專利名稱：治療或預(yù)防骨疾病的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物，具體涉及一種治療或預(yù)防骨疾病的藥物組合物。

背景技術(shù)：
本發(fā)明一般涉及治療或預(yù)防骨疾病的藥物組合物。這些藥物組合物可用于損傷愈合和組織修復(fù)時誘導(dǎo)骨和/或軟骨的形成。
整形外科和顱面骨損傷的治療費用造成很大的生物醫(yī)學(xué)負(fù)擔(dān)。根據(jù)2002年美國健康費用和利用工程的報道，醫(yī)院僅花費在顱蓋骨外科(大骨瓣開顱術(shù)和顱蓋骨切除術(shù))和顱面外傷修復(fù)的費用，估計分別為近5.49億和近4億美元(Steiner，C.，A.Elixhauser，and J.Schnaier，Eff Clin Pract，2002.5(3)p.143-51)。醫(yī)院花費在整形外科(外傷和非外傷)的費用可能還要高，據(jù)2002年僅整型外科銷售額估計近13億美元(Medical Technology Fundamentals，MerrillLynch，2003.p.11)。
總之，在整形外科和顱面骨損傷的治療中，遇到的主要問題是骨和/或軟骨形成的調(diào)節(jié)。更適宜地是，在以下情況下可以使骨形成增加作為某些疾病治療(例如，整形外科或顱面骨折修復(fù)，脊柱融合手術(shù)，關(guān)節(jié)融合手術(shù)，損傷的骨質(zhì)疏松的骨)的一部分，或某些疾病預(yù)防(預(yù)防骨質(zhì)疏松骨的骨折)的一部分，人們希望有更多的或加速的骨形成。對于長骨骨折，通過加速軟骨增生并被骨替代來加速軟骨內(nèi)成骨是人們所希望的。甚至于更適宜地，在以下情況下還可以使骨形成減少或抑制作為某些疾病的治療或預(yù)防(例如，顱縫早閉，新生兒顱蓋過度生長寬約骨縫導(dǎo)致過早的骨縫融合；異位骨化，異位部骨不正常形成)的一部分，人們希望骨形成減少或抑制。相似地，在以下情況下人們期望軟骨形成增加在此情況下增加或加速軟骨形成有利的(例如，關(guān)節(jié)面重建，顳下頜關(guān)節(jié)重建，關(guān)節(jié)盤修復(fù)，椎間盤的修復(fù)頜再生)。
許多組合物已被描述用于骨疾病的治療(見表1)。大部分，如非全部，描述了組合物通過骨傳導(dǎo)和/或骨誘導(dǎo)特性促進(jìn)骨形成。在本領(lǐng)域中，具有骨誘導(dǎo)特性的組合物在骨形成方面比具有骨傳導(dǎo)特性的組合物更有效已經(jīng)形成共識。然而，對于最佳的骨形成二者均為必要的(見表1)。目前，治療多種骨疾病的“金標(biāo)準(zhǔn)”組合物是自體同源骨移植，其具有骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)的雙重特性。然而，自體移植物的采集可伴隨主要供體部位病態(tài)表現(xiàn)，包括疼痛，步態(tài)紊亂，髖骨頂部提供移植后引起的大腿感覺異常(Laurie，S.W.，et al.Plast Reconstr Surg，1984.73(6)p.933-8.)。因此，急需更好的自體移植物替代物。在具有骨誘導(dǎo)功能的復(fù)合物中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)，已被廣泛的闡述。在治療多種骨疾病過程中，當(dāng)BMPs與骨傳導(dǎo)載體同時使用時，對于許多骨骼疾病的治療能夠提供與自體移植物相同，甚至與超過自體移植物的治療效果(Valentin-Opran，A.，et al.Clin Orthop，2002(395)p.110-20)。
然而，已知的BMPs功能不均一性(Ducy，P.and G.Karsenty，Kidney Int，2000.57(6)p.2207-14；Wang，S.，et al.，Kidney Int，2003.63(6)p.2037-49)和骨誘導(dǎo)所需高劑量的BMPs可能會限制它的應(yīng)用，這是因為費用方面的考慮和不可預(yù)知的副作用如，形成上頜竇膿腫(van den Bergh，J.P.，et al.，J Clin Periodontol，2000.27(9)p.627-36)。因此，目前在臨床和商業(yè)上均需要替代或補(bǔ)充BMPs的骨誘導(dǎo)分子以促進(jìn)骨和/或軟骨的形成。此外，目前在臨床和商業(yè)上均需要在特殊情況下抑制骨和/或軟骨形成，而這是BMPs無法解決的。
下述實施例解決了上述存在的問題和需要。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一，就是提供一種含有一種或多種藥劑(如，一種或多種NELL肽或NELL核糖核酸)的藥物組合物。在一個實施例中，藥物組合物含有有效量的一種或多種NELL肽，用于通過促進(jìn)損傷后骨的增殖來治療骨骼的疾病，例如長骨損傷的愈合，脊髓融合和顱面骨的修復(fù)。在另一個實施例中，藥物組合物含有有效量的一種或多種NELL肽，通過促進(jìn)骨的生成來治療或預(yù)防沒有必要的明顯骨損傷證據(jù)的疾病(如，骨質(zhì)疏松癥，臀部壞疽，和齒槽脊骨的再吸收)。
在一些實施例中，在此描述的組合物是有效的，并能夠用于治療，預(yù)防，改善，減輕或減少疾病的癥狀，這些疾病涉及骨骼代謝為次級作用的多重癥狀。這些疾病的例子包括但不限于，慢性腎病，其可導(dǎo)致很多全身性的影響，包括腎病性骨營養(yǎng)不良和血管鈣化。Nell可增加骨形成但不會伴隨非期望的刺激性成骨，因此，它只促進(jìn)骨間隙的成骨而不會刺激人體內(nèi)非骨細(xì)胞(如癌前期細(xì)胞)的增殖，因此目標(biāo)的骨形成減少了因為腎臟損傷引起的骨流失。NELL誘導(dǎo)的礦化作用也消耗掉鈣和磷酸鹽離子，否則這些離子會在正常非鈣化的組織(如，血管)形成病理性的鈣化。其它病理性鈣化的形式有多因子參與的原因(細(xì)菌，旁分泌，自分泌等等)。Nell調(diào)節(jié)骨沉積和骨再吸收之間的平衡的能力使所述組合物能夠維持骨間隙內(nèi)的必需離子，而降低了他們在非骨組織的生物利用度，從而減少了異位軟組織鈣化，膽結(jié)石，腎結(jié)石，松果體鈣化，白內(nèi)障，涎石，心臟瓣膜和/或前裂腺結(jié)石的風(fēng)險。
本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有有效量的抑制骨生成(如顱縫早閉或異位骨化，骨硬化病)的NELL肽的抑制劑。本發(fā)明又一方面，提供了一種藥物組合物，其含有充分高，足夠劑量的NELL肽用于抑制骨生成。本發(fā)明再一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其含有有效量的NELL1或NELL2肽受體的調(diào)節(jié)劑，用于促進(jìn)骨生成(如，顱面骨或長骨的生成)。調(diào)節(jié)劑可以是NELL1或NELL2肽受體的激動劑。在另一個實施例中，該藥物組合物含有有效量的NELL1或NELL2肽受體的調(diào)節(jié)劑，在治療或預(yù)防降低骨質(zhì)量的骨病(如骨質(zhì)疏松癥和齒槽脊骨再吸收)中，該藥物組合物促進(jìn)骨的生成。調(diào)節(jié)劑可以是NELL1或NELL2肽受體的激動劑。
本發(fā)明進(jìn)一步的一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有有效量的NELL1或NELL2肽受體的調(diào)節(jié)劑，用于抑制骨生成(如，顱面骨或長骨的生成)。調(diào)節(jié)劑可以是NELL1或NELL2肽受體的拮抗劑。在一個實施例中，該藥物組合物含有有效量的NELL1或NELL2肽受體的調(diào)節(jié)劑，在治療或預(yù)防增加骨質(zhì)量的骨病(如，骨骼石化癥)中，該藥物組合物抑制骨的生成。該調(diào)節(jié)劑劑可以是NELL1或NELL2肽受體的拮抗劑。
本發(fā)明的進(jìn)一步的一個方面，本發(fā)明提供了一種用于骨生成的藥物組合物，它包括一種或多種NELL肽的增強(qiáng)劑。
本發(fā)明進(jìn)一步的一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有有效量的至少一種藥劑，在治療或預(yù)防軟骨相關(guān)的骨病(例如，關(guān)節(jié)再生，顳下頜關(guān)節(jié)重建，關(guān)節(jié)炎修復(fù)，或椎骨板的修復(fù))中，該試劑或直接或間接地促進(jìn)軟骨生成。直接促進(jìn)軟骨生成的藥劑之一可以是應(yīng)用于軟骨生成細(xì)胞(如，但不限于成軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，或軟骨前體細(xì)胞，干細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，或脂肪來源細(xì)胞)的NELL肽。間接促進(jìn)軟骨生成的藥劑(例如，通過誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞/軟骨細(xì)胞分化)可以是，例如，NELL肽，或NELL肽受體激動劑的一種。
在某些特殊條件下，當(dāng)需要抑制軟骨內(nèi)成骨以阻止軟骨被骨進(jìn)一步替代時，藥物組合物可包含例如一種或多種NELL肽受體的抑制劑或拮抗劑，高劑量的NELL肽，或者他們的組合。這樣的組合物能夠通過抑制潛在的，定型的骨生成細(xì)胞(例如，但不限于，成骨細(xì)胞，骨生成細(xì)胞，干細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，硬腦(脊)膜細(xì)胞，骨膜細(xì)胞，基底細(xì)胞，和/或肌肉細(xì)胞)有效的抑制成骨細(xì)胞的分化。
在本發(fā)明進(jìn)一步一個方面中，能夠通過調(diào)節(jié)NELL啟動子的小分子誘導(dǎo)骨形成。
上述藥物組合物可任選地包括藥理學(xué)上可接受的載體，作為進(jìn)行全身或局部遞送的合適的遞送模式。例如，藥理學(xué)上可接受的載體可以是用于口腔遞送，肺部遞送，非腸道遞送或移植的載體。
在本發(fā)明的進(jìn)一步一個方面，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防骨骼疾病的方法。該方法通常包括給予哺乳動物上述藥物組合物。
藥物組合物可根據(jù)適當(dāng)?shù)倪f送模式而制備成多種配方。



圖1顯示了為大鼠NELL1蛋白和小鼠血栓收縮蛋白(TSP)-1的結(jié)構(gòu)示意圖。顯示了信號肽區(qū)段(實心的黑框)，TSP-N端(TSP-N，陰影框)，半胱氨酸富集(CR)區(qū)段(CR，實心白框)，表皮生長因子(EGF)樣區(qū)段(E，帶陰影線的框)，盤旋的螺旋區(qū)(CC，桿)，鈣離子結(jié)合型表皮生長因子樣區(qū)段(*)，和RGD肽區(qū)段(RGD，實心白框)。
圖2A顯示了野生型小鼠骨骼模型，示范了正常骨骼模型，骨骼著色(上，中部)和斷層掃描(CT)(底部)。圖2A也顯示了礦化的典型邊界(淺藍(lán)色點線)和前(紅箭頭)和后(藍(lán)箭頭)囟門的位置。能夠看到模糊的右冠狀縫輪廓(綠色箭頭所指)。冠狀縫通常很難看清楚，因為冠狀縫是交迭的而不是對接縫。中間的圖也顯示了鎖骨的正常尺寸(黑色箭頭)。斷層掃描顯示了典型顱面骨的形態(tài)。冠狀縫(綠色箭頭)和前囟門(紅色星號)是高亮度的。圖2B顯示了雜合核心結(jié)合因子1敲除的動物(Cbfa1+/-)的骨骼模型。Cbfa1缺失的動物存在成骨缺陷。這些小鼠廣泛地說明了顯著的中縫和囟門。在中線顱頂缺陷側(cè)面的著色弱的組織(在黃色和淺藍(lán)點線之間)，可見缺陷的礦化和成骨。在冠狀縫區(qū)域(綠色箭頭，頂端和底部的圖片)可見透明區(qū)域。在中間的圖片，顯示了鎖骨發(fā)育不全的明顯程度(黑色箭頭)。圖2C顯示了Cbfa+/-動物與NELL過度表達(dá)動物交配后的子代的骨骼模型。在骨著色和X線斷層掃描中，該Cbfa+/-+NELL過度表達(dá)的動物顯示了與Cbfa+/-單倍體缺陷動物比較明顯增加的鎖骨形成。在中間的圖片，有較輕微的鎖骨發(fā)育不全(黑色箭頭)。該圖片還顯示了在冠狀縫上的多骨交迭修復(fù)(綠色箭頭，頂部和底部照片)。圖2D顯示了，當(dāng)NELL1過度表達(dá)或加入NELL1蛋白時，在體外顱蓋骨組織培養(yǎng)中，顱蓋骨的過度生長或異位成骨。圖2E顯示了加入NELL1蛋白的正常小鼠顱蓋骨的移植物。綠色熒光代表新骨的生長。NELL1蛋白誘導(dǎo)骨過度生長(紅色箭頭)，和正位成骨(黃箭頭)?？傊?，圖2顯示出在顱面區(qū)域(例如，頭頂)和軸向骨區(qū)域(例如，鎖骨)由于NELL的過度表達(dá)而增加了的骨生成。
圖3A顯示了腺病毒NELL1(AdNELL1)轉(zhuǎn)導(dǎo)的長骨來源的骨髓間質(zhì)細(xì)胞的Von Kossa’s染色情況。細(xì)胞培養(yǎng)至80％匯合后用50個斑點形成單位(pfu)/細(xì)胞的AdNELL1進(jìn)行感染(右)。對照組時用50pfu/細(xì)胞的Adβ-Gal感染(左)。在第11天時，計數(shù)Von Kossa’s染色的骨小結(jié)，骨小結(jié)數(shù)表示為平均值+SEM。每個實驗重復(fù)三次。典型的染色后的骨小結(jié)樣本已被指出(綠色箭頭)。AdNELL1轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMSCs具有明顯更多的礦化和成骨。圖3B、3C和3D顯示了轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMSCs注射入裸鼠肌肉。。圖3B顯示了具有片狀模式的更成熟的骨的組織學(xué)形態(tài)。圖3C用放射照相術(shù)顯示了具有更成熟的骨骼的AdNELL1轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMSCs。圖3D用放射照相術(shù)顯示了具有更多骨形成的AdNELL1轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMSCs。總之，圖3A-3D顯示了，由于NELL1的過度表達(dá)，而導(dǎo)致非顱蓋骨來源的細(xì)胞中增加的骨礦化和骨形成。
圖4是NELL1或BMP2處理的顱蓋骨缺陷的容積分析，表明在控制線(藍(lán)線)以上NELL1(綠線)和BMP2(紅線)骨形成的明顯增加。這表明NELL1能再生/修復(fù)骨。
圖5A-D是治療4周后的顱蓋骨CT圖像。圖5A是4周的用負(fù)載NELL1的膜(綠色為最初缺陷的輪廓)和負(fù)載BMP2的PLGA膜(紅色為最初缺陷的輪廓)治療的顱蓋切片(內(nèi)頭蓋視圖)。圖5B是同圖5A同樣的標(biāo)本(外頭蓋視圖)。圖5C是4周的用負(fù)載NELL1的PLGA膜(綠色為最初缺陷輪廓)治療的顱蓋骨切片(內(nèi)頭蓋視圖)。也可見到對側(cè)的沒有治療過的對照(黃色為最初缺失的輪廓)。圖5D代表的是同圖5C一樣的樣本(外頭蓋視圖)。條的尺寸為3mm(黃色，左下)?？傊?，圖5A-5D顯示了用NELL1和BMP2治療后相似的骨礦化和骨形成的增加。
圖6A-C顯示了治療4周時的顱蓋骨組織切片。切片用Masson’strichome.染色。圖6A是4周的用負(fù)載NELL1的膜治療的顱蓋骨切片?？煽吹娇缭饺笔У耐耆墓窃偕D6B是4周的用負(fù)載BMP2膜治療的顱蓋骨切片，同樣可看到跨越缺失的完全的骨再生。圖6C是用無負(fù)載的膜治療的顱蓋骨的切片，只有極少的跨越缺失的骨再生?？傊?，圖6A-C也顯示了用NELL1和BMP2治療后相似的骨形成增加。
圖7A-D顯示了在不同的微環(huán)境下，NELL1誘導(dǎo)的軟骨形成和軟骨內(nèi)骨形成。圖7A顯示了包括關(guān)節(jié)軟骨部位(上版面)和軟骨內(nèi)長成骨部位(下板面)整個脛骨內(nèi)NELL1的表達(dá)。上版面顯示了在關(guān)節(jié)軟骨部位，NELL1可調(diào)節(jié)并增加軟骨的分化。因而，這些數(shù)據(jù)表明，增加的NELL肽的活性直接(例如，通過加入NELL肽或增加NELL肽的表達(dá))或間接(例如，加入NELL肽的增強(qiáng)劑和/或NELL肽受體的激動劑和/或活化劑)能夠促進(jìn)軟骨的形成。在下板面，在軟骨內(nèi)骨形成起始的長骨軸部位，增加的NELL1促成軟骨形成然后變肥大，還使軟骨內(nèi)骨形成增加。然而，在Cbfa1敲除的模型中，NELL1的缺失只能保持分化程度較低的成軟骨細(xì)胞/軟骨細(xì)胞表型，而沒有軟骨內(nèi)骨形成。因而，這些數(shù)據(jù)表明增加的NELL肽的活性直接(例如，通過加入NELL肽或增加NELL肽的表達(dá))或間接(例如，通過加入NELL肽增強(qiáng)劑和/或NELL肽受體激動劑和/或活化劑)可促進(jìn)軟骨的形成，軟骨肥大和軟骨內(nèi)骨化。這對軟骨內(nèi)骨形成(如，骨折)是有用的。外源性NELL1的缺失與受控制的關(guān)節(jié)成軟骨細(xì)胞/軟骨細(xì)胞表型及肥大的抑制有關(guān)聯(lián)，這對阻止關(guān)節(jié)軟骨被骨替代是很重要的。因此，抑制NELL肽的活性可直接(通過降低NELL肽的表達(dá)或使用NELL肽抑制劑)或間接(通過NELL肽受體拮抗劑和/或抑制劑)阻止軟骨肥大和軟骨內(nèi)骨形成，并促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨表型的維持?？傊?，這些數(shù)據(jù)不是用于限制，而是為了表明NELL對軟骨前體細(xì)胞類型有著廣泛的影響，NELL肽誘導(dǎo)的具體的表型依賴于應(yīng)用NELL肽的量和時間、具體細(xì)胞的類型、細(xì)胞分化狀態(tài)，和微環(huán)境之間的復(fù)雜的相互作用。圖7B顯示了在腭裂模型中，NELL蛋白誘導(dǎo)軟骨形成(藍(lán)色染色)。圖7C通過增加的Sox 9染色顯示了NELL1增加成軟骨細(xì)胞增殖。Sox 9是軟骨細(xì)胞增殖的標(biāo)記物。圖7D通過增加的X型膠原質(zhì)染色顯示了NELL1誘導(dǎo)軟骨進(jìn)一步的分化。此外，圖7D還顯示了NELL可加速軟骨分化/形成和軟骨基的軟骨內(nèi)骨形成。總之，圖7A-D顯示了NELL可調(diào)節(jié)軟骨分化和肥大。增加的NELL1促使軟骨形成和肥大，并增加了在不同微環(huán)境下軟骨內(nèi)骨形成，而NELL1缺失僅能維持較少量的關(guān)節(jié)成軟骨細(xì)胞/軟骨細(xì)胞表型。
圖8顯示了NELL1和BMP2在體外(A)和體內(nèi)(B，C)的協(xié)同作用。這些數(shù)據(jù)表明NELL1和BMPs在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物的表達(dá)和誘導(dǎo)骨形成是協(xié)同作用的。
圖9顯示了以軟化骨基質(zhì)作為載體的NELL1脊骨融合圖，及6周的NELL處理的融合脊骨(A，B and C)和非結(jié)合對照樣本(D，Eand F)的放射圖像和微型CT三維立體再構(gòu)建圖。(A)紅色箭頭識別在L4和L5脊骨兩側(cè)的放射不透明組織塊。每一組織塊的中間線(綠色箭頭)表現(xiàn)出的最高密度類似于皮層骨。(B)微型CT的三維圖像顯示了密度類似于骨，很好界定的的組織塊(紅箭頭)，該組織塊被包裹在兩個橫突的背側(cè)面和他們之間的空間內(nèi)(綠箭頭)；(C)在CT三維掃描圖像的冠狀面顯示了橋骨(綠箭頭)和兩個橫突(黃箭頭)清楚的連接；在此放射圖中，可見低放射-不透明的，稍小的組織塊(紅色箭頭)；(E)在L4和L5區(qū)域上方的組織塊(紅色箭頭)不與橫突物緊密連接；(F)CT三維掃描的冠狀面，可見裂縫(粉色箭頭)。這一數(shù)據(jù)顯示NELL1可通過形成橋來誘導(dǎo)脊骨融合。
圖10顯示了6周的由NELL1融合的樣本(A，B，C，G和H)和非融合對照(D，E，F(xiàn)，I和J)的組織學(xué)表現(xiàn)。(A)綠色箭頭表示皮層骨樣連接兩個橫突的橋骨(H&E染色切片中的點線)；(B)和(C)為(A)中橋骨限定區(qū)域薄片骨的放大；(D)H&E染色顯示靠近橫突的較小的骨塊，以點線表示；(E和F)是(D)限定區(qū)域未成熟骨的放大圖；(G和H)Masson trichrome染色切片中骨細(xì)胞形成粘合線顯示了新的骨生長；(I和J)更多的軟骨組織出現(xiàn)再造骨的DBMDBM碎片中(箭頭)。A和D 9.8倍放大；B，E，G和I 100倍放大；C，F(xiàn)，H和J200倍放大。這一數(shù)據(jù)表明NELL1可通過形成橋骨誘導(dǎo)脊骨融合。
圖11A和11B顯示了人，小鼠和大鼠包含多OSE2共有基序的NELL1啟動子。圖11顯示假定的OSE2結(jié)合位點，A，B和C沿著相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的序列和位置示出。隱藏的OSE2位點以有條紋的盒子表示。圖11B為人，小鼠和大鼠的NELL啟動子概括的比較(沒有畫刻度)。小鼠和大鼠的兩個OSE2位點在一個區(qū)域內(nèi)為81％同源。隱藏位點以有條紋的盒子表示。這一數(shù)據(jù)顯示NELL啟動子的序列可用于藥物篩選來誘導(dǎo)NELL的表達(dá)。

具體實施例方式 本發(fā)明的另一個方面提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有一種或多種藥劑(如一種或多種NELL肽)用來治療或預(yù)防骨病。在一個實施例中，藥物組合物含有有效量的一種或多種NELL肽，用于調(diào)節(jié)(例如，促進(jìn)骨的生成，例如，顱面骨的生成。牙齒移植的整合，牙周骨的生成，牙齒或整形外科移植的整合，長骨骨折的治療，脊骨融合或結(jié)合)。在另一實施例中，藥物組合物含有有效量的一種或多種NELL肽，用于治療或預(yù)防骨病(如，骨質(zhì)疏松癥)。本發(fā)明的另一個方面，提供了藥物組合物，含有有效量的NELL1或NELL2肽的抑制劑，用來治療或預(yù)防跨越頭顱骨縫的骨性過渡生長。
本發(fā)明進(jìn)一步的一個方面，提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有有效量的NELL1或NELL2肽受體調(diào)節(jié)劑，用來促進(jìn)骨生長(如，顱面骨生長)。該調(diào)節(jié)劑可以是NELL1或NELL2的受體的激動劑或拮抗劑。調(diào)節(jié)劑本身可刺激或抑制該受體。在另一個實施例中，藥物組合物含有有效量的NELL1或NELL2肽的受體調(diào)節(jié)劑，用來治療或預(yù)防骨病(如，骨質(zhì)疏松癥)。
在本發(fā)明進(jìn)一步的一個方面中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有有效量的至少一種藥劑，用來促進(jìn)軟骨的生成，用于治療或預(yù)防與軟骨相關(guān)的骨疾病。該藥劑可以是NELL肽抑制劑、NELL肽受體的拮抗劑、和他們的組合的一種。
上述藥物組合物可任選擇包括一種藥理學(xué)上可接受的載體，用于全身或局部遞送的合適的遞送藥物模式。例如，藥理學(xué)上可接受的載體可為口腔遞送，非腸胃道遞送或移植的載體。
在本發(fā)明進(jìn)一步一個方面中，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防骨病的方法。該方法一般包括給哺乳動物使用所述藥物組合物。
在本發(fā)明進(jìn)一步一個方面中，所述組合物與骨基質(zhì)聯(lián)合可用于誘導(dǎo)骨形成。骨基質(zhì)可以是去礦化的骨基質(zhì)或礦化的基質(zhì)。
在本發(fā)明進(jìn)一步一個方面中，所述藥物組合物通過干細(xì)胞與組合物接觸，可用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。。干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞或成年干細(xì)胞。進(jìn)一步的，所述藥物組合物通過使骨基質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞與所述組合物接觸，可用于誘導(dǎo)骨基質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞以形成骨。
在本發(fā)明進(jìn)一步一個方面中，所述藥物組合物是有效的，可用于治療，預(yù)防，改善，減輕，或減少疾病的相關(guān)癥狀例如，因微重力，組織萎縮，長期臥床引起的骨流失等。
在一些實施例中，所述組合物是有效的，可用于治療，預(yù)防，改善，減輕，或減少疾病/病況的癥狀，這些疾病和病況涉及骨代謝為次級作用的多重癥狀。這些疾病/病況包括，但不限于，可導(dǎo)致許多全身性作用(包括腎病性骨營養(yǎng)不良和血管鈣化)的慢性腎臟疾病。Nell可增加骨形成而不會刺激非期望的骨形成，從而，Nell僅刺激骨間隔的骨形成而不會刺激身體其它非骨細(xì)胞的增殖(如，癌前細(xì)胞)，因而目標(biāo)的骨形成減輕了由于腎損傷引起的骨流失。NELL誘導(dǎo)的礦化也消耗鈣和磷酸鹽離子，否則這些鈣和磷酸鹽離子會在正常的非鈣化組織(例如，血管)形成病理性的鈣化。其它病理性鈣化的形式具有多因素的根源(細(xì)菌，旁分泌，自分泌等)。NELL有利平衡骨沉積和骨再吸收的能力使得所述組合物在維持骨間隔必需離子和降低他們在非骨組織的生物利用度方面是有效的組合物，因而可以減少異位軟組織鈣化，膽結(jié)石，腎結(jié)石，松果體鈣化，白內(nèi)障，涎石，心臟瓣膜和/或前裂腺結(jié)石的風(fēng)險。
在一些實施例中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，用于促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞的骨的形成，這些哺乳動物細(xì)胞包括，但不限于，干細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，或脂肪來源的細(xì)胞。
在此使用的術(shù)語“Nell肽(Nel樣分子-1，Nel(一種蛋白質(zhì)，高表達(dá)于神經(jīng)組織編碼的表皮生長因子樣的結(jié)構(gòu)域))”可以是NELL1或NELL2多肽，或者他們的片段；NELL1或NELL2相關(guān)的多肽，或他們的片段；任何與“NELL肽”高度同源的多肽或其片段。高度同源可以解釋為，與“NELL肽”的同源性大于50％，例如，與“NELL肽”的同源性大于60％，與“NELL肽”的同源性大于70％，或與“NELL肽”的同源性大于80％。肽可以是天然和/或與非突變的野生型序列的重組NELL肽，或與仍舊含有與NELL肽高度同源的突變野生型序列的重組NELL肽。另外，NELL肽可以來源于，但不限于，生物體，如人的細(xì)胞，細(xì)菌，酵母，或昆蟲或植物細(xì)胞。在一些實施例中，術(shù)語“NELL肽”包括NELL肽的結(jié)構(gòu)同等物，功能同等物或構(gòu)象同等物。于此使用的NELL肽結(jié)構(gòu)同等物指含有與NELL肽或NELL肽功能域結(jié)構(gòu)同等的蛋白或肽，或?qū)嵸|(zhì)上與NELL肽或NELL肽功能域結(jié)構(gòu)相似的蛋白或肽。NELL肽的功能同等物是指具有與NELL肽或NELL肽功能域同等物功能相同的蛋白質(zhì)或肽，或與NELL肽或NELL肽功能域功能相似的蛋白或肽。肽的構(gòu)象等同物是指具有與NELL肽或NELL肽功能域的構(gòu)象相同的蛋白或肽，或NELL肽或NELL肽功能域的構(gòu)象基本上相似的蛋白或肽。
在一些實施例中，所述NELL肽可以是NELL肽的衍生物。這里所用的術(shù)語“衍生物”指由NELL肽或其結(jié)構(gòu)等同物，或構(gòu)象等同物衍生而來的化學(xué)或生物的化合物或物質(zhì)。例如這些衍生物可包括，前藥形式，聚乙二醇化的形式，或任何其它形式的能夠使NELL肽更穩(wěn)定或具有更好的親骨性或親油性的NELL肽。在一些實施例中，衍生物可以是連接在聚乙二醇、，聚氨基酸、具有C1-C20的烴基短鏈，或生物相容性聚合物上的NELL肽。在一些實施例中，術(shù)語“衍生物”可包括NELL肽模仿物。肽模仿物的合成在本技術(shù)領(lǐng)域中已有很好的介紹。接下來描述肽(包括肽模仿物)合成的基本程序。
在開始肽合成前，氨基酸(啟始材料)的胺末端可用FMOC(9-氟甲基氨基甲酸酯)或其它保護(hù)基團(tuán)予以保護(hù)，并使用固體載體，如Merrifield樹脂(游離胺)作為起始劑。然后，進(jìn)行步驟(1)至步驟(3)的反應(yīng)，重復(fù)反應(yīng)直到獲得期望的肽(1)用碳二亞胺化學(xué)使游離胺與羧基末端反應(yīng)，(2)純化氨基酸序列，和(3)在溫和的酸性條件下去除保護(hù)基團(tuán)(例如FMOC保護(hù)基團(tuán))產(chǎn)生游離胺。然后肽從樹脂上斷裂下來，生成獨立的肽或肽模仿物。
在一些實施例中，所述肽衍生物包括被物理或化學(xué)修飾的NELL肽。物理修飾的肽可以是，例如通過離子力的修飾(例如形成帶平衡離子的離子對)、通過氫鍵的修飾、通過pH調(diào)節(jié)的修飾、，通過溶劑選擇修飾、或通過使用不同的蛋白折疊/解折疊序列的修飾，這些修飾可涉及折疊/解折疊溫度，pH值，溶劑，和在不同折疊/解折疊時期的持續(xù)時間的選擇。
在一些實施例中，肽衍生物可包括化學(xué)修飾的NELL肽。例如短烴基團(tuán)(例如，甲基或乙基)可被選擇性地連接到NELL肽分子的一個或多個位點上，以修肽的化學(xué)和/或物理的特性。在一些實施例中，單-，寡-或聚(乙二醇)(PEG)基團(tuán)可被選擇性地連接到NELL肽分子的一個或多個位點上，通過普遍了解的蛋白質(zhì)PEG化程序修飾肽的化學(xué)和/或物理的特性(參見Mok，H.，et al.，Mol.Ther.，11(1)66-79(2005))。
術(shù)語“NELL肽的抑制劑”指能夠抑制NELL肽活性的化學(xué)或生物化合物。此術(shù)語也包括能夠抑制NELL肽表達(dá)的化學(xué)或生物化合物。NELL肽的抑制劑可直接或間接地與NELL肽轉(zhuǎn)錄物或翻譯產(chǎn)物相互作用。例如相互作用的方法可包括(但不限于)，降低NELL肽的轉(zhuǎn)錄或翻譯，降低NELL肽轉(zhuǎn)錄物或蛋白產(chǎn)物的穩(wěn)定性，減低NELL肽轉(zhuǎn)錄物或蛋白產(chǎn)物的活性，和增加NELL肽轉(zhuǎn)錄物或蛋白產(chǎn)物的降解。術(shù)語“NELL肽的增強(qiáng)劑”指能夠增強(qiáng)NELL肽活性的化學(xué)或生物化合物。該術(shù)語還包括能夠增加NELL肽表達(dá)的化學(xué)或生物化合物。例如相互作用的方法包括但不限于增加NELL肽的轉(zhuǎn)錄或翻譯，增加NELL肽轉(zhuǎn)錄物或蛋白產(chǎn)物的穩(wěn)定性，增加NELL肽轉(zhuǎn)錄物或蛋白產(chǎn)物的活性，和降低NELL肽轉(zhuǎn)錄物或蛋白產(chǎn)物的降解。
術(shù)語“NELL肽受體的調(diào)節(jié)劑”指能夠促進(jìn)或抑制NELL肽受體與NELL肽結(jié)合(或被NELL肽結(jié)合)的化學(xué)或生物化合物，或指無論是否有NELL肽存在都能夠調(diào)節(jié)NELL肽受體活性的化學(xué)或生物化合物。促進(jìn)NELL肽受體與NELL肽結(jié)合(或被NELL肽結(jié)合)和/或促進(jìn)NELL肽受體激活的調(diào)節(jié)劑是指受體的“激動劑”。抑制NELL肽受體與NELL肽結(jié)合(或被NELL肽結(jié)合)和/或NELL肽受體激活的調(diào)節(jié)劑是指受體的“拮抗劑”。無論是否有NELL肽存在都促進(jìn)NELL肽受體激活的調(diào)節(jié)劑是指受體的“激活劑”，而無論是否有NELL肽存在都抑制NELL肽受體激活的調(diào)節(jié)劑是指受體的“抑制劑”。
術(shù)語“NELL肽”，“NELL肽的抑制劑”或“NELL肽受體的“調(diào)節(jié)劑”在整個說明書中也稱為“藥劑”。
術(shù)語“骨病況”可包括，但不限于，1)通過增加或降低骨形成調(diào)節(jié)骨愈合和骨再生，如意外的或醫(yī)源性的整形外科損傷(例如，外傷(如長骨骨折)(見圖7B-D)，或外科手術(shù)(如，脊骨融合)(見圖2、9和10)；2)通過增加或降低骨形成調(diào)節(jié)骨質(zhì)量，而沒有明顯的整形外科損傷指征如股骨頭壞死，骨質(zhì)疏松癥(骨質(zhì)量降低)，骨骼石化癥(骨質(zhì)量增加)；3)通過增加或降低骨形成調(diào)節(jié)骨愈合和骨再生，如意外或醫(yī)源性顱面骨和/或牙周損傷例如，外傷(如，顱面骨骨折)，外科手術(shù)(如，唇裂/腭裂的修復(fù)，頭蓋骨缺損的修復(fù))(見圖4，5和6)或牙齒校正(例如，拔牙，種牙)4)通過增加或降低骨形成調(diào)節(jié)骨質(zhì)量，而沒有沒有明顯的顱面骨和/或牙周損傷(例如或上頜和下頜牙槽脊的再造和/或保存；抑制未成熟的顱蓋骨跨越骨縫過度生長)；5)通過增加在硬體移植位點的骨形成，調(diào)節(jié)骨愈合和骨再生，以促進(jìn)骨整合(例如整個膝蓋骨的移植，牙移植，脊骨移植)；6)通過調(diào)節(jié)肥大軟骨形成來調(diào)節(jié)軟骨的愈合和軟骨的再生(例如在所期望的是非肥大的軟骨的骨病中，防止軟骨肥大，如，引起嚴(yán)重關(guān)節(jié)損傷的關(guān)節(jié)內(nèi)骨折，嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)炎或伴有進(jìn)行性關(guān)節(jié)表面損失的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；在人們期望的是肥大的軟骨的骨病中，促進(jìn)軟骨肥大，，例如加速軟骨內(nèi)骨化；在人們不希望肥大的軟骨的骨病中，防止軟骨肥大，例如膜內(nèi)骨化。) 術(shù)語“干細(xì)胞”可包括，但不限于，成人干細(xì)胞，胎兒干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，間質(zhì)干細(xì)胞，和骨髓干細(xì)胞。
成骨細(xì)胞的形成和功能 成骨細(xì)胞的形成和功能構(gòu)成骨生物學(xué)的兩個重要方面(Aubin，J.E.，Rev Endocr Metab Disord，2001.2(1)p.81-94；Ducy，P.，et al.，Genes Dev，1999.13(8)p.1025-36).這兩個概念是骨誘導(dǎo)和骨再生的中心。根據(jù)Aubin的報道(Aubin，2001)，成骨細(xì)胞的形成包括幾個分化階段，包括起始的基質(zhì)干細(xì)胞定型為成骨祖細(xì)胞譜系，然后分化為成骨細(xì)胞，并最終分化成為骨細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。另一方面，成骨細(xì)胞的功能涉及在基質(zhì)沉積中已分化的成骨細(xì)胞的活性和骨形成。既需要成骨細(xì)胞的形成又需要成骨細(xì)胞功能的骨形成可發(fā)生在胚胎發(fā)育，生長，骨再塑，骨折修復(fù)過程中，以及實驗上通過脫鈣骨基質(zhì)的移植和添加純化的BMP(Id.)而發(fā)生。因此，就適當(dāng)?shù)某晒羌?xì)胞功僅能發(fā)生在適當(dāng)?shù)某晒羌?xì)胞分化過程中而言，成骨細(xì)胞的分化和功能是兩個沒有必然分界的過程。
未分化的基質(zhì)干細(xì)胞定型為骨祖細(xì)胞譜系的首要標(biāo)志是Cbfa1的表達(dá)(Nakashima，K.and B.de Crombrugghe，Trends Genet，2003.19(8)p.458-66；Yamaguchi，A.，T.Komori，and T.Suda，Endocr Rev，2000.21(4)p.393-411)。Cbfa1對于成骨細(xì)胞的形成和功能是必需的。Cbfa1(Cbfa1-/-)裸鼠表現(xiàn)出成骨細(xì)胞和骨生成的完全缺失，在產(chǎn)期階段，因缺少硬肋架無法維持呼吸而導(dǎo)致呼吸功能不全，最終死亡(Komori，T.，et al.，Cell，1997.89(5)p.755-64；Otto，F(xiàn).，et al.，Cell，1997.89(5)p.765-71；Ducy，P.，et al.，Cell，1997.89(5)p.747-54)。同時，雜合子的(Cbfa1+/-)功能缺失小鼠顯示出鎖骨發(fā)育不全，膜成骨發(fā)育延遲和顱骨成骨延遲，進(jìn)而引起引起開放的前囟門和后囟門，較小的顱骨和顱骨間頂骨，多發(fā)的沃姆(氏)骨(骨縫間的小骨)，這是一種類似于人鎖骨發(fā)育不全的表形(CCD)(Otto，F(xiàn).，等人，Cell，1997，89(5)p.765-71；Mundlos，S.，等人，Cell，1997，89(5)p.773-9)。Cbfa1+/-小鼠表型表明膜內(nèi)成骨可能對Cbfa1單倍型機(jī)能不全特別敏感。
