺傳性特定蛋白質不足、酶不全病包括尿素循環(huán)障礙、色素代謝障礙、嘌呤代謝障礙和多糖和粘多糖及糖蛋白代謝障礙。
在用本文定義的制品培養(yǎng)之前，所述要被培養(yǎng)的非CP細胞可以處于休眠狀態(tài)，比如冷凍干燥的或冷凍的。這樣的休眠細胞可以在適宜的條件下，在適宜的細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，比如Hams F-12、Dulbecco′s修飾的Eagles培養(yǎng)基(DME)、RPMl 1640和Iscove′s修飾的DME，所述適宜的條件取決于細胞類型，如本領域技術人員所能理解的。接著，將所述CP制品以一定量加入到在培養(yǎng)物中的非CP細胞，與沒有向其中加入CP制品的這樣的細胞相比，其將增加非CP細胞的生長、存活和/或保持其功能。
所述CP制品可包括純化的CP細胞群和/或CP衍生的細胞，選自神經膠質或神經膠質衍生細胞、上皮細胞、多能神經元前體細胞(multipotent neuronal precursor cells)、祖細胞、和對神經元前體細胞標記物為陽性的細胞(比如neu-N)。
所述CP制品的CP和CP衍生的細胞可以使用本領域已知的方法從任意供體哺乳動物獲得，所述哺乳動物包括豬、羊、母牛、山羊、兔、小鼠和靈長類，包括恒河猴和人類，所述方法例如在WO00/66188中描述的。所述CP和CP衍生的細胞可以從供體的腦或從腦脊液直接獲得。
可選地，所述CP制品的CP和CP衍生的細胞可以從CP或CP衍生的細胞系獲得，包括永生的(immortalized)細胞系，比如TR-CSFB細胞(Hosoya K，Hori S，Ohtsuki S，Terasaki T，(2004)。A new in vitromodel for blood-cerebrospinal fluid barrier transport studiesan immortalized choroid plexus epithelial cell line derived fromthe tsA58 SV40 large T-antigen gene transgenic rat.(用于血腦脊液屏障運輸的體外模型研究了源自tsA58 SV40大T-抗原基因轉基因的大鼠的永生的脈絡叢上皮細胞系)，Adv Drug Deliv Rev.56(12)1875-85)；或Z310細胞(Zheng W，Zhao Q，(2002)，Establishment and characterization of an immortalized Z2310 choroidalepithelia cell line form murine choroids plexus，Brain Res.958(2)371-80)。
可以使用本領域眾所周知的遺傳修飾技術遺傳修飾所述CP制品的CP和CP衍生的細胞，以產生一種或多種期望的因子，所述因子將增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中的存活和生長。
在本發(fā)明中使用之前，所述CP制劑可以被冷凍干燥或冷凍來儲存，如本領域技術人員所理解的。當使用時，所述冷凍的或冷凍干燥的CP制劑可以簡單地重構。
所述CP制劑可包括分離的CP和/或CP衍生的細胞或小的這樣的細胞簇，其可以是“裸露的(naked)”，即，以其在從供體或細胞培養(yǎng)收獲后的自然狀態(tài)存在，或者它們可以被通過本領域已知的方法包封在生物相容性物質比如海藻酸鹽中(參見例如WO00/66188和US6322804)。可選地，這樣的細胞無論是裸露的或包封的都可以被放入限制工具(confinement means)中，其起與培養(yǎng)物中的非CP細胞分隔CP制品的作用，比如管或其他結構，其由在培養(yǎng)物中允許生長因子等從CP制品擴散進入非CP細胞的生物相容性材料制成。
可選地，所述CP制品包括來自CP和/或CP衍生的細胞的條件培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基為從CP和/或CP衍生的細胞培養(yǎng)物制備，其中所述細胞已經在一定的條件下培養(yǎng)了一段時間，所述條件允許從CP和/或CP衍生的細胞分泌生長因子等進入培養(yǎng)基。接著，將所述條件培養(yǎng)基與細胞分離，提供本發(fā)明所用的富含因子、無細胞的CP制品。
