專利名稱：：偏肺病毒株及其在疫苗制備和作為抗原序列表達載體的應(yīng)用以及增殖該病毒的方法偏肺病毒株及其在疫苗制備和作為抗原序列表達載體的應(yīng)用以及增殖該病毒的方法相關(guān)申請本申請要求2005年3月10日提交的美國臨時申請?zhí)?0/660,735的優(yōu)先權(quán)，該申請的全部內(nèi)容納入本文作為參考。1.引言本發(fā)明涉及哺乳動物副黏病毒科副黏病毒亞科中的一種負鏈RNA病毒，偏肺病毒(metapneumovirus)(MPV)的改良毒株。本發(fā)明還涉及沒有胰蛋白酶存在時增殖哺乳動物MPV的方法。可利用本發(fā)明方法和組合物制備抗，例如MPV感染的疫苗。2.發(fā)明背景人偏肺病毒(hMPV)是近年來鑒定的呼吸道病毒，最初從病因未明的急性呼吸道疾病癥狀的荷蘭兒童中分離。hMPV導(dǎo)致的呼吸道疾病從輕度上呼吸道癥狀到嚴(yán)重的下呼吸道疾病，例如支氣管炎和肺炎(Boivin等，2002;vandenHoogen等，2001，2003)。根據(jù)取樣的患者群體，幼兒中5-15。/。的呼吸道感染歸因于hMPV感染(Boivin，2003;Williams等，2004;vandenHoogen，2004b)。hMPV也與12-50%的兒童中耳炎有關(guān)(Boivin，2003;Peiris，2003;vandenHoogen，2004b)。在荷蘭，2歲的測試個體中有55。/。是hMPV血清陽性，幾乎所有5歲以上個體是血清陽性(vandenHoogen，2001)。hMPV分布于全世界，歐洲、北美洲、澳大利亞、非洲、以色列、日本和香港均有報道(Bastien等，2003b;Howe，2002;Hamelin等，2004;Jpma等，2004;Maggi等，2003;Nissen等，2002;Peiris，2003;Peret等，2002;Stockton等，2002;Wolf等，2003)。對存檔血清樣品的測試表明hMPV在人群中至少已流行了50年(vandeHoogen等，2001)。為何直到近年才鑒定到的一個原因是它在細胞培養(yǎng)中生長不佳，致細胞病變作用很弱(Hamelin等，2004;vandenHoogen等，2001)。hMPV是副黏病毒科(尸aramyxowW(iae)副黏病毒亞科CPwewmoWn'"fle)的一禾中包膜單鏈負鏈RNA病毒，該科也包括呼吸道合胞體病毒(RSV)、禽肺病毒(APV)和小鼠肺病毒(VandenHoogen等，2001)。根據(jù)與其它肺病毒的同源性，已鑒定到以下順序的8個轉(zhuǎn)錄單元3'N-P-M-F-M2-SH-G-L5'(Toquin等，2003;vandenHoogen，2002)。系統(tǒng)發(fā)生分析將hMPV毒株分為兩種遺傳簇(geneticcluster),稱為不同于APV病毒的亞群A和B(Bastien等，2003a和b;Biacchesi等，2003;Peret等，2002和2004;vandenHoogen，2002)。在這些亞群中，hMPV還可再分為Al、A2、Bl和B2亞型(vandenHoogen，2003)。估計亞群A和B之間高度保守的融合糖蛋白(F)介導(dǎo)了病毒侵入和合胞體形成。肺病毒，例如RSV和APV的F蛋白先合成為全長前體(Fo)，隨后在多元弗林蛋白酶樣(polybasicfurin-like)切割位點切割形成F,和F2。切割Fo暴露了F，N末端的融合肽(Collins，2001;Lamb，1993;Morrison,2003;Russell等，2001;White,1990)。與RSV和APV不同，hMPV含有不符合弗林蛋白酶樣基序的推定切割位點RQS/PR(Barr，1991)。已有報道說從臨床樣品細胞培養(yǎng)中分離到的hMPV依賴于胰蛋白酶(Bastien等，2003a;Biacchesi等，2003;Boivin等，2002;Skiadopoulos等，2004;vandenHoogen等，2001和2004a)。因此，hMPV的兩種分離物，毒株hMPV/NL/1/00和hMPV/NL/1/99能在Vero細胞中生長而無需加入胰蛋白酶出乎意料。沒有和有胰蛋白酶存在時均得到相等的高滴度。測序野生型(wt)hMPV/NL/1/00和wthMPV/NL/1/99的RT-PCR產(chǎn)物，與公開的序列GI:20150834和GI:50059145比較時發(fā)現(xiàn)在編碼F蛋白的推定切割位點的RQSR基序中含有氨基酸取代S101P突變。本文報道的結(jié)果證明對于分別代表hMPV的Al和Bl亞型的兩種毒株hMPV/NL/1/00和hMPV/NL/l/99，在F糖蛋白推定切割位點的RQSR基序中含有101P的病毒無需外源性添加胰蛋白酶即能在Vero細胞中復(fù)制。相反，在F蛋白中含有l(wèi)OlS的hMPV為生長需要加入蛋白酶，例如胰蛋白酶。此報道評估了在沒有和有胰蛋白酶存在時hMPVF糖蛋白變體的體外生長特性、切割特性和在接近該推定切割位點處含有氨基酸取代的重組病毒的合胞體形成。發(fā)現(xiàn)hMPVF的S101P是提高F的切割效率和增強其融合活性的主要遺傳決定簇，兩種情況均可能導(dǎo)致wthMPV/NL/1/00和wthMPV/NL/1/99在沒有胰蛋白酶存在時在Vero細胞中有效生長。所引用參考文獻的目錄見第6章結(jié)尾處。3.發(fā)明概述本發(fā)明提供增殖哺乳動物偏肺病毒的方法，該方法包括用胰蛋白酶比活性低于20毫單位/毫升培養(yǎng)基的培養(yǎng)基培養(yǎng)哺乳動物偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，培養(yǎng)基中未外源性添加胰蛋白酶。在某些方面，培養(yǎng)基中未添加血清。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒F蛋白質(zhì)切割位點中的RQSR切割基序含有至少一個氨基酸取代。在某些方面，與SEQIDNO:314相比，所述哺乳動物偏肺病毒的F蛋白質(zhì)包含至少一個其它的氨基酸取代。在某些方面，RQSR切割基序中的氨基酸取代是絲氨酸被脯氨酸取代，從而產(chǎn)生RQPR序列。在某些方面，F(xiàn)蛋白中的其它氨基酸取代至少是以下之一E93K、Q100K、E92K、E93V、195S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H。在某些方面，F(xiàn)蛋白中的其它氨基酸取代是E93K。在某些方面，所述其它氨基酸取代穩(wěn)定了RQSR基序中的氨基酸取代。