根據(jù)已公開的研究，大多數(shù)所描述的骨誘導(dǎo)因子出現(xiàn)在Cbfa1功能區(qū)上游(表1)。例如已知正調(diào)節(jié)Cbfa1轉(zhuǎn)錄的有，BMP2，BMP7，胰島素樣生長因子-I(IGF-I)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)(Nakashima，K.and B.de Crombrugghe，Trends Genet，2003.19(8)p.458-66；Tou，L.，N.Quibria，and J.M.Alexander，Mol CellEndocrinol，2003.205(1-2)p.121-9；Pei，Y.，et al.，Acta PharmacolSin，2003.24(10)p.975-84；Lee，M.H.，et al.，J Cell Biochem，1999.73(1)p.114-25)。表1表明了一些被文獻(xiàn)記載的骨誘導(dǎo)因子成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF2)，甲狀旁腺激素(PTH)(Franceschi，R.T.and G.Xiao，J Cell Biochem，2003.88(3)p.446-54；Kim，H.J.，et al.，J Biol Chem，2003.278(1)p.319-26)，成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFR1)(Zhou，Y.X.，et al.，Hum Mol Genet，2000.9(13)p.2001-8)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，它是血管源性的因子(Zelzer，E.，et al.，Mech Dev，2001.106(1-2)p.97-106)和血小板來源的生長因子(PDGF)，它是一種多功能生長因子，與Cbfa1在生長板血管化中協(xié)同作用(Himeno，M.，et al.，J Bone Miner Res，2002.17(7)p.1297-305)。

Cbfa1的骨誘導(dǎo)特性也已被研究。用腺病毒Cbfa1(Ad Cbfa1)轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMS)表現(xiàn)出體外礦化作用的增加和臨界尺寸顱蓋骨缺失小鼠中骨形成的增加(Zheng，H.，et al.，Calcif TissueInt，2004.74(2)p.194-203)。而且，AdCbfa1和AdBMP2共轉(zhuǎn)導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞(一種鼠科的多能間質(zhì)細(xì)胞系)能在體外協(xié)同刺激成骨細(xì)胞分化，顯著增加皮下移植轉(zhuǎn)導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞的免疫缺陷小鼠體內(nèi)的骨形成(Franceschi，R.T.，et al.，Cells Tissues Organs，2004.176(1-3)p.95-108；Yang，S.，et al.，J Bone Miner Res，2003.18(4)p.705-15).這些研究結(jié)果表明骨祖細(xì)胞群對BMPs的反應(yīng)性能夠通過Cbfa1(骨祖細(xì)胞譜系的主要調(diào)節(jié)因子)在體外和體內(nèi)得到增加(Franceschi，R.T.，et al.，Cells Tissues Organs，2004.176(1-3)p.95-108)。
NELL肽作為Cbfa1的下游靶標(biāo) NELL可以是Cbfa1的下游靶標(biāo)(Kuroda，S.，et al.，Biochem.Biophys Res Commun，1999.26579-86；Ting，K.，et al.，J Bone MinerRes，1999.1480-89).。已知，Cbfa1通過結(jié)合在啟動子區(qū)域中的成骨細(xì)胞特異性的順式作用元件(OSE2)來增強(qiáng)許多目的基因(如I型膠原(Col1-1)，骨涎蛋白(Bsp)，骨橋蛋白(Op)，和Oc)的轉(zhuǎn)錄(Ducy，P.，et al.，Genes Dev，1999.13(8)p.1025-36)。已有研究表明，在人的NELL1基因上存在3個功能的OSE2應(yīng)答成分，這肯定了NELL1是受Cbfa1調(diào)控的基因(見圖11)。
NELL1首次被認(rèn)為與骨的形成有關(guān)，是因為發(fā)現(xiàn)腺病毒NELL1的體外過度表達(dá)能夠選擇性地顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化和礦化，而對非成骨細(xì)胞(如NIH3T3成纖維細(xì)胞)并無這種作用(Zhang，X.，et al.，J Clin Invest，2002.110(6)p.861-70)，并且，體內(nèi)過表達(dá)NELL1的轉(zhuǎn)基因動物過早的骨形成和顱骨跨越骨縫的過度生長均顯著地增加。正如前段所陳述，NELL1的表達(dá)處于下游，并被成骨細(xì)胞形成和發(fā)揮功能的關(guān)鍵介體Cbfa1/Runx2直接調(diào)控，這表明NELL1能更特異性地或優(yōu)先地作用于進(jìn)一步分化的成骨細(xì)胞譜系的細(xì)胞(即定型的成骨細(xì)胞)。
NELL1是種屬間高度保守的。大鼠和人NELL1共有93％的預(yù)見的氨基酸同源性(Ting，K.，et al.，J Bone Miner Res，1999.1480-89)。NELL1有幾個高度保守的結(jié)構(gòu)域，包括一個分泌信號肽，一個NH2-端TSP-1樣模塊，5個chordin樣CR區(qū)和6個EGF樣區(qū)(圖1)(Kuroda，S.，et al.，Biochem Biophys Res Commun，1999.265(1)p.79-86)。大鼠NELL1作為400KD蛋白分泌到基質(zhì)中，其在長時間變性后轉(zhuǎn)變?yōu)?30KD的蛋白(Id.)。這130KD的單體被假定通過盤旋的-螺旋區(qū)或CR域締合成同質(zhì)3聚體(Voorberg，J.，etal.，Journal of Cell Biology，1991.113(1)p.195-205)。研究顯示NELL1可能關(guān)鍵性地介調(diào)Cbfa1的下游作用，如維持成骨細(xì)胞的分化和功能。
在體內(nèi)，內(nèi)源性的NELL1表達(dá)已鑒定出與延伸著的融合骨縫的骨前沿時空上相對應(yīng)。過度表達(dá)NELL1的轉(zhuǎn)基因小鼠也顯示出病理性的骨性顱蓋骨跨越顱縫的過度生長(Zhang，X.，et al.，JClin Invest，2002.110(6)p.861-70)。
NELL1對Cbfa1缺陷后的某些方面的功能性補(bǔ)償進(jìn)一步證明了，在成骨細(xì)胞分化和功能方面NELL1是Cbfa1的下游介體。在一項研究中，檢測了NELL1過度表達(dá)的小鼠(NELL1overexp)與Cbfa1+/-小鼠交的F2子代。在推測會缺失定型的成骨細(xì)胞的NELL1overexp+Cbfa1-/-小鼠中，，觀察到成骨細(xì)胞表型最小程度地補(bǔ)救。此外，NELL1overexp Cbfa1-/-小鼠顯示出增加的軟骨細(xì)胞肥大(見圖7)，這提示NELL1在軟骨內(nèi)成骨相關(guān)過程中發(fā)揮重要作用。應(yīng)該含有定型的但功能還不完善的成骨細(xì)胞的NELL1overexpCbfa1+/-小鼠，11只中有9只，顯示出由正常的CCD樣表型確定的挽救(Otto，F(xiàn).，et al.，Cell，1997.89(5)p.765-71)。通過茜素紅和阿爾新藍(lán)染色及顯微CT分析，確認(rèn)了NELL1overexpCbfa1+/-小鼠與非補(bǔ)救性的Cbfa1+/-小鼠相比，其囟門的尺寸和縫的寬度相當(dāng)?shù)匦?，并伴有程較小的發(fā)育不全的鎖骨。
這些研究的結(jié)果還顯示1)Cbfa上調(diào)NELL1的表達(dá)；2)在易感細(xì)胞類型中，NELL1的過度表達(dá)可選擇性地增強(qiáng)成骨細(xì)胞樣的分化(即增強(qiáng)的ALP活性，增加的OP和OC的表達(dá))3)NELL1過度表達(dá)作用于進(jìn)一步分化的成骨細(xì)胞的細(xì)胞；4)NELL1過度表達(dá)增加了跨越骨縫的骨性過度生長；5)NELL1過度表達(dá)可對Cbfa1缺失的某些方面予以功能性的補(bǔ)償；6)NELL1過度表達(dá)選擇性地增強(qiáng)了與軟骨內(nèi)骨形成相關(guān)的過程(如軟骨細(xì)胞肥大)。
NELL肽對非顱面骨的骨生成同樣有作用。例如已研究了轉(zhuǎn)導(dǎo)的(Ad NELL1對由長骨分離的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)的體外效應(yīng)和在裸鼠中注射Ad NELL1的體內(nèi)效應(yīng)。該研究發(fā)現(xiàn)AdNELL1轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMSC細(xì)胞跟Adβ-半乳糖苷酶(Adβ-Gal)對照相(圖3)比，顯示出鈣化骨節(jié)的形成明顯增強(qiáng)。Ad NELL1注射導(dǎo)致在肌肉組織中有異位鈣化節(jié)的形成，說明NELL1可增強(qiáng)非顱面成骨細(xì)胞的分化和骨形成。
此外，NELL肽還可上調(diào)成骨細(xì)胞分化的標(biāo)記物，并與BMP蛋白，TGFβ蛋白，F(xiàn)GF，IGF(胰島素樣生長因子)，VEGF，或它們的組合協(xié)同作用，提高體外骨分化標(biāo)記物的表達(dá)(例如ALP，OC)和體內(nèi)的骨形成(見圖8)。比如，NELL2和BMP2可協(xié)同性作用誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。圖8顯示的例子表明NELL肽，如NELL2和NELL1，能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化以促進(jìn)骨的形成。
因此，在一些實施例中，本發(fā)明提供了鑒別誘導(dǎo)NELL肽表達(dá)的分子的方法。方法包括(1)用測試化合物接觸NELL啟動基因，(2)檢測NELL1啟動基因表達(dá)的水平，(3)比較用測試化合物的與不用測試化合物的NELL1啟動基因的表達(dá)水平(4)如果用測試化合物的與不用測試化合物的NELL1啟動基因的表達(dá)水平不同，則指定測試該化合物為NELL肽表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。在一些實施例中，方法步驟還包括(5)如果使用測試化合物的NELL1啟動基因的表達(dá)水平低于不使用測試化合物的NELL1啟動基因的表達(dá)水平，則指定該調(diào)節(jié)劑為抑制劑，或者(6)如果使用測試化合物的NELL1啟動基因的表達(dá)水平高于不使用測試化合物的NELL1啟動基因的表達(dá)水平，則指定該調(diào)節(jié)劑為增強(qiáng)劑。根據(jù)本方法鑒定的調(diào)節(jié)劑可用于調(diào)節(jié)哺乳動物中NELL肽表達(dá)水平。
表達(dá)NELL肽的系統(tǒng) NELL1肽是可由NELL1基因，或cDNA或RNA或他們的片斷表達(dá)的一種蛋白。這樣的NELL基因，cDNA，RNA或他們的片段包括編碼人的NELL1肽或者其片段的SEQ ID NO1-11，編碼小鼠的NELL1肽或其片段的；SEQ ID NO17-71，編碼大鼠的NELL1肽或其片段的SEQ ID NO75和76。NELL1肽可包括NELL1肽的片斷，NELL1肽可包括仍保持著誘導(dǎo)骨細(xì)胞分化，成骨細(xì)胞分化骨形成，或軟骨的再生的能力的NELL1肽片段。
NELL2肽是可由NELL2基因，cDNA或RNA或他們的片段表達(dá)的一種蛋白。這種NELL2基因，cDNA或RNA或他們的片段包括編碼人NELL2肽或其片段的SEQ ID NO12-16，編碼小鼠NELL肽或其片段的SEQ ID NO72-74，編碼大鼠NELL肽或其片段的SEQ ID NO77-81。NELL2肽可包括仍保持著與所述NELL2肽相似的活性的NELL2肽片段。
NELL1或NELL2肽可表達(dá)于核酸構(gòu)造物，這些核酸結(jié)構(gòu)包括上述NELL1或NELL2基因。在一個實施例中，本發(fā)明包括一種使用昆蟲細(xì)胞系表達(dá)功能性NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的方法。在一個實施例中，昆蟲細(xì)胞可以是高五細(xì)胞(high five cell)，Sf9和其他Sf細(xì)胞。
在一個實施例中，本方法可包括提供一種編碼所述NELL1或NELL2肽的核酸序列。該核酸序列也可以包括一些序列，例如具有基本相似性的序列(如具有與上述序列的任何部分至少75％序列相似的序列)。
在一些實施例中，核酸可包括表達(dá)編碼NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的核酸的表達(dá)載體。例如，表達(dá)載體可以是pIZT/V5-His(Invitrogen)，和包括殺稻瘟和新霉素的選擇性標(biāo)記物。
在一些實施例中，核酸序列還可以包括附加的核酸，該附加的核酸編碼報告基因產(chǎn)物以監(jiān)測基因的表達(dá)水平，或者編碼能夠使用本領(lǐng)域已知方法使其直觀可視的肽標(biāo)記，以監(jiān)測肽的表達(dá)水平?？蛇x擇附加序列，使其不影響核酸的表達(dá)或表達(dá)的肽產(chǎn)物的功能性。
核酸構(gòu)造物可包括編碼信號肽的核酸序列。這樣的信號肽可以是任何NELL信號肽。這些信號肽可以是人，大鼠，小鼠或狗NELL信號肽。其他一些NELL信號肽包括但不限于，由核酸SEQ ID NO88編碼的人NELL2信號肽SEQ ID NO89，核酸SEQ ID NO90編碼的大鼠NELL2信號肽SEQ ID NO91，核酸SEQ ID NO92編碼的小鼠NELL2信號肽SEQ ID NO93和核酸SEQ ID NO94編碼的狗NELL2信號肽SEQ ID NO95。核酸可包括用于表達(dá)編碼NELL肽的核酸序列的表達(dá)載體。而且，這些核酸序列可包括編碼報告基因產(chǎn)物以監(jiān)測基因表達(dá)水平的附加核酸?；蛘呔幋a能夠通過本領(lǐng)域已知方法使其直觀可視的肽標(biāo)志，以監(jiān)測肽表達(dá)的水平。
核酸構(gòu)造物可包括表達(dá)載體和克隆載體，載體應(yīng)該包含一個選擇基因，也稱為可選標(biāo)記物，如編碼對于轉(zhuǎn)化了載體的宿主細(xì)胞存活或生長是必要的基因。這一基因的存在保證了任何刪除該載體的宿主細(xì)胞不會獲得在生長和再生上超過轉(zhuǎn)化的宿主的優(yōu)勢。典型的選擇基因編碼(a)賦予對抗抗生素或其他毒素(例如氨芐西林，新霉素，氨甲喋呤，四環(huán)素)的抗性；(b)補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷的蛋白。
核酸構(gòu)造物可以包括一個啟動子，該啟動子能夠被宿主生物識別，并可被可操作地連接到編碼NELL的核酸上。啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因起始密碼子上游(通常在100到1000個bp以內(nèi))的非翻譯序列，啟動子控制他們所控制的核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯，包括可誘導(dǎo)的啟動子和組成啟動子?？烧T導(dǎo)的啟動子是啟動被其控制的DNA轉(zhuǎn)錄水平增加的啟動子，該轉(zhuǎn)錄水平的增加是對培養(yǎng)條件的某些改變的反應(yīng)(如有營養(yǎng)因子或缺乏營養(yǎng)因子或溫度的變化)?，F(xiàn)在已知可被多種潛在的宿主細(xì)胞識別的大量啟動子。一些NELL啟動子核酸序列的例子包括，但不限于，分別編碼人NELL1啟動子，小鼠NELL1啟動子和大鼠NELL1啟動子的SEQ ID NO82，84和86。一些NELL2啟動子核酸序列的例子，但不限于，包括分別編碼人NELL2啟動子，小鼠NELL2啟動子和大鼠NELL2啟動子的SEQ IDNO83，85，和87。
當(dāng)核酸與另一個核酸序列有功能性的關(guān)系時，核酸可被操作性地連接。例如一個DNA如果它表達(dá)參與多肽分泌的前體蛋白，用于前序列或分泌先導(dǎo)的DNA可與一個用于多肽的DNA連接；如果一個啟動子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，它可被操作性地與編碼序列連接；或如果它被定位來促進(jìn)翻譯，就可使一個核糖體結(jié)合位點操作性地連接到一個編碼序列上。
在一個實施例中，本發(fā)明可包括一個核酸結(jié)構(gòu)用來表達(dá)NELL肽，例如在哺乳動物細(xì)胞(如中國倉鼠細(xì)胞CHO細(xì)胞)中表達(dá)NELL1和/或NELL2肽。核酸序列可以是一個編碼至少一個NELL肽功能段的cDNA，基因組DNA或RNA。例如核酸序列可包括上述NELL1或NELL2基因。在一些實施例中，核酸序列還可包括一些序列，例如具有基本的序列相似性的序列(如，與上面所列序列任何部分具有至少75％相似性的序列)。
在一些實施例中，為在哺乳動物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中獲得NELL1和/或NELL2肽產(chǎn)物，NELL1和/或NELL2的表達(dá)系統(tǒng)可包括表達(dá)內(nèi)源性信號肽的核酸或cDNA。在一些實施例中，表達(dá)NELL1和/或NELL2的系統(tǒng)可包括表達(dá)NELL2信號肽的核酸或cDNA。NELL2信號核酸或cDNA整合入表達(dá)NELL1肽的系統(tǒng)中，可使NELL1肽的產(chǎn)剩更有效。
在一個實施例中，本發(fā)明可包括表達(dá)功能性NELL肽的細(xì)胞。在一個實施例中，這一細(xì)胞可以使昆蟲細(xì)胞。在一個實施例中，昆蟲細(xì)胞可以是高五細(xì)胞。
在一個實施例中，細(xì)胞可被編碼NELL肽的核酸構(gòu)造物轉(zhuǎn)染。例如細(xì)胞系可用編碼NELL肽的核酸構(gòu)造物瞬時轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。在一個實施例中，表達(dá)NELL的核酸(例如cDNA)可被克隆到基因表達(dá)載體或病毒顆粒中，該基因表達(dá)載體或病毒顆粒能夠轉(zhuǎn)染細(xì)胞(例如昆蟲細(xì)胞或中國倉鼠細(xì)胞(CHO細(xì)胞))。在一些實施例中，此構(gòu)造物可包括諸如使用信號肽(前胰島素原(Preprotrypsin)，人tPA，免疫球蛋白Ig的輕鏈和Fc段，白介素等的任何一個)的pTB701的載體。pTB701載體已在文獻(xiàn)(Kurodaet al.，Biochemical&Biophysical Research Communications，26579-86(1999))中報道。
該核酸序列也可包括一個編碼NELL肽(如，NELL1或NELL2肽)的核酸序列，該序列和編碼昆蟲分泌信號肽的核酸序列整合。
在一個實施例中，本發(fā)明可包括表達(dá)功能性NELL肽，并能分泌功能性蛋白的細(xì)胞。
在一個實施例中，本發(fā)明可包括一種包含NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的多肽，也可包括分泌信號肽。
在一些實施例中，表達(dá)NELL肽或蛋白的基因序列可包括任何表達(dá)整個NELL分子或其片段的的基因序列。這樣的基因序列可任選地包括非編碼序列。通常，基因組序列可粗略地分為(1)編碼功能蛋白的基因組序列(可包括不同的mRNA拼接變異體)，(2)可調(diào)控功能蛋白表達(dá)的非編碼，非轉(zhuǎn)錄基因組序列(啟動子域，其他非轉(zhuǎn)錄DNA域等等)，(3)可調(diào)控功能蛋白表達(dá)的非編碼，轉(zhuǎn)錄基因組序列(如，tRNA，rRNA，內(nèi)含子，5′和3′末端非翻譯區(qū)，易位因子，基因間區(qū)和數(shù)千的具有反義或不具有反義功能的不同的小而穩(wěn)定的RNA). 每一個DNA分子包含許多基因——遺傳基本的結(jié)構(gòu)和功能單位。一個基因是一個特殊的核苷堿基序列，序列中攜帶著構(gòu)造蛋白質(zhì)所需要的信息，蛋白質(zhì)提供了細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)組分以及生化反應(yīng)所必需的酶。人類基因組估計包含3萬多個基因。
人類基因長度相差非常大，通常延長數(shù)千個堿基，但是只有約10％的基因組已知是包括編碼蛋白序列基因(外顯子)。在許多基因間散在分布著許多沒有編碼功能的內(nèi)含子序列?；蚪M的平衡被認(rèn)為包含其他非編碼區(qū)域(例如，控制序列和基因間區(qū))，這些非編碼區(qū)域的功能尚不清楚。所有活的生物體都由大量的蛋白質(zhì)組成。人類可合成至少10萬種不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是大而復(fù)雜的分子，由稱為氨基酸的亞單位長鏈構(gòu)成。通常組成蛋白質(zhì)的氨基酸有二十種。在基因中，每一個特殊的三個DNA堿基序列(密碼子)指導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成器加入特殊的氨基酸。例如，堿基序列ATG編碼甲硫氨酸。因為三個堿基編碼一個氨基酸，所以由平均大小的基因(3000堿基)編碼的蛋白質(zhì)包含1000個氨基酸。因此，遺傳密碼是一套密碼子，它具體決定需要用哪一個氨基酸來制造特定的蛋白質(zhì)。
基因中編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息通過信使RNA(mRNA)被間接傳遞，mRNA是與單鏈DNA相似的一種短暫的中間分子。為了表達(dá)基因中的信息，從細(xì)胞核中的DNA模板產(chǎn)生一種互補(bǔ)的RNA單鏈(這一過程稱為轉(zhuǎn)錄)。這個mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板。然后，細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成器將密碼子翻譯成氨基酸鏈，這一氨基酸鏈將組成密碼子所編碼的蛋白質(zhì)分子。在實驗室，mRNA分子可被分離并用于合成互補(bǔ)DNA(cDNA)單鏈的模板，然后cDNA可被用于染色體圖上相關(guān)基因的定位。
在一些實施例中，所述組合物可通過與其他化學(xué)藥品結(jié)合或納入納米籠或生物材料中來使組合物穩(wěn)定化，直至其成功遞送。在人類，非編碼區(qū)域比編碼區(qū)域要多?；蚪M中的非編碼部分扮演著重要的調(diào)節(jié)角色。至少一半的人類基因組被轉(zhuǎn)錄。約95％的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是非編碼RNA(ncRNA)，它不僅僅包括tRNA，rRNS還有內(nèi)含子，5′和3′末端非翻譯區(qū)，易位因子，基因間區(qū)和數(shù)千個不同的小而穩(wěn)定的RNA.納米籠或生物材料可作為下述的載體或框架。
在人和嚙齒動物之間，大量的這些轉(zhuǎn)錄區(qū)域是進(jìn)化保守的(人和小鼠間有近95％的保守)，提示了保留的功能。大部分這些非編碼RNA的的首要特征是他們的反義功能他們能通過或多或少的延伸堿基配對互補(bǔ)性尋找到另一個RNA。這已被snoRNA和miRNA說明。ncRNA實現(xiàn)著一些意料之外的功能。他們在調(diào)節(jié)細(xì)胞過程(包括發(fā)育，異染色質(zhì)形成，轉(zhuǎn)錄，選擇性剪接和編輯，核酸的化學(xué)修飾和真核生物基因組穩(wěn)定性)中扮演著重要的角色。雖然大多數(shù)具有被精確描述功能的ncRNA是普遍存在的，但大多數(shù)新確定的ncRNA被發(fā)現(xiàn)是被發(fā)育調(diào)節(jié)的，即，以性別，組織或細(xì)胞特異的方式表達(dá)。在反義ncRNA中，正迅速出現(xiàn)一個大家族微小RNA(miRNA).他們在高級生物體中高度保守，，參與暫時的細(xì)胞譜系決定和組織特異性基因調(diào)節(jié)，并調(diào)節(jié)各種發(fā)育和生理過程。他們共同的行為模式是靶向定位于mRNA以便破壞或抑制翻譯。
NELL肽的抑制劑 本發(fā)明的一個方面，所述藥物組合物可包括NELL肽活性抑制劑，用來治療，預(yù)防或改善伴隨未成熟的或過度的骨形成的骨病。這些藥劑可以是但不限于，NELL1抑制劑或NELL2抑制劑或他們的組合。術(shù)語“NELL肽抑制劑”已在發(fā)明概述部分描述。
任何用來篩選生物活性化合物(如，蛋白質(zhì))抑制劑的化驗方法都可用來篩選NELL肽抑制劑。一些化驗方法在PCT/2003/029281(WO 2004/024893)中已有描述。
典型的NELL1或NELL2抑制劑包括任何能夠在轉(zhuǎn)錄期(如，Cbfa1特異性的siRNA，抗體，因為NELL1或NELL2在啟動子中包含Cbfa1的結(jié)合位點)和/或翻譯期(如，NELL1特異性的siRNA，NELL2特異性的siRNA，或結(jié)合NELL1或NELL2的受體比如，NELL1或NELL2特異性的抗體)特異性地抑制NELL1或NELL2的藥劑。
NELL肽的增強(qiáng)劑 在另一實施例中，提供了一種包含一個或多個NELL肽增強(qiáng)劑的藥物組合物。
NELL肽受體的調(diào)節(jié)劑 本發(fā)明的進(jìn)一步一個方面，所述藥物組合物可包含NELL肽受體的調(diào)節(jié)劑。NELL1和NELL2蛋白是結(jié)合在膜結(jié)合的受體上的分泌分子(Kuroda，S.，等人，Biochem.Biophys Res Commun，265(1)p.79-86)(1999)。
NELL肽受體調(diào)節(jié)劑可用任何已確定的篩選受體調(diào)節(jié)劑的方法來鑒別。在一個實施例中，NELL肽受體調(diào)節(jié)劑可通過競爭性的結(jié)合來篩選。例如，一種篩選這種調(diào)節(jié)劑的方法，可包括以下步驟(1)使NELL肽受體分子與試驗化合物接觸，(2)使NELL肽與受體分子和試驗化合物接觸，(3)檢測NELL肽與受體分子在有試驗化合物時的結(jié)合程度，(4)對比NELL肽與受體分子，在有試驗化合物時結(jié)合的程度和對照的結(jié)合程度，其中對照是通過檢測NELL肽在沒有試驗化合物時與受體分子結(jié)合程度得來的，(5)如果有試驗化合物時NELL肽與受體分子的結(jié)合程度不同于對照組的結(jié)合程度，則認(rèn)為該試驗化合物是NELL肽的調(diào)節(jié)分子。調(diào)節(jié)劑可被認(rèn)為是受體的拮抗劑或激動劑。如果有試驗化合物時的NELL肽與受體分子結(jié)合的程度低于對照組，則調(diào)節(jié)劑是NELL肽受體的拮抗劑。如果有試驗化合物時的NELL肽與受體分子的結(jié)合程度高于對照組，則調(diào)節(jié)劑是NELL肽受體的激動劑。
在一些實施例中，所述的NELL調(diào)節(jié)劑可包括穩(wěn)定或降解NELL和/或NELL肽受體的分子，還有在最初的受體連接后參與NELL受體復(fù)合體的穩(wěn)定化和磷酸化作用的分子。在一些實施例中，所述調(diào)節(jié)劑可包括上述激動劑和拮抗劑的激動劑和拮抗劑。例如，包含NELL拮抗劑的抑制劑的組合物可增加骨的代謝。在所有案例中，請將臨床應(yīng)用擴(kuò)展到包括之前段落討論的那些。
NELL肽受體的調(diào)節(jié)劑可通過人工篩選或自動化系統(tǒng)(如，基于組合化合的系統(tǒng))來篩選?；诮M合化合的檢測系統(tǒng)的一個例子在PCT/2003/029281(WO 2004/024893)有描述。
軟骨的再生 關(guān)節(jié)軟骨由大部分水(60-80％重量百分比)構(gòu)成，其余的ECM主要含有II型膠原質(zhì)(干重的50-90％)和蛋白多糖(5-10％)。僅有少量的其他膠原質(zhì)和次要的ECM分子。正是ECM進(jìn)入不同區(qū)域的組織，以及不同區(qū)域中水與ECM的相互作用提供了韌性，跨關(guān)節(jié)的生物機(jī)械力的吸收和傳送需要這一韌性，同時無摩擦的關(guān)節(jié)表面是關(guān)節(jié)運動所需要的。據(jù)報道，人的髖關(guān)節(jié)在平時走路和跳躍時的壓力分別達(dá)到4MPa和20Mpa！同關(guān)節(jié)軟骨一樣令人驚異的是，它表現(xiàn)出非常不幸的最小的修復(fù)能力。超過2000萬的美國人經(jīng)受著關(guān)節(jié)炎和退行性關(guān)節(jié)病的折磨，每年承擔(dān)的相關(guān)費用超過了600億美元。各種各樣的支架，細(xì)胞因子和生長因子在軟骨組織工程中被研究(參見Frenkel，S.R.，et al.，Ann.Biomed.Eng.3226-34(2004)；Tuli，R.，et al.，Arthritis Res.Ther.5235-238(2003)；and Ashammakhi，N.and Reis，RL.Topics in Tissue Engineering，Vol.2，2005)關(guān)于靜態(tài)對動態(tài)的壓縮，切應(yīng)力，流體靜力學(xué)壓力，流體流動，電流動電勢，生物反應(yīng)器，加載在軟骨細(xì)胞上生物應(yīng)答的復(fù)合物和組織重建已經(jīng)被廣泛地研究，關(guān)于其動力傳導(dǎo)途徑的綜述見(Ashammakhi，N.and Reis，RL Tissue Engineering，Vol.2，2005圖7A-D) 因此，本發(fā)明進(jìn)一步的一個方面，這里提供的藥物組合物包括了至少一種NELL肽或一種NELL肽受體的激動劑，其量為誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞形成軟骨的有效的量。在有或無細(xì)胞，有或無機(jī)械刺激，有或無附加生長因子的情況下，NELL蛋白，肽，DNA，RNA，NELL激動劑和拮抗劑的抑制劑可單獨地使用或與支架聯(lián)合使用。例如，在一個實施例中，藥物組合物可在椎間盤的再生軟骨，關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)和再生中發(fā)揮有效的作用。在另一實施例中，在組織工程中，藥物組合物在通過體外(ex vivo)基因治療形成軟骨和在有或無支架存在情況下將蛋白質(zhì)應(yīng)用到細(xì)胞中有效地發(fā)揮作用。
依賴于遞送方法和局部環(huán)境，包括一種NELL肽(如，一種NELL1肽)的組合物可用于誘導(dǎo)骨原細(xì)胞(如，軟骨細(xì)胞或成軟骨細(xì)胞)，分化和只形成軟骨。例如，在關(guān)節(jié)軟骨缺損時，此處所述的組合物可誘導(dǎo)軟骨形成細(xì)胞(如，軟骨細(xì)胞/成軟骨細(xì)胞)只形成軟骨。組合物作為一種支架或載體應(yīng)用于缺失的軟骨部位。在一些實施例中，組合物可任選地包括細(xì)胞(干細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞等)。在一些實施例中，組合物可應(yīng)用于基因治療。
還在一些實施例中，組合物可用于軟骨組織工程。例如，當(dāng)成軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于一種振蕩的間歇性壓力環(huán)境中時，NELL1肽可包括成軟骨細(xì)胞以便分化并形成軟骨。在這些實施例中，振蕩壓力的持續(xù)時間也發(fā)揮著重要的作用。例如，如果振蕩壓力持續(xù)應(yīng)用，含NELL1肽的組合物可誘導(dǎo)軟骨內(nèi)的骨形成。。因此，應(yīng)該間歇性地實施振蕩壓力，以便骨原細(xì)胞(如，軟骨細(xì)胞/成軟骨細(xì)胞)的分化停留在軟骨階段，這就防止了細(xì)胞分化為軟骨內(nèi)的骨形成。。
因此，在一些實施例中，此處所述組合物可用于軟骨再生/修復(fù)，如，關(guān)節(jié)軟骨盤和椎間盤的修復(fù)。
此處公開的藥物組合物可用于治療，預(yù)防或改善其他軟骨病的例子，包括但不限于，軟骨鈣質(zhì)沉著病，骨關(guān)節(jié)炎，和/或以病理性軟骨退化為特征的其他疾病。
其他藥劑 在一些實施例中，此處所述藥物組合物可包括NELL肽和其他能夠有效促進(jìn)骨生成的藥劑。這種其他要劑包括，如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)如，BMP-1，BMP-2，BMP-3，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-8，BMP-9，BMP-10，BMP-11，BMP-12，BMP-13，BMP-14，BMP-15，BMP-16，BMP-17，BMP-18，BMP-19，BMP-20，BMP-21，F(xiàn)GF(成纖維細(xì)胞生長因子，如，F(xiàn)GF1，F(xiàn)GF2，F(xiàn)GF4，F(xiàn)GF7，F(xiàn)GF10，F(xiàn)GF19，F(xiàn)GF21，F(xiàn)GF23)，TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子-β，如TGF-β1)，IGF(胰島素樣生長因子，如，IGF-I)，VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)，PDGF(血小板源性生長因子)，PTH(甲狀旁腺激素)/PTHrp(甲狀旁腺激素調(diào)節(jié)蛋白)，氧化型膽固醇，親脂抑制素，生長/分化因子5(GDF5)；和至少存在三種剪切體的LIM礦化蛋白(LMPs)。一些關(guān)于這些因子和他們發(fā)揮作用機(jī)制的研究參見文獻(xiàn)Nakashima，K.and B.de Crombrugghe，Trends Genet，2003.19(8)p.458-66；Tou，L.，N.Quibria，and J.M.Alexander，Mol CellEndocrinol，2003.205(1-2)p.121-9；Pei，Y.，et al.，Acta PharmacolSin，2003.24(10)p.975-84；Lee，M.H.，et al.，J Cell Biochem，1999.73(1)p.114-25；Franceschi，R.T.and G.Xiao，J Cell Biochem，2003.88(3)p.446-54；Kim，H.J.，et al.，J Biol Chem，2003.278(1)p.319-26；Zelzer，E.，et al.，Mech Dev，2001.106(1-2)p.97-106；Himeno，M.，et al.，J Bone Miner Res，2002.17(7)p.1297-305；Kha，H.T.et al.J Bone Miner Res 19，830-40，2004；Izumo，N.et al.Methods Find Exp Clin Pharmacol 23，389-94，2001；Hatakeyama，Y.et al.J Cell Biochem 91，1204-17，2004；Pola，E.et al.Gene Ther11，683-93，2004).一項研究報道說，激活突變的FGF受體1(FGFR1)顯著增加小鼠體內(nèi)Cbfa1的表達(dá)，成骨細(xì)胞的增殖和分化，以及骨性顱骨跨越骨縫的過度生長(Zhou，Y.X.，et al.，Hum Mol Genet，2000.9(13)p.2001-8). 在一個實施例中，藥物組合物含有NELL1肽和BMP肽。作為例子，人的骨肉瘤細(xì)胞株，(Saos-2)(McQuillan，D.J.，et al.，Bone，1995.16(4)p.415-26；Fedde，K.N.，Bone Miner，1992.17(2)p.145-51)，分別與100ng/ml和200ng/ml劑量的重組NELL1和BMP2蛋白培養(yǎng)。試驗結(jié)果顯示，相對于BMP2培養(yǎng)，NELL1/BMP2聯(lián)合培養(yǎng)使ALP的活性增加了5倍，這一結(jié)果表明NELL1可增加成骨細(xì)胞樣細(xì)胞群對BMPs的應(yīng)答。