本文定義的CP制品對短期或長期培養(yǎng)非CP細胞有用。如上所述，可以在將非CP細胞移植進入接受者之前，將其短期培養(yǎng)。當非CP細胞要培養(yǎng)很長時間時，比如例如，在連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，所述CP制品可以保持與非CP細胞培養(yǎng)分離，并且例如和當需要時，無論通過是人工的還是自動的輸注裝置或其類似物加入其中。
可選地將所述CP制劑植入聚合物或其他生物相容性基質中，當與在培養(yǎng)物中的非CP細胞接觸時，所述聚合物或其他生物相容性基質可以被降解，以釋放CP細胞。可選地，所述聚合物可以是不可降解的，但替換的是可以對叢CP制品分泌的或釋放的生長因子是可滲透的。
本發(fā)明還涉及腦脊液(CSF)作為本發(fā)明所用的CP制品的用途。如上討論的，在體內CP細胞分泌生長因子等進入CSF。因此，CSF將包含能增加非CP細胞生長和存活的CP分泌的因子，其可以用于本發(fā)明。所述CSF可包括CP和/或CP衍生的細胞。
本發(fā)明為還涉及增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中的生長、存活和/或保持其功能的方法，其包括用CP制品培養(yǎng)非CP細胞的步驟，所述CP制品包括 a)CP細胞群，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子。
本發(fā)明進一步涉及保護在培養(yǎng)物中的非CP細胞免于撤除血清誘導的細胞死亡的方法，其包括將非CP細胞培養(yǎng)在不含血清而含有CP制品的培養(yǎng)基中的步驟，所述CP制品包括 a)CP細胞群，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活率和生長的因子；和/或 b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或 c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子。
優(yōu)選地，所述非CP細胞為非神經元細胞。
本發(fā)明有許多益處，包括 -保護培養(yǎng)物中的非CP細胞免于在比如損傷、疾病、創(chuàng)傷、撤除血清等事件中的損傷； -預防或最小化在培養(yǎng)物中的非CP細胞的細胞凋亡性細胞死亡； -再生在培養(yǎng)物中的非CP細胞的破壞的細胞； -阻止或終止由事件比如細胞損傷、疾病、創(chuàng)傷、撤除血清引起的在培養(yǎng)物中的非CP細胞的細胞死亡和/或細胞死亡級聯(cascades)； -增強在培養(yǎng)物中的非CP細胞的細胞功能； -增強在培養(yǎng)物中的非CP細胞的細胞存活； -提供在培養(yǎng)物中的非CP細胞的細胞存活、生長和/或保持其功能所需的因子。
廣義地說，本發(fā)明也可以包括分別或組合的在本申請的說明書中所指出的或顯示的部分、要素和特征，及任意兩種或多種所述部分、要素或特征的所有組合，其中本文提及的具體的完整的事物具有本發(fā)明涉及的領域已知的同等物，這樣的已知的同等物被認為包括在本文中，就像它們被分別闡述一樣。
本發(fā)明包括前述的以及下述的內容，其中下述的內容僅僅是舉例。
實施例1 CP制劑支持非神經元細胞在培養(yǎng)物中生長和存活的用途 將游離的和包封的豬胰島細胞與CP細胞或CP條件培養(yǎng)基共同培養(yǎng)，在短期和長期培養(yǎng)條件下測定胰島細胞的生存力、成熟和功能。
材料和方法 胰島細胞和分離和純化 通過經由Ricordi等人(1990)記載的步驟用膠原酶(Liberase)消化切碎的胰腺來分離豬胰島細胞，方法有一些修飾。使用無菌技術，用Liberase(1.5mg/ml)擴張腺，修剪(trimmed)過量的脂肪、血管和結締組織，切碎并在37℃在以120rpm振搖的水浴中消化10分鐘。消化后，將細胞通過無菌280μm目篩，進入無菌燒杯中。對于任何沒有消化的組織進行第二次消化(10分鐘)。
膠原酶消化過程的更詳細的細節(jié)在Diatranz′s Manual of StandardOperating Procedures，SOP P101中和在前述專利，比如例如WO01/52871和WO02/32437中可獲得。