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了分離的哺乳動物偏肺病毒，其中所述哺乳動物偏肺病毒能在沒有胰蛋白酶存在下生長。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒F蛋白質(zhì)的切割位點中的RQSR切割基序包含至少一個氨基酸取代。在某些方面，與SEQIDNO:314相比，所述哺乳動物偏肺病毒的F蛋白質(zhì)包含至少一個其它氨基酸取代。在某些方面，RQSR切割基序中的氨基酸取代是絲氨酸被脯氨酸取代，從而產(chǎn)生RQPR序列。在某些方面，F(xiàn)蛋白中的其它氨基酸取代至少是以下之一E93K、Q100K、E92K、E93V、195S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H。在某些方面，所述其它氨基酸取代穩(wěn)定了RQSR基序中的氨基酸取代。在某些方面，F(xiàn)蛋白中的其它氨基酸取代是E93K。在某些方面，所述分離的核酸編碼哺乳動物偏肺病毒的F蛋白，其中所述F蛋白含有S101P氨基酸取代和至少一個以下氨基酸取代E93K、Q100K、E92K、E93V、195S、E96K、Q94K、Q94H、195S、N97K或N97H。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些實施方式中，本發(fā)明提供鑒定哺乳動物偏肺病毒F蛋白的方法，該F有胰蛋白酶時穩(wěn)定生長，該方法包括(a)在沒有胰蛋白酶存在下培養(yǎng)哺乳動物偏肺病毒，至少傳代兩次，所述哺乳動物偏肺病毒F蛋白的切割位點中含有RQPR基序；禾Q(b)檢測合胞體形成；其中與步驟(a)之前哺乳動物偏肺病毒形成合胞體相比，合胞體的形成增加表明哺乳動物偏肺病毒的F蛋白已獲得能支持所述哺乳動物偏肺病毒在沒有胰蛋白酶存在下穩(wěn)定生長的其它氨基酸取代。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒攜帶S101P突變。在某些實施方式中，本發(fā)明提供鑒定哺乳動物偏肺病毒的F蛋白的方法，該F蛋白能支持哺乳動物偏肺病毒在沒有胰蛋白酶時穩(wěn)定生長，該方法包括(a)在沒有胰蛋白酶存在下培養(yǎng)哺乳動物偏肺病毒，至少傳代兩次，所述哺乳動物偏肺病毒F蛋白的切割位點中含有RQPR基序；禾B(b)檢測F蛋白切割；其中與步驟(a)之前哺乳動物偏肺病毒的F蛋白切割相比，F(xiàn)蛋白切割增加表明所述哺乳動物偏肺病毒的F蛋白已獲得能支持所述哺乳動物偏肺病毒在沒有胰蛋白酶存在下穩(wěn)定生長的其它氨基酸取代。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒攜帶S101P突變。在某些實施方式中，本發(fā)明提供鑒定哺乳動物偏肺病毒的F蛋白突變體的方法，該蛋白突變體能提高該F蛋白不依賴胰蛋白酶的切割，其中所述F蛋白在切割位點包含RQPR基序，所述方法包括(a)在沒有胰蛋白酶存在下培養(yǎng)所述哺乳動物偏肺病毒，至少傳代兩次；和(b)檢測所述F蛋白的切割效率，當(dāng)F蛋白的切割效率提高表明其已獲得能提高不依賴胰蛋白酶切割的突變。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒攜帶S101P突變。在某些實施方式中，本發(fā)明提供鑒定能催化哺乳動物偏肺病毒F蛋白切割的蛋白酶的方法，其中所述F蛋白在切割位點包含RQPR基序，所述方法包括(a)使F蛋白與檢驗的蛋白酶接觸；和(b)檢測是否發(fā)生了F蛋白的切割；其中F蛋白發(fā)生切割表明該蛋白酶能催化F蛋白切割。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒攜帶S101P突變。3.1慣用語和縮寫cDNA互補DNAL大蛋白M基質(zhì)蛋白(被膜內(nèi)的譜系)F融合糖蛋白麗血凝素-神經(jīng)氨酸酶糖蛋白N、NP或NC核蛋白(與RNA結(jié)合和聚合酶活性所需)P磷蛋白MOI感染復(fù)數(shù)NA神經(jīng)氨酸酶(被膜糖蛋白)PIV副流感病毒hPIV人副流感病毒hPIV33型人副流感病毒APV/hMPV含hMPV序列的重組APVhMPV/APV含APV序列的重組hMPV哺乳動物MPV哺乳動物偏肺病毒nt核苷酸RNP核糖核蛋白鐘P重組RNPvRNA基因組病毒RNAcRNA反基因組(antigenomic)病毒RNAhMPV人偏肺病毒APV禽肺病毒MVA修飾痘苗病毒，AnkaraFACS熒光激活細胞分選儀CPE細胞病變作用位置1病毒基因組中待轉(zhuǎn)錄的第一個基因的位置位置2天然病毒基因組中第一和第二開放讀框之間的位置，者，病毒基因組中待轉(zhuǎn)錄的第二個基因的位置或位置3天然病毒基因組中第二和第三開放讀框之間的位置，者，病毒基因組中待轉(zhuǎn)錄的第三個基因的位置或位置4天然病毒基因組中第三和第四開放讀框之間的位置，者，病毒基因組中待轉(zhuǎn)錄的第四個基因的位置或位置5天然病毒基因組中第四和第五開放讀框之間的位置，者，病毒基因組中待轉(zhuǎn)錄的第五個基因的位置或位置6天然病毒基因組中第五和第六開放讀框之間的位置，者，病毒基因組中待轉(zhuǎn)錄的第六個基因的位置或Ab抗體dpi感染后的天數(shù)F融合HAI血凝抑制HN血凝素-神經(jīng)氨酸酶hpi感染后的小時MOI感染復(fù)數(shù)POI感染點bPIV-33)型牛副流感病毒hPIV-33型人副流感病毒RSV呼吸道合胞體病毒SFM無血清培養(yǎng)基TCID5Q50%組織培養(yǎng)物感染劑量4.圖1:hMPV4種亞型的滴度和噬斑。將0.1PFU/細胞MOI的各種所示生物學(xué)衍生病毒(+/-0.2(ig/mlTPCK胰蛋白酶)接種于亞匯合單層Vero細胞。接種6天后收集細胞和上清液，冷凍于-7(TC，通過噬斑試驗滴定Vero細胞。將感染的細胞單層在1%甲基纖維素中培養(yǎng)，接種6天后用甲醇固定并依次用雪貂抗-hMPV多克隆抗體和馬-辣根過氧化物酶-偶聯(lián)的抗雪貂抗體免疫染色。用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)目測觀察噬斑，用NikoneclipseTE2000-U顯微鏡攝影。滴度以log1QPFU/ml表示。圖2:比較代表亞型Al的rhMPV/NL/l/00/101P和rhMPV/NL/l/00/101S的生長特性。