在一些實施例中，此處所述組合物可任選地包括誘導(dǎo)LIM蛋白。
在一些實施例中，此處所述組合物可特定地排除一種或多種上述藥劑。
劑量 NELL肽和其他藥劑的劑量可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，基于藥劑的類型，疾病和其他因素(如年齡和性別)來決定。
在一個實施例中，在有或無特殊載體或支架的情況下，骨形成所需NELL肽的劑量，其范圍通常在0.001Pg/mm2到1Pg/mm2之間，或更優(yōu)選的在0.001ng/mm2到1ng/mm2之間，或更優(yōu)選的在0.001μg/mm2到1μg/mm2之間，或更適宜的在0.001mg/mm2到1mg/mm2之間，或更優(yōu)選的在0.001g/mm2到1g/mm2之間。在另一實施例中，在有或無特殊載體或支架情況下，骨形成所需NELL肽的劑量，其范圍通常在0.001pg/ml到1pg/ml之間，或更優(yōu)選的在0.001ng/ml到1ng/ml之間，或更優(yōu)選的在0.001μg/ml到1μg/ml之間，或更優(yōu)選的在0.001mg/ml到1mg/ml之間，或更優(yōu)選的在0.001g/ml到1g/ml之間。在另一實施例中，在有或無特殊載體或支架的情況，骨形成所需NELL肽的劑量，其范圍通常在0.001pg/kg到1pg/kg之間，或更優(yōu)選的在0.001ng/kg到1ng/kg之間，或更優(yōu)選的在0.001μg/kg到1μg/kg之間，或更優(yōu)選的在0.001mg/kg到1mg/kg之間，或更優(yōu)選的在0.001g/kg到1g/kg之間。而且，可以理解，，所有劑量可以是連續(xù)給藥或按一個特定的時間段分別給藥。時間段的例子包括，但不限于，每一小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時24小時、48小時、72小時、或每1周、2周、4周、或每1個月、2個月、4個月等等。
然而，因為NELL肽可能影響體外成骨細(xì)胞調(diào)亡(Zhang，X.，et al.，J Bone Miner Res，2003.18(12)p.2126-34)，所以顯著高于最佳范圍的NELL(如NELL1)劑量不能夠增加骨的形成。因此，更優(yōu)選的NELL肽劑量不應(yīng)該明顯高于最佳的劑量范圍。可根據(jù)一些因素調(diào)整更優(yōu)選的最佳NELL肽的劑量范圍，如，哺乳動物類受治療的主體的類型，年齡，部位，性別，使用的載體或支架的材料，以及不同NELL肽的純度和強(qiáng)度。在一個實施例中，更優(yōu)選的NELL肽的劑量范圍包括，但不限于，從1ng/mm2到100ng/mm2，或更優(yōu)選的從100ng/mm2到1000ng/mm2，或更優(yōu)選的從1μg/mm2到100μg/mm2，或更優(yōu)選的從100μg/mm2到1000μg/mm2。在另一實施例中，更優(yōu)選的NELL肽的劑量范圍包括，但不限于從1ng/ml到100ng/ml，或更優(yōu)選的從100ng/ml到1000ng/ml，或更優(yōu)選的從1μg/ml到100μg/ml，或更優(yōu)選的從100μg/ml到1000μg/ml。但在另一實施例中，在有或無特殊的載體或支架的情況下，更優(yōu)選的NELL肽的劑量范圍通常為從1μg/kg到100μg/kg，或更優(yōu)選的從100μg/kg到1000μg/kg，或更優(yōu)選的從1mg/kg到100mg/kg。而且，可以理解，，所有劑量可以是連續(xù)給藥或按一個特定的時間段分段給藥。時間段的例子包括，但不限于，每一小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時24小時、48小時、72小時、或每1周、2周、4周、或每1個月、2個月、4個月等等。此處所述的“顯著高于最佳的范圍”是指，例如，高于最佳范圍大約1％到大約50％，大約5％到大約50％，大約10％到大約50％，大約20％到大約50％，大約30％到大約50％，或大約40％到大約50％。
根據(jù)抑制劑種類，需要治療、預(yù)防或需要改善的骨或軟骨病的情況，以及接受含此抑制劑的藥物組合物的哺乳動物主體的年齡，部位和性別等因素調(diào)整NELL肽抑制劑的劑量。通常，在有或無特殊的載體或支架情況下，NELL肽抑制劑的劑量范圍從，但不限于，0.001pg/mm2到1pg/mm2，或更優(yōu)選從0.001ng/mm2到1ng/mm2，或更優(yōu)選的從0.001μg/mm2到1μg/mm2，或更優(yōu)選的從0.001mg/mm2到1mg/mm2，或更優(yōu)選的從0.001g/mm2到1g/mm2。在另一個實施例中，在有或無特殊的載體或支架情況下，NELL肽抑制劑的劑量范圍通常從0.001pg/ml到1pg/ml，或更優(yōu)選地從0.001ng/ml到1ng/ml，或更優(yōu)選地從0.001μg/ml到1μg/ml，或更優(yōu)選地從0.001mg/ml到1mg/ml，或更優(yōu)選地從0.001g/ml到1g/ml。但在另一個實施例，在有或無特定的載體或支架情況下，NELL肽抑制劑劑量范圍通常從0.001pg/kg到1pg/kg，或更優(yōu)選從0.001ng/kg到1ng/kg，或更優(yōu)選從0.001ug/kg到1ug/kg，或更優(yōu)選從0.001mg/kg到1mg/kg，或更優(yōu)選從0.001g/kg到1g/kg，或更優(yōu)選從0.001kg/kg到1kg/kg。而且，可以理解，，所有的劑量可持續(xù)地給藥或按一個特定的時間段分段給藥。時間段的例子包括但不限于，每1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、24小時、48小時、或72小時、或每周、每2周、4周，或每1個月，2月，4月等等。
根據(jù)抑制劑類型，受體的類型，需要治療、預(yù)防或需要改善的骨或軟骨病的情況，以及接受含此受體調(diào)節(jié)劑的藥物組合物的哺乳動物主體的年齡，部位和性別等因素調(diào)整NELL肽受體調(diào)節(jié)劑的劑量。通常，在有或無特殊的載體或支架情況下，NELL肽受體調(diào)節(jié)劑的劑量范圍從，但不限于，0.001pg/mm2到1pg/mm2，或更優(yōu)選從0.001ng/mm2到1ng/mm2，或更優(yōu)選的從0.001μg/mm2到1μg/mm2，或更優(yōu)選的從0.001mg/mm2到1mg/mm2，或更優(yōu)選的從0.001g/mm2到1g/mm2。在另一個實施例中，在有或無特殊的載體或支架情況下，NELL肽受體調(diào)節(jié)劑的劑量范圍通常從0.001pg/ml到1pg/ml，或更優(yōu)選地從0.001ng/ml到1ng/ml，或更優(yōu)選地從0.001μg/ml到1μg/ml，或更優(yōu)選地從0.001mg/ml到1mg/ml，或更優(yōu)選地從0.001g/ml到1g/ml。但在另一個實施例，在有或無特定的載體或支架情況下，NELL肽受體調(diào)節(jié)劑的劑量范圍通常從0.001pg/kg到1pg/kg，或更優(yōu)選從0.001ng/kg到1ng/kg，或更優(yōu)選從0.001ug/kg到1ug/kg，或更優(yōu)選從0.001mg/kg到1mg/kg，或更優(yōu)選從0.001g/kg到1g/kg，或更優(yōu)選從0.001kg/kg到1kg/kg。而且，可以理解，，所有的劑量可持續(xù)地給藥或按一個特定的時間段分段給藥。時間段的例子包括但不限于，每1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、24小時、48小時、或72小時、或每周、每2周、4周，或每1個月，2月，4月等等。
配方載體 此處所述藥物組合物可用于需要通過多種給藥途徑治療的個體，給藥途徑包括口服，胃腸道外給藥(如，靜脈注射，皮下注射，骨髓內(nèi)注射)以鼻內(nèi)給藥，用作栓劑或使用“閃釋”配方(即，使藥物無需用水就在口腔中溶解)，局部給藥，皮下給藥，皮內(nèi)給藥和/或以液態(tài)或固態(tài)形式通過粘膜途徑給藥。藥物組合物可配制成多種劑型，如，提取物，丸劑，片劑，微顆粒，膠囊，口服液。
還可以包括作為藥物組合物一部分的藥理學(xué)兼容的粘合劑和/或佐劑材料。活性材料可與其他活性材料混合，包括抗生素，抗真菌藥，其他殺病毒藥和免疫興奮劑，這些材料不會削弱預(yù)期的療效和/或補(bǔ)充預(yù)期的療效。
在一個實施例中，此處所述藥物組合物的給藥途徑是口服?？诜慕M合物通常包括惰性的稀釋劑或可食用的載體。他們可密封于明膠膠囊中或壓縮成片劑。為了通過口服治療給藥，上述組合物可摻入賦形劑，以片劑，含片，膠囊，酏劑，懸浮液，糖漿劑，薄脆餅和口香糖等形式使用。然而，依賴于被治療主體的情況，必要時可改變用藥劑量。這些藥劑應(yīng)產(chǎn)生活性成分血清濃度從大約0.01nM到1,000,000nM，例如，從大約0.2到40μM。優(yōu)選的濃度范圍從0.2到20μM，更優(yōu)選的大約從1到10μM。然而，藥物組合物中的活性成分的濃度依賴于藥物的生物利用度和其他本領(lǐng)域已知的因素。
在另一實施例中，此處所述藥物組合物的給藥方式是局部或粘膜給藥。一種特殊的首選粘膜給藥方式是通過女性生殖道給藥。另一首選的粘膜給藥方式是直腸給藥。
多種多樣的聚合和/或非聚合材料可作為提高此處所述藥物組合物粘膜附著性的佐劑。作為佐劑的適宜的聚合材料可以是天然的或合成聚合物。。典型的天然聚合物包括，如，淀粉，殼聚糖，膠原質(zhì)，糖，明膠，果膠，藻酸鹽，karya膠，甲基纖維素，羧甲基纖維素，甲基乙基纖維素和羥丙纖維素。典型的合成聚合物包括，例如，聚(丙烯酸)，黃芪膠，聚(甲基乙烯基醚-共-順丁烯二酸酐)，聚(環(huán)氧乙烷)，聚羧乙烯，，聚(乙烯基吡咯烷)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)，聚卡波非。也可以使用本領(lǐng)域其他可獲得的生物黏附材料(參見，Bioadhesion-Possibilities and Future Trends，Gurny and Junginger，eds.，1990) 需要注意的是，使用的劑量也可隨將要減緩的疾病的嚴(yán)重程度而改變。進(jìn)步理解便是對于任何特殊的主體，應(yīng)該根據(jù)個體的需要以及根據(jù)執(zhí)行或監(jiān)督上述組合物給藥的專業(yè)人員的判斷來調(diào)整特殊的給藥方案。更進(jìn)一步的理解是，上述濃度范圍僅用來舉例，并不能限制本發(fā)明的范圍或?qū)嵤?。活性成分可以一次性給藥，或者也可以分割成小劑量不同時段給藥。
藥物的配方可含有下述成分粘合劑(如微晶纖維素，黃芪膠或明膠)，賦形劑(如淀粉或乳糖)，崩解劑(如海藻酸，羧甲淀粉鈉，玉米淀粉等)，潤滑劑(如硬脂酸鎂或氫化植物油(Sterotes))，助流劑(如膠體的二氧化硅)，甜味劑(如蔗糖或糖精)或調(diào)味劑(如薄荷油，水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑)都可以加入。當(dāng)劑型的單位是膠囊時，，它可含有，除了上述類型的材料外，液態(tài)載體如脂肪油。其他的劑型單位可含有修飾劑型單位的物理形狀的其他各種材料，例如，胞衣。。因此，片劑或丸劑可涂敷糖，蟲膠或其他腸溶包衣劑。用于制備這些組合物的材料應(yīng)該具有藥學(xué)純凈度并且在所用的量是無毒性的。
溶液或懸浮液也可包括下述成分無菌稀釋劑(如注射用水，鹽水溶液，不揮發(fā)性油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他合成溶劑)，抗生劑(如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯)，抗氧化劑(如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)，鰲合劑(如乙二胺四乙酸)，緩沖劑(如醋酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽)，張力調(diào)節(jié)劑(如氯化鈉或葡萄糖)。胃腸道外給藥的藥劑可裝入安瓿瓶，一次性注射器或盛裝倍劑量的玻璃或塑料小瓶中。
本發(fā)明的藥物組合物可用藥學(xué)可接受的載體制備而成。優(yōu)選的這些載體是能夠保護(hù)活性成分不被迅速從體內(nèi)排出的載體，如控制釋放的配方，，包括埋植劑和微囊遞藥系統(tǒng)?？墒褂蒙锝到猓锵嗳菪跃酆衔?，如聚酐，聚乙醇酸，膠原質(zhì)和聚乳酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易的實施制備這些配方的方法。
脂質(zhì)體懸浮液(包括帶有對抗病毒抗原的單克隆抗體的靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也是優(yōu)選的藥理學(xué)可接受的載體。關(guān)于包裝或參合組合物到脂質(zhì)體的方法參見Cozzani，I.；Jori，G.；Bertoloni，G.；Milanesi，C.；Sicuro，T.Chem.Biol.Interact.53，131-143(1985)andby Jori，G.；Tomio，L.；Reddi，E.；Rossi，E.Br.J.Cancer 48，307-309(1983)這些藥劑也可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備，如，美國專利4,522,811的描述(該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本申請中)。例如，可通過在無機(jī)溶劑中溶解適當(dāng)?shù)闹|(zhì)(如，硬脂酰磷脂酰乙醇胺，硬脂酰磷脂酰膽堿，花生酰卵磷脂和膽固醇)，然后蒸發(fā)，在容器表面形成干燥的脂質(zhì)薄膜，然后將活性化合物的水溶液放入容器中，用手搖動容器使脂質(zhì)材料從容器壁上脫落下來，分散脂質(zhì)凝聚物，從而形成脂質(zhì)體懸液。
其他將化合物裝入脂質(zhì)體及遞送至身體目的部位的方法已記述在Sicuro，T.；Scarcelli，V.；Vigna，M.F.；Cozzani，I.Med.Biol.Environ.15(1)，67-70(1987)and Jori，G.；Reddi，E.；Cozzani，I.；Tomio，L.Br.J.Cancer，53(5)，615-21(1986)。
此處所述藥物組合物可通過單劑量(如每日一次)的或多劑量或持續(xù)輸液的方式給藥。本發(fā)明的化合物也可以通過單劑量的或多劑量的方式，單獨或與藥學(xué)上可接受的載體，運載工具或稀釋劑聯(lián)合給藥。合適的藥物載體，運載工具和稀釋劑包括惰性的固態(tài)稀釋劑，充填劑，無菌水溶液和多種有機(jī)溶劑。由本發(fā)明的化合物與藥學(xué)上可接受的載體，運載工具或稀釋劑形成藥物組合物后，迅速以多種劑型，如片劑，粉末，錠劑，糖漿劑，注射液等等給藥。如果需要，藥物組合物根據(jù)特殊的劑型可包含附加成分，如調(diào)味劑，粘合劑，賦形劑等等。
因此，例如，口服給藥時，含有不同賦形劑(如，檸檬酸鈉，碳酸鈣和/或磷酸鈣)的片劑與粘合劑(如聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖，凝膠和/或阿卡膠)一起，與多種崩解劑(如淀粉，海藻酸和/或復(fù)雜的硅酸鹽)一同使用。此外，潤滑劑(如硬脂酸鎂，十二烷基硫酸鈉，滑石)通常對于壓片是有用的。相似的固態(tài)組合物也可以作為填充劑在軟和硬明膠膠囊中使用。優(yōu)選的材料包括乳糖，高分子量聚乙二醇。當(dāng)希望把水(制)混懸液或酏劑用于口服給藥時，所述活性藥物試劑可與多種甜味劑或調(diào)味劑，色素或染料一同使用，如果需要還可以加入乳化劑或懸浮劑，稀釋劑如水，乙醇，丙二醇，甘油和/或他們的組合。
為了胃腸道外給藥，可將本發(fā)明化合物溶解到芝麻油，花生油，水性丙二醇，或無菌水溶液中。必要時應(yīng)該將這些水性溶劑進(jìn)行合適的緩沖，液體稀釋劑首先用足夠的鹽或葡萄糖賦予滲透壓。這些特殊的液體溶劑特別適合于靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下和腹膜內(nèi)給藥。。所用的這些無菌的水性介質(zhì)都可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。
鼻內(nèi)給藥或吸入給藥時，可以很方便通過病人擠壓或打氣噴霧器以溶液或懸液的形式實現(xiàn)本發(fā)明化合物的給藥，或通過發(fā)射藥(如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他合適的氣體)提供推進(jìn)力從一個加壓容器或噴霧器噴出以氣溶膠的形式實現(xiàn)本發(fā)明化合物的給藥。使用加壓氣溶膠時，可以通過閥門傳送一定定量的藥劑來控制給藥劑量。加壓容器或噴霧器可含有本發(fā)明化合物的溶液或懸浮液。吸入器或吹入器使用的膠囊或藥筒(由，如明膠成的)可含有本發(fā)明的化合物粉末和合適基質(zhì)的粉末，如乳糖或淀粉的粉末混合物。
此處提供的藥物組合物也可與其他對疾病(如，神經(jīng)紊亂，心血管病，腫瘤，艾滋病，抑郁癥和/或I型和II型糖尿病)有效的藥理活性劑聯(lián)合使用。這些附加的藥劑可以是，如，抗病毒劑，抗生素，抗抑郁劑，抗腫瘤劑，免疫抑制劑，抗真菌藥以及他們的聯(lián)合。
此處所述藥物配方可可以是單獨或與其他藥劑一起，制成單劑型或分次劑型。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，使用一定量的活性成分制備多種藥物配方的方法是已知的，或與公開的內(nèi)容相似。準(zhǔn)備藥物配方的方法可參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pa.，19th Edition(1995)。
支架 在一個實施例中，發(fā)明包括將NELL肽結(jié)合到載體中或基質(zhì)中的方法以及形成基材的方法。。
在一個實施例中，用于誘導(dǎo)骨形成的組合物可包括有效量的誘導(dǎo)骨形成的第一藥劑，選自但不限于NELL肽，如NELL1肽，NELL2肽，改變NELL1肽表達(dá)的藥劑，改變NELL1肽活性的藥劑，改變NELL2肽表達(dá)的藥劑，改變NELL2肽活性的藥劑，和任選的載體。
組合物可包含第二藥劑，包括，但不限于，TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，F(xiàn)GF，IGF(胰島素樣生長因子)，VEGF，膠原質(zhì)，骨，骨基質(zhì)，腱基質(zhì)，韌帶基質(zhì)，骨原性細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞。
在一個實施例中，載體為可生物降解的，如，可通過酶或水解機(jī)制降解的。載體的例子包括但不限于合成的可吸收的聚合物例如，但不限于聚(α-羥酸)如聚(L-丙交酯)(PLLA)，聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)，聚(乙醇酸交酯(PGA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，聚(己內(nèi)酯)，聚(碳酸亞丙酯)，聚(對二氧雜環(huán)己酮)(poly(p-dioxanone))，聚(己內(nèi)酯-共-乙交酯)，聚(乙交酯-碳酸亞丙酯)，聚(D，L-丙交酯-共-碳酸亞丙酯)，聚芳酯，聚β-羥基丁酸酯(PHB)，聚酐，聚(酐-共-酰亞胺)，丙稀共-延胡索酸酯，聚內(nèi)酯，聚酯，聚碳酸酯，聚陰離子聚合物，聚酐，聚酯-酰胺，聚(氨基酸)，同多肽，聚磷腈，聚glaxanone，多糖，聚(原酸酯)，羥乙酸乳酸聚酯(polyglactin)，羥乙酸乳酸聚酯酸(polyglactic acid)，聚糖醛酸，聚丙烯酸，，聚烷酸酯；他們的共聚物和混合物，衍生物，和修飾物。例子可見美國專利4,563,489，和PCT國際申請WO/03024316，此處該2篇文獻(xiàn)聯(lián)合作為參考文獻(xiàn)。其他載體的例子包括纖維類的聚合物，，例如，但不限于，烷基纖維素，羥烷基纖維素，纖維素甲醚，乙基纖維素，羥乙基纖維素，羥丙纖維素，羥丙基-甲基纖維素，羧甲基纖維素和他們的陽離子鹽。其他載體的例子包括合成的和天然的生物陶瓷例如，但不限于，碳酸鈣，磷酸鈣，磷石灰，生物活性的玻璃材料以及珊瑚衍生的碳灰石。參見美國專利申請2002187104，PCT國際申請WO/9731661和PCT國際申請WO/0071083，這些文獻(xiàn)以引用的方式并入本申請中。
在一個實施例中，載體可進(jìn)一步用組合物涂敷，這些組合物包括生物玻璃和/或由固態(tài)成溶膠-凝膠技術(shù)或浸沒技術(shù)衍生而來的磷灰石例如，但不限于，含濃度從大約1.5到7倍于天然血清濃度并且通過多種方法調(diào)整成為pH大約在2.8-7.8，溫度在大約15-65oC的鈣和磷酸鹽溶液的模擬體液，參見美國專利6,426,114和6,013,591，PCT國際申請WO/9117965，以引用的方式并入本申請中。
其他載體的例子包括膠原質(zhì)(如，膠質(zhì)素(Collastat)，Helistat膠原海綿)，透明質(zhì)烷，纖維蛋白，脫乙酰殼多糖，藻酸鹽和ming2膠或他們的混合物。參見PCT國際申請WO/9505846，WO/02085422，其內(nèi)容以引用的方式并入本申請中。
在一個實施例中，載體可包括結(jié)合肝素的藥劑，包括，但不限于，肝素樣聚合物(如硫酸右旋糖酐，磷酸軟骨素，硫酸肝素，墨角藻多糖，藻酸鹽，或他們的衍生物)和通過氨基酸修飾以提高肝素親和力的肽片段，參見Journal of Biological Chemistry(2003)，278(44)，p.43229-43235，其內(nèi)容以引用方式并入本申請中。
在一個實施例中，基質(zhì)可以是液體，固態(tài)或凝膠的形式。
在一個實施例中，基質(zhì)可包括一可流動凝膠的載體。為了可以注射，可對凝膠進(jìn)行選擇，如通過注射器注射到需要骨形成的部位。凝膠可以是化學(xué)的凝膠，此化學(xué)凝膠由基本的鍵合形成，可通過pH，離子基團(tuán)和/或溶劑濃度來控制該凝膠。凝膠也可以是由次級鍵合形成的物理凝膠，此凝膠可以通過溫度和粘度來控制。凝膠的例子包括，但不限于，普流羅尼類(pluronics)，明膠，透明質(zhì)烷，膠原質(zhì)，聚丙交酯-聚乙二醇溶液和綴合物，脫乙酰殼多糖，脫乙酰殼多糖-b-磷酸甘油(BST-凝膠)，藻酸鹽，瓊脂糖，羥丙纖維素，甲基纖維素，聚氧化乙烯，聚丙交酯/乙交酯在N-甲基-2-吡咯(烷)酮中。參見Anatomical Record(2001)，263(4)，342-349，其內(nèi)容以引用的方式并入本申請中。
在一個實施例中，載體可以是可光聚合的，如，通過波長至少大約250nm的電磁輻射?？晒饩酆系木酆衔锇ň垡蚁?PEG)丙烯酸酯衍生物，PEG甲基丙烯酸衍生物，延胡索酸丙二醇酯-共-乙二醇，聚乙烯醇衍生物，PEG-共-聚(-羥基酸)二丙烯酸酯大單體，和修飾的多糖，如透明質(zhì)酸衍生物和葡萄糖甲基丙烯酸酯，參見美國專利5,410,016，以引用的方式并入本申請。
在一個實施例中，基質(zhì)可包含一溫度敏感性載體。例子包含由以下材料制成的載體N-異丙基丙烯酰胺(NiPAM)，用降低的低臨界溶液溫度修飾的NiPAM，和用甲基丙烯酸乙酯和N-丙烯酰琥珀酰亞胺粘合的增強(qiáng)的肽(如，NELL1)，或甲基丙烯酸烷基酯，如甲基丙烯酸丁酯，甲基丙烯酸己酯和甲基丙烯酸十二烷酯(PCT國際申請WO/2001070288；美國專利5,124,151，以引用方式并入本申請中)。
在一個實施例中，載體可有一個表面，該表面由以下物質(zhì)修飾和/或固定細(xì)胞黏附分子，粘合肽和粘合肽類似物，這些物質(zhì)可通過受體介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞-基質(zhì)粘連，和或分子的一部分，該部分可通過非受體介導(dǎo)機(jī)制促進(jìn)粘連，如，但不限于，聚陽離子的聚氨基酸-肽(如，聚賴氨酸)，聚陰離子的聚氨基酸肽，Mefp類黏附分子和其他DOPA-富集的肽(如，聚賴氨酸-DOPA)，多糖，和蛋白聚糖。參見，如PCT國際申請WO/2004005421；WO/2003008376；WO/9734016，以引用方式并入本申請中。
在一個實施例中，載體可包含由鰲合劑組成的載體，例如，但不限于，膠原質(zhì)，明膠，透明質(zhì)酸，海藻酸，聚(乙二醇)，烷基纖維素(包括羥基烷基纖維素)，包括甲基纖維素，乙基纖維素，羥基乙基纖維素，羥基丙基纖維素，羥基丙基-甲基纖維素和羧甲基纖維素，血液，纖維蛋白，聚氧乙烯氧化物，硫酸鈣半水合物，碳灰石，羧基乙烯基聚合物，以及聚(乙烯醇)，參見，美國專利6,620,406，以引用方式并入本申請。
在一個實施例中，載體可包含表面活性劑來促進(jìn)NELL1或NELL2的穩(wěn)定性和/或在載體材料中的分布例如，但不限于，聚氧酯(如，聚山梨酸酯80，聚山梨酸酯20或泊洛沙姆F-68)。
在一個實施例中，載體可包含緩沖劑，例如，但不限于，甘氨酸，谷氨酸鹽酸鹽，氯化鈉，胍，肝素，谷氨酸鹽酸鹽，乙酸，琥珀酸，聚山梨酸酯，硫酸葡聚糖，蔗糖，和氨基酸。參見，美國專利5,385,887，以引用方式并入本申請。在一個實施例中，載體可包含材料的組合，如，上述材料的組合。
作為例子，載體可以是PLGA/膠原質(zhì)載體膜。該膜可以浸入一種藥劑的溶液中，該藥劑包括，NELL1肽，NELL2肽，或他們的混合物。
在一個實施例中，用于人體的植入片可包含一種基質(zhì)，該基質(zhì)包含上述的一種或多種足夠量的可誘導(dǎo)植入片最近的骨形成的藥劑，比如包含NELL1肽，NELL2肽，或他們的混合物。
在一個實施例中，用于人體的植入片可包含具有一表面的基質(zhì)，該表面包含足夠量的可誘導(dǎo)植入片最近的骨形成的一種藥劑，例如NELL1肽，NELL2肽，或他們的混合物。
在一個實施例中，用于人體的植入片可包含具有一表面的基質(zhì)，該表面包含足夠量的誘導(dǎo)骨形成的骨原細(xì)胞，和例如NELL1或NELL2。在一個實施例中，植入片可種植細(xì)胞，這些細(xì)胞包括，但不限于，自體細(xì)胞，骨原性細(xì)胞或成骨細(xì)胞，表達(dá)NELL肽(如NELL1肽，NELL2肽或他們的混合或其他骨原性分子)的細(xì)胞。
植入片可包含一種基質(zhì)，該基質(zhì)被制成網(wǎng)，栓，螺絲，板，或假關(guān)節(jié)形狀。作為例子，一種基質(zhì)可以是牙齒形或矯正植入片形，而且可以含有藥劑例如NELL1肽，NELL2肽或他們的混合物用來提高植入片最近的骨整合。植入片可包含一種基質(zhì)，該基質(zhì)是可再吸收的，例如一種含有膠原質(zhì)的基質(zhì)。
在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包含在一個時間緩釋片劑中。
一種試劑，例如NELL肽(如，NELL1肽，NELL2肽或他們的混合物)可于藥學(xué)可接受的載體結(jié)合，形成藥物組合物?？山邮艿妮d體可包含生理學(xué)可接受的化合物，其具有穩(wěn)定化合物或增加或降低藥劑的吸收的作用。生理學(xué)可接受化合物可包括，例如，糖類，(如葡萄糖，蔗糖，或葡聚糖，)抗氧化劑(如，抗壞血酸或谷胱甘肽)，鰲合劑，低分子量蛋白質(zhì)，降低抗有絲分裂劑清除或水解的組合物，或賦形劑或其他穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。
其他生理學(xué)上可接受的化合物包括保濕劑，乳化劑，分散劑或防腐劑，防腐劑對于防止微生物的生長和活動有特效。各種各樣的防腐劑是已知的，其包括，例如苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，載體(包括生理學(xué)上可接受的化合物)的選擇依賴于如，給藥途徑 根據(jù)給藥方法，組合物可以多種單位劑型給藥。例如，合適的單位劑型可包括粉末劑，片劑，丸劑，膠囊。
本發(fā)明組合物可包含一種藥劑溶的液例如，一種可溶解于藥理學(xué)上可接受的載體中的NELL肽(如，NELL1肽，NELL2肽，或他們的混合物)，該載體，例如，用于水溶性肽的水性載體?？墒褂酶鞣N各樣的載體，例如，緩沖鹽水等等。這些溶液是無菌的通常不會引起意外的麻煩。這些組合物可以通過傳統(tǒng)的，熟知的方法滅菌。組合物可包含藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)用以接近需要的生理學(xué)條件，如調(diào)節(jié)pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑，毒性調(diào)整劑等等，例如，醋酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，乳酸鈉等等。
這些配方中藥劑如NELL肽(如NELL1肽，NELL2肽或其混合物)的濃度可大范圍的改變，主要根據(jù)與具體選定的給藥方式和病人需要選擇相應(yīng)的液體的體積，粘度，體重等等。
在一些實施例中，支架可包括其他載體的例子，這些載體包含合成的和天然的生物陶瓷例如，但不限于，碳酸鈣，磷酸鈣，磷灰石，生物活性的玻璃材料，和珊瑚衍生的磷灰石。參見，美國專利申請2002187104；PCT國際申請WO/9731661；，和PCT國際申請WO/0071083，在此以引用方式并入本申請中。另外的生物陶瓷載體的例子包括自體的，同基因的，和異基因的移植骨片，這些移植骨片可以是完整的或被去蛋白化的，或去礦物質(zhì)的。其他載體的例子包括合成的和天然的生物陶瓷和聚合物以及他們的復(fù)合材料，，當(dāng)局部微環(huán)境中鈣和磷酸鹽的濃度分別在，鈣0.01-10mM，磷酸鹽0.01-3mM時，這些材料可使成骨細(xì)胞或他們的前體細(xì)胞的骨橋基因表達(dá)量增加至少1.5倍；當(dāng)局部微環(huán)境中磷酸鹽和鈣的濃度分別在，磷酸鹽0.01-10mM，鈣0.01-3mM時，這些材料可使成骨細(xì)胞或他們的前體細(xì)胞的骨橋基因表達(dá)量增加至少1.5倍。
在一個實施例中，載體可進(jìn)一步地用組合物涂敷，這些組合物包括生物玻璃和/或由溶膠-凝膠技術(shù)，或浸入技術(shù)獲得的磷灰石，例如，但不限于，根據(jù)載體的材料，用0.1-10倍與自然血清濃度的鈣和磷酸鹽制得的，再通過多種方法調(diào)整其pH約2.8-9.8，溫度約15-65oC的模擬體液。參見，美國專利6,426,114和6,013,591；和國際申請WO/9117965，以引用方式并入本申請。其他涂層材料的例子包括合成和天然的生物陶瓷和聚合物以及他們的復(fù)合材料，當(dāng)局部微環(huán)境中鈣和磷酸鹽的濃度分別在，鈣0.01-10mM，磷酸鹽0.01-3mM時，這些材料可使成骨細(xì)胞或他們的前體細(xì)胞的骨橋基因表達(dá)量增加至少1.5倍；當(dāng)局部微環(huán)境中磷酸鹽和鈣的濃度分別在，磷酸鹽0.01-10mM，鈣0.01-3mM時，這些材料可使成骨細(xì)胞或他們的前體細(xì)胞的骨橋基因表達(dá)量增加至少1.5倍。
藥物組合物的使用 根據(jù)本發(fā)明的實施例，為了治療或預(yù)防骨病或與骨相關(guān)的病況，可對哺乳動物使用所描述的多個實施例中的藥物組合物。此處所用的術(shù)語“哺乳動物”包含所有哺乳動物個體包括人類和動物。
在一個實施例中，藥物組合物可被給予哺乳動物，用于治療，預(yù)防，或改善哺乳動物的期望骨生成的骨性病變。
在另一實施例中，此處提供的藥物組合物可被給予哺乳動物，用于治療，預(yù)防或改善，哺乳動物骨生長過度或意外骨生長的骨性病變。在進(jìn)一步的實施例中，此處提供的藥物組合物可被給予哺乳動物，用于治療，預(yù)防或改善哺乳動物的一種骨性病變。
上述的藥物組合物可用于治療，預(yù)防，和/或改善各種骨性病變。
具體實施例 本發(fā)明實施方式將由下述本發(fā)明的實施例說明。所有的參數(shù)和數(shù)據(jù)并不會不適當(dāng)?shù)叵拗票景l(fā)明實施方式的范圍。
實施例1.通過顱骨損傷模型來研究骨形成 一般程序(全身用藥) 在一個實施例中，骨不連接模型中缺損的臨界大小可用于確定NELL1在顱骨修復(fù)中的合適濃度。顱骨缺損已被用做在無負(fù)荷情況下檢測骨再生的模型。(Hollinger，J.O.and J.C.Kleinschmidt，JCraniofac Surg，1990.1(1)p.60-8)。示例性的程序敘述如下。
標(biāo)準(zhǔn)化為了使骨修復(fù)特征標(biāo)準(zhǔn)化，5個月大的骨骼成熟的雄性SD大鼠而不是發(fā)育中的動物(骨骼未成熟的哺乳動物)被用于存活外科手術(shù)(Allen，M.R.and S.A.Bloomfield，J Appl Physiol，2003.94(2)p.642-50)。麻醉后，剃去成年大鼠頭皮，準(zhǔn)備3x的乙醇和聚烯吡酮碘，然后用無菌布單包裹。切開整個頭皮，暴露兩側(cè)的顱骨。用環(huán)鉆鉆孔的同時不斷的澆注無菌鹽水以防止骨的邊緣被過度加熱。每側(cè)的顱骨都全部切除，同時注意不要損傷下面的硬腦膜[即，每個大鼠兩側(cè)頂骨缺損；每個缺損的直徑＝5mm(臨界尺寸)].，表2提供了估計的兩側(cè)愈合率，未處理的5mm缺損。

制備好后，用鹽水沖洗每處缺損，清除骨碎片，然后植入對照組的與無菌鹽溶液混合的陶瓷載體或者與不同劑量NELL1混合的陶瓷載體來測定NELL1的最佳處理濃度。根據(jù)缺損的面積來標(biāo)準(zhǔn)化NELL1的濃度(即NELL1蛋白的量(ng)/mm2)(表2，I組)。在I組(N＝35只大鼠，總數(shù))中每個干預(yù)小組使用5只大鼠(N＝10個缺損)。此外，在5mm缺損模型中不同濃度的BMP2和BMP7以相同的方式使用(表2，II組)(N＝45只大鼠)。檢測NELL1的濃度是基于之前的研究。檢測BMP的濃度基于已發(fā)表的關(guān)于8mm直徑的大鼠顱骨缺損的研究，該研究中BMP的濃度范圍從～20ng/mm2到～600ng/mm2(表3)。

I組和II組(表2)的每個干預(yù)小組的5只大鼠，用已確定的程序微CT連續(xù)8周掃描，進(jìn)行現(xiàn)場連續(xù)的每周成像(Cowan，C.M.，et al.，Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mousecalvarial defects.Nat Biotechnol，2004.22(5)p.560-7)。現(xiàn)場微型斷層CT掃描提供了不同的干預(yù)小組中的骨密度，骨再生面積和體積的精確實時的定量數(shù)據(jù)以及骨形態(tài)學(xué)的定性數(shù)據(jù)。在第8周，動物被處死，用于高分辯率的尸體微型斷層掃描分析和組織學(xué)研究。尸體切片經(jīng)蘇木精和曙紅(H&E)染色，用以對骨形成進(jìn)行定量的組織學(xué)評定。。如果觀察到軟骨，進(jìn)一步用阿辛蘭確定該發(fā)現(xiàn)。在第8周，最佳的NELL1，BMP2，和BMP7的濃度將會被定義為誘導(dǎo)最大的CT掃描產(chǎn)生的組織學(xué)確認(rèn)的骨的面積。如果在某一濃度以外觀察到一個骨形成的平臺，那么達(dá)到這個平臺的最低濃度將認(rèn)為是“最佳的”。
器材來自于μCT40(Scanco，PA)的使用最近的9-20um分辨率技術(shù)的高分辯率的微型CT掃描儀，如早先已發(fā)表的(Zhang，X.，et al.，J Clin Invest，2002.110(6)p.861-70)。在50kVp和和160μA收集微型-CT掃描數(shù)據(jù)，用隨同微型CT掃描儀的由Scanco供應(yīng)的錐-束分析系統(tǒng)對其進(jìn)行重建。取得并分析2D和3D數(shù)據(jù)以確保生物行為的最佳特性。數(shù)據(jù)的可視化和重建可用MetaMorph