胰島的產量和生存力 經由二硫腙(DTZ)染色細胞測定胰島產率。二硫腙為鋅螯合劑，其選擇性染色Langherhans的胰島中的鋅，產生特定的紅色外觀。
使用吖啶橙和碘化丙啶(AO/PI)測定胰島細胞的生存力。吖啶橙為一種發(fā)熒光的染料，其易于穿過所有的細胞膜染色細胞質和細胞核。暴露于紫外線(UV)燈時，在細胞核和細胞質中的亮綠色熒光指示完整的活細胞。相反，碘化丙啶為一種發(fā)熒光的染料，其不能通過完整的膜。當暴露于紫外線燈時，它發(fā)射鮮紅色熒光，碘化丙啶在細胞核中的存在指示嚴重破壞或死亡細胞。
胰島的成熟和功能體外胰島素分泌能力 通過將豬胰島暴露在低濃度的葡萄糖(2.8mmol/L)和高濃度的葡萄糖(19.4mmol/L)加茶堿(10mmol/L)兩者中，使用穩(wěn)定的葡萄糖刺激(SGS)來評價其在體外的功能。然后，計算胰島素刺激指數，作為對于SGS測定中高濃度對低濃度葡萄糖從胰島中釋放胰島素的速率(以μU/100IEQ/小時)。胰島素刺激指數＞3被認為是可接受的活細胞的指示劑。
組織學 在SGS后，將細胞放置在凝血酶結塊中(20-50μl的豬血漿與相同量的凝血酶1000U/ml混合)。然后，將含細胞結塊固定在10％福爾馬林中，并包埋在石蠟中。制備5μm切片用于標準的蘇木精和伊紅(H &E)、胰島素和胰高血糖素(IPX)免疫過氧化酶染色。
共培養(yǎng)的條件 如下將來自單批(BR50)的胰島制劑與CP細胞的制品或來自CP細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基共培養(yǎng) 1.在共培養(yǎng)中的豬游離的胰島與包封的CP(比例1∶1)。通過40μm目膜將兩種細胞類型分離，游離的胰島在籃狀植入物(basket insert)中，和脈絡叢微膠囊在植入物下的孔中自由浮動。所有的試驗進行一式三份。
2.豬游離的胰島與游離的CP(比例1∶1)聚集。在分離后第3天，將胰島和脈絡叢細胞團塊放在一起。聚集的目的是修復胰島周圍的施旺細胞。
3.用CP條件培養(yǎng)基培養(yǎng)豬游離的胰島。將游離的胰島放置在6孔培養(yǎng)皿中的40μm目籃狀植入物中。所述CP條件培養(yǎng)基為來自CP細胞培養(yǎng)物(批BR52)的48-72小時培養(yǎng)基的上清液。
4.培養(yǎng)的包封的豬胰島與游離的CP細胞簇(比例1∶3)。將所述包封的胰島包含在40μm目籃狀植入物中，將所述CP細胞附著在6孔培養(yǎng)皿上。
5.培養(yǎng)的包封的豬胰島與CP條件培養(yǎng)基。將所述包封的胰島包含在40μm目籃狀植入物中，將所述CP細胞附著在6孔培養(yǎng)皿上。
結果 1.在共培養(yǎng)中的豬游離的胰島與包封的CP細胞(比例1∶1)。
與包封的CP細胞共培養(yǎng)的豬胰島保持活性并響應穩(wěn)定的葡萄糖刺激(SGS)至多21天。與7天相比，在第21天胰島素應答增加59.8％，如下表1所示。
組織學顯示了在第21天的胰島素和胰高血糖素陽性細胞(IPX)。
表1 2.豬游離的胰島與游離的CP細胞的聚集(比例1∶1)。
胰島釋放足量的胰島素至多60天。在第21天，胰島素生成增加最大值為83％。在第60天，應答類似于第7天的，如下表2所示。
表2 3.用CP條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的游離的胰島 在CP條件培養(yǎng)基的存在下，胰島生成大量的胰島素。例如在第7天，與對照胰島相比，胰島素增加332％，在第21天，增加114％。在第60天，與對照細胞相比，胰島生成高于612％的胰島素，如下表3所示。
表3 4.培養(yǎng)的包封的豬胰島與游離的CP細胞簇(比例1∶3) 與對照相比，在培養(yǎng)物中21天后，與CP細胞簇共培養(yǎng)后對SGS的應答高，如下表4所示。
表4 在培養(yǎng)60天后，也研究這些胰島細胞的組織學。
在第60天，共培養(yǎng)的胰島細胞顯示出形成胰島素陽性細胞的新簇，與對照胰島相比胰島更成熟(上部，圖1)，而且，與對照細胞相比，胰高血糖素陽性細胞(包括強陽性細胞)的數量更多(底部，圖1)。
5.用CP培養(yǎng)基培養(yǎng)包封的豬胰島 在第7天，胰島對SGS的應答比對照細胞高368％；在第21天，比對照細胞高350％，且在第60天，胰島素的含量比第21天高173％，結果如在下表5中所示。