(A)rhMPV/NL/l/00/101P和rhMPV/NL/l/00/101S(+/-0.2|ig/ml胰蛋白酶)在Vero細胞中培養(yǎng)產(chǎn)生噬斑，接種6天后依次用雪貂抗-hMPV多克隆抗體和馬-辣根過氧化物酶-偶聯(lián)的抗雪貂抗體作免疫染色，加入3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)色原(Dako)顯色。(B)感染rhMPV/NL/l/00/101P(空心正方形)或rhMPV/NL/l/00/101S(實心三角形)的Vero細胞的6-天生長曲線。在左圖中，在Vero細胞中病毒增殖期間和噬斑試驗期間加入0.2!ig/ml胰蛋白酶。在中圖中，不使用胰蛋白酶。在右圖中，病毒增殖期間不用胰蛋白酶，但在噬斑試驗期間中加入0.2pg/ml胰蛋白酶。通過材料與方法所述的噬斑試驗測定滴度。(C)Vero細胞單層接種rhMPV/NL/l/00/101P或rhMPV/NL/l/00/101S(+/-0.2ug/ml胰蛋白酶)。用3%低聚甲醛固定感染的細胞單層，依次用針對hMPVF的倉鼠Mab121-1017-133和FITC-偶聯(lián)的抗-倉鼠Ab作免疫染色，用NikoneclipseTE2000-U顯微鏡目測觀察hMPVF的表面表達。(D)如材料與方法所述，用rhMPV/NL/l/00/101P或rhMPV/NL/1/00/101S(+A0.2ug/ml胰蛋白酶)感染的Vero細胞單層的蛋白質(zhì)印跡。用12%SDS-PAGE凝膠分離病毒樣品，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，依次用針對hMPVF的倉鼠Mab121-1017-133和HRP-偶聯(lián)的倉鼠Ab作免疫印跡，用電化學(xué)發(fā)光(electrochemoluminescence)溶液處理并與曝光膠片。左側(cè)的數(shù)字是以千道爾頓計的分子量標(biāo)記。右側(cè)的箭頭表明對應(yīng)于全長hMPVF(Fo)和切割片段hMPVF,的預(yù)計大小的兩條帶位置。圖3:蛋白質(zhì)印跡檢測以b/hPIV3為載體的hMPVF表達。如教材所述，用wthMPV/NL/l/00、b/hPIV3/hMPVF/101P或b/hPIV3/hMPVF/101S(+A胰蛋白酶)接種亞匯合單層Vero細胞。如材料與方法所述，用針對hMPVF的倉鼠Mab121-1017-133進行蛋白質(zhì)印跡分析。左側(cè)的數(shù)字是以千道爾頓計的分子量標(biāo)記。右側(cè)的箭頭表明對應(yīng)于全長hMPVF(Fo)和切割片段hMPVF,的預(yù)計大小的兩條帶位置。圖4:重組、變體和野生型hMPV病毒的核苷酸序列圖譜。如材料與方法所述進行RT-PCR。所示的圖譜從核苷酸3348延伸至3373。標(biāo)出了對應(yīng)于F糖蛋白的預(yù)計氨基酸93(矩形)、IOO(橢圓形)和101(下劃線的)密碼子。星號表明突變或多態(tài)性。圖5:蛋白質(zhì)印跡檢測的hMPVF蛋白的相對切割效率。將所示hMPV病毒(+/-0.2ug/ml胰蛋白酶)以0.1PFU/細胞的MOI接種Vero細胞。這些病毒是r固PV/NL/l層101S(第1、6、13和18泳道)、r固PV/NL/l層101P(第2、7、11和16道)、v固PV/93K/101P(第3禾卩8泳道)、vhMPV/100K/101P(第4和9泳道)、wthMPV/NL/1/OO(第5、10、15和20泳道)、rhMP'V/93K/101P(第12和17泳道)或rhMPV/93K/101S(第14和19泳道)。如教材所述，應(yīng)注意wthMPV/NL/1/OO是含E93K的hMPV與含Q100K的hMPV的混合物。接種6天后收集細胞和上清液，冷凍于-7(TC，融化后用12。/。SDS-PAGE凝膠分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用針對hMPVF的Mab122-1017-133檢測。左側(cè)的數(shù)字是以千道爾頓計的分子量標(biāo)記。右側(cè)的箭頭表明對應(yīng)于全長hMPVF(Fo)和切割片段hMPVF,的預(yù)計大小的兩條帶。在印跡上方標(biāo)注了各泳道中各病毒的hMPVF氨基酸93、100和101位。印跡下方標(biāo)注了是否存在胰蛋白酶。圖6:在F蛋白中含有101P的重組、變體和野生型hMPV病毒的多輪生長曲線。以O(shè).lPFU/細胞MOI(無胰蛋白酶)接種亞匯合的單層Vero細胞。在6天中以24小時間隔收集細胞和上清液。采用噬斑試驗測定所收集病毒的滴度。圖7:受hMPV病毒感染的Vero細胞單層的相對融合效率。將3PFU/細胞MOI的所示hMPV病毒(+A0.2ug/mlTPCK胰蛋白酶)接種于匯合的單層Vero細胞，用含1%甲基纖維素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在第48小時用甲醇固定這些單層。用Heochst染色劑培育來目測觀察核，用NikoneclipseTE2000-U熒光顯微鏡的DAPI透鏡攝影。所示的照片代表了3個獨立實驗之一的一個視野。計數(shù)10個視野中融合細胞的聚集核與未融合細胞的單核，圖示了融合細胞的百分比。所示數(shù)據(jù)是3個實驗之一。圖8:比較代表Bl亞型的wthMPV/l/99/101P和rhMPV/l/99/101S的生長特性。(A)接種6天后免疫染色wthMPV/NL/l/99/101P或rhMPV/NL/99/101S(各+/-0.2嗎/ml胰蛋白酶)在Vero細胞中生長產(chǎn)生的噬斑。(B)感染wthMPV/NL/l/99/101P(空心正方形)或rhMPV/NL/l/99/101S(實心三角形)的Vero細胞的6-天生長曲線。在左圖中，在病毒增殖期間和噬斑試驗期間加入0.2ng/ml胰蛋白酶。在中圖中，不使用胰蛋白酶。在右圖中，病毒增殖期間不使用胰蛋白酶，但在噬斑試驗期間加入0.2ng/ml胰蛋白酶。通過材料與方法所述的噬斑試驗測定滴度。(C)Vero細胞單層接種wthMPV/NL/l/99/101P或rhMPV/NL/l/99/101S(+A0.2ug/ml胰蛋白酶)。用3%低聚甲醛固定感染的細胞單層，依次用針對hMPVF的倉鼠Mab121-1017-133和FITC-偶聯(lián)的抗-倉鼠Ab作免疫染色，用NikonTE2000-U顯微鏡目測觀察hMPVF的表面表達。(D)如材料與方法所述，用wthMPV/NL/l/99/101P或rhMPV/NL/l/99/101S(+/-0.2ug/ml胰蛋白酶)感染的Vero細胞單層的蛋白質(zhì)印跡。