成像系統(tǒng)(對2D)(Universal Imaging Corporation，Downingtown，PA)，Image Pro Plus 5.0版(Media Cybernetics，Carlsbad，CA)(對2D)，和AmiraTM(對3D)(Visual Concepts GmbH，Berlin，Germany)進(jìn)行。
許多已知的骨特異性的三維結(jié)構(gòu)參數(shù)的CT形態(tài)測定分析包括1)骨體積/組織體積----在感興趣的體積(VOI)中的骨象素(voxel)的數(shù)量除以VOI中組織像素的總數(shù)量；2)礦化密度---骨質(zhì)量的射線不透性除以骨質(zhì)量的體積；3)橫隔片厚度，橫隔片數(shù)量以及橫隔片的分離(來源于骨體積和表面積)(Borah，B.D.，T.E.et al.，JBMR，2000.15(9)p.1786-1797)。
支架的制造MTF提供的陶瓷載體以Synthacer的名字推向市場?？梢缘玫綁K狀的圓筒狀(95％羥磷灰石；200-800微米孔徑，65-80％多孔)的和疏松的粉末狀的Synthacer。實驗中將使用塊狀的Synthacer盤來擬合相應(yīng)的缺損，由MTF提供。關(guān)于磷灰石載體最初的研究證明了，相對于不加膠原的對照組，涂敷了膠原/生長因子的磷灰石產(chǎn)生更快的骨誘導(dǎo)反應(yīng)時間。因此，所有生長因子都將被結(jié)合在I型膠原溶液中。該溶液可以通過在0℃將生長因子加入pH調(diào)整過的膠原溶液中制得。將預(yù)先確定量的膠原/生長因子溶液加到每一個圓盤，按配方制造的支架放到20℃環(huán)境中，形成凝膠，然后空氣中干燥形成一薄層膠原/生長因子。必要時，其他生物陶瓷(透明質(zhì)烷，纖維蛋白，或藻酸鹽)可用以代替膠原成分。
用優(yōu)化的NELL1，BMP2和BMP7濃度的顱面骨形成的分析以上述臨界缺損(骨不連接)模型進(jìn)行動物的外科手術(shù)。將優(yōu)化的NELL1，BMP2，和BMP7濃度施加在陶瓷載體上(表4)。對照組使用陶瓷載體和無菌鹽溶液。為了暫時性描述組織學(xué)上新形成的骨，對動物進(jìn)行體內(nèi)的連續(xù)熒光標(biāo)記，分別在第0天(手術(shù)后立即操作)腹腔注射鈣黃綠素藍(lán)(30mg/kg體重)，在第14天腹腔注射二甲酚橙黃(90mg/kg體重)，在第28天腹腔注射鈣黃綠素(10mg/kg體重)。鈣黃綠素藍(lán)(發(fā)藍(lán)光)，二甲酚橙黃(發(fā)橙光)和鈣黃綠素(發(fā)綠光)均為對放射性標(biāo)記的鈣具有相同的分布方式的鰲合的熒光染料，放射性標(biāo)記的鈣沉積在活性骨的位點內(nèi)或軟骨基質(zhì)礦化作用的位點中。(參見Lee，T.C.，et al.，J Anat，2003.203(2)p.161-72)。不同的熒光生色帶之間的距離的量度除以給予的時間間隔，使得能夠計算礦物質(zhì)沉積率(MAR)，就如Iwamoto等人所敘述的(Iwamoto，J.，J.K.Yeh，and J.F.Aloia，J Bone Miner Res，2000.15(9)p.1842-9)。
此外，通過微型-CT和微型-PET使用確定的程序連續(xù)數(shù)周對每一個動物進(jìn)行現(xiàn)場成像，直至其被處死(Cowan，C.M.et al.，NatBiotechnol，2004.22(5)p.560-7；Berger，F(xiàn).，et al.，Eur J Nucl MedMol Imaging，2002.29(9)p.1225-36)。.NELL1，BMP2，或BMP7的加入如何在時空上影響骨代謝活性的定量分析，可通過微型-PET很方便的完成。小組中的動物在1，2，4和8周處死。取自每個動物的同樣處理的成對的顱蓋骨樣本進(jìn)行不同的收取和加工。取一個帶有大邊緣的正常組織的樣本，用4％多聚甲醛固定，用做組織學(xué)分析和后繼的II期細(xì)胞分析。取其他的帶小邊緣(＜2mm)的正常組織的樣本，立即在液氮中冷凍，儲存在-70oC用于II期更詳細(xì)的分子方面的分析。

使固定的樣本首先使用高分辨率的微型-CT和上述圖像軟件進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。然后，該固定的樣本被分割兩段。該樣本的一半被去礦物質(zhì)化，脫水，包埋在石蠟中，切片(5μm厚度)，然后H&E染色；另一半經(jīng)加工但未脫鈣處理，植入甲基丙烯酸甲酯中。用四個未染色的，未脫鈣的，不連續(xù)的切片(10μm厚)通過熒光顯微技術(shù)觀察體內(nèi)標(biāo)記情況。額外的切片用Masson-Goldner′s三色染色，用于組織測量分析，例如，Hollinger等所述的骨小梁的體積和表面濃度(Hollinger，J.O.，D.Buck，and J.P.Schmitz，Clin Plast Surg，21(3)p.463-75)(1994)。
微型-PET提供了詳細(xì)的，關(guān)于是在鉆口邊緣或是在缺損中心代謝活性最強(qiáng)的信息，以及加入的最佳化的NELL1或BMP如何影響該活性。在鉆孔邊緣和缺損中心NELL1和BMP都增加了骨代謝的活性。此外，不同的鰲合熒光染料的使用使得能將計算的MAR與在微-CT觀察到的骨形成，和在微-PET獲得的代謝活性相關(guān)聯(lián)，也更準(zhǔn)確的確定了新沉積的骨的時空順序(例如，中心對邊緣骨沉積的比率，硬腦膜對骨膜骨沉積比率)。
通過NELL1促進(jìn)顱蓋骨的再生 建立顱蓋的缺損臨界尺寸的顱蓋骨缺損代表了非骨愈合模型(定義為通過3個月的三維體積測試確定為＜10％愈合)，而次臨界尺寸顱蓋骨缺損顯示了延遲的骨愈合模型(定義為通過3個月的三維體積測試確定為≤15％愈合)。表5顯示了在大鼠模型中，未處理的臨界尺寸(5mm直徑)和次臨界尺寸(3mm直徑)顱蓋骨缺損的雙側(cè)估計愈合率。其他文獻(xiàn)報道了少于10％的5mm缺損的愈合(Bosch，C.，et al.，J Craniofac Surg，1998.9(4)p.310-6)。盡管一些大鼠臨界尺寸缺損模型包含超出矢狀縫缺損中心8mm直徑(Kenley，R.，et al.，J Biomed Mater Res，1994.28(10)p.1139-47；Schmoekel，H.，et al.，J Orthop Res，2004.22(2)p.376-81)，但選擇雙側(cè)模型(其可適應(yīng)達(dá)5mm的雙重缺損)是由于下列原因1)特別避免矢狀縫中纖維狀的組織；2)使中央矢狀竇的損傷減小到最低限度；3)能夠進(jìn)行成對的實驗設(shè)計((Bosch，C.，et al.，J CraniofacSurg，1998.9(4)p.310-6)。
延遲閉合模型(即3mm直徑的次臨界尺寸缺損)使用了骨骼未成熟的動物(小于3個月)。對于大鼠而言，5個月左右骨骼成熟(Allen，M.R.and S.A.Bloomfield，J Appl Physiol，2003.94(2)p.642-50)。聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)/膠原載體膜用于結(jié)合生物活性分子，是因為PLGA1)已經(jīng)證明的生物相容性，并用于目前FDA認(rèn)可的裝置中；2)相對的惰性(非骨誘導(dǎo)性)；3)操作容易并容易得到，用來控制生物活性分子釋放的動力學(xué)(Dhiman，N.，et al.，Indian J Exp Biol，2000.38(8)p.746-52；Panyam，J.and V.Labhasetwar，Adv Drug Deliv Rev，2003.55(3)p.329-47)；and 4)degradation profile(Bessho，K.，et al.，J Biomed Mater Res，2002.61p.61-65)。
PLGA支架是根據(jù)前述方法制備的(Cowan，C.M.，et al.，NatBiotechnol，2004.22(5)p.560-7)。制備好支架后，用I型膠原(Vitrogen

；Cohesion，Palo Alto，CA)涂敷，I型膠原已預(yù)先混合適量的NELL1，BMP2或無菌眼溶液對照。在初步研究中，每3mm直徑的PLGA支架用重量200ng的NELL1和BMP2涂敷支架，裝置在鉆孔缺損處。對照組只單獨使用了PLGA膜。動物分別在0周，1周，2周，3周，和4周處死，用于顱蓋骨的微-CT和組織學(xué)分析。
在這些研究中，初始劑量200ng是根據(jù)經(jīng)驗從體外NELL1細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)和體內(nèi)BMP2的臨界缺損數(shù)據(jù)得來的(見前面表3)。體外使用5-50ng/ml濃度的NELL1同時導(dǎo)致凋亡的增加和骨小結(jié)形成的增加，而濃度超過100ng/ml時凋亡是增加的，但骨小結(jié)的形成卻降低了，濃度超過200ng/ml時伴隨著調(diào)亡的增加的是最小量的骨小結(jié)形成(Zhang，X.，et al.，J Bone Miner Res，2003.18(12)p.2126-34)。因此，這一結(jié)果表明過度劑量的NELL1會降低骨形成。在已發(fā)表的關(guān)于BMP2的研究中，相對較低的總量1μg的劑量用于3周的8mm直徑缺損可達(dá)到46％-74％閉合(Schmoekel，H.，etal.，J Orthop Res，2004.22(2)p.376-81)。在歸一化為總?cè)睋p面積時，1μg劑量相當(dāng)于20ng/mm2.(標(biāo)準(zhǔn)化為缺損面積而不是體積更適用于此實施例與已公布研究的對比，在公布的研究中通常很難得到用以體積計算的顱蓋骨的厚度)。此處使用的200ng總量，除以3mm直徑缺損的總面積(即7mm2＝總面積)，相當(dāng)于28ng/mm2。
由NELL1誘導(dǎo)的顱蓋骨再生在用總劑量200ng(28ng/mm2)的NELL1和BMP2添加到PLGA膜的研究中，與沒有添加物質(zhì)的PLGA對照相比，NELL1和BMP2處理的樣本表現(xiàn)出顯著的骨形成(每一個時間點，每一個處理亞組的缺損為4-6個)。體積分析結(jié)果顯示，在4周的研究期中，相對于對照組，NELL2和BMP2顯著的增加了骨形成(見圖4)。如圖4所示，在第1周，NELL1比BMP2更顯著的誘導(dǎo)了骨形成。
總之，約在3個月時骨體積再生不超過15％。在2周時，據(jù)表面分析，使用NELL1和BMP2的實驗顯示約70-80％的缺損閉合，據(jù)體積分析有35-45％的體積再生(見圖4)。組織學(xué)切片證實了骨的存在。在NELL1和BMP2之間，骨樣的沉積和小梁分叉的圖象沒有顯著的不同。圖5顯示，在4周時，通過表面分析，NELL1和BMP2處理的樣本接近于90-100％的缺損閉合，這相當(dāng)于通過三維體積分析的45-50％體積再生。組織學(xué)切片證實了骨的存在(見圖6A-6C)。此外，在誘導(dǎo)骨形成上，NELL1和BMP2之間沒有明顯的組織學(xué)差別(見圖6A-6C)。
需注意的是，表面分析的標(biāo)準(zhǔn)差顯著高于體積分析的標(biāo)準(zhǔn)差。這強(qiáng)調(diào)了2維為基礎(chǔ)的線性測量不必定能反映三維生物體的全部組織事件。確實，從組織學(xué)樣本(見圖6A-6C)可以看到，雖然對于NELL1和BMP2處理過的顱蓋骨的二維基礎(chǔ)的“缺損閉合”已經(jīng)發(fā)生，缺陷中再生骨的橫斷層面的厚度不如未受損的骨那樣厚。因此，二維基礎(chǔ)測量的缺損“閉合”并不必然地相當(dāng)于三維測量的缺損“重建”。Gosain等人已指出了在臨界評估，特別是在次臨界尺寸缺損評估中，橫斷層面的或“三維”基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)采集以及參數(shù)分析的重要性Gosain，A.K.，et al.，Plast Reconstr Surg，2000.106(2)p.360-71；discussion 372).。
這些研究顯示，重組NELL1具有體內(nèi)骨誘導(dǎo)性，并且在4周時NELL1與BMP2誘導(dǎo)的骨之間沒有顯著的差異。
實施例2.表達(dá)重組人NELL1(rhNELL1)的哺乳動物系統(tǒng) 為了研究NELL1/NELL2蛋白/肽的功能，成功地制備和純化
了該蛋白。本發(fā)明中，用非病毒DNA傳遞來表達(dá)rhNELL1的哺乳動物系統(tǒng)可包括，但不限于，表6所列出的這些常用的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。詳細(xì)的方案包括載體的設(shè)計，宿主細(xì)胞株的培養(yǎng)，穩(wěn)定細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染和選擇，以及在HEK293和CHO系統(tǒng)中rhNELL1的純化，這將在以下敘述以作為參考。
表6.表達(dá)rhNELL1的哺乳動物系統(tǒng)
DHFR二氫葉酸(diydrofolate)還原酶；MTX氨甲喋呤GS谷氨酰胺合成酶MSX甲硫氨酸砜亞胺. A.CHO系統(tǒng) 載體設(shè)計將cDNA片段連接到表達(dá)載體p3XFlag-CMV(Sigma)中。產(chǎn)生的表達(dá)構(gòu)成物pCMV-rhNell-3Xflag包括一個早期前胰蛋白酶引導(dǎo)序列，成年人NELL1編碼區(qū)域的cDNA片段和C末端的3X標(biāo)記序列。
宿主細(xì)胞株CHO-K1是一個黏附細(xì)胞株，適合無血清培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)。通過脂質(zhì)體(Invitrogen)或磷酸鈣轉(zhuǎn)染pCMV-rhNELL1-3Xflag。通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入G418(400-600ug/ml)2個星期，來選擇穩(wěn)定的細(xì)胞株。通過限制性稀釋法進(jìn)一步篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞以得到具有rhNELL1高表達(dá)性的單克隆。選擇后的穩(wěn)定細(xì)胞株可用于實驗室或工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)rhNELL1的生物反應(yīng)器。
純化步驟在rhNELL1的自然條件下，通過抗標(biāo)記抗體M2(Sigma)親和層析柱純化含有自然狀態(tài)的rhNELL1肽的培養(yǎng)基或細(xì)胞溶解物，再用3X標(biāo)記肽洗脫。
B.HEK293系統(tǒng) 載體設(shè)計將cDNA片段連接到表達(dá)載體pSecTagA(Invitrogen)中。合成表達(dá)結(jié)構(gòu)pSec-hNELL1-Tag包括一個鼠的免疫球蛋白κ鏈引導(dǎo)序列，成年人NELL1編碼區(qū)域的cDNA片段和C末端的Myc和His雙標(biāo)記序列。
宿主細(xì)胞人胚腎細(xì)胞株，HEK-293(適合無血清培養(yǎng)基，并在懸浮狀態(tài)生長)用NELL1肽表達(dá)載體pSec-hNELL1-Tag轉(zhuǎn)染。細(xì)胞或在收集用于純化的條件培養(yǎng)基前培養(yǎng)2天作為瞬時轉(zhuǎn)染，或用Zeocin處理(250ug/ml)用于選擇穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。通過限制性稀釋法篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞以便得到rhNELL1高生產(chǎn)性的單克隆。選擇后的穩(wěn)定細(xì)胞株可用于實驗室或工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)rhNELL1的生物反應(yīng)器。
純化步驟通過Ni2+親和層析柱純化含有自然狀態(tài)rhNELL1肽的培養(yǎng)基，再用1M的咪唑洗脫。40oC，至少1000體積PBS(pH7.4)充分透析20小時后，檢測rhNELL1的完整性，純度和生物活性。
此外，通過用新的序列例如大鼠血清白蛋白，CD33，tPA和人白介素-2引導(dǎo)序列替換現(xiàn)有的引導(dǎo)序列，或?qū)⒒蚍糯竽繕?biāo)序列例如DHFR或GS到骨架序列中，對親代載體進(jìn)行修飾，從而得到一個新的表達(dá)載體和系統(tǒng)。本發(fā)明中，天然的人NELL1信號肽不能有效地引導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌，甚至有時外源性的引導(dǎo)序列也不能很好地發(fā)揮作用。因此，就需要通過含有蛋白內(nèi)His標(biāo)記和蛋白水解切割位點“MPHHHHHHGGGDDDDKDPM”的間隔序列，構(gòu)件在框架融合中帶有小的天然分泌蛋白(如人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF))的表達(dá)載體，，。用于純化NELL1的表位標(biāo)記可以是下列其中之一6X組氨酸(6XHistidines)，3XFlag，Myc，GST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)，EGFP or CTHS(SOMO的C末端一半，SUMO代表小的泛素修飾蛋白)等等，但是也可以是如表6中列出的質(zhì)粒pSecTag，雙重的His加Myc。
而且，在某些情況下，可以構(gòu)建使用IRES的二順反子或多順反子載體，用于調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)rhNELL1的表達(dá)。為了改進(jìn)rhNELL1的生產(chǎn)，可以對宿主細(xì)胞株進(jìn)行遺傳修飾，以延長增殖持續(xù)的時間或延遲凋亡或使其與特殊的要求相容，例如四環(huán)素可誘導(dǎo)的體系和Flp-In特異性的位點整合體系。
除了上述穩(wěn)定表達(dá)rhNELL1的系統(tǒng)，大規(guī)模的使用數(shù)毫克純化的質(zhì)粒載體(pREP4)瞬時轉(zhuǎn)染(LST)的方法，可用于轉(zhuǎn)染HEK293H或BHK懸浮細(xì)胞，以陽離子聚合物PEI作為備用的選擇或補(bǔ)充到穩(wěn)定系統(tǒng)中。
已說明和描述了本發(fā)明的特殊例子，在不脫離本發(fā)明的概括方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員所做的改變和修改是顯而易見的。因此，這些改變和修改都落入本申請精神和所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
序列表
<110>宋嘉
丁淦
蘇立奇 科羅達(dá)
胡恩明
<120>治療或預(yù)防骨疾病的藥物組合物
<130>39370.28
<140>
<141>
<150>60/653,722
<151>2005-02-16
<160>95
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>3329
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
atatgcgagc gcagcacccg gcgctgccga gccacctccc ccgccgcccg ctagcaagtt 60
tggcggctcc aagccaggcg cgcctcagga tccaggctca tttgcttcca cctagcttcg 120
gtgccccctg ctaggcgggg accctcaaga gcgatgccga tggatttgat tttagttgtg 180
tggttctgtg tgtgcactgc caggacagca gaagatatga agccacccgt gttatcgctg 240
atatggagaa ctagagttct gaagtctctg cttcagcaat cccttcaggg agtggtgggc 300
tttgggatgg accctgacct tcagatggat atcgtcaccg agcttgacct tgtgaacacc 360
acccttggag ttgctcaggt gtctggaatg cacaatgcca gcaaagcatt tttatttcaa 420
gacatagaaa gagagatcca tgcagctcct catgtgagtg agaaattaat tcagctgttc 480
cagaacaaga gtgaattcac cattttggcc actgtacagc agaagccatc cacttcagga 540
gtgatactgt ccattcgaga actggagcac agctattttg aaccggagag cagtggcctg 600
agggatgaga ttcggtatca ctacatacac aatgggaagc caaggacaga ggcacttcct 660
taccgcatgg cagatggaca atggcacaag gttgcactgt cagttagcgc ctctcatctc 720
ctgctccatg tcgactgtaa caggatttat gagcgtgtga tagaccctcc agataccaac 780
cttcccccag gaatcaattt atggcttggc cagcgcaacc aaaagcatgg cttattcaaa 840
gggatcatcc aagatgggaa gatcatcttt atgccgaatg gatatataac acagtgtcca 900
aatctaaatc acacttgccc aacctgcagt gatttcttaa gcctggtgca aggaataatg 960
gatttacaag agcttttggc caagatgact gcaaaactaa attatgcaga gacaagactt 1020
agtcaattgg aaaactgtca ttgtgagaag acttgtcaag tgagtggact gctctatcga 1080
gatcaagact cttgggtaga tggtgaccat tgcaggaact gcacttgcaa aagtggtgcc 1140
gtggaatgcc gaaggatgtc ctgtccccct ctcaattgct ccccagactc cctcccagtg 1200
cacattgctg gccagtgctg taaggtctgc cgaccaaaat gtatctatgg aggaaaagtt 1260
cttgcagaag gccagcggat tttaaccaag agctgtcggg aatgccgagg tggagtttta 1320
gtaaaaatta cagaaatgtg tcctcctttg aactgctcag aaaaggatca cattcttcct 1380
gagaatcagt gctgccgtgt ctgtagaggt cataactttt gtgcagaagg acctaaatgt 1440
ggtgaaaact cagagtgcaa aaactggaat acaaaagcta cttgtgagtg caagagtggt 1500
tacatctctg tccagggaga ctctgcctac tgtgaagata ttgatgagtg tgcagctaag 1560
atgcattact gtcatgccaa tactgtgtgt gtcaaccttc ctgggttata tcgctgtgac 1620
tgtgtcccag gatacattcg tgtggatgac ttctcttgta cagaacacga tgaatgtggc 1680
agcggccagc acaactgtga tgagaatgcc atctgcacca acactgtcca gggacacagc 1740
tgcacctgca aaccgggcta cgtggggaac gggaccatct gcagagcttt ctgtgaagag 1800
ggctgcagat acggtggaac gtgtgtggct cccaacaaat gtgtctgtcc atctggattc 1860
acaggaagcc actgcgagaa agatattgat gaatgttcag agggaatcat tgagtgccac 1920
aaccattccc gctgcgttaa cctgccgggg tggtaccact gtgagtgcag aagcggtttc 1980
catgacgatg ggacctattc actgtccggg gagtcctgta ttgacattga tgaatgtgcc 2040
ttaagaactc acacctgttg gaacgattct gcctgcatca acctggcagg gggttttgac 2100
tgtctctgcc cctctgggcc ctcctgctct ggtgactgtc ctcatgaagg ggggctgaag 2160
cacaatggcc aggtgtggac cttgaaagaa gacaggtgtt ctgtctgctc ctgcaaggat 2220
ggcaagatat tctgccgacg gacagcttgt gattgccaga atccaagtgc tgacctattc 2280
tgttgcccag aatgtgacac cagagtcaca agtcaatgtt tagaccaaaa tggtcacaag 2340
ctgtatcgaa gtggagacaa ttggacccat agctgtcagc agtgtcggtg tctggaagga 2400
gaggtagatt gctggccact cacttgcccc aacttgagct gtgagtatac agctatctta 2460
gaaggggaat gttgtccccg ctgtgtcagt gacccctgcc tagctgataa catcacctat 2520
gacatcagaa aaacttgcct ggacagctat ggtgtttcac ggcttagtgg ctcagtgtgg 2580
acgatggctg gatctccctg cacaacctgt aaatgcaaga atggaagagt ctgttgttct 2640
gtggattttg agtgtcttca aaataattga agtatttaca gtggactcaa cgcagaagaa 2700
tggacgaaat gaccatccaa cgtgattaag gataggaatc ggtagtttgg tttttttgtt 2760
tgttttgttt ttttaaccac agataattgc caaagtttcc acctgaggac ggtgtttgga 2820
ggttgccttt tggacctacc actttgctca ttcttgctaa cctagtctag gtgacctaca 2880
gtgccgtgca tttaagtcaa tggttgttaa aagaagtttc ccgtgttgta aatcatgttt 2940
cccttatcag atcatttgca aatacattta aatgatctca tggtaaatgt tgatgtattt 3000
tttggtttat tttgtgtact aacataatag agagagactc agctcctttt atttattttg 3060
ttgatttatg gatcaaattc taaaataaag ttgcctgttg tgacttttgt cccatctact 3120
gcatacttag tgctgagatc cctgtaaaat gttttgatga aaatatgtat gtagagtcca 3180
gtcgcattat acatacattt catagtgctg aaccttctta aatgcctact cattcagctt 3240
aaacaggctg aagccaagta tgacaaagag gggaagggcc aaaaacataa tcaaagaata 3300
attttaaaga gaattcttgt ctctcttgc 3329
<210>2
<211>1907
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
agagagaatt atgacccaag caagaatcat gggtccagaa ttccacccaa ggaagctagt 60
tcaaagccag agaaagagca cagcttttca cacaattgaa tagatctcaa cttcatgatt 120
ttggtattga agatgctgac agtagccagt ggctctgtga aggcaatttt ccaacctacc 180
attcttggct actcctggga tattttactt ggctgtgaga tccccctgag aagcttctct 240
ttttctcaca caattcctcc atcagcgaag tgtggtgggc agcacacagt gactatgatt 300
cctggagatg gcactgggac tgaacttatg ctgcctgtca agattatgtt cagacatctg 360
tgtgtgcctg tggactttga gggaatgtca gtgacctcca cctctgcctc acatgaagag 420
gaaattcata atgccatcat ggcagttcat tgaaaccgtg tggctttgaa gagtagcgtt 480
aaaactgacg acaccctgcc accatcatac aaatccttca acaacatgtt gcataccacc 540
ctagatctct atgccagtgt cattcattta aaaaatttgc caaacgtgga gacctggcac 600
aaagatgtag acatcctagt tgtttgggaa aacacagagg gtgagtatag caatctggag 660
catgagagtg tgaaaggagt gacagagagc ctaaagatca tgactaaggc caagtctttg 720
cgcattgctg aatatgcctt ccagctggcc cagaagatgg gatgcaaaaa agtgatggct 780
gtgcacaagg tcaacatcac gaaactggga gatggtccct tcctccagtg ctgtggggga 840
ggtggcatcc cgctatcctc agctcacctt agaagacatg attgtggaga atgccacaat 900
gcactttctg tgaagagggc tgcagatacg gtggaacgtg tgtggctccc aacaaatgtg 960
tctgtccatc tggattcaca ggaagccact gcgagaaaga tattgatgaa tgttcagagg 1020
gaatcattga gtgccacaac cattcccgct gcgttaacct gccagggtgg taccactgtg 1080
agtgcagaag cggtttccat gacgatggga cctattcact gtccggggag tcctgtattg 1140
gatggcaaga tattctgccg acggacagct tgtgattgcc agaatccaag tgctgaccta 1200
ttctgttgcc cagaatgtga caccagagtc acaagtcaat gtttagacca aaatggtcac 1260
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ggagaggtag attgctggcc actcacttgc cccaacttga gctgtgagta tacagctatc 1380
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tatgacatca gaaaaacttg cctggacagc tatggtgttt cacggcttag tggctcagtg 1500
tggacgatgg ctggatctcc ctgcacaacc tgtaaatgca agaatggaag agtctgttgt 1560
tctgtggatt ttgagtgtct tcaaaataat tgaagtattt acagtggact caacgcagaa 1620
gaatggacga aatgaccatc caacgtgatt aaggatagga atcggtagtt tggttttttt 1680
gtttgttttg tttttttaac cacagataat tgccaaagtt tccacctgag gacggtgttt 1740
ggaggttgcc ttttggacct accactttgc tcattcttgc taacctagtc taggtgacct 1800
acagtgccgt gcatttaagt caatggttgt taaaagaagt ttcccgtgtt gtaaatcatg 1860
tttcccttat cagatcattt gcaaatacat ttaaatgatc tcatggt 1907
<210>3
<211>3026
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>3
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acattgatga atgtgcctta agaactcaca cctgttggaa cgattctgcc tgcatcaacc 1980
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caagtgctga cctattctgt tgcccagaat gtgacaccag agtcacaagt caatgtttag 2220
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gtcggtgtct ggaaggagag gtagattgct ggccactcac ttgccccaac ttgagctgtg 2340
agtatacagc tatcttagaa ggggaatgtt gtccccgctg tgtcagtgac ccctgcctag 2400
ctgataacat cacctatgac atcagaaaaa cttgcctgga cagctatggt gtttcacggc 2460
ttagtggctc agtgtggacg atggctggat ctccctgcac aacctgtaaa tgcaagaatg 2520
gaagagtctg ttgttctgtg gattttgagt gtcttcaaaa taattgaagt atttacagtg 2580
gactcaacgc agaagaatgg acgaaatgac catccaacgt gattaaggat aggaatcggt 2640
agtttggttt ttttgtttgt tttgtttttt taaccacaga taattgccaa agtttccacc 2700
tgaggacggt gtttggaggt tgccttttgg acctaccact ttgctcattc ttgctaacct 2760
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tgttgtaaat catgtttccc ttatcagatc atttgcaaat acatttaaat gatctcatgg 2880
taaatgttga tgtatttttt ggtttatttt gtgtactaac ataatagaga gagactcagc 2940
tccttttatt tattttgttg atttatggat caaattctaa aataaagttg cctgttgtga 3000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3026
<210>4
<211>2541
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>4
tccaggctca tttgcttcca cctagcttcg gtgccccctg ctaggcgggg accctcgaga 60
gcgatgccga tggatttgat tttagttgtg tggttctgtg tgtgcactgc caggacagtg 120
gtgggctttg ggatggaccc tgaccttcag atggatatcg tcaccgagct tgaccttgtg 180