表5 總結 這些數據表明CP制品增加了生成胰島素的胰島細胞的存活和功能。
實施例2 CP制品保護培養(yǎng)物中的神經元細胞免于撤除血清誘導的細胞死亡 脈絡叢(CP)細胞分泌神經營養(yǎng)因子的混合物(cocktail)。在下述研究中，CP條件培養(yǎng)基促進了培養(yǎng)基中胎大鼠神經元細胞的存活和功能，提供了對在體外神經營養(yǎng)缺乏的保護。
材料和方法 體外生物活性 通過將CP條件培養(yǎng)基放置在原發(fā)的15天胚胎皮層神經元上測定脈絡叢的體外生物活性，并測定其在撤除血清的條件下對神經元存活的影響。用于制備和保持原發(fā)皮層神經元培養(yǎng)物的技術與之前描述的那些類似(Fukuda A，Deshpande SB，Shimano Y，Nishino H.“Astrocytes are more vulnerable than neurons to cellular Ca2+overloadinduced by a mitochondrial toxin，3-nitropropionic acid”，Neuroscience.87497-507，1998)。從在15天胚胎的Wistar大鼠取下大腦，培養(yǎng)在用冰冷卻的HBSS中。解剖分離皮層組織，切成小塊，在37℃，用不含Ca2+的Hanks′溶液培養(yǎng)30分鐘，所述Hanks′溶液包含胰蛋白酶(0.05mg/ml)和膠原酶(0.01mg/ml)，接著，加入大豆胰蛋白酶抑制劑(0.1mg/ml)和DNase(0.1mg/ml)。然后，在補充有10％胎牛血清的Dulbecco′s修飾的Eagle’s培養(yǎng)基中的組織離心5分鐘(1000rpm)。再懸浮沉淀，并通過使用防火(fire polished)Pasteur吸量管溫和的研磨制得均勻的細胞懸浮液。將細胞放置在35mm組織培養(yǎng)皿上(5×104細胞/ml)。將所述培養(yǎng)皿保存在37℃和5％CO2和95％空氣下的濕潤的培養(yǎng)箱中4天。在第4天，將細胞再放置在24孔培養(yǎng)皿中，經過又一個兩天后，不用血清和用大范圍濃度的條件培養(yǎng)基(0-30％)培養(yǎng)細胞的子集。如在本文的實施例3中的描述制備CP條件培養(yǎng)基，使用前，儲存在-20℃。在第6天，使用臺盼藍排除分析細胞生存力。所有的研究進行一式三份。
神經元細胞功能 根據如上所述的方法制備15天胎大鼠大腦的原始培養(yǎng)物，放置在96孔培養(yǎng)皿中。用補充有B27營養(yǎng)和胎牛血清(10％)的Neurobasal培養(yǎng)基建立培養(yǎng)物4天。建立后，將培養(yǎng)細胞分成三組在血清補充的培養(yǎng)基中生長的對照細胞；在沒有補充的培養(yǎng)基中生長的細胞；和在補充有的CP條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中生長的細胞。然后，對于每個細胞組，測定軸突突起數和軸突突起的向外生長的程度，作為神經元細胞功能的指示劑。
結果 體外生物活性 體外試驗證實由包封的脈絡叢分泌的分子發(fā)揮有效的神經營養(yǎng)的效果。整體ANOVA揭示了對神經元細胞生存力的處理效果(ANOVA，F5，3.8＝109.01，p＜0.0001)。與保持在血清培養(yǎng)基中的細胞相比，不含血清2天的原發(fā)皮層神經元顯示出明顯的細胞死亡(約90％)(圖2)。從豬脈絡叢收集的條件培養(yǎng)基明顯地防護撤除血清誘導的細胞死亡。該效果為劑量依賴性的，當用10％至30％的來自豬脈絡叢的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)不含血清的神經元時，獲得最大的效果(p′s＜0.0001)。在這些濃度下，神經元存活率為60％-85％，并且與血清維持的細胞細胞差別不大(p′s＞0.05)。
神經元細胞功能 在補充有B27營養(yǎng)和胎牛血清(10％)的Neurobasal培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經元已建立，并伸出軸突伸展，其包括神經元網絡的基本的和主要的成分。在血清中存在的神經營養(yǎng)生長因子的影響下，這些軸突突起的數量和長度增加。