在用12%SDS-PAGE凝膠上分離病毒樣品，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，依次用針對hMPVF的倉鼠Mab121-1017-133和HRP-偶聯(lián)的倉鼠Ab作免疫印跡，用電化學(xué)發(fā)光溶液處理并曝光膠片。左側(cè)的數(shù)字是以千道爾頓計的分子量標(biāo)記。右側(cè)的箭頭表明對應(yīng)于全長hMPVF(Fo)和切割片段hMPVF,的預(yù)計大小的兩條帶位置。圖9:hMPV基因組分析顯示了相對于hMPV基因組構(gòu)成(genomicorganization)的hMPV基因組序列的PCR片段。在表示PCR片段的豎條下面標(biāo)出了突變的位置。圖10:hMPV分離物00-1(Al)禾卩hMPV分離物99-1(Bl)的限制性圖譜。在顯示hMPV的基因組構(gòu)成的圖下方標(biāo)出了各分離物中的限制性位點。圖上面的比例尺表明以kb計的hMPV基因組的位置。5.發(fā)明詳述偏肺病毒毒株本發(fā)明提供在沒有胰蛋白酶存在下能增殖的分離的哺乳動物偏肺病毒毒株。在某些實施方式中，本發(fā)明提供經(jīng)工程改造在沒有胰蛋白酶存在下能增殖的重組哺乳動物(例如人)偏肺病毒。不想局限于理論，本發(fā)明的哺乳動物偏肺病毒毒株能在沒有胰蛋白酶存在下增殖是因為其F蛋白的切割不依賴胰蛋白酶。在某些具體實施方式中，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒是重組偏肺病毒。在某些具體實施方式中，所述哺乳動物偏肺病毒是重組人偏肺病毒(rhMPV)。在某些實施方式中，本發(fā)明提供無需外源性添加胰蛋白酶而能增殖的哺乳動物偏肺病毒毒株。在某些實施方式中，本發(fā)明提供能在胰蛋白酶比活性低于以下值的胰蛋白酶濃度下增殖的哺乳動物偏肺病毒毒株低于40毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于35毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于30毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于25毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于20毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于15毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于10毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于5毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于2毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于l毫單位/毫升培養(yǎng)基或低于0.5毫單位/毫升培養(yǎng)基。在某些實施方式中，本發(fā)明提供能在培養(yǎng)基胰蛋白酶低于以下濃度時增殖的哺乳動物偏肺病毒毒株低于O.l微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基；低于0.05微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基；低于O.Ol微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基；低于0.005微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基；低于0.001微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基；或低于0.0005微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基。在本發(fā)明的某些實施方式中，F(xiàn)蛋白切割位點中RQSR基序的一個或多個氨基酸被取代或缺失。在某些實施方式中，本發(fā)明哺乳動物偏肺病毒的F蛋白切割位點中RQSR基序的絲氨酸被不同的氨基酸取代。在更具體的實施方式中，該F蛋白切割位點中RQSR基序的絲氨酸被脯氨酸取代，從而產(chǎn)生RQPR基序。為減少回復(fù)成野生基因型的可能性，可在編碼某氨基酸的密碼子中至少引入兩個核苷酸變化來工程改造該氨基酸取代。在一示范性實施例中，該F蛋白具有SEQIDNO:314所示的氨基酸序列(人偏肺病毒毒株NL/1/00的F蛋白氨基酸序列)，和氨基酸位置101的絲氨酸被脯氨酸取代從而得到不依賴胰蛋白酶亦能增殖的哺乳動物偏肺病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何通過將不同毒株F蛋白的氨基酸序列與，例如SEQIDNO:314所示氨基酸序列作排列對比來鑒定哺乳動物偏肺病毒不同毒株F蛋白中的同源性氨基酸位置。例如，將SEQIDNO:314與另一種人偏肺病毒毒株F蛋白氨基酸序列作排列對比，定位SEQIDNO:314的RQSR序列(氨基酸位置99-102)，從而鑒定哺乳動物偏肺病毒不同毒株F蛋白中相應(yīng)的氨基酸。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述F蛋白包含一個或多個其它突變("第二位點突變")，例如除F蛋白切割位點RQSR基序中的絲氨酸取代外，相對于SEQIDNO:314具有其它氨基酸取代、添加或缺失。不想局限于理論，這種第二位點突變可穩(wěn)定F蛋白切割位點RQSR基序中的絲氨酸取代，使得在沒有胰蛋白酶存在下生長時，哺乳動物偏肺病毒毒株F蛋白中發(fā)生任何其它突變的頻率低于不含這種第二位點突變的哺乳動物偏肺病毒毒株。此外，不想局限于理論，這種第二位點突變提高了F蛋白的胰蛋白酶不依賴性切割。在某些實施方式中，攜帶第二位點突變的本發(fā)明哺乳動物偏肺病毒毒株可在沒有胰蛋白酶存在下傳代至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或至少25代，而不會在F蛋白中獲得除F蛋白切割位點的RQSR基序中絲氨酸取代之外的任何自發(fā)突變。在本發(fā)明的某些實施方式中，第二位點突變發(fā)生在不同于F基因的某基因中。不想局限于理論，F(xiàn)蛋白的切割取決于該F蛋白的分子環(huán)境(moleculecontext),因而這些蛋白質(zhì)中影響(例如)病毒顆粒中F蛋白折疊或F蛋白取向的變化也能影響F蛋白的切割。