aacaccaccc ttggagttgc tcaggtgtct ggaatgcaca atgccagcaa agcattttta 240
tttcaagaca tagaaagaga gatccatgca gctcctcatg tgagtgagaa attaattcag 300
ctgttccgga acaagagtga attcaccatt ttggccactg tacagcagaa gccatctact 360
tcaggagtga tactgtccat tcgagaactg gagcacagct attttgaact ggagagcagt 420
ggcctgaggg atgagattcg gtatcactac atacacaatg ggaagccaag gacagaggca 480
cttccttacc gcatggcaga tggacaatgg cacaaggttg cactgtcagt tagcgcctct 540
catctcctgc tccatgtcga ctgtaacagg atttatgagc gtgtgataga ccctccagat 600
accaaccttc ccccaggaat caatttatgg cttggccagc gcaaccaaaa gcatggctta 660
ttcaaaggga tcatccaaga tgggaagatc atctttatgc cgaatggata tataacacag 720
tgtccaaatc taaatcacac ttgcccaacc tgcagtgatt tcttaagcct ggtgcaagga 780
ataatggatt tacaagagct tttggccaag atgactgcaa aactaaatta tgcagagaca 840
agacttagtc aattggaaaa ctgtcattgt gagaagactt gtcaagtgag tggactgctc 900
tatcgagatc aagactcttg ggtagatggt gaccattgca ggaactgcac ttgcaaaagt 960
ggtgccgtgg aatgccgaag gatgtcctgt ccccctctca attgctcccc agactccctc 1020
ccagtgcaca ttgctggcca gtgctgtaag gtctgccgac caaaatgtat ctatggagga 1080
aaagttcttg cagaaggcca gcggatttta accaagagct gtcgggaatg ccgaggtgga 1140
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tttgaactgg agagcagtgg cccaagagaa tagatacgct aacaaaacaa ccatggctgc 720
cngcccggta ttgaggccct tccctaccgc atggccgatg gacagtggca caaggtcgcg 780
ctgtctgtga gcgcctttca cctcctactc catgtcgact gcaataggat ttatgagcgt 840
gtgatagatc ctccggagac caaccttcct ccaggaagca atctatggct tgggcaacgt 900
aatcaaaagc atggcttttt caaaggaatc atccaagatg gcaagatcat cttcatgccg 960
aacggcttca tcacacagtg ccccaaccta aatcgcactt gcccaacatg cagtgatttc 1020
ctgagcctgg ttcaaggaat aatggatttg caagagcttt tggccaagat gactgcaaaa 1080
ctgaattatg cagagacgag acttggtcaa ctggaaaatt gccactgtga gaagacctgc 1140
caagtgagtg ggctgctcta cagggaccaa gactcctggg tagatggtga caactgcagg 1200
aactgcacat gcaaaagtgg tgctgtggag tgccgaagga tgtcctgtcc cccactcaac 1260
tgttccccag actcacttcc tgtgcatatt tctggccaat gttgtaaagt ttgcagacca 1320
aaatgtatct atggaggaaa agttcttgct gagggccagc ggattttaac caagacctgc 1380
cgggaatgtc gaggtggagt cttggtaaaa atcacagaag cttgccctcc tttgaactgc 1440
tcagagaagg atcatattct tccggagaac cagtgctgca gggtctgccg aggtcataac 1500
ttctgtgcag aagcacctaa gtgtggagaa aactcggaat gcaaaaattg gaatacaaaa 1560
gcgacttgtg agtgcaagaa tggatacatc tctgtccagg gcaactctgc atactgtgaa 1620
ggtaaggtca gccaggtctt gtggggaagt ggtagagaag tttatttcca gttactacag 1680
atatggattt ggctatgcaa gggcatcagt tctcatggtt tatccagcag cttcatgtga 1740
gaaactaagg gctgtgtgag atcataccgt ctccccactg tccacaccaa caccagggta 1800
accacaagca caacactttc attctaacga ttggagggga gaatcatctc caaggtcatc 1860
atgggatgtg gcaaatgagt tcccttttaa aataagggat cagacattgg cttagaccca 1920
gatttcatct tcaattcctg aaggcagaat tattttttca gttgatttcc tcaaaggatg 1980
attcgtgagc tgtcactttc tggtcattat c2011
<210>21
<211>294
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>21
tcttcatcag aagcaggtgt ctgggacccc tacaccactt tgctcatcct tgccgacctc 60
gtcaagaatc ctcctgtacc gcgtatttcg ctcgatggtt gttgagtctc cgtgctctaa 120
atcacatttc ccttatcaga tcatttatag atacatttaa aggattccat gataaatgtt 180
taagtacctt tcgtttattt tgtgtaccca catcatagag acttggcacc atttatttat 240
ttttcttgat ttttggatca aattctaaaa ataaagttgc ctcttgtgac ttct 294
<210>22
<211>296
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>22
atatttacta cttgtttccc tcaacctccc ttacccctcc tcaccactct cctcccctcc 60
taacccactc tagatgcctc cactccctca aattcgtcga tttcgttgat ctccgtcctt 120
aaatcacatt tcccttttca gatcatttac agatacattt aaaggattcc atgatacatg 180
ttaaagtacc ttttgtttat tttgtgtacc aacataatag agacttggca ccatttattt 240
atttttcttg atttctggat caaattctaa aaataaagtt ccctgttgtg actccc 296
<210>23
<211>235
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>23
ttgacccgta cactccccct atttcgctcg atgatttcag attctccctt ctttcattca 60
caattccctt ctcagttcat ttacagatac atttaaagga ttccatgata attgttaaag 120
taccttttgt ttattttctg taccaacata atagagactt gccaccattt atttattttt 180
cttgattttt ggatcatatt ctaaaaataa acttccctgt tgtgacttct atctc 235
<210>24
<211>287
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>24
agtatttgga ttccctatac cactttcttc atccctactc acctcgtcca gatgcctcca 60
gtaccgcgta tttcggtcga tggttctcga ctctccctgc tgtaaatcac atttccctct 120
tcagatcatt tacagataca tttaaaggat tccatgataa atgttaaagt accttttgtt 180
tattttgtgt accaacatca tagagacttg gcaccattta tttatttttc ttgatttttg 240
gatcaaattc taaaaataaa gttccctgtt gtgacttcta tctcatc 287
<210>25
<211>295
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>25
ccatcacagg acgccgtccg cgtacccttc accactttcc tcatccttgc tgacctcctc 60
tagatgcctg cagtaccgtg tatttcggtc catggttgtt gatctccgtg ctctgaatca 120
catttccctt gtcagatcat ttacagatac atttaaagga ttccatgata aatgttaaag 180
taccttttgt ttattttgtg taccaacatc atagagactt ggcaccattt attttttctt 240
cttgattttt ggatcaaatt ctaaaaataa agttccctgt tgtgacttct atctc 295
<210>26
<211>282
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>26
cctttgggtt ccctttacca ctttgctcat ccttcctgac ctagtctaga tccctccagt 60
accgtgtatt tcgatcgatg gttgttgatt ctccgtgctg taaatcacat ttcccttttc 120
agatcattta cagatacatt taaaggattc catgataaat gttaaagtac cttttgttta 180
ttttgtgtac caacataata gagacttggc accatttatt tatttttctt gatttttgga 240
tcaaattcta aaaataaagt tccctgttgt gacttctatc tc282
<210>27
<211>298
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>27
attaccaaaa tctccatcag aggaagccgt ttgggttccc tttaccactt tgctcatcct 60
tgctgaccta atctagatcc ctccagtacc gtgtatttcc gtcgatggtt gttgagtctc 120
cgtgctgtaa atcacatttc ccttgtcaga tcatttacag atacatttaa aggattccat 180
gataaatgtt aaagtacctt ttgtttattt tgtgtaccaa cataatagag acttggcacc 240
atttatttat ttttcttgat ttttggatca aattctaaaa ataaagttcc ctgttgtg 298
<210>28
<211>295
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>28
attctccatc agagggagcc ttatgcgttc cctttaccac tttactcatc cttcctgacc 60
taatctagat ccctgcagtc ccctgtattt cggtcgatgg tcgttgagtc tccctgctgt 120
agttcacatt tcccttgtca gatcatttac agacacattt aaaggattcc atgatagatg 180
ttaaagtacc ttttgtttat tttgtgtacc aacataatag agacttggca ccatttattt 240
atttttcttg atttttggat caaattctaa aaataaagtt ccctgttgtg acttc 295
<210>29
<211>302
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>29
ccaatttcca tcagaggccc cgtctgggtc gcctttacca ccttgctctt ccttgctgac 60
ctagtctaga tgcctccagt accgtgcatt tcggtcgatg gttgttgact ctccctcctg 120
taattcacat ttcccttctc agatcattta cagatacatt taaaggattc catgataaat 180
gttaaagtac cttttgttta ttttgtgtac caacataata gagacttggc accatttatt 240
tatttttctt gatttttgga tcaaattcta aaaataaagt tccctgttgt gacttctatc 300
cc302
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<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
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<222>(47)
<223>a，c，g，t，unknown or other
<400>30
aaggcctttg gcttcccttt accactttgc tcatccttgc tgacctngtc aagatgcctg 60
cagtaccgtg tatttcggtc gatggttgtt gagtttccgt gctgtaaatc acatttccct 120
tgtcagatca tttacagata catttaaagg attccatgat aaatgttaaa gtaccttttg 180
tttattttgt gtaccaacat aatagagact tggcaccatt tatttatttt tcttgatttt 240
tggatcaaat tctaaaaata aagttccctg ttcc 274
<210>31
<211>284
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>31
gaaggcgttt gggtctcctt caccactttg ctcatccttg ctgacctagt ctagatccct 60
gcagtaccgt gtatttcggt cgatggttgt tgagtctccg tgctgtaaat cacatttccc 120
tagtcagatc atttacagat acatttaaag gattccatga taaatgttaa agtacctttt 180
gtttattttg tgtaccaaca taatagagac ttggcaccat ttatttattt ttcttgattt 240
ttggatcaaa ttctaaaaat aaagtcgcct gttgtgactt ctat 284
<210>32
<211>298
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>32
attaccaaag tctccatcag aggaaggcgt ttgggttgcc tctaccactt tgctcatcct 60
tgctcacctc gtctagatgc ctgcagtacc gtgtatttcg gtcgatggtt gttgagtctc 120
cgtgctgtaa atcacatttc ccttgtcaca tcatttacag atacatttaa aggattccat 180
gataaatgtt taagtacctt ttgtttattt tgtgtaccaa cattatagag acttggcacc 240
atttatttat ttttcttgat ttttggatca aattctaaaa ataaagttcc ctgttgtg 298
<210>33
<211>284
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>modified_base
<222>(24)
<223>a，c，g，t，unknown or other
<400>33
attagaagaa ggccctctgc gttnccttca ccactttgct tttccttgct aacctagtct 60
agatgcctgc agcaccgtgt atttcgctcg atggttgttg agtttcccta ctgtttatca 120
catttccctc gtcagatcat ttacagatac atttaaagga ttccatgata aatgttaaag 180
taccttttgt ttattttgtg taccaacata atagagactt ggcaccattt atttattttt 240
cttgattttt ggatcaaatt ctaaaaataa agttgcctgt tgtg 284
<210>34
<211>288
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>34
ggaaacgcct tcggaagcct tcactacttt cctaatcctt cctaacctgt tttagatgcc 60
tccagtaccg tgtatttcgg tggatggtta ttgagtctcc ctcctgtaaa tcacatttcc 120
cttttcagat aatttacaga tacatttaaa ggattccatg ataaatgtta aagtaccttt 180
tgtttatttt gtgtaccaac ataatagaga cttggcacca tttatttatt tttcttgatt 240
tttggatcaa attctaaaaa taaagttgcc tgttgtgact tctatttc 288
<210>35
<211>281
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>35
tcagaggaag cttttgggtc ccctttacca atttcctaat ctattctgac ctcgtctaga 60
tgcctgcagt accgtgtatt tcggttgatg gttgttgact ctccgtcctg tatatcacat 120
ttccctagtc agatcattta cagatacatt taaaggattc catgataaat gttaaagtac 180
cttttgttta ttttgtgtac caacataata gagacttggc accattcatt tatttttctt 240
gatttttgga tcaaattcta aaaataaagt tgcctgttgt g 281
<210>36
<211>293
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>36
atcagaggaa ggcgttcggt tcccttaacc actttgctca tccccgctga cctcgtctag 60
atccctgcag taccgtgtat ttcggtcgat ggttgttgag tctccctcct gtaaatcaca 120
tttccctcgt cagatcattc acagatacat ttaaaggatt ccctgataaa tgttaaagta 180
ccttttgttt attttgtgta ccaacatgat agagacttgg caccatttat ttatttttct 240
tgatttttgg atcaaattct aaaaataaag ttccctgttg tgacttctat ccc293
<210>37
<211>297
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>37
tccattagag gaaggcgttt gggttgcctt aaccactttg ctcatccttg ctgacctggt 60
ccagatgcct gcagtaccgt gtatttcggt cgatggttgt tgagtctccc tgctgtaaat 120
cacatttccc ttgtcagatc atttacagat acatttaaag gattccatga taaatgttaa 180
agtacctttt gtttattttg tgtaccaaca taatagagac ttggcaccat ttatttattt 240
ttcttgattt ttggatcaaa ttctaaaaat aaagttccct gttgtgactt ctatccc297
<210>38
<211>294
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>38
tccatcagac gtggcatacc tgtatccctt accacatatg tcatccttcc tgaccttttt 60
ttgatccctc ctgttcttaa tttcggtcca ttcttgttga ttctccttgc cgtaaatcac 120
atttcccttt cagatcattt acagttacat tttaaggatt ccatgattaa tgtttaagta 180
ccttttgttt attttgtgta ccaacatcat agagacttgg caccatttat ttgttttttt 240
tgatttttgg atcaaattct aaaaataaag ttcccttttg tgacttcttt cccc 294
<210>39
<211>283
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>39
ggccaattgg tttcattaac cactttccta atctttctcc acttagtatt gattccccca 60
gctcctttat ttccttcgat gcttgttgac tctccgtgct gtaaatcaca tttcccttgt 120
cagatcattt acagatacat ttagaggatt ccatgataaa tgttaaagta ccttttgttt 180
attttgtcta ccaacataat agagacttgc caccatttat ttatttttct tgatttttgg 240
atcaaattct aaaaataaag ttccctgttg tgacttctat ccc 283
<210>40
<211>243
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>40
tccttaccta ctctacatcc ctgcagtacc gatatttcgg tcgatggatg ttgagtctcc 60
gtgctgtaaa tcacatttcc cttatcagat cattcacaga tacatttaaa ggattccatg 120
ataaatgtta aagtaccttt tgtttatttt gtgtaccaac ataatagaga cttggcacca 180
tttatttatt tttcttgatt tttggatcaa attctaaaaa taaagttccc tgttgtgact 240
tct 243
<210>41
<211>293
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>41
tcagacgaag gcctatgggt tccctttacc attttgctca tccttcctga cctattttag 60
atgcctgcag taccgtgtat ttcggtcgat ggttgttgag tctccgtgct gtaaatcaca 120
tttcccttgt cagatcattt acagatacat ttaaaggatt ccatgataaa tgttaaagta 180
ccttttgttt attttgtgta ccaacataat agagacttgg caccatttat ttatttttct 240
tgatttttgg atcaaattct aaaaataaag ttgcctgttg tgacttctat ccc293
<210>42
<211>234
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>modified_base
<222>(33)
<223>a，c，g，t，unknown or other
<400>42
catccctcca gtaccctatt tttcggtcga tgnttgttga gtctccttgc tctagatcac 60
atttcccttg tcagatcatt tacagataca tttcaaggat tccatgataa atgttaaagt 120
accttttgtt tattttgtgt accaacataa tagagacttg gcaccattta tttatttttc 180
ttgatttttg gatcaaattc taaacataaa gttccctgtt gtgacttcta tccc 234
<210>43
<211>236
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>43
agtctagatc cctccagtac cctgtatttc ggtcgatggt tgttgagtct ccgtcctgta 60
aatcacattt cccttgtcag atcatttaca gatacattta aaggattcca tgataaatgt 120
taaagtacct tttgtttatt ttgtgtacca acataataga gacttggcac catttattta 180
tttttcttga tttttggatc aaattctaaa aataaagttc cctgttgtga cttctg 236
<210>44
<211>318
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>44
ttaacccctc tcaattacca tattctccct cagaggaagg cgtttgggtt cccttctcca 60
ctttgctctt ccttcctgac ctagtctaga tccctgcagt accgtgtatt tcggtcgatg 120
gttgttgagt ctccgtgctg taaatcacat ttcccttgtc agatcattta cagatacatt 180
taaaggattc catgataaat gttaaagtac cttttgttta ttttgtgtac caacataata 240
gagacttggc accatttatt tatttttctt gatttttgga tcaaattcta taaataaagt 300
tccctgttgt gacttccc 318
<210>45
<211>247
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>45
ctgacctagt atagatccct gcagcaccct gtacttcggt cgatcgtcgt tgagtctccc 60
tcctgtaaat cacatttccc ttctcagatc atttacagat acatttaaag gattccatga 120
taaatgttaa agtacctttt gtttattttg tgtaccaaca taatagagac ttggcaccat 180
ttatttattt ttcttgattt ttggatcaaa ttcttaaaat aaagttgcct gttgtgactt 240
ctatccc 247
<210>46
<211>310
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>46
ttttttaacc acatcgctta ccaatttcca tcagaggaag gctttgcgtt ccctttacca 60
ctttgctcat ccttgctgac ctagtctaga tgcctccagt accctctatt tcggtcgatg 120
gttgttgatt ctccgtgctc taaatcacat ttcccttgtc agatcattta cagatacatt 180
taaaggattc catgataaat gttaaagtac cttttgttta ttttgtgtac caacataata 240
gagacttggc accatttatt tatttttctt gatttttgga tcaaattcta aaaataaagt 300
tccctgttcc310
<210>47
<211>200
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>47
tgttgaatct ccctgcttta aatcacattt cccttctcag atcatttaca gatacattta 60
aaggattcca tgataaatgt taaagtacct tttctttatt ttgtgtacca acataataga 120
gacttggcac catttattta tttttcttga tttttggttc aaattctata aataaagttc 180
cctgttgtga cttttttccc 200
<210>48
<211>273
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>48
ctgcttacct ttaccacttt gctcatcctt actgacctac tcttgatgcc tgcactaccg 60
tgtatttcgg tcgatggttg ttgagtttcc gtgctgtaaa tcacatttcc cttgtcagat 120
catttacaga tacatttaaa ggattccatg ataaatgtta aagtaccttt tgtttatttt 180
gtgtaccaac ataatagaga cttgccacca tttatttatt tttcttgatt tttggatcaa 240
attctaaaaa taaagttccc tgttgtgact tct 273
<210>49
<211>294
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>49
atcagacgaa ggcctttggg ccccctccac cactttcctc atccttgctg acctagtcaa 60
gacgcctgca gtaccgtgta tttcggtcga tggttgttga gtctccgtgc tgtaaatcac 120
atttccctcg tcagatcatt tacagataca tttaaaggat tccatgataa atgttaaagt 180
accttttgtt tattttgtgt accaacataa tagagacttg gcaccattca tttatttttc 240
ttgatttttg gatcaaattc taaaaataaa gttccctgtt gtgacttcta tctc 294
<210>50
<211>214
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>50
attccatcga ttctcgttca atctccatcc tgtaaatcac atttcccttt tcagatcatt 60
cacacataca ttttaaggat tccatgataa atgttaaagt accttttgtt tattttctgt 120
accaacataa tagagacttg gcaccattca tttatttttc ttgatttttg gatcaaattc 180
taaaaataaa gttccctgtt gtgacttcta tctc 214
<210>51
<211>323
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>51
tctcaaccac agtctctaac ccaatctcca tcagacgaac acctgtaagt tccctaaacc 60
actctactca tccttgcaga cctcttccag aagccttcat taccgtgtat ttcgctcgat 120
ggttgttgag tttccctgct gtaaatcaca tttccctctt caaatcattt acagacacat 180
ttaaaggatt ccatgataaa tgttaaagta ccttttgttt attttgtgta ccaacataat 240
agagacttgg caccatttat ttatttttct tgatttttgg atcaaattct aaaaataaag 300
ttccctgttg tgacttctat ctc 323
<210>52
<211>302
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>52
aagtttccat cagaggaagc cctttgggtt gcctttacca ctttgctcat ccttcctgac 60
ctagtctaga tccctgcagt accctgtatt tcggtcgatg gttgttgagt ctccctgctg 120
tagatcacat ttcccttgtc agatcattta cagatacatt taaaggattc catgataaat 180
gttaaagtac cttttgttta ttttgtgtac caacataata gagacttggc accatttatt 240
tatttttctt gatttttgga tcaaattcta aaaataaagt tgcctgttgt gacttctatc 300
tc302
<210>53
<211>309
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>53
aatcacccaa attttctatc agaggaaggt tgttctgcgt agcctctagc cactttgctc 60
atccttgttg acctactcta gatgcttcca gtaccgtgta tttcgctcga tggttgttga 120
ttctccgtgc tgtaaatcac atttcccttg tcagatcatt tacagataca tttaaaggat 180
tccatgataa atgttaaagt accttttgtt tattttgtgt accaacataa tagagacttg 240
gcaccattta tttatttttc ttgatttttg gatcaaattc tacaaataaa gttgcctgtt 300
gtgacttct 309
<210>54
<211>287
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>54
cagaggtagg cgtttgggtt cccttcacca ctttgctcat ccttgctgac ctcttctaga 60