用未補充的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基(因此，所述神經元沒有血清衍生的神經營養(yǎng)生長因子的支持)，導致軸突數和長度減少。用通過CP細胞簇的分泌活性處理48小時的條件培養(yǎng)基的50％補充所述未補充的培養(yǎng)基，導致軸突數恢復(CP-CM補充，圖3)和軸突延伸(CP-CM補充，圖4)至接近10％胎牛血清中可見的數量和長度(圖3和4，對照)。
實施例3 包含多能神經元細胞前體的CP制品 根據本文描述的方法制備包含具有多能神經元前體特征的細胞的脈絡叢(CP)細胞簇。
材料和方法 細胞培養(yǎng)物 如本文所述分離新生的豬和成年大鼠的脈絡叢，將其培養(yǎng)在空氣中含有5％CO2和補充有2％新生豬血清、煙酰胺和cyproxin的RPMI中的細胞培養(yǎng)物中，如實施例1所描述的。
免疫組織化學 沉淀細胞簇(約2000-2500)，去掉培養(yǎng)基使其減少為100微升的體積，在35-37℃，在Hanks平衡鹽類緩沖溶液(200微升)將懸液與2％低熔點的瓊脂糖混合。使該物質冷卻，并將包含所述細胞簇的凝固的瓊脂糖塊固定在中性緩沖的福爾馬林中。使用標準方法將所述塊處理進入石蠟，在切片機上將這些塊切成切片(5微米厚)，放置在標準的玻璃顯微鏡載片上。根據抗血清供應者的說明，使用對使用免疫組織化學檢測技術的neu-N特異性的抗血清染色neu-N的切片。
結果 當在培養(yǎng)物中7-8天后測定時，發(fā)現約20％的細胞，主要在所述簇的外周，對神經元前體標記物neu-N為陽性。這些數據表明包括細胞的脈絡叢具有多能神經元前體的特征，當在本文描述的條件下培養(yǎng)時，這樣的細胞存活并保持它們的表型。
實施例2和3的總結 這些數據表明CP制品增加神經元細胞的存活和功能分化，并且也可以生成多能神經元前體。
實施例4 用脈絡叢(CP)細胞的條件生長培養(yǎng)基處理的豬成纖維細胞增殖 評價來自CP細胞的24小時培養(yǎng)物的不含血清的條件培養(yǎng)基增加成纖維細胞增殖的能力。
材料和方法 CP細胞SFCM 在不含血清的條件培養(yǎng)基(SFCM)中培養(yǎng)脈絡叢細胞簇24小時。收獲所述培養(yǎng)基，過濾并冷凍至-80℃直到使用。
豬皮膚成纖維細胞 成纖維細胞源自豬皮膚，培養(yǎng)和傳代并冷凍，當需要時溶化。在24孔培養(yǎng)皿中，以15,000細胞每孔用在1ml的培養(yǎng)物中包括MinimumEssential Media(MEM，Gibco，USA)+10％胎牛血清(FBS+0.08％環(huán)丙沙星)的完全生長培養(yǎng)基接種豬皮膚成纖維細胞，一式三份。
也在不含血清的生長培養(yǎng)基(MEM+0.08％環(huán)丙沙星)中，以20,000細胞每孔接種豬皮膚成纖維細胞。在24孔培養(yǎng)皿中，在1ml培養(yǎng)基中接種細胞，一式三份，24小時后檢查細胞增殖。
增殖測定 使用細胞計數試劑盒8(CCK-8)，Dojindo(Japan)測定豬皮膚成纖維細胞的增殖。使用Dojindo′s四唑鹽、WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑，一鈉鹽)進行CCK-8的測定，當在電子載體1-甲氧基PMS存在下生物還原時，所述WST-8生成水溶性的甲月替(formazan)染料。將CCK-8溶液直接加入到細胞中。通過細胞脫氫酶將WST-8生物還原成橙色甲月替產物，其可溶于組織培養(yǎng)基中。生成的甲月替的含量與活細胞數成正比。
對于接種在24孔培養(yǎng)皿上的細胞，將100μl的CCK試劑加入到1ml生長培養(yǎng)基中。培養(yǎng)該培養(yǎng)皿24小時。將100μl的等分試樣轉移到96孔培養(yǎng)皿中，使用E-Liza MAT 3000培養(yǎng)皿閱讀器在450nm(DRG，USA)讀其相對于含有試劑(沒有細胞)的對照生長培養(yǎng)基的光密度(ODs)。
由直線標準曲線計算細胞數，所述直線標準曲線為從一個范圍內的通過血細胞計數器和CCK試劑測定的成纖維細胞數的ODs產生的。
結果 1.在完全生長培養(yǎng)基和不含血清的生長培養(yǎng)基中的豬皮膚成纖維細胞 與在不存在CP條件培養(yǎng)基下生長的成纖維細胞相比(對照)，在CP條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的豬皮膚成纖維細胞導致在完全生長培養(yǎng)基(表6)和不含血清的生長培養(yǎng)基(表7)中的生長率增加。