在某些實施方式中，第二位點突變位于F蛋白切割位點中RQPR基序附近。在某些實施方式中，第二位點突變在距離RQPR基序氨基末端20個氨基酸之內(nèi)、15個氨基酸之內(nèi)、10個氨基酸之內(nèi)或5個氨基酸之內(nèi)。在某些實施方式中，第二位點突變在距離RQPR基序的羧基末端20個氨基酸之內(nèi)、15個氨基酸之內(nèi)、10個氨基酸之內(nèi)或5個氨基酸之內(nèi)。在某些更具體的實施方式中，第二位點突變在F蛋白中的氨基酸位置對應(yīng)于SEQIDNO:314的氨基酸位置92、93、94、95、96、97或100。在某些甚至更具體的實施方式中，其它突變可以是E93K、Q100K、E92K、E93V、195S、E96K、Q94K、Q94H、195S、N97K或N97H，其中第一個字母指SEQIDNO:314中的氨基酸，數(shù)字指氨基酸位置，第二個字母指取代SEQIDNO:314中相應(yīng)位置氨基酸的氨基酸。在某些實施方式中，本發(fā)明偏肺病毒含有RQPR基序(例如通過攜帶S101P突變)和第二位點突變。在一具體的示范性實施方式中，本發(fā)明提供含有F蛋白的重組人偏肺病毒，其中所述F蛋白含E93K和S101P氨基酸取代。在某些實施方式中，本發(fā)明病毒F蛋白中的突變不會導(dǎo)致哺乳動物偏肺病毒的宿主特異性改變。在某些實施方式中，本發(fā)明病毒F蛋白中的突變不會導(dǎo)致哺乳動物偏肺病毒的宿主細胞特異性改變。本發(fā)明哺乳動物偏肺病毒毒株可用于，例如開發(fā)減毒活病毒疫苗。在某些實施方式中可將兩個或三個突變引入一個密碼子中來影響氨基酸取代。不想局限于理論，一個密碼子中含有多個突變會降低野生基因型的回復(fù)率。可遺傳修飾本發(fā)明偏肺病毒毒株使其編碼異源序列。在某些實施方式中，可修飾本發(fā)明偏肺病毒毒株來編碼抗原性肽、多肽或蛋白質(zhì)。如下文進一步描述的，這種修飾的偏肺病毒可用作疫苗?？蛇M一步遺傳修飾本發(fā)明偏肺病毒毒株，使之在特定宿主體內(nèi)減毒(見下文；見章節(jié)5.7)。-增殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供在沒有胰蛋白酶存在下增殖哺乳動物偏肺病毒的方法。在某些實施方式中，所述哺乳動物偏肺病毒是經(jīng)工程改造能在沒有胰蛋白酶存在下增殖的重組哺乳動物(例如人)偏肺病毒。不想局限于理論，如果哺乳動物偏肺病毒毒株F蛋白的切割不依賴胰蛋白酶，它們能在沒有胰蛋白酶存在下增殖。在某些更具體的實施方式中，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳動物偏肺病毒是重組偏肺病毒。在某些具體實施方式中，所述哺乳動物偏肺病毒是重組人偏肺病毒(rhMPV)。在某些實施方式中，本發(fā)明提供無需外源性添加胰蛋白酶而增殖哺乳動物偏肺病毒的方法。在某些實施方式中，本發(fā)明提供能在胰蛋白酶比活性低于以下值的胰蛋白酶濃度下增殖哺乳動物偏肺病毒毒株的方法低于40毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于35毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于30毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于25毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于20毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于15毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于10毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于5毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于2毫單位/毫升培養(yǎng)基、低于1毫單位/毫升培養(yǎng)基或低于0.5毫單位/毫升培養(yǎng)基。在某些實施方式中，本發(fā)明提供在含以下濃度胰蛋白酶的培養(yǎng)基中增殖哺乳動物偏肺病毒的方法低于0.1微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基；低于0.05微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基；低于O.Ol微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基；低于0.005微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基；低于0.001微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基；或低于0.0005微克胰蛋白酶/毫升培養(yǎng)基。在某些其它實施方式中，用胰蛋白酶活性抑制劑滅活胰蛋白酶。在本發(fā)明的某些實施方式中，F(xiàn)蛋白切割位點中RQSR基序的一個或多個氨基酸被取代或缺失。在某些實施方式中，采用本發(fā)明方法增殖的哺乳動物偏肺病毒F蛋白切割位點中RQSR基序的絲氨酸被不同氨基酸取代，從而賦予該偏肺病毒不依賴胰蛋白酶的生長(能力)。在更具體的實施方式中，采用本發(fā)明方法增殖的哺乳動物偏肺病毒F蛋白切割位點中RQSR基序的絲氨酸被脯氨酸取代。在一示范性實施例中，采用本發(fā)明方法增殖的哺乳動物偏肺病毒F蛋白具有SEQIDNO:314所示的氨基酸序列，氨基酸位置101的絲氨酸被脯氨酸取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何將不同毒株的F蛋白的氨基酸序列與，例如SEQIDNO:314所示氨基酸序列作排列對比來鑒定哺乳動物偏肺病毒不同毒株F蛋白中的同源性氨基酸位置。在本發(fā)明的某些實施方式中，釆用本發(fā)明方法增殖的哺乳動物偏肺病毒F蛋白包含一個或多個其它突變("第二位點突變")，例如除F蛋白切割位點RQSR基序中的絲氨酸取代外，相對于SEQIDNO:314具有其它氨基酸取代、添加或缺失。不想局限于理論，這種第二位點突變可穩(wěn)定F蛋白切割位點RQSR基序中的絲氨酸取代，從而使得該病毒在沒有胰蛋白酶存在下生長時，該哺乳動物偏肺病毒毒株F蛋白中發(fā)生任何其它突變的頻率低于不含這種第二位點突變的哺乳動物偏肺病毒毒株。