tccctgcagt accgtgtatt tcggtcgatg gttgttgagt ctccctgctg taaatcacat 120
ttccctagtc agatcattta cagatacatt taaaggattc catgataaat gttaaagtac 180
cttttgttta ttttgtgtac caacataata gagacttggc accatttatt tatttttctt 240
gatttttgga tcaaattcta aaaataaagt tacctgttgt gacttct 287
<210>55
<211>299
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>55
caaattctcc ttcagaggaa gccgtttggg ttcccttaac cactttgctc ttccttgctg 60
acctagtcta gatgcctgca gtaccgtgta tttcggtcga tggttgttga ttttccctgc 120
tgtaaatcac atttccctcg tcagatcatt tacagataca tttaaaggat tccatgataa 180
atgttaaagt accttttgtt tattttgtgt accaacataa tagagacttg gcaccattta 240
tttatttttc ttgatttttg gatcaaattc taaaaataaa gttccctgtt gtgacttct 299
<210>56
<211>287
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>56
gaaggcgtta ggtttgccta aaccactttg ctcatccttg ctgaccttgt ccagatccct 60
gcagtaccgt gtatttcggt cgatggttgt tgagtctccg tgctgtaaat cacatttccc 120
tcgtcagatc atttacagat acatttaaag gattccatga taaatgttaa agtacctttt 180
gtttattttg tgtaccaaca taatagagac ttggcaccat ttatttattt ttcttgattt 240
ttggatcaaa ttctaaaaat aaagttccct gttgtgactt ctatctc 287
<210>57
<211>288
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>57
attcagcttt ccccagactc acttcctgtc catatttctg cccaaagttt taaagtttgc 60
agaccaaaat gtatgaatgg aggaaaactt cttcctgagg cccagcggat tttaaccaag 120
acctgccggg aatgtcgagg tggattcttg gtaaaaatca cagaagcttc ccctcctttg 180
aactgctcag agaaggatca tattcttccg gagaaccagt gctgcaggat ctgccgagtt 240
cataacttct gtgcagaagc acctaagtgt ggagaaaact cggaatgc 288
<210>58
<211>233
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>58
tgacatactt tagatccttg cagtaccgtt atttcggtcg atggttgttg actttccgtg 60
ctgtaaatca catttccctt ctcagatcat ttacagatac atttaaagga ttccatgata 120
aatgttaaag taccttttgt ttattttgtg taccaacata atagagactt ggcaccattt 180
atttattttt tttgattttt ggatcaaatt ttaaaaataa agttgcctgt tgt233
<210>59
<211>239
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>59
atttagatcc ctccggtacc gtgtatttcg gtcgatggtt gttgagtttc cgtgctgtaa 60
atcacatttc ccttgtcaga tcattcacag atacatttaa aggattccat gataaatgtt 120
aaagtacctt ttgtttattt tgtgtaccaa cataatagag atttggcacc atttatttat 180
tttttttgat ttttggatca aattcttaaa ataaagttgc ctgttgtgac ttctatccc 239
<210>60
<211>281
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>60
atttgggttc ccttaaccac tttcctcttc cttgctgacc tggtctagat ccctgcagta 60
ccctctattt cggtcgatgg ttgttgattc tccctgctgt aaatcacatt tcccttgtca 120
gatcatttac agatacattt aaaggattcc ctgataaatg ttaaagtacc ttttgtttat 180
tttgtgtacc aacttcatag agacttggca ccatttattt atttttcttg atttttggat 240
caaattctaa aaataaagtt gcctgttgtg acttctatct c 281
<210>61
<211>278
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>61
ccccagactc acttcctgtg catatttcag gccgatgttg tgaagtttgc agacccaaat 60
gtatctatgg aggaaaattt cttcctgagg cccagcggat tttaacccag accccccggg 120
aaagtcgagg tggattcttg gtaaaaatca cagaagcttc ccctcctttg aactgctcag 180
agaaggatca tattcttccg gagaaccagt gctccaggtt ctcccgaggt cataacttct 240
gtgcagaagc acctaagtgt ggagaaaact cggaatcc 278
<210>62
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<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>62
atgcctgcag taccgtgtat ttcggtcgat ggttgttgag tttccgtgct gtaaatcaca 60
tttcccttct cagatcattt acagatacat ttaaaggatt ccatgataaa tgttaaagta 120
ccttttgttt attttgtgta ccaacataat agagacttgg caccatttat ttattttttt 180
tgatttttgg atcaaattct aaaaataaag ttgcctgttg tgacttctg 229
<210>63
<211>245
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>63
catctccaga cgccacctct accccgtatt tccgtcgatc gttgtagact ttccgtcctc 60
ttaatcacat ttccctcttc agatcattta cagatacatt taaaggattc catgatgaat 120
gttacagtac cttttgttta ttttgtctac caacatcata gagacttggc tccatttatt 180
tatttttctt gatttttgca tcaaattcta aaaataaagt tccctgttgt gacttctatc 240
cccaa 245
<210>64
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<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>64
agtctccata agaggcaggc ttcgggtagc ctataccact ttgctcgtcc ttgccgacct 60
agtccagatg cccgcagtac cgtgtatttc ggtcgatggt tgttgagtat ccgtgctgta 120
aatcacattt ccctcgtcag atcatttaca gatacattta aaggattcca tgatcaatgt 180
taaagtacct tttgtttatt ttgtgtacca acataataga gacttggcac catttattta 240
ttttttttga tttttggatc aaattctaaa aataaagttg cctgttgcg 289
<210>65
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<212>DNA
<213>Mus musculus
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ccattagagg aaggcgttcg ggtactttca ccactttgtc atctctccca acctagtcca 60
gatacctgca ataccgtgta tttcggtcga tgcttgttga ttctccgtct tgtatatcac 120
atttccctcg tcagattatc tagagataca tttaaaggat tccatgataa atgttaaagt 180
accttttgtt tattttgtgt accaacataa tagagactcg gcaccattta tttatttttc 240
ttgatttttg gatcaaattc taaaaataaa gttgcctgtt gtgacttcta tctc 294
<210>66
<211>311
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>66
caatcaccat aatatccata agaggaaggc gtttggctcc ccttaatcat tttgtttatc 60
cttcctgacc ttttctagat gcctgcagta ccgtgtattt cggtcgatgg ttgttgagtc 120
tccgtgctgt aaatcacatt tccctagtca gatcatttac agatacattt aaaggattcc 180
atgataaatg ttaaagtacc ttttgtttat tttgtgtacc aacataatag agacttggca 240
ccatttattt atttttcttg atttttggat caaattctaa aaataaagtt gcctgttgtg 300
acttctatca c 311
<210>67
<211>336
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>67
tgacatcttt ttcttttcac ccacatcact aacctatctc cattagagga acccctcggc 60
taccctctac cactctgctc atccttcctg acgctgttct agatgcctgc cagtaccgtg 120
tatttcggtc gatggttgct gattctccgt cctttaaatc acatttccct cctcagatca 180
tttacagata catttcaagg attccatgat aaatgttaaa gtaccttttg tttattttgt 240
gtaccaacat aatagagact tggcaccatt tatttatttt tcttgatttt tggatcaaat 300
tctaaaaata aagttgcctg ttgtgacttc tatcac 336
<210>68
<211>328
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>68
tcttcttttt tttaaccaca gtccgttacc acattctcct tcagaggaag gcctctgggt 60
cgcctttacc actttgctca tccttgctga ccttgtctag atccctgcag taccgtgtac 120
ttcggtcgat ggttgttgag tctccgtgct gtaaatcaca tttcccttgt cagatcattt 180
acagatacat ttaaaggatt ccatgataca tgttaaagta ccttttgttt attttgttta 240
cccacataat agagacttgg caccatttat ttatttttct tgatttttgg atcaaattct 300
taatataaag ttccctgttg tgacttcg328
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<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>69
ttttggttga tggttcctga atctccgtgc tgtagatcac atttcccttt tcagttcatt 60
tacagataca tttaaaggat tccatgataa atgttaaagt accttttgtt tattttgtgt 120
accaacataa tagagacttg gcaccattta tttatttttc ttgatttttg gatcaaattc 180
taaaaataaa gttgcctgtt gtgacttct 209
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<211>250
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>70
tttatttatc tttaataaca tagtctagat ccctacagta ccgtgtattt cgcttgatgg 60
ttgttgagtc tccgtggtgt aaatcacatt tcccttgtca gatcatttac agaaacattt 120
ataggattcc atgataaatg ttaaagtacc ttttgtttat tttgtgtacc aacataatag 180
agacttggca ccatttattt attttttttg atttttggat caaattttaa aaataaaatt 240
gcctgttgtg250
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<211>265
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>71
accttgctca tccttccaga cttcttctag attcgtccaa ttccacgtat ttcggtcggt 60
ggttgttgac tttccgcgtt gtaaatcact tttccctcgt cagatcattc acagaaacat 120
ttaagggatt ccatgattaa tgttaaagta ccttttgttt attttttgta ccaacataat 180
agagacttgg caccatttat ttatttttct tgatttttgg atcaaattct aaaaataaag 240
ttgcctgttg tgaattcttt cccaa 265
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<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>modified_base
<222>(684)
<223>a，c ，g，t，unknown or other
<400>72
gattgtctcc gcctttccaa cagagggaga cgatggactg agacgatgca cgccatggaa 60
tcccgggtgt tactgagaac gttctgcgtg atcctcggcc ttggagcggt ttgggggctt 120
ggtgtggacc cctccctaca gattgacgtc ttaacagagt tagaacttgg ggagtctaca 180
gatggagtgc gccaagtccc gggactgcat aatgggacga aagccttcct cttccaagag 240
tcccccagaa gcataaaggc atccactgct acagctgagc ggtttctcca gaagctgaga 300
aataaacacg agttcacaat cttggtgacc ttaaaacaga tccacttaaa ttcgggagtt 360
atcctctcca tccaccactt ggatcacagg tacctggaac tggaaagcag tggccatcgg 420
aatgagatca gactccacta ccgctctggc actcaccgcc cccacacgga agtgtttcct 480
tatattttgg ctgatgccaa gtggcacaag ctctccttag ccttcagtgc ctctcactta 540
attttacaca tcgactgcaa taagatctat gaacgagtgg tggaaatgcc cttcacagac 600
ttggctctgg gcacaacatt ttggttggga cagagaaata atgcacatgg ctattttaag 660
ggaataatgc aggatgtgca cgtncttgtc atgcctcagg gcttcattgc tcagtgcccg 720
gaccttaatc gaacctgtcc aacatgcaac gacttccatg ggcttgtgca gaaaatcatg 780
gagctgcagg acattttatc aaagacgtca gccaagctgt cccgagctga acaaagaatg 840
aacaggctgg atcagtgcta ctgtgagcgg acatgcactg tgaagggaac cacctaccga 900
gagtctgagt cctggacaga cggctgtaag aactgcacat gcttgaacgg gaccatccag 960
tgcgagactc tggtctgccc tgctcctgac tgccctccta aatcggcccc tgcgtatgtg 1020
gatggcaagt gctgtaagga gtgcaaatca acctgccagt tccagggacg gagctacttt 1080
gagggagaaa ggaacacggc atactcatct tctggaatgt gtgtcttata tgaatgcaag 1140
gatcagacca tgaagcttgt tgagaacatt ggctgcccac ccttagattg tcccgagtct 1200
catcagattg ccttgtctca cagctgctgc aaggtttgta aaggttatga cttctgttct 1260
gagaagcata cctgcatgga gaactcggtc tgcaggaacc tgaacgacag ggttgtgtgc 1320
agctgcaggg atggttttcg ggctctccga gaggacaacg cctactgtga agacattgac 1380
gagtgtgcag aagggcgcca ttactgccgt gagaacacca tgtgtgtgaa tacacctggt 1440
tctttcatgt gtgtctgcaa aactgggtac atcaggatcg acgattactc atgtacagaa 1500
catgatgagt gtctcacaac ccagcacaat tgtgatgaaa acgctttgtg ctttaacact 1560
gttggaggac acaactgtgt ctgcaagcct ggctacaccg ggaatggaac cacgtgcaaa 1620
gctttctgca aagatggctg tagaaacgga ggagcgtgca ttgctgccaa tgtgtgtgcc 1680
tgcccacaag gcttcacggg acccagctgt gagacagaca ttgacgagtg ctctgagggc 1740
tttgttcagt gtgacagccg tgccaactgc atcaacctgc ctgggtggta tcactgtgag 1800
tgcagagacg gctaccatga caatgggatg tttgcgccag gcggagaatc ctgtgaagat 1860
attgacgaat gcgggactgg gaggcacagc tgcaccaacg acaccatttg cttcaacttg 1920
gacgggggat acgattgccg gtgtccccat gggaagaact gcactgggga ctgcgtgcac 1980
gaggggaaag tgaagcacac cggccagatc tgggtgctgg aaaacgacag gtgctccgtg 2040
tgttcctggc agactgggtt tgtcatgtgt cgacggatgg tctgcgactg cgaaaacccc 2100
acagatgacc tttcctgctg ccctgagtgt gacccaaggc tgagcagtca gtgcctgcat 2160
caaaacgggg aaaccgtgta caacagcggc gacacctggg tccaggattg ccgtcagtgc 2220
cgctgcttgc aaggagaagt tgactgttgg cccctggctt gcccagaggt agaatgtgaa 2280
tttagcgtcc ttcctgagaa cgagtgctgc ccacgctgtg tcaccgatcc ttgtcaggcc 2340
gacaccatcc gcaatgacat caccaaaacc tgcctggacg agatgaacgt ggttcgcttc 2400
accgggtctt cctggatcaa gcacggcacg gagtgtaccc tctgccagtg caagaatggc 2460
catttgtgct gctcagtgga tccacagtgc cttcaggagc tgtgaagtta actgcctcat 2520
gggagatatc tgttcaaaga tgttttctca tttcaaaaga ccaaataaat aaataaataa 2580
ataaaaagtg aggtgtggcc agccagatgc aactttgtta gcagctggat agactgatgt 2640
cgattatgga ttcgtggggc ctgaggaaca tctct2675
<210>73
<211>3144
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>73
tggactgaga cgatgcacgc catggaatcc cgggtgttac tgagaacgtt ctgcgtgatc 60
ctcgggcttg gagcggtttg ggggcttggt gtggacccct ccctacagat tgacgtctta 120
acagagttag aacttgggga gtctacagat ggagtgcgcc aagtcccggg actgcataat 180
gggacgaaag ccttcctctt ccaagagtcc cccagaagca taaaggcatc cactgctaca 240
gctgagcggt ttttccagaa gctgagaaat aaacacgagt tcacaatctt ggtgaccctg 300
aaacagatcc acttaaattc gggagttatc ctctccatcc accacttgga tcacaggtac 360
ctggaactgg aaagcagtgg ccatcggaat gagatcagac tccactaccg ctctggcact 420
caccgtcccc acacggaagt gtttccttat attttggctg atgccaagtg gcacaagctc 480
tccttagcct tcagtgcctc tcacttaatt ttacacatcg actgcaataa gatctatgaa 540
cgagtggtgg aaatgccttc aacagacttg cctctgggca ccacattttg gttgggacag 600
agaaataatg cacatggcta ttttaaggga ataatgcagg atgtgcacgt tcttgtcatg 660
cctcagggct tcattgctca gtgcccggac cttaatcgaa cctgtccaac atgcaacgac 720
ttccatgggc ttgtgcagaa aatcatggag ctgcaggaca ttttatcaaa gacgtcagcc 780
aagttgtcca gagctgaaca aagaatgaac aggctggatc agtgctactg tgagcggaca 840
tgcactgtga agggaaccac ctaccgagag tctgagtcct ggacagacgg ctgtaagaac 900
tgcacatgct tgaacgggac catccagtgc gagactctgg tctgccctgc tcctgactgc 960
cctcctaaat cggcccctgc gtatgtggat ggcaagtgct gtaaggagtg caaatcaacc 1020
tgccagttcc agggacggag ctactttgag ggagaaagga acacggtata ctcatcttct 1080
ggaatgtgtg tcttatatga atgcaaggat cagaccatga agcttgttga gaacattggc 1140
tgcccaccct tagattgtcc cgagtctcat cagattgcct tgtctcacag ctgctgcaag 1200
gtttgtaaag gttatgactt ctgttctgag aagcatacct gcatggagaa ctcggtctgc 1260
aggaacctga acgacagggc tgtgtgcagc tgcagggatg gttttcgggc tctccgagag 1320
gacaacgcct actgtgaaga cattgacgag tgtgcagaag ggcgccatta ctgccgtgag 1380
aacaccatgt gtgtgaatac acctggttct ttcatgtgta tctgcaaaac tgggtacatc 1440
aggatcgacg attactcatg tacagaacat gatgagtgtc tcacaaacca gcacaattgt 1500
gatgaaaacg ctttgtgctt taacactgtt ggaggacaca actgtgtctg caagcctggc 1560
tacaccggga atggaaccac gtgcaaagct ttctgcaaag atggctgtag aaacggagga 1620
gcgtgcattg ctgccaatgt gtgtgcctgc ccacaaggct tcacgggacc cagctgtgag 1680
acagacattg acgagtgctc tgagggcttt gttcagtgtg acagccgtgc caactgcatc 1740
aacctgcctg ggtggtatca ctgtgagtgc agagacggct accatgacaa tgggatgttt 1800
gcgccaggcg gagaatcctg tgaagatatt gacgaatgcg ggactgggag gcacagctgc 1860
accaacgaca ccatttgctt caacttggac gggggatacg attgccggtg tccccatggg 1920
aagaactgca ctggggactg cgtgcacgag gggaaagtga agcacaccgg ccagatctgg 1980
gtgctggaaa acgacaggtg ctccgtgtgt tcctgccaga ctgggtttgt catgtgtcga 2040
cggatggtct gcgactgcga aaaccccaca gttgaccttt cctgctgccc tgagtgtgac 2100
ccaaggctga gcagtcagtg cctgcatcaa aacggggaaa ccgtgtacaa cagcggcgac 2160
acctgggtcc aggattgccg tcagtgccgc tgcttgcaag gagaagttga ctgttggccc 2220
ctggcttgcc cagaggtaga atgtgaattt agcgtccttc ctgagaacga gtgctgccca 2280
cgctgtgtca ccgatccttg tcaggccgac accatccgca atgacatcac caaaacctgc 2340
ctggacgaga tgaacgtggt tcgcttcacc gggtcttcct ggatcaagca cggcacggag 2400
tgtaccctct gccagtgcaa gaatggccat ttgtgctgct cagtggatcc acagtgcctt 2460
caggagctgt gaagttaact gcctcatggg agatatctgt tcaaagaatg ttttctcatt 2520
tcaaaagacc aaataaataa ataaataaat aaaaagtgag gtgtggccag ccagatgcaa 2580
ctttgttagc agctggatag actgatgtcg attatggatt cgtggggcct gaggaacatc 2640
tctgaggaag cgagatgacc attctgcttt tactattcct gggatcacct tgcagaggaa 2700
tgggtgtgga gcccaggcca tgccatcctc gcccctggat aagaagcctg agccccatca 2760
gctctgggag agcctctcgc tctgtccgca gccaggcgca ggacacgtcc ttctatctca 2820
gactcttcct gagtcagcga ggctcctcac tgaggctgtc gaacgtgagg tgacagcggt 2880
gagcgagtta tattttcaga atccaagaag ctgatgcgtc tgtacagtgc actccgcaac 2940
ccgaaacaag ctattgtcat gataaataac gcacaggcat ggttacgtaa ccttttctaa 3000
cacgaaaagt cacccctccc cccccccccc agtttccttg tttactgccc ttaatattgt 3060
ttggttgaat ttgttcagta gacgcttgtt cttgtgcaaa ataaaataac tatttctctt 3120
accttaaaaa aaaaaaaaaa aaaa3144
<210>74
<211>749
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>74
agtttttctg ggtccaagcc cgggcacgga gttgtccctt tgcccaggca aagaaaggcc 60
atttgtgctg tcaagtggat ccacagtgcc ttcaggagct gtgaagttaa ctgcttcatg 120
gaagatatct gttcaaagaa tgttttctcc tttcaaaagc cccaataaat aaataaataa 180
ataaaaagtg aggtgtggcc agccagatgc aactttgtta gcagctggat agactgatgt 240
cgattatgga ttcgtggggc ctgaggaaca tctctgagga agcgagatgg ccattctgct 300
tttactattc ctgggatcac cttgcagagg aatgggtgtg gagcccaggc catgccatcc 360
tcgcccctgg ataagaagcc tgagccccat cagctctggg agagcctctc gctctgtccg 420
cagccaggcg caggacacgt ccttctatct cagactcttc ctgagtcagc gaggctcctc 480
actgaggctg tcgaacgtga ggtgacagcg gtgagcgagt tatattttca gaatccaaga 540
agctgatgcg tctgtacagt gcactccgca acccgaaaca agctattgtc atgataaata 600
acgcacaggc atggttacgt aaccttttct aacacgaaaa gtcacccctc ccccccccca 660
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<210>75
<211>2915
<212>DNA
<213>Rattus norvegicus
<400>75
aagcactggt ttcttgttag cgttggtgcg ccctgcttgg cgggggttct ccggagcgat 60
gccgatggat gtgattttag ttttgtggtt ctgtgtatgc accgccagga cagtgttggg 120
ctttgggatg gaccctgacc ttcagctgga catcatctca gagctcgacc tggtgaacac 180
caccctggga gtcacgcagg tggctggact gcacaacgcc agtaaagcat ttctatttca 240
agatgtacag agagagatcc attcggcccc tcacgtgagt gagaagctga tccagctatt 300
ccggaataag agcgagttca cctttttggc tacagtgcag cagaaaccat ccacctcagg 360
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cctgctccac atcgactgca ataggattta cgagcgtgtg atagaccctc cggagaccaa 600
ccttcctcca ggaagcaatc tgtggcttgg gcaacgtaac caaaagcatg gctttttcaa 660
aggaatcatc caagatggta agatcatctt catgccgaat ggtttcatca cacagtgtcc 720
caacctcaat cgcacttgcc caacatgcag tgacttcctg agcctggttc aaggaataat 780
ggatttgcaa gagcttttgg ccaagatgac tgcaaaactg aattatgcag agacgagact 840
tggtcaactg gaaaattgcc actgtgagaa gacctgccaa gtgagtgggc tgctctacag 900
ggaccaagac tcctgggtgg atggtgacaa ctgtgggaac tgcacgtgca aaagtggtgc 960
cgtggagtgc cgcaggatgt cctgtccccc gctcaactgt tccccggact cacttcctgt 1020
gcacatttcc ggccagtgtt gtaaagtttg cagaccaaaa tgtatctatg gaggaaaagt 1080
tcttgctgag ggccagcgga ttttaaccaa gacctgccgg gaatgtcgag gtggagtctt 1140