表6 培養(yǎng)基條件 每孔細胞數 ％ 完全生長培養(yǎng)基(對照) 159×103100 完全生長培養(yǎng)基+5％CP細胞SFCM 183×103115 完全生長培養(yǎng)基+10％CP細胞SFCM178×103112 完全生長培養(yǎng)基+15％CP細胞SFCM190×103120 完全生長培養(yǎng)基+20％CP細胞SFCM173×103109 表7 培養(yǎng)基條件 每孔細胞數 ％ 完全生長培養(yǎng)基(對照) 144×103100 完全生長培養(yǎng)基+5％CP細胞SFCM 168×103114 完全生長培養(yǎng)基+10％CP細胞SFCM164×103116 完全生長培養(yǎng)基+15％CP細胞SFCM176×103122 完全生長培養(yǎng)基+20％CP細胞SFCM158×103110 總結 這些數據表明CP條件培養(yǎng)基包含增加非神經元細胞比如成纖維細胞增殖的因子。
實施例5 包封的CP制品增加人類臍帶血管內皮細胞(HUVEC)增殖的用途 材料和方法 包封的CP細胞的分離和制備 如本文描述的，從7天齡豬中分離脈絡叢。在包含2％從小豬供體同窩的小豬獲得的新生豬血清和抗生素(RPMI-CP)的RMPI中的7天培養(yǎng)期后，通過已知的方法以30K/mL海藻酸鹽的密度將脈絡叢簇包封在海藻酸鹽-聚鳥氨酸-海藻酸鹽微膠囊中。在與HUVEC共培養(yǎng)前，在最適宜的培養(yǎng)條件下使包封的脈絡叢(eCP)培養(yǎng)3天。此時，通過在1mL新鮮RPMI-CP中培養(yǎng)6000個包封的簇同等物24小時并用R&D系統(tǒng)生成的夾心ELISA測定VEGF來評價樣品分泌血管內皮生長因子(VEGF)。
eCP與HUVEC的共培養(yǎng) HUVEC培養(yǎng)物是在24孔組織培養(yǎng)皿中建立的，其在包含大腦抽出物(BE)的基礎培養(yǎng)基中融合50％，大腦抽出物為一種已知的促進HUVEC生長的制劑。從所有的樣品中除去培養(yǎng)基，向每孔加入新的培養(yǎng)基和/或eCP。每個樣品包括1mL總體積的培養(yǎng)基。各組如下 樣品 N培養(yǎng)基 HUVEC 10 基礎+BE(完全) HUVEC 10 基礎(不完全) eCP(2.5K)+HUVEC 3基礎 eCP(5K)+HUVEC 4基礎 eCP(10K)+HUVEC3基礎 共培養(yǎng)72小時后，收集eCP和條件培養(yǎng)基、分開并且經72小時測定培養(yǎng)基的VEGF。通過受胰蛋白酶作用細胞計數HUVEC，并在超聲溶解細胞后，使用來自Molecular Probes的PicoQuant DNA測定試劑盒檢測DNA。
結果 體外保存3天的來自eCP的條件培養(yǎng)基顯示出6000個包封的簇分泌1.15±0.02ng VEGF/1mL/24小時。當在最低限度培養(yǎng)基中與HUVEC培養(yǎng)時，觀察到HUVEC的細胞增殖顯著的增加，如圖5所示，其顯示出每組共培養(yǎng)條件的細胞數和最終VEGF水平。對所有的組，除了10K和5K eCP組，VEGF水平，在右Y軸顯示并對應于三角形標記，除了10K和5K eCP組之外所有都低于檢測極限，所述10K和5K eCP組測定的VEGF水平分別為546±51和174±69pg/mL/72小時。
在圖5中顯示的細胞計數證實了eCP對HUVEC增殖的清楚的效果，其沒有表明在這些試驗中評價的水平的劑量依賴性。所有eCP組和在特別用于HUVEC增殖的培養(yǎng)基配方(完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)的組為統(tǒng)計學相等的，并且高于在不完全培養(yǎng)基中的細胞計數。所述eCP組，其缺少用于HUVEC生長配制的腦抽出物，得到了與完全培養(yǎng)基相同的生長水平。