在某些實施方式中，含有這種第二位點突變以及在F蛋白切割位點的RQSR基序中含有絲氨酸取代的哺乳動物偏肺病毒毒株可在沒有胰蛋白酶存在下傳代至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或至少25代，而不會在F蛋白中獲得任何自發(fā)突變。在某些實施方式中，第二位點突變位于F蛋白切割位點中RQPR基序附近。在某些實施方式中，第二位點突變在距離RQPR基序氨基末端20個氨基酸之內(nèi)、15個氨基酸之內(nèi)、10個氨基酸之內(nèi)或5個氨基酸之內(nèi)。在某些實施方式中，第二位點突變在距離RQPR基序羧基末端20個氨基酸之內(nèi)、15個氨基酸之內(nèi)、10個氨基酸之內(nèi)或5個氨基酸之內(nèi)。在某些更具體的實施方式中，第二位點突變在F蛋白中的氨基酸位置對應(yīng)于SEQIDNO:314的氨基酸位置92、93、94、95、96、97或100。在某些甚至更具體的實施方式中，第二位點突變可以是E93K、Q100K、E92K、E93V、195S、E96K、Q94K、Q94H、195S、N97K或N97H，其中第一個字母指SEQIDNO:314中的氨基酸，數(shù)字指氨基酸位置，第二個字母指取代SEQIDNO:314中相應(yīng)位置氨基酸的氨基酸。在本發(fā)明的某些實施方式中，第二位點突變位于不同于F基因的基因中。不想局限于理論，F(xiàn)蛋白的切割取決于F蛋白的分子環(huán)境，因而這些蛋白質(zhì)中影響(例如)病毒顆粒中F蛋白折疊或F蛋白取向的變化也可能影響F蛋白的切割。在一具體的示范性實施方式中，本發(fā)明提供在沒有胰蛋白酶存在下增殖含F(xiàn)蛋白的重組人偏肺病毒的方法，其中所述F蛋白含E93K和S101P氨基酸取代。在某些實施方式中，本發(fā)明提供無需向培養(yǎng)基中添加血清而增殖哺乳動物偏肺病毒的方法。在沒有血清存在下培養(yǎng)受感染細胞的詳述見章節(jié)5.6。本發(fā)明方法所用的示范性細胞系包括但不限于Vero細胞和LLC-MK2恒河猴腎(細胞)。如果本發(fā)明方法利用重組病毒，可用BHK細胞來拯救哺乳動物偏肺病毒。在某些實施方式中，本發(fā)明方法可用的病毒F蛋白中的突變不會導(dǎo)致哺乳動物偏肺病毒的宿主特異性改變。在某些實施方式中，本發(fā)明方法可用的病毒F蛋白中的突變不會導(dǎo)致哺乳動物偏肺病毒的宿主細胞特異性改變。篩選試驗本發(fā)明也提供哺乳動物偏肺病毒F蛋白的胰蛋白酶不依賴性切割的第二位點突變的鑒定方法，所述F蛋白在切割位點含有RQPR基序。在某些實施方式中，本發(fā)明提供鑒定哺乳動物偏肺病毒F蛋白的胰蛋白酶不依賴性切割的增強劑(enhancer怖篩選方法，所述F蛋白在切割位點含有RQPR基序。不想局限于任何具體的機制或理論，含RQPR基序的哺乳動物偏肺病毒F蛋白的胰蛋白酶不依賴性切割的這種第二位點突變(例如，增強劑)可穩(wěn)定病毒基因組，從而使得該病毒在沒有胰蛋白酶存在下生長不會導(dǎo)致F基因中積累其它自發(fā)突變。在某些實施方式中，這種第二位點的修飾位于F基因中。在某些其它實施方式中，這種第二位點修飾位于哺乳動物偏肺病毒的其它基因中。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將突變引入哺乳動物偏肺病毒的F基因中?？刹捎靡韵路椒ㄒ胪蛔?，例如隨機誘變DNA和采用反向遺傳學(xué)(方法)來拯救含突變的病毒顆粒；定點誘變DNA和采用反向遺傳學(xué)(方法)來拯救含突變的病毒顆粒；或在選擇壓力，即沒有胰蛋白酶存在下培養(yǎng)該病毒。可在不同水平選擇合適的第二位點突變。在某些實施方式中，誘變編碼F蛋白的DNA，表達F蛋白并檢驗其胰蛋白酶不依賴性切割的能力(示范性試驗如下文所述)。胰蛋白酶不依賴性切割提高表明第二位點突變是F蛋白的胰蛋白酶不依賴性切割的增強劑。在其它實施方式中，誘變編碼F的基因DNA，采用反向遺傳學(xué)(方法)拯救病毒，檢驗該病毒的胰蛋白酶不依賴性F蛋白切割(是否)提高或合胞體形成(是否)增加。在還有其它實施方式中，在沒有胰蛋白酶存在下，即在選擇壓力下培養(yǎng)該病毒，然后檢驗任何第二位點突變的影響，例如胰蛋白酶不依賴性F蛋白切割(是否)提高或合胞體形成(是否)增加。一旦選擇了在F基因中攜帶有第二位點修飾的突變體，可測序F基因。隨后，將該突變引入充分表征的毒株中(例如但不限于rhMPV/NL/l/00/101P)以確認(rèn)該第二位點突變的作用并產(chǎn)生適合于疫苗生產(chǎn)的病毒株。為鑒定能切割含RQPR基序的偏肺病毒F蛋白的蛋白酶，可采用技術(shù)人員已知的任何方法檢測和定量蛋白酶活性。在某些實施方式中，將切割位點中含有RQPR基序的可檢測標(biāo)記的F蛋白固定在固體支持物上，因而切割該F蛋白便導(dǎo)致標(biāo)記喪失(即，與切割位點相比，標(biāo)記遠離固定位點)。因此，可依靠可檢測標(biāo)記的減少來檢測和定量測定蛋白酶活性。其它實施方式檢測了釋放入反應(yīng)緩沖液的可檢測標(biāo)記的氨基酸或肽或多肽。在某些其它實施方式中，采用FRET或熒光極化來檢測和定量測定蛋白酶的反應(yīng)。在一示范性實施例中，F(xiàn)蛋白在未與固體支持物相連的一端作熒光標(biāo)記。與檢驗蛋白酶培育后，熒光標(biāo)記因蛋白水解而喪失，因而熒光降低表明存在能切割含RQPR基序的F蛋白的蛋白酶活性。在某些實施方式中，所述固體支持物是珠?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何方法可檢測地標(biāo)記F蛋白。在某些實施方式中，放射性標(biāo)記該蛋白或多肽。在某些實施方式中，將該蛋白或多肽的一端與固體支持物表面相連，另一端作可檢測標(biāo)記。固體支持物表面可檢測標(biāo)記的減少是可衡量蛋白酶的活性。可用作檢驗蛋白酶的各類蛋白酶包括但不限于菠羅蛋白酶、組織蛋白酶、糜蛋白酶、膠原酶、彈性蛋白酶、血管舒緩素、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纖維蛋白溶酶、腎素、鏈激酶、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶和尿激酶。在一具體實施方式中，蛋白酶是類胰蛋白酶Clara或其同系物。5.1哺乳動物偏肺病毒的結(jié)構(gòu)特征本發(fā)明提供一種哺乳動物MPV。該哺乳動物MPV是屬于副黏病毒科，肺病毒亞科的負義單鏈RNA病毒。