ggtaaaaatc acagaagctt gccctccttt gaactgctca gcaaaggatc atattcttcc 1200
agagaatcag tgctgcaggg tctgcccagg tcataacttc tgtgcagaag cacctaagtg 1260
cggagaaaac tcggaatgca aaaattggaa tacaaaagca acctgtgagt gcaagaatgg 1320
atacatctct gtccagggca actctgcata ctgtgaagat attgatgagt gtgcagctaa 1380
aatgcactat tgtcatgcca acaccgtgtg tgtcaacttg ccggggttgt atcgctgtga 1440
ctgcgtccca gggtacatcc gtgtggatga cttctcttgt acggagcatg atgattgtgg 1500
cagcggacaa cacaactgcg acaaaaatgc catctgtacc aacacagtcc agggacacag 1560
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caactactcc cgctgtgtta acctgccagg gtggtaccac tgtgagtgca gaagcggttt 1800
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tttgaaactc tcaggctcaa ttataggctt agagatgatg ctgtactgtg tgatctctat 5100
aaagcactta atgtctctgg acctcattta attcttccca tatcccttat gaatgggaca 5160
tgtatgaaag taggcagtgc atttcagtgt gtttgccggt attcttgtat attaggacaa 5220
tgtacttaca tggtttccac tgaaatgggg ttattgtctt attgattgtc atagcacaca 5280
atacaatgtt ttcattacat tttcacacac acacacacac acacacacac acacacgcac 5340
acaccactgc agttttctct tatttcccct catttcccag gttttttcca ctttccactt 5400
cttgtctgtt tccccaccac tctggaatga attcttaatc atattcattt taactgctta 5460
tattagctct aatcctgaaa cagaaacatg tcttttctat taattaattt atttattcac 5520
tttacatccc aatcacagcc actcctacca gttccctttt atattgcctc tcaccagtat 5580
cacccctatt ctcctcagag gaaggggagg cctgtcctgg gtaccaacct accctggaag 5640
atcaagtcac tgcagtgcta ggtgcatcct ctctcactga ggccagacaa ggcagcacag 5700
ttaggggaac agaagtcaca cactggcaac cgagtcaggg atagcccctg cttcacagaa 5760
acatattttt aaatattcaa agaacatact gatgtttatc ccttgggtac acttagcaat 5820
gtttccattt tgacttggct ggctccagga aagaaaggct gtgcctgctt tgaacaagat 5880
gggaagtaga caatatagat tcagagctaa gaagtttatt ctgtgagctc tatggtgcat 5940
ttgcaaggct tgatttttgg agtacatctg tgcatatgtt ttcctaatca caaaaccttc 6000
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agcagtgccg atgtctggta tgtcctgtcc ctaaggatcc tggtgccttt actgtagaaa 6240
acgttataaa cttgagagct tttgggcagg agttccaaga tgttcccagt attatacaga 6300
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tttaaaatgt tgcaaaagta aaaataatga atttatagaa cagatttaac ctgagcagtt 6420
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aacataatag aagtgatgga gtttgggtga gcaatagtga gaatccaatt ccataattgt 6600
ctcctaggtc agcttgatgt agacactttg gatatatcaa agcatttcag tggttagtct 6660
tttccataaa agtaccagtt caaagattct tgagaagtta agagaatgtg tgtgaaagat 6720
aagtaccata ttcattgtac agcaagcact tggctgagtg tcacggaaga tctccttaat 6780
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ggagcattct tcctgagtca gcttataagg aaagctttta gattggtgct taatatttat 7080
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gaaaaccatt tttcttcctt gagaagccag tcatcagata gctgggatta ctggcattta 7380
tcttctacgt gacattttca ttcaaagagt ttcaaaaagg acatcttgaa tgtccagtct 7440
ttgggatgta catttatttt tcaactcaca gaagctattg agcattaact taaaattcct 7500
ttagaataat atcggtctca tttatgaaat acttcatcaa gaattgcctg tgccagactc 7560
ctagtgatat acaagcaagg cagacacagt cacagcatga ataagcctag aatatggaga 7620
cattgactga ataattaagt aaatgagaat cactgcagtt gacagggcca tgataacagt 7680
gaacctgtgt ggagaaacct cgttgccata ggcagctcag tggtgcctgc ggtcagaaga 7740
ggactcaggt agaggctcca tttaagctgt gatttggaga ccttagagtg atgggatggt 7800
ttgtccagag aacaaccagc ttcagctctg aacttgaatc ctgcatccca gctgatgcag 7860
ctgttgaaat attccatgtc tccaggtctc cctttggacc tgaaaagaag tggttatctc 7920
tttatacact accctcacgc gactatctga ttgcttgttt gttctattag tatctgttaa 7980
acaaatctct gaacatcatc agggaagaaa acaaacaata caatccaaaa gttcaagtta 8040
atgttgaact caacacttac caattatgca gcataacctg aaaaaacaaa cagtacactt 8100
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tcctagaatg tagtatatta agattaattc ccaatagaaa aataatgtca ggccttctat 9420
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ctacctactc tcacttcaag gtccacctcc ttcctgtctc tcctttgaaa acaaacagga 9660
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aggacaaagc aaatagaagg aaaagagccc cagaaaatgc acaagaaaaa agtagatgca 9780
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tttggctttg ggtctctgta ttttctcatc tgcttcagga ggaagcttcc atgatgctgg 10380
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cttctttttc tttagatcag catagacacc atctcaattc tctataatta ataaggtgta 10500
tatgtgtttt cgctatcaat ttatggagag caacctacat agctttggta atagcttagg 10560
tagtttggga attcccatgg actcctttgg ccagcaactc aattagatat aattcatcca 10620
ttcccagcac tggaagtacc atttagtgat aagatatgtc cagttggaat ttagatatcc 10680
tttatatatg tttatatcat aggagcttct actagatagg ttacaatatg acccctcaaa 10740
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gatcctcctg ttcttgtcca tccctaaaca gctcttccat ccataactat atattctatt 10860
tctccttccc agggagattt atccatgcca tctagtccct tactctttat ctaacctcta 10920
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gtgattacat acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacat 11040
atatatatat accatactta tccttatggg tctggactat gtaactcaag atgattattt 11100
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gatcgtttcc catctatctg aggaaccatc atattgattt tcatagtagc tgtacaattt 11220
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aactgtcacc tacattattg gcccgacagg tataagatgt tatctcaaaa aaagttttaa 11340
tttgcatttc catgattgct aaaggttttg aacatttccc agtcatttga atttcctcta 11400
ataagaattt gtttagatct gtatccaatt tttaaaatta gattgtatgg tttcattttc 11460
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cttatcccca cctagcatat atataataaa tgagattatg ttcattttat ttggctttca 11580
cagttactgg ggggtagcct caaatctact gttctaactg ctgacttggc tgcctcccca 11640
gtggtgtatc tcagacactt gctgttcctc tctcctcatg gcagcttcct ccctctctca 11700
gttcttcctc cttcttcact ttgtctctcc tctctgcttt ctcttttcca tgccccagcc 11760
aggtcaaatc ccacctacct ctaatccctc cagtatttgg ctgtagccaa ttttattaaa 11820
ccaatagttt taaatcaagg aacaaggttt gcacagcaaa agcttgtaaa tgtggaaatt 11880
cactttccag gccttgtcct tcctttcagg tacagaattt agcattacaa cgcacagcaa 11940
cagaccaaat ctcaacagaa tagtagatgt ggagttagaa aacaaaaaaa caaaaaacaa 12000
aaaacaaaac cttttcccat tccatagaca gctgctatta gttcaaggtt attccccagt 12060
ttctcatcta tcaggttcag tgtatataga tttgctttga agcatttgat tatttggaat 12120
tgagttttgt gcagggtgat aagtattgat ccatttgtat tgttttagat gctgccaatc 12180
agtttgtcca gtatcatctg gccctggact tttgggggga taagagatat ttaattactg 12240
cttctatttt atgaggaatt atatatctgt ttagattgct tatctgatct tgattcagct 12300
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gctctatctt ttagtcaatc ttattgatat ttctcttata accaactttg ctttattgat 12540
ttttttgtac agttttttat tactatttta ttttttgttc agccctgagt ttgattattt 12600
cttgtcctct actcttttcg gttgtgattt tatctttttc ttcttattat ttt12653
<210>85
<211>3000
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>85
tcctgtgtga gattagactt ggctctttag aggaagacct gctccgttgt tccccatggt 60
gggtaccaat gagaagaggc agttcatggt gttaaggcat ttattgtaga aaggcagaga 120
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ggtaaggtgg ggatggtgtg ggagggcctg tgggaggctg tagctgaggc aggagccagg 480
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agcttgacca gggaccaagc tgcatatcac agctcactgc cccacacttg tgtggggaag 600
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atgtagtaat ttcattttat gagttaaata agagagggtg acataaaaga aaagtcagat 780
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cctccaatgt agatcagaat tctaaagtga agaaacccaa atagttttgc ttacatgtgc 960
aaactttaca atttaatttc caattggttc attcttattc cattacattt ttgtttttat 1020
ttttattatt ttttcactgc ccatatttat agggtatgct gtgggttttt aatacatgga 1080
tccatcatga caagatctaa ttaggataat tagcatatgt ctccttaagt gtttatcttt 1140
tgtgtgtgtg tgtggtgaga ctattcaaaa tatgctgttc ttttgctttt aaaacctgca 1200
gtgcattgta ataagctata gcaggcccac tgtgtgatag ccccactgtg tgatgggaca 1260
cttagcttca ttcctttctc cgttactcag caaaggagtt cctccctcac cttctagtct 1320
cctcactgtc cccagctttt cataactaat tcttttctct aattttatga gatcataatg 1380
ggatatctat tgccatttaa aataatgaat cctgccctga cttggttttg tttctgtttt 1440
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tgtgctcggt ggcaaataca tcgccatgcc acagcctaca ggatagttct agaatccctt 1560
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aaatagaatg aacagtgaag acgagaaaaa cattaaaaaa gatatacatt ctatggttgt 1980
gtgaaatgtg agttatggat gtttgagaca aaggagatga aagatatgcc tactatgagt 2040
ggaggaacaa ctacagaatt tgagttttat ttcatatctc tctatgatca tacttaatat 2100
agaagggtta atatttactg tcatttttag gcttaaagat actaagctta atatcacact 2160
cccagacggt cccgcaacaa tttgatccgc atgttttaag aatctatgaa ggaagtataa 2220
gttactctag tttggaaaaa tatttaaccc tttgggttga cagtaatatg tatgaaaatc 2280
agtgcaatca atggaactac tactatttag aggtattttt attcaagatt tttagcgcaa 2340
tatctttgca gagaagcact gagactcttt accagaagat atgattagtg tgtataactg 2400
ttgatctgta gtcccaaacc acagagagtt ctttcctaac ccaagaccct ttggtggcta 2460
cataatgaat caaagtgtgt aagtaagtct ttcacacgcc ctcagaatga ctttcaggct 2520
gcaagaagcc tttcaagcag catcgctgtc atgttgaaag gaatggacag aagtgttgtt 2580
tcatttactc cccatcatcg tttgtagctg aggaactcgg acgttggatt agctctgttg 2640
tctctcaccc aatggtgttt atcagcaaca gattctaatc tacagctgct ggaaaaagaa 2700
tttggtcagg gagatgtggg agtagctgtg gggaaagcat ttcttttttt tttttttaat 2760
taggtatttt cctcgtttac attttcaatg ctatcccaaa agtcccccat gcccaccccc 2820
ccccaatccc ctacccaccc actcccccat tttggccctg gggttcccct gtactggggc 2880
atataaagtt tgcaagtcca atgggcctct ctttccagtg atggccgact aggccatctt 2940
ttgatacata tgcagctaga aacaagagct ccggggtact ggttagttca tattgttgtt 3000
<210>86
<211>8622
<212>DNA
<213>Rattus norvegicus
<400>86
ggaagaaaac caagagcaca gagaagaaca gcaagaaagc ccacctacac tgagtagagg 60
cgcctgggca gagagagcta ggaagctgag atacaagggg ggcttgaaag ataattggat 120
tgatataaaa cagtgaccac agcaggattt ggggacaagg gaatacggtt tgataattgc 180
cttttaaaaa tggtgggtta ccccttcagc agtcatgcca gtattgcacc aacgcacaca 240
cctcgtgtct gaccgacaag tcgtgtaaca tgcaggattc acagctgtgt aagatcgctg 300
atgacaatgc tctcccagtg gcctgcagag ttcatcccag cacgatgaaa tcttcgccag 360
caggcaggac aaaaactggc cctattccga cttggtttgt ttgtgtcctg cggccaaagt 420
gtgtggtgtc tccacagtac caatagaatt tcgtacagtt cgggaagcag actgtgacct 480
ttatgaggtg actggcttgt aaagggcagg caagcttgga ggcagtgagg acagccagaa 540
aagagatatg aatgggttgg agggttgagg gcactggggc tgctgagaaa accacctttc 600
ctaacagatt ctggcagagt ttacggttta catgtaggca tagggtagtt gagggtagcc 660
aggcgttatt tgattgggtc atgtagtgaa ggctagtgct ttctcttaga acttggcagg 720
aaacaagttt gggcaaaggg agaaaccaga aatcaaaaat tctacttggt catcattata 780
gacactatta aggaattttc caaaatacat attccagata taactcacat gccacatgat 840
ttaccaaagt acacaatgta atggtttttt agtacattgt gacgtctacg aaggccacgc 900
acccatcaac tttagaacat tttatgacct ccaaaggaaa ccctacgttc tctagccatc 960
attctcctcc tcactcctca tctggaggca aagtctcatc aactttctgt ttctataaat 1020
ttgatttttt ctggagaaat ggaatagatg ccatgctgtt catcgacttt gctgaggaga 1080
ggtgaaagaa acatttattt accccaaacg aggagggtgt atgcagaccc aaggaagatg 1140
ctaagtctaa actgtgaaat aagtgaaatt cttgctatta cttatgaagc catgggggat 1200
tcacaggaag ttttatcact ggaaagttcc cgtctccagc caccgaacac ctactttttt 1260
tgtggcattt tatctctagg gaatttaagg taggcctggt tgggttcggg gtacaagcct 1320
tgttactgtg aggaacacca ttgtgtggta agcacaacag aaattcactg ggcctattct 1380
ctgatggacc aacaggtcca ccccttcccc catccccact caagagtgta cctacgtgag 1440
gaaatcgagg tacttagtta tctagggaag atttatgtgc ttgttaagat taacttgtta 1500
ccgctaatgg atgcgaggcc gcagagctat gacaggacat atgtctcact taattttttt 1560
aatggaacac gcggaaaccc tcatcccaca ggaccagcta cacagttagt cttaaagatt 1620
aaggttcaaa agatacaagt cccctgctgg gaccactgtg ccttttaggc cttctgggat 1680
ttctgagatt aagaaaaggg gctagggggg ttgggtattt agctcagtgg tagagcgttt 1740
gcctagcaag cacaaggccc tgggttcggt ccccagctcc gggggggaaa aaaaagaaag 1800
aaagaaagaa agaaggaaag aaagaaagga agaaaggaag aagaggggct agggaaaagc 1860
actctgaagt gctaaggaag tgcatttttt gagggagagt tgggggtggg tgggacgtgg 1920
tcctcacagc acagcttggc atccggtagc cttacttagg aggcccagtg aaactgggga 1980
atctaacttt tttgcaaagt gtgtgtgatt ttagtgttgt cattgagtgt tgcatgcttc 2040
tggaggaatg gaaagccccg actctgtatg ggagacacag gagtaagggt ctgctctggg 2100
gccaagttga attttgagag tgttggagga tagactatag acacagttta gttggtagag 2160
tgcttggccg ggatgcataa gtctgtgggt tccatcccca acactatgta aactaggtgt 2220
ggtggcccag acctatgacc ctagcactta ggaggtgaag ggacaagagg atcaaggttc 2280
aaggttatct tcagatacat aacaaatggt cctggacaca tgtcacaata gcctgtactt 2340
ccagcagtgg gacatccaac atcctcttct gttctccaag ggcacacaca cacacacaca 2400
cacacacaca cacacacacg cacacacaca cacacttaaa agctggtgag taagttgggc 2460
cttgacctcc acttggtaat agctcagttc aattgcactg cagtgggcac ttcttgaaat 2520
gatttaactt ccatagttcc tttcttcacc tgcccaggaa ggtcatacat gaagtaaatg 2580
gacaagggca tgtatacaga atgccctgaa aaataggaca aagttcagag gaccatgtag 2640
gtaagacctt tcatcttcaa acgttgcaca gctaaattgg tgacccccca ctggtctcct 2700
ggggtcaaag gtatataaag ttaagcttct gggaacacag aggatatgca aatgccagag 2760
agaaaccctg gaaagaaagc agggctcttt tggagaattc cttttccttt tggatccctg 2820
aggatatatg ggtttaggca tcttaaatag tattggatgt tgcggggagc cggggggggc 2880
atagatggag gtacagggca agctggggct ccggagaccc agaggctccg acctacaggt 2940
tctgtgactg catcatctct agatagactg aggcacacag ggactcttgc aggtcggttc 3000
caggttccaa taacagagga tactctagac gggagagact cctctgcttg tccactggtc 3060
gccagcaaag cccagctttt ctatctacag agtggcgtta cagtaggggt ctccaaggaa 3120
agcaggggag agcggcccag agagccagtt ttgaagaaaa ccatccagaa agtcacaaat 3180
ggtttagaac ttcccctatg tggcagcatt tggcctgtag aacgaaattt gcaaacactt 3240
cttaaattcc agccatagat tgctccaagc tcagggactt ccacctcagc accctccacc 3300
agcactccta aaagccagaa tccagtcaca agagcctttg gctgggaata gatagcaagt 3360
acaggtggcc gttggggact caggcaccac tcatcccccc ccccccccac ctgctcctcc 3420
ccacccactt gctggagcga atccgtagta gttgttcccc aaagagggtc tgggagcact 3480
cggtgacacc gcctaggtct ggtttcccta ggaaacaacc cacgcaccag ggttgggctg 3540
cttcggacac ggcccggatg aactgttgca acttgggcag cccgcagcgc ggcgcagtgg 3600
cagaggcggg ggcgtgaagc cgggaggcgc gtgtaaccag gatcctcgaa gctccggaga 3660
cccggaggcg aaaggatccg cacaggaacc cagggcaacc tgcgcgagtg gcggagcccc 3720
gcgctcccgc cctagctcaa ggggagcgca gtcgtagcgg ggttcagagc cccagccccg 3780
tgccaccgcc acccgcggtg gggggtgggc tgggggcggg gcagctgggg ttgccttccc 3840
gggcgcgatc cccgagcgcg gcacccggcg ccgccgagcc acctcccctg ccgcccgcca 3900
gcaagtttgg cggcttcgag cccagagagc cacggctttc tgcctcgtgt ctgaccgaca 3960
agtcgtgtaa catgcaggat tcacagctgt gtaagatcgc tgatgacaat gctctcccag 4020
tggcctgcag agttcatccc agcacgatga aatcttcgcc agcaggcagg acaaaaactg 4080
gccctattcc gacttggttt gtttgtgtcc tgcggccaaa gtgtgtggtg tctccacagt 4140
accaatagaa tttcgtacag ttcgggaagc agactgtgac ctttatgagg tgactggctt 4200
gtaaagggca ggcaagcttg gaggcagtga ggacagccag aaaagagata tgaatgggtt 4260
ggagggttga gggcactggg gctgctgaga aaaccacctt tcctaacaga ttctggcaga 4320
gtttacggtt tacatgtagg catagggtag ttgagggtag ccaggcgtta tttgattggg 4380
tcatgtagtg aaggctagtg ctttctctta gaacttggca ggaaacaagt ttgggcaaag 4440
ggagaaacca gaaatcaaaa attctacttg gtcatcatta tagacactat taaggaattt 4500
tccaaaatac atattccaga tataactcac atgccacatg atttaccaaa gtacacaatg 4560
taatggtttt ttagtacatt gtgacgtcta cgaaggccac gcacccatca actttagaac 4620
attttatgac ctccaaagga aaccctacgt tctctagcca tcattctcct cctcactcct 4680
catctggagg caaagtctca tcaactttct gtttctataa atttgatttt ttctggagaa 4740
atggaataga tgccatgctg ttcatcgact ttgctgagga gaggtgaaag aaacatttat 4800
ttaccccaaa cgaggagggt gtatgcagac ccaaggaaga tgctaagtct aaactgtgaa 4860
ataagtgaaa ttcttgctat tacttatgaa gccatggggg attcacagga agttttatca 4920
ctggaaagtt cccgtctcca gccaccgaac acctactttt tttgtggcat tttatctcta 4980
gggaatttaa ggtaggcctg gttgggttcg gggtacaagc cttgttactg tgaggaacac 5040
cattgtgtgg taagcacaac agaaattcac tgggcctatt ctctgatgga ccaacaggtc 5100
caccccttcc cccatcccca ctcaagagtg tacctacgtg aggaaatcga ggtacttagt 5160
tatctaggga agatttatgt gcttgttaag attaacttgt taccgctaat ggatgcgagg 5220
ccgcagagct atgacaggac atatgtctca cttaattttt ttaatggaac acgcggaaac 5280
cctcatccca caggaccagc tacacagtta gtcttaaaga ttaaggttca aaagatacaa 5340
gtcccctgct gggaccactg tgccttttag gccttctggg atttctgaga ttaagaaaag 5400
gggctagggg ggttgggtat ttagctcagt ggtagagcgt ttgcctagca agcacaaggc 5460
cctgggttcg gtccccagct ccggggggga aaaaaaagaa agaaagaaag aaagaaggaa 5520
agaaagaaag gaagaaagga agaagagggg ctagggaaaa gcactctgaa gtgctaagga 5580
agtgcatttt ttgagggaga gttgggggtg ggtgggacgt ggtcctcaca gcacagcttg 5640
gcatccggta gccttactta ggaggcccag tgaaactggg gaatctaact tttttgcaaa 5700
gtgtgtgtga ttttagtgtt gtcattgagt gttgcatgct tctggaggaa tggaaagccc 5760
cgactctgta tgggagacac aggagtaagg gtctgctctg gggccaagtt gaattttgag 5820
agtgttggag gatagactat agacacagtt tagttggtag agtgcttggc cgggatgcat 5880
aagtctgtgg gttccatccc caacactatg taaactaggt gtggtggccc agacctatga 5940
ccctagcact taggaggtga agggacaaga ggatcaaggt tcaaggttat cttcagatac 6000
ataacaaatg gtcctggaca catgtcacaa tagcctgtac ttccagcagt gggacatcca 6060