總結 這些結果表明包封的脈絡叢分泌較高水平的生物活性VEGF。在與HUVEC的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，eCP能夠刺激在不完全培養(yǎng)基中與如在包含特別地制備用于HUVEC增殖的大腦抽出物的培養(yǎng)基中相同水平的HUVEC生長。這點似乎不是劑量依賴性作用，然而，因為VEGF在培養(yǎng)基中的半衰期短、試驗的72小時持續(xù)期和HUVEC的未知代謝率，這一可能不能被排除。這些數據表明eCP分泌增加非神經元細胞比如臍帶細胞增殖的因子。
討論 這些試驗證實CP制品，包括CP細胞和/或CP衍生的細胞和/或CP條件培養(yǎng)基，生成顯著量的神經營養(yǎng)因子和生長因子，其能增加非CP細胞在細胞培養(yǎng)物中的生長和存活，所述非CP細胞包括神經元細胞和非神經元細胞。而且，實驗證實CP制品可以保護神經元免于撤除血清誘導的細胞死亡。所述CP制品進一步能刺激和/或保持在神經元細胞中的神經元軸突突起，其對支持(underpins)所有大腦活動的中樞神經系統(tǒng)網狀結構是必不可少的。盡管對CP條件培養(yǎng)基補充劑的應答沒有超過在實施例2中對血清的應答，在該培養(yǎng)基中的蛋白質濃度少于在血清補充劑中的1％，因此，其為非常有效的制劑。這些試驗證實如本文定義的CP制品能增加體外神經元和非神經元細胞的血清存活和功能。
工業(yè)實用性 本發(fā)明在增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中的生長和存活特別有用。這樣的非CP細胞可包括已經從供體獲得的細胞或組織，其在移植到接受者之前保持短期培養(yǎng)?？蛇x地，所述非CP細胞可包括用于體外試驗的第一代和第二代細胞培養(yǎng)物或細胞系，其包括永生的細胞系。
其不意味著限制本發(fā)明的范圍到上述實施例。如本領域技術人員將理解的，在不背離附加權利要求的范圍下，多種變化都是可能的。
在本說明書中，其中所用的參考有專利說明書、其它外部文獻或其它信息資源，這些通常是為了提供討論本發(fā)明特征的背景。除非另有特別的說明，對這些外部文獻的參考不能被看作是一種許可，這些任意權限的文獻或這些信息來源是現有技術或者成為本領域公知常識的一部分。
權利要求
1.脈絡叢(CP)制品用于增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中生長、存活和/或保持其功能的用途，其中所述制品包括
a)CP細胞群，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或
b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或
c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子。
2.如權利要求1所述的用途，其中所述非CP細胞為神經元或非神經元細胞，選自原發(fā)皮層神經元細胞、胰島β細胞、成纖維細胞、能生成或分泌因子VIII的細胞、能生成因子VIII和血管假性血友病因子的細胞、心肌細胞、心臟傳導系統(tǒng)的細胞或參與修復新生兒畸形或矯正遺傳性代謝缺陷的細胞。
3.如權利要求2所述的用途，其中所述能生成因子VIII的細胞選自肝細胞、膽囊上皮細胞、膽囊內皮細胞、膽管上皮細胞、膽管內皮細胞、肝臟內皮細胞、血竇細胞、非肝實質細胞或臍帶內皮細胞。
4.如權利要求2所述的用途，其中所述能生成因子VIII和血管假性血友病因子的細胞選自內皮細胞、臍帶內皮細胞或肝臟內皮細胞。
5.如權利要求2所述的用途，其中所述心臟傳導系統(tǒng)的細胞選自竇房結細胞或來自房室束的細胞。
6.如權利要求2所述的用途，其中所述細胞參與修復新生兒畸形和遺傳性代謝缺陷，選自氨基酸代謝病、有機酸尿癥、遺傳特異性蛋白質缺乏癥、酶不全病包括尿素循環(huán)障礙、色素代謝障礙、嘌呤代謝障礙和多糖和粘粘多糖和糖蛋白代謝障礙。
7.如權利要求1所述的用途，其中在移植進入接受者之前將所述非CP細胞培養(yǎng)短時期。
8.如權利要求7所述的用途，其中所述非CP細胞為胰島β細胞，在移植進入接受者用于治療糖尿病之前培養(yǎng)。
9.如權利要求1所述的用途，其中所述非CP細胞獲得自與CP制品的細胞不同的種類。
10.如權利要求9所述的用途，用于增加在異種移植中使用的非CP細胞的生長和存活。
11.如權利要求1所述的用途，其中所述非CP細胞在用CP制品培養(yǎng)之前為休眠狀態(tài)。
12.如權利要求11所述的用途，其中所述非CP細胞被冷凍干燥或冷凍。