此外，該哺乳動物MPV在系統(tǒng)發(fā)育上鑒定為對應(yīng)于偏肺病毒屬(MWa/we^nov/^^)，所述哺乳動物MPV在系統(tǒng)發(fā)育上更接近CNCM(巴黎)以1-2614保藏的病毒分離物(SEQIDNO:19)，而不是火雞鼻氣管炎病毒(禽鼻氣管炎的病原體)。可通過，例如獲得某病毒的核酸序列信息后采用系統(tǒng)發(fā)育分析檢驗將該病毒鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于偏肺病毒屬?？刹捎眉夹g(shù)人員己知的任何技術(shù)測定病毒的各毒株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。示范性方法可參見章節(jié)5.9。其它技術(shù)公開于全文納入本文作為參考的國際專利申請PCT/NL02/00040,其公布為WO02/057302。具體地說，PCT/NL02/00040在第12頁第27行到第19頁第29行公開了適合于系統(tǒng)發(fā)育分析的核酸序列，這些序列納入本文作為參考。根據(jù)下文更加詳述的序列相似性將病毒進一步鑒定為哺乳動物MPV。除了某病毒與本文所述哺乳動物MPV的系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)和序列相似外，也可利用某病毒的基因組構(gòu)成與本文所述哺乳動物MPV的基因組構(gòu)成的相似性將該病毒鑒定為哺乳動物MPV。哺乳動物MPV的代表性基因組構(gòu)成見圖9。在某些實施方式中，在副黏病毒科的肺病毒亞科內(nèi)，哺乳動物MPV的基因組構(gòu)成不同于肺病毒屬的基因組構(gòu)成。此兩屬(偏肺病毒屬和肺病毒屬)的分類主要依據(jù)它們的基因構(gòu)象(geneconstellation);偏肺病毒通常缺乏非結(jié)構(gòu)蛋白，例如NS1或NS2(也參見Randhawa等，1997，J.Virol.71:9849-9854)，基因順序(geneorder)不同于肺病毒的(RSV:'3-NSl-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L匿5，，APV:'3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5，)(Lung等，1992，J.Gen.Virol.73:1709-1715;Yu等，1992，P7ra/ogy186:426-434;Randhawa等，1997，J.Virol.71:9849-9854)。此外，可通過免疫學(xué)特性來鑒定本發(fā)明哺乳動物MPV。在某些實施方式中，可產(chǎn)生針對哺乳動物MPV的能中和哺乳動物MPV的特異性抗血清?？僧a(chǎn)生針對MPV的也能中和哺乳動物MPV的單克隆抗體和多克隆抗體。參見納入本文作為參考的PCTWO02/057302第—頁到第—頁。可通過感染哺乳動物宿主(即哺乳動物培養(yǎng)細胞或哺乳動物)的能力來進一步表征本發(fā)明哺乳動物MPV。與APV不同，哺乳動物MPV在雞和火雞中不能復(fù)制或只有低水平復(fù)制。然而，哺乳動物MPV能在哺乳動物宿主，例如彌猴(cynomolgousmacaques)中復(fù)制。在某些更具體的實施方式中，可通過在哺乳動物宿主中復(fù)制的能力進一步表征哺乳動物MPV。在某些更具體的實施方式中，通過導(dǎo)致哺乳動物宿主表達哺乳動物MPV基因組所編碼蛋白質(zhì)的能力進一步表征哺乳動物MPV。在甚至更具體的實施方式中，哺乳動物MPV表達的病毒蛋白可插入哺乳動物宿主的細胞質(zhì)膜。在某些實施方式中，本發(fā)明哺乳動物MPV能感染哺乳動物宿主并導(dǎo)致哺乳動物宿主產(chǎn)生該哺乳動物MPV的新感染性病毒顆粒。本發(fā)明哺乳動物MPV的功能特征的更詳細描述見章節(jié)5.12。在某些實施方式中，可利用該病毒在電子顯微鏡下的外觀或其對氯仿的敏感性將病毒鑒定為哺乳動物MPV。本發(fā)明哺乳動物MPV在電子顯微鏡下呈副黏病毒樣顆粒。哺乳動物MPV—貫對氯仿處理敏感；最好用tMK細胞或其功能等價細胞培養(yǎng)哺乳動物MPV，其在大多數(shù)細胞培養(yǎng)中必須依賴于胰蛋白酶。此外，哺乳動物MPV具有典型的細胞病變效應(yīng)(CPE)，對各種紅細胞缺乏凝血活性。MPV分離物誘導(dǎo)的CPE類似于hRSV誘導(dǎo)的CPE，特征為合胞體形成，然后細胞內(nèi)快速破壞，接著與培養(yǎng)板脫離。雖然大多數(shù)副黏病毒具有凝血活性，但大多數(shù)肺病毒無此活性(Pringle，C.R.，刊于7Tze尸crramyxov〖n/^y(《副黏病毒》)，(D.W.Kingsbury編)1-39(PlenumPress,紐約，1991))。哺乳動物MPV在編碼M2蛋白的核酸片段中含有第二重疊ORF(M2-2)。如Ahmadian等，1999，《/.G饑80:2011-2016所示，其它肺病毒中也出現(xiàn)該第二重疊ORF。在某些實施方式中，本發(fā)明提供將病毒分離物鑒定為哺乳動物MPV的方法。檢驗樣品可以得自，例如動物或人。然后檢驗樣品中是否存在肺病毒亞科的病毒。如果存在肺病毒亞科病毒，可檢驗該病毒(是否具有)本文所述哺乳動物MOV的特征，例如但不限于與哺乳動物MPV在系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)、與哺乳動物MPV核苷酸序列的核苷酸序列相同性、與哺乳動物MPV氨基酸序列的氨基酸序列相同性/同源性和基因組構(gòu)成。此外，可通過利用MPV分離物核酸序列作交叉雜交實驗，利用哺乳動物MPV特異性引物作RT-PCR或利用針對哺乳動物MPV分離物的抗體作經(jīng)典交叉血清學(xué)實驗將病毒鑒定為哺乳動物MPV。在某些其它實施方式中，可根據(jù)免疫學(xué)差異，例如用動物抗血清定量中和來鑒定哺乳動物MPV?？寡蹇傻米裕绺腥玖瞬溉閯游颩PV的雪貂、豬或彌猴(參見，例如實施例8)。在某些實施方式中，所述血清型不與除哺乳動物MPV以外的病毒交叉反應(yīng)。在其它實施方式中，所述血清型顯示兩種方向的同源-異源滴度比例均〉16。如果中和(反應(yīng))顯示在一種或兩種方向上兩種病毒之間有某種程度的交叉反應(yīng)(同源-異源滴度比例為8或16)，如果DNA序列存在實質(zhì)性的生物物理/生物化學(xué)差異則可假定血清型不同。如果中和(反應(yīng))顯示在一種或兩種方向上兩種病毒之間有明顯程度的交叉反應(yīng)(同源-異源滴度比例小于8)，則可假定所研究二分離物血清型相同。分離物I-2614(本文也稱為MPV分離物OO-l)可用作原型。在某些實施方式中，可利用保藏物的序列，通過比較病毒蛋白或核酸與本文所述病毒分離物的氨基酸序列和核苷酸序列的序列同源性/相同性將病毒鑒定為哺乳動物MPV。具體地說，當(dāng)病毒所含的核酸序列與CNCM(巴黎)保藏為1-2614的病毒分離物有以下所述百分比的核酸相同性時，該病毒可鑒定為哺乳動物MPV，所述百分比高于本文鑒定的編碼L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白或F蛋白的核酸(如下文鑒定的)與APV-C相比的百分比(見表1)。參見納入本文作為參考的PCTWO02/05302，第12-19頁。不想受理論的限制，通常知道病毒種類(特別是RNA病毒種類)常構(gòu)成其中一簇病毒顯示序列有異質(zhì)性的擬種(quasispecies)。因此，當(dāng)與APV-C相比時，估計各分離物的序列相同性百分比可能稍有不同。迄今為止，MPV的蛋白質(zhì)與同科其它已知病毒的蛋白質(zhì)之間的最高氨基(酸)序列相同性是APV-C與人MPV之間的相同性。當(dāng)與序列表所示序列比較時，可以推測在人MPV與APV-C之間，基質(zhì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列相同性是87%、核蛋白是88%，磷蛋白是68%，融合蛋白是81%，聚合酶蛋白的各部分是56-64%，也參見表1。與這些最大值相比，可認(rèn)為含有編碼同源性較高蛋白質(zhì)的ORF的病毒分離物是哺乳動物MPV。應(yīng)該注意，與其它病毒相似，發(fā)現(xiàn)在哺乳動物MPV的不同分離物之間有一定程度差異。表1:MPV的ORF與其它副黏病毒的ORF之間的氨基酸序列相同性NPMFM2-lM2-2APVA69557867722664APVB695176677127-2NPMFM2-lM2-2APVC886887818456-2hRSVA42243834361842hRSVB41233733351944bRSV42223834351344PVM452637393312其它37-114-97-1010-18-4-413-14腳注1.已知與G和SH蛋白未發(fā)現(xiàn)序列同源性，因而排除。2.未得到序列。3.其它2型和3型人副流感病毒、仙臺病毒、麻疹病毒、尼帕病毒(nipah)、海豹(phocine)瘟熱病毒和新城疫病毒。4.病毒基因組中缺乏ORF在某些實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV中SH蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:382所示氨基酸序列(分離物NL/1/00的SH蛋白；參見表14)有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。所含SH蛋白與SEQIDNO:382(分離物NL/1/00的SH蛋白；參見表14)有至少30%相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能感染哺乳動物宿主。在某些實施方式中，所含SH蛋白與SEQIDNO:382(分離物NL/1/00的SH蛋白；參見表14)有至少30%相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能在哺乳動物宿主中復(fù)制。在某些實施方式中，哺乳動物MPV所含核苷酸序列編碼的SH蛋白與SEQIDNO:382(分離物NL/1/00的SH蛋白；參見表14)有至少30%相同。在某些實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV中G蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:322所示氨基酸序列(分離物NL/1/00的G蛋白；參見表14)有至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。所含G蛋白與SEQIDNO:322(分離物NL/1/00的G蛋白；參見表14)有至少20%相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能感染哺乳動物宿主。在某些實施方式中，所含G蛋白與SEQIDNO:322(分離物NL/1/00的G蛋白；參見表14)有至少20%相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能在哺乳動物宿主中復(fù)制。在某些實施方式中，哺乳動物MPV所含核苷酸序列編碼的G蛋白與SEQIDNO:322(分離物NL/1/00的G蛋白；參見表14)有至少20%相同。在某些實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV中L蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:330所示氨基酸序列(分離物NL/1/00的L蛋白；參見表14)有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。所含L蛋白與SEQIDNO:330(分離物NL/1/00的L蛋白；參見表14)有至少85。/。相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能感染哺乳動物宿主。在某些實施方式中，所含L蛋白與SEQIDNO:330(分離物NL/1/00的L蛋白；參見表14)有至少85y。相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能在哺乳動物宿主中復(fù)制。在某些實施方式中，哺乳動物MPV所含核苷酸序列編碼的L蛋白與SEQIDNO:330(分離物NL/1/00的L蛋白；參見表14)有至少20%相同。在某些實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV中N蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:366所示氨基酸序列有至少90%、至少95%或至少98%相同。所含N蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:366有至少90%相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能