acatcctctt ctgttctcca agggcacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 6120
cgcacacaca cacacactta aaagctggtg agtaagttgg gccttgacct ccacttggta 6180
atagctcagt tcaattgcac tgcagtgggc acttcttgaa atgatttaac ttccatagtt 6240
cctttcttca cctgcccagg aaggtcatac atgaagtaaa tggacaaggg catgtataca 6300
gaatgccctg aaaaatagga caaagttcag aggaccatgt aggtaagacc tttcatcttc 6360
aaacgttgca cagctaaatt ggtgaccccc cactggtctc ctggggtcaa aggtatataa 6420
agttaagctt ctgggaacac agaggatatg caaatgccag agagaaaccc tggaaagaaa 6480
gcagggctct tttggagaat tccttttcct tttggatccc tgaggatata tgggtttagg 6540
catcttaaat agtattggat gttgcgggga gccggggggg gcatagatgg aggtacaggg 6600
caagctgggg ctccggagac ccagaggctc cgacctacag gttctgtgac tgcatcatct 6660
ctagatagac tgaggcacac agggactctt gcaggtcggt tccaggttcc aataacagag 6720
gatactctag acgggagaga ctcctctgct tgtccactgg tcgccagcaa agcccagctt 6780
ttctatctac agagtggcgt tacagtaggg gtctccaagg aaagcagggg agagcggccc 6840
agagagccag ttttgaagaa aaccatccag aaagtcacaa atggtttaga acttccccta 6900
tgtggcagca tttggcctgt agaacgaaat ttgcaaacac ttcttaaatt ccagccatag 6960
attgctccaa gctcagggac ttccacctca gcaccctcca ccagcactcc taaaagccag 7020
aatccagtca caagagcctt tggctgggaa tagatagcaa gtacaggtgg ccgttgggga 7080
ctcaggcacc actcatcccc cccccccccc acctgctcct ccccacccac ttgctggagc 7140
gaatccgtag tagttgttcc ccaaagaggg tctgggagca ctcggtgaca ccgcctaggt 7200
ctggtttccc taggaaacaa cccacgcacc agggttgggc tgcttcggac acggcccgga 7260
tgaactgttg caacttgggc agcccgcagc gcggcgcagt ggcagaggcg ggggcgtgaa 7320
gccgggaggc gcgtgtaacc aggatcctcg aagctccgga gacccggagg cgaaaggatc 7380
cgcacaggaa cccagggcaa cctgcgcgag tggcggagcc ccgcgctccc gccctagctc 7440
aaggggagcg cagtcgtagc ggggttcaga gccccagccc cgtgccaccg ccacccgcgg 7500
tggggggtgg gctgggggcg gggcagctgg ggttgccttc ccgggcgcga tccccgagcg 7560
cggcacccgg cgccgccgag ccacctcccc tgccgcccgc cagcaagttt ggcggcttcg 7620
agcccagaga gccacggctt tctgaagcac tggtttcttg ttagcgttgg tgcgccctgc 7680
ttggcggggg ttctccggag cgatgccgat ggatgtgatt ttagttttgt ggttctgtgt 7740
atgcaccgcc aggacaggta agcaaggctg ggcgttaagg gggatatggg gggaggtggt 7800
ggtgatgatc atgctgttcc tggttgctgt aacccgggat tactctggct gtgagagacg 7860
cggaaactag ctctgacggg ctagagaaag aaggacagca gcatgcttgg gtctctgatc 7920
gcccagcaca gctcggggta aaagcgctag aaaagatgtt ctggcgagcg tcctcttccc 7980
cagggacgca gctgcgggca ttcagtgtgc agggtgcggc cgggtggtcg cacccttgtg 8040
tggctagcta gtagcttccc ggttctgggg agtcagaacc cgctgcagcg ctgccagcga 8100
tccctacatc cttgaacttg cagggtgcgg tggacgaggg tgtcactgag ccgcgggagt 8160
tccacccgca gagggagcgc gtgtagcaag caggtacggc cagggctggg gggagccaga 8220
cgcctcacag gagagggctg cgaggaaagc ggggacctgc gagctcttct gtggctccca 8280
catggttccc ggaggggaac tctaggattg ttctcctttt atgggctccg cgcctaaaca 8340
actgggcgaa caattattag gagggaattt ggagcagtgg agacaactgg aagattttct 8400
cacccgctaa accgtgtttc taatgctatc atcaaagatt gcagggcggg accaggggcc 8460
aaggaaattg gcctaatggc caagtcccta agagaagctg cctgctggag gtggccttat 8520
gatgaccctg aggagcactc ccctctttct tcttccacag gggttccctg actccaggtc 8580
cctggggttc aagaatgtag cctacttcac tggaggcagg ag8622
<210>87
<211>3060
<212>DNA
<213>Rattus norvegicus
<400>87
tggcatctgc tggagaagca acaagtggtt ctgaaatcac ctctgctcgt ttagaataga 60
tttgatagca caggaaactt gtacatgaag tttgtatgaa atctgggagc ggagcacctc 120
accgtttttc ttttttgttg ttgatgtttc tattcttgct atgacatttt acacactata 180
taaaatactg gcagcattct caatttacta taaatggaac ctcagaacgc ttggtggtat 240
gactgctctt gtctctctaa gccccgtggg atcccgggaa acagcacaat gcaggactga 300
gtccttatca aacctgctgc tcgcctgctg tctgaggaga ggccttacca aggcgatgca 360
caaccaccca tcagtcacct gtcatcgact tcaaaattca aatcttataa taagagttta 420
ctaaagtaca gtccatatat caggaacgca ggccttgcaa ggccatggca gacggtagag 480
agtggctaat acacaaagat actcaatgag gctggaagtg taattccaca tctttgagtg 540
aaaactagat ttgtgaagcc tttgctcttt ctaatattga gcttggtatt atctaggaaa 600
caaaagaagt tcaccagtgg gagccggcat ccgccaactg agcacaatta aaagaaaaca 660
cagcacgggc catgcttttt aaacacaaca catactttaa agaagctgac tatttatata 720
gaaataacta ttgttttaaa ttaactagaa gaggaaactt gataccctga gactattgcc 780
tagaaactgt caaactgttt gatatgtaat tgtccaattg tctcacaaaa aactgtacat 840
ttctggtttc tgcttgtgat agatgtacat tctgtatagg aagccagtac ccttaggaag 900
gctagagggg gcctgtgcgg ttatcataag aatacagaca attattagaa actcgttttg 960
taaagcttcc tatttactca aactgtcaag tcctaaaata gtaaggccct gttctaagag 1020
actgaaaatg agaaacagaa acaacacgca gcataagcct aacgcctata cctaattaca 1080
tctctagcca actggaattt tgctgacaat tgggctctat ttccgtgatt acattaggct 1140
attgtcttca gtatcccagc cccaccctcc ccaaagcatc tgaaagtgaa gaaaatatca 1200
taaacacttg tcacaataga aacaccaatt aaggacttta actgaaatcc ttgcttaaag 1260
agcttacatt ttaatttatg atgaacacaa actcctctta aatgcaacac atgtcagttt 1320
ttcccctctc cctacagaga gcttatgagc tgctgtccat ggtggcaccc gctggctgta 1380
tgcagcaaca gcgccaccac agaaacatcc aagttgcatc ctatgtctgc ttcttaaggc 1440
agatgtgctg ggttggttgc attttgcatt gccaacgtct ccgtaattct aagttgcacg 1500
acttcatttg aagccatagc tcccaaaagc ataagaacct cccataccca tgtgtagtgg 1560
gagaggacgc cttgattttc gagatccggg accttcctct gtgcttctct atgaattcct 1620
tggacacttt agccccctta tagaccctca agctaagcac catcctgcaa gccaggaagt 1680
cttcaaaagc tttgctcaat caatttgctg cccgctttct ttaattgaag tttccttaag 1740
actgaacagt atattgaaat ataatttgaa atatgggcag taatgaataa ccaatgtcca 1800
ctgacttcaa aaagaaaaaa aagttttaaa attctacaat tacggtgata tgaggctgtg 1860
cttctgtgaa catccccttg aaacgatttc aaaataattg taacagtatc gtgcccttcc 1920
cctggccact gatgggaagg gaagaatggg tagcgctcca tggtactctg cttcaagtac 1980
agagatgtgc agtagaaata ccgtaaggga attcctctgg gcaggcacca cagcgccgaa 2040
actttgggag gtcagtatct taaccaagat tgagctatct tgtttccttc ccaaatccat 2100
tccacccaaa tgaggcgttt gtgttacaat ttattgttcc ctagacgccc aaatcaccca 2160
tctgcctctg gagtttctag tcggtaatta aggcactatc cattacaacc gccaagtgca 2220
ccaagtgagg aggaggaggg cgcaggaaat gaagggggag aacccacttt aaaagagcca 2280
ggccctgagc gcacagagcc cttcacccca gctgggaccc tccgcctgcc caccccagtg 2340
cagcgcgaag ccaagttagc aagagccgca gggccagctc cccacgacac acagggggct 2400
tctcactggg ccataccttg gaagaggaag gctttcgtcc cattatgcag tcctgggact 2460
tggcgcactc cagctgtgga ctccccaagt tctaactctg ataagacgtc aatctgtagg 2520
gaggggtcca caccaagtcc ccaaactggt gggagtggag aggggtagga aagaaaggaa 2580
gagagaaaga aagggggcca ttaaaacgca agcttccaca gcagcaaaga aagcacgcgt 2640
cttggcgaca atatttggaa gtgctgacaa gaggcaacac gctcctccac agggagagcc 2700
ttacctggac gcgctgtcaa gcttaaaata gcagagcgct gggtcccatc tcctgaccta 2760
ctttaagccc ctctctgtac aaagttcccc cacagccaca gaccctaagg gtgtgacccg 2820
ccttgctgtc gccaggacaa gcacagaaag gactcaaatg caaaccctcc agaggtcccc 2880
aatccagagg gaaaccgggc ggcgacccca tggcggggag catcccggcc cagctcggcg 2940
gccactcacc cgcttcgagc ccgaggatca cgcagaacgt tctcagtaat acccgggatt 3000
ccatggcgtg catcgtctca gtccatcgtc tccctcttta aaaaataaag ataaaaacca 3060
<210>88
<211>72
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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atggagtctc gggtcttact gagaacattc tgtttgatct tcggtctcgg agcagtttgg 60
gggcttggtg tg 72
<210>89
<211>24
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>89
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1 5 10 15
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20
<210>90
<211>72
<212>DNA
<213>Rattus norvegicus
<400>90
atggaatccc gggtattact gagaacgttc tgcgtgatcc tcgggctcga agcggtttgg 60
ggacttggtg tg 72
<210>91
<211>24
<212>PRT
<213>Rattus norvegicus
<400>91
Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Val Ile Leu Gly Leu
1 5 10 15
Glu Ala Val Trp Gly Leu Gly Val
20
<210>92
<211>72
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>92
atggaatccc gggtgttact gagaacgttc tgcgtgatcc tcggccttgg agcggtttgg 60
gggcttggtg tg 72
<210>93
<211>24
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>93
Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Val Ile Leu Gly Leu
1 5 10 15
Gly Ala Val Trp Gly Leu Gly Val
20
<210>94
<211>72
<212>DNA
<213>Canis familiaris
<400>94
atggagcctc gggtcttgct gagaaccttc tgtttgatct tcggtctcgg agcagtctgg 60
gggctcggtg tg 72
<210>95
<211>24
<212>PRT
<213>Canis familiaris
<400>95
Met Glu Pro Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Leu Ile Phe Gly Leu
1 5 10 15
Gly Ala Val Trp Gly Leu Gly Val
20
權(quán)利要求
1.一種用于治療，預(yù)防，或改善哺乳動物骨相關(guān)疾病的藥物組合物，包含有效量的NELL肽，或NELL RNA。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL肽的劑量沒有實質(zhì)上超過NELL肽的最佳劑量范圍。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL肽選自NELL1，NELL2，NELL1肽的片段，NELL2肽的片段以及他們的組合。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述與骨相關(guān)的疾病選自顱面骨產(chǎn)生，非顱面鼓產(chǎn)生，長骨產(chǎn)生，牙周骨產(chǎn)生，膜內(nèi)骨產(chǎn)生，軟骨內(nèi)骨產(chǎn)生，軟骨再生，軟骨肥大以及他們的組合。
5.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述骨相關(guān)疾病選自骨質(zhì)疏松癥，因微重力導(dǎo)致的骨丟失，廢用性萎縮，長期臥床，以及骨代謝為次級效應(yīng)的涉及多癥狀的疾病。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述涉及多癥狀的疾病導(dǎo)致病理性鈣化。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述涉及多癥狀的疾病是導(dǎo)致腎性骨營養(yǎng)不良和/或血管鈣化的慢性腎臟疾病。
8.如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述骨相關(guān)疾病是異位的軟組織鈣化，膽結(jié)石，腎結(jié)石，松果體鈣化，白內(nèi)障，涎石，心臟瓣膜或前列腺的結(jié)石。
9.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL RNA是mRNA，非編碼RNA，微小RNA，dsRNA，或他們的組合。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述NELL RNA通過一種化學(xué)藥品穩(wěn)定化或?qū)ELL RNA摻入一種納米籠或生物材料中穩(wěn)定化。
11.一種藥物組合物，包含有效量的用于治療，預(yù)防，或改善哺乳動物跨越顱骨縫的骨性過度生長的藥劑，其特征在于，該藥劑選自NELL肽，NELL肽的抑制劑，NELL肽受體的拮抗劑，和他們的組合。
12.一種用于治療或預(yù)防哺乳動物軟骨相關(guān)骨病的藥物組合物，該藥物組合物包含有效量的至少一種對于軟骨再生有效的藥劑，其特征在于，所述藥劑選自NELL肽，NELL肽的抑制劑，NELL肽受體的拮抗劑，NELL肽的增強(qiáng)劑，NELL RNA和他們的組合。
13.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL肽選自NELL1，NELL2，NELL1肽的片段，NELL2肽的片段，和他們的組合。
14.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL RNA是mRNA，非編碼RNA，微小RNA，dsRNA，或他們的組合。
15.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL RNA通過一種化學(xué)藥品穩(wěn)定化或?qū)ELL RNA摻入一種納米籠或生物材料中穩(wěn)定化。
16.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥劑對于關(guān)節(jié)面重建，顳下頜關(guān)節(jié)重建，關(guān)節(jié)炎修復(fù)，或椎間盤修復(fù)是有效的。
17.一種藥物組合物，包含有效量的用于治療，預(yù)防或改善骨相關(guān)疾病的NELL肽受體調(diào)節(jié)劑。
18.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，所述調(diào)節(jié)劑選自NELL肽受體的激動劑或拮抗劑，穩(wěn)定化或降解NELL肽的分子，穩(wěn)定化或降解NELL肽受體的分子，初始的受體連接后參與NELL肽和受體的復(fù)合物的穩(wěn)定化和磷酸化作用的分子，NELL肽受體激動劑或拮抗劑的激動劑，NELL肽受體激動劑或拮抗劑的拮抗劑，和他們的組合。
19.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，所述骨相關(guān)疾病選自骨質(zhì)疏松癥，因微重力導(dǎo)致的骨丟失，廢用性萎縮，長期臥床，和涉及以骨代謝為次級效應(yīng)的多癥狀的疾病。
20.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，所述涉及多癥狀的疾病導(dǎo)致病理性鈣化。
21.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，所述涉及多癥狀的疾病是導(dǎo)致腎性骨營養(yǎng)不良和/或血管鈣化的慢性腎臟疾病。
22.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，所述骨相關(guān)疾病是異位的軟組織鈣化，膽結(jié)石，腎結(jié)石，松果體鈣化，白內(nèi)障，涎石，心臟瓣膜或前列腺的結(jié)石。
23.一種用于治療，預(yù)防或改善哺乳動物骨相關(guān)疾病，的藥物組合物，該藥物組合物含有有效量的NELL肽衍生物。
24.如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體。
25.如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體是一種用于某種遞送模式的載體，所述遞送模式選自口服給藥，外用給藥，原位植入，靜脈內(nèi)給藥，胃腸外給藥，局部給藥，動脈內(nèi)注射，骨折部位注射，和用生物可降解的基質(zhì)遞送。
26.如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其特征在于，所述骨相關(guān)疾病選自與下列組，包括因微重力導(dǎo)致的骨丟失，廢用性萎縮，長期臥床，和引起骨代謝為副反應(yīng)的多癥狀的疾病。
27.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其特征在于，所述涉及多癥狀的疾病導(dǎo)致病理性鈣化。
28.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其特征在于，所述涉及多癥狀的疾病是導(dǎo)致腎性骨營養(yǎng)不良和/或血管鈣化的慢性腎臟疾病。
29.如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其特征在于，所述骨相關(guān)疾病是，異位軟組織鈣化，膽結(jié)石，腎結(jié)石，松果體鈣化，白內(nèi)障，涎石，心臟瓣膜或前列腺的結(jié)石。
30.如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL肽衍生物是物理修飾的NELL1肽或NELL2肽。
31.如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL肽衍生物是化學(xué)修飾的NELL1肽或NELL2肽。
32.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL肽衍生物選自于聚乙二醇修飾的NELL1肽，聚乙二醇修飾的NELL2肽，至少含有一個短烴基的NELL1肽，或至少含有一個短烴基的NELL2肽。
33.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其特征在于，所述化學(xué)修飾的NELL肽是NELL肽類似物或NELL2肽類似物。
34.如權(quán)利要求1-33任意一項所述的藥物組合物，進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體。
35.如權(quán)利要求1-33任意一項所述的藥物組合物，進(jìn)一步含有一種第二藥劑，其特征在于所述藥物組合物對于治療，預(yù)防，或改善與骨相關(guān)的疾病是有效的。
36.如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其特征在于，所述第二藥劑選自BMP蛋白，TGFβ蛋白，F(xiàn)GF蛋白，IGF(胰島素樣生長因子)，VEGF，和他們的組合。
37.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，所述與骨相關(guān)的疾病選自骨折，脊柱融合，長骨骨折，顱面骨愈合或形成，牙齒或整形整合，牙齒植入整合，或他們的組合。
38.如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，進(jìn)一步含有一種藥學(xué)上可接受的載體。
39.如權(quán)利要求1-33任意一項所述的藥物組合物，為一種適合于以下遞送模式的配方，該遞送模式選自口服遞送，胃腸外給藥，肺部給藥，和移植。
40.一種治療，預(yù)防，或改善與骨相關(guān)的疾病的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求1-33任意一項所述的藥物組合物給予哺乳動物。
41.一種誘導(dǎo)成骨細(xì)胞或骨形成的方法，包括使細(xì)胞與含有NELL肽，NELL RNA和任選的一種第二藥劑的組合物接觸。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于NELL肽選自NELL1，NELL2，NELL1肽片段，NELL2肽片段，和他們的組合，
其特征在于，所述第二藥劑選自BMP蛋白，GFβ蛋白，F(xiàn)GF蛋白，IGF，VEGF，，和他們的組合
其中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，或脂肪衍生細(xì)胞。
44.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其特征在于，NELL RNA是mRNA，非編碼RNA，微小RNA，dsRNA，或他們的組合。
45.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL RNA通過化學(xué)藥品穩(wěn)定化或?qū)ELL RNA摻合在納米籠或生物材料中穩(wěn)定化。
46.一種誘導(dǎo)骨形成的方法，包括使骨基質(zhì)與一種含有NELL肽，NELLRNA和任選的第二藥劑的組合物接觸。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于所述NELL肽選自NELL1，NELL2，NELL1肽片段，NELL2肽片段，和他們的組合
其特征在于，所述第二藥劑選自BMP蛋白，GFβ蛋白，F(xiàn)GF蛋白，IGF，VEGF，，和他們的組合
其中，所述骨基質(zhì)是去礦化的骨基質(zhì)或礦化的骨基質(zhì)。
48.如權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL RNA是mRNA，非編碼RNA，微小RNA，dsRNA，或他們的組合。
49.如權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其特征在于，所述NELL RNA通過化學(xué)藥品穩(wěn)定化或?qū)ELL RNA摻合在納米籠或生物材料中穩(wěn)定化。
50.一種鑒別NELL相關(guān)的肽受體調(diào)節(jié)劑的方法，包括
使NELL肽的受體分子與試驗復(fù)合物接觸，
使NELL肽與受體分子和試驗化合物接觸，
檢測NELL肽與加入了試驗化合物的受體分子的結(jié)合程度，
對比加入了試驗化合物的NELL肽與受體分子的結(jié)合程度，和對照組的沒有加試驗化合物的NELL肽與受體分子的結(jié)合程度，和
如果加試驗化合物的NELL肽與受體的結(jié)合程度與對照組的結(jié)合程度不同，則指定該試驗化合物為NELL肽受體的調(diào)節(jié)劑。
51.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述指定步驟進(jìn)一步包括
如果加試驗化合物的NELL肽與受體的結(jié)合程度低于對照組，則指定該調(diào)節(jié)劑是NELL肽受體的拮抗劑，或
如果加試驗化合物的NELL肽與受體的結(jié)合程度高于對照組，則指定該調(diào)節(jié)劑是NELL肽受體的激動劑。
52.一種制備NELL肽的方法，包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼NELL基因的核酸構(gòu)成物。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述核酸構(gòu)成物進(jìn)一步含有一個信號肽基因。
54.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)成物含有一個具有選自SEQ ID NO1-81的序列的基因。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)成物含有一個選自SEQ ID NO82-87的啟動基因和/或一個編碼選自SEQ ID NO88-95信號肽的基因。
56.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述核酸構(gòu)成物進(jìn)一步含有一個位于NELL肽基因組DNA的非編碼基因。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述NELL肽是NELL1肽。
58.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
59.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)成物進(jìn)一步含有一個表達(dá)利于分泌的肽的基因。
60.一種根據(jù)權(quán)利要求52-59任意一項制備的重組NELL肽。
61.一種鑒別誘導(dǎo)NELL肽表達(dá)的分子的方法，包括
將NELL1啟動基因與試驗化合物接觸，
檢測NELL1啟動基因的表達(dá)水平，
比較加入試驗化合物的NELL1啟動基因的表達(dá)水平與不加試驗化合物的NELL1啟動基因的表達(dá)水平，和
如果加入試驗化合物的NELL1啟動基因的表達(dá)水平與不加試驗化合的NELL1啟動基因表達(dá)水平不同，則指定該試驗化合物為NELL肽表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。
62.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，指定步驟進(jìn)一步包括
如果加入了試驗化合物的NELL1啟動基因表達(dá)水平低于不加試驗化合物的NELL1啟動基因表達(dá)水平，則指定該調(diào)節(jié)劑為NELL肽表達(dá)的抑制劑，或
如果加入了試驗化合物的NELL1啟動基因表達(dá)水平高于不加試驗化合物的NELL1啟動基因表達(dá)水平，則指定該調(diào)節(jié)劑為NELL肽表達(dá)的增強(qiáng)劑。
63.一種調(diào)節(jié)哺乳動物NELL肽表達(dá)的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求61-62任意一項鑒定的調(diào)節(jié)劑對哺乳動物給藥。
64.一種藥物組合物，其特征在于含有根據(jù)權(quán)利要求61-62任何一項所鑒定的調(diào)節(jié)劑。
65.一種支架，其特征在于含有有效量的NELL肽，或NELL RNA。
66.如權(quán)利要求65所述的支架，其特征在于，所述NELL肽的劑量沒有實質(zhì)上超過NELL肽的最佳劑量范圍。
67.如權(quán)利要求65所述的支架，其特征在于，所述NELL肽選自NELL1，NELL2，NELL1肽片段，NELL2肽片段，和他們的組合。
68.如權(quán)利要求65所述的支架，其特征在于所述與骨相關(guān)的疾病選自顱面骨生成，，非顱面骨生成，長骨生成，牙槽骨生成，膜內(nèi)骨生成，軟骨內(nèi)骨生成，關(guān)節(jié)修復(fù)，關(guān)節(jié)肥大和他們的組合。
69.如權(quán)利要求65所述的支架，其特征在于所述與骨相關(guān)的疾病選自骨質(zhì)疏松癥，因微重力導(dǎo)致的骨丟失，廢用性萎縮，長期臥床，和涉及骨代謝為次級效應(yīng)的多癥狀的疾病。
70.如權(quán)利要求69所述的支架，其特征在于所述涉及多癥狀的疾病導(dǎo)致病理性鈣化。
71.如權(quán)利要求70所述的支架，其特征在于，所述涉及多癥狀的疾病是導(dǎo)致腎病性骨營養(yǎng)不良和/或血管鈣化的慢性腎臟疾病。
72.如權(quán)利要求69所述的支架，其特征在于，所述骨相關(guān)疾病是異位軟組織鈣化，膽結(jié)石，腎結(jié)石，松果體鈣化，白內(nèi)障，涎石，心臟瓣膜或前列腺結(jié)石。
73.如權(quán)利要求65所述的支架，其特征在于，所述NELL RNA是mRNA，非編碼RNA，微小RNA，dsRNA，或他們的組合。
74.如權(quán)利要求65所述的支架，其特征在于，所述NELL RNA通過化學(xué)藥品穩(wěn)定化或?qū)ELL RNA摻合在納米籠或生物材料中穩(wěn)定化。
75.一種治療，預(yù)防，或改善骨相關(guān)疾病的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求1-33任意一項的支架給予哺乳動物。
全文摘要
本發(fā)明在此提供了一種治療，預(yù)防或改善骨或軟骨疾病的藥物組合物，其制備方法以及使用方法。
文檔編號C12P21/06GK101611051SQ200680012707
公開日2009年12月23日 申請日期2006年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月16日
發(fā)明者嘉 宋, 淦 丁, 蘇立奇.科羅達(dá), 本 吳 申請人:加州大學(xué)董事會