13.如權利要求1所述的用途，其中一種或多種能支持非CP細胞存活和生長的因子選自神經營養(yǎng)因子、生長因子、血管內皮生長因子、營養(yǎng)因子、細胞因子、促細胞分裂劑、基質細胞支持因子、酶、能降解有毒蛋白質沉淀的蛋白酶類或能絡合有毒金屬離子的蛋白質。
14.如權利要求13所述的用途，其中所述酶選自蛋白酶類、α-1抗胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶、乳糖酶和麥芽糖酶。
15.如權利要求13所述的用途，其中所述能絡合有毒金屬離子的蛋白質選自轉鐵蛋白和血漿銅藍蛋白。
16.如權利要求1所述的用途，其中所述a)和/或b)的CP細胞包括純化的CP細胞群和/或CP衍生的細胞，選自神經膠質或神經膠質衍生細胞、上皮細胞、多能神經元前體細胞、祖細胞、和對神經元前體細胞標記物為陽性的細胞。
17.如權利要求16所述的用途，其中所述神經元前體細胞標記物為neu-N。
18.如權利要求1所述的用途，其中所述CP細胞為直接從下述獲得a)適宜的哺乳動物供體，b)第一代或第二代CP培養(yǎng)物，c)包括永生的CP細胞系的CP細胞系，或者a)、b)和c)的組合。
19.如權利要求18所述的用途，其中在培養(yǎng)物中的所述CP細胞已經被遺傳修飾。
20.如權利要求18所述的用途，其中當所述CP細胞為直接地從供體獲得時，其被包在腦脊液中。
21.如權利要求1所述的用途，其中所述CP和/或非CP細胞包括分離的細胞或細胞簇，并且是游離的或被包封的。
22.如權利要求21所述的用途，其中所述CP和非CP細胞是游離的以便彼此直接接觸，或者它們是游離的但通過生物相容的分離工具分離，所述分離工具能使CP細胞分泌的因子擴散到非CP細胞。
23.CP制品用于增加非神經元細胞在長期或短期培養(yǎng)中生長、存活和/或保持其功能的用途，其中所述制品包括
a)CP細胞群，其能產生一種或多種支持非神經元細胞存活和生長的因子；和/或
b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非神經元細胞存活和生長的因子；和/或
c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非神經元細胞存活和生長的因子。
24.增加非CP細胞在長期或短期培養(yǎng)中生長、存活和/或保持其功能的方法，其包括用CP制品培養(yǎng)非CP細胞的步驟，所述CP制品包括
a)CP細胞群，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或
b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或
c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子。
25.如權利要求24所述的方法，其中所述非CP細胞為非神經元細胞。
26.保護在培養(yǎng)物中的非CP細胞免于撤除血清誘導的細胞死亡的方法，其包括將非CP細胞培養(yǎng)在不含血清而含有CP制品的培養(yǎng)基中的步驟，所述CP制品包括
a)CP細胞群，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或
b)CP細胞培養(yǎng)物，其能產生一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子；和/或
c)來自a)或b)的CP條件培養(yǎng)基，其包含一種或多種支持非CP細胞存活和生長的因子。
27.如權利要求26所述的方法，其中所述非CP細胞為非神經元細胞。
28.使用權利要求1定義的CP制品培養(yǎng)的非CP細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及脈絡叢細胞和/或脈絡叢條件培養(yǎng)基用于增加非脈絡叢細胞在長期或短期培養(yǎng)中生長、存活和/或保持其功能的用途。
文檔編號C12N5/071GK101189328SQ200680012956
公開日2008年5月28日 申請日期2006年4月18日 優(yōu)先權日2005年4月18日
發(fā)明者R·B·埃利奧特, S·J·M·斯金納, L·D·C·E·奧雷利亞納, C·薩諾斯 申請人:神經營養(yǎng)細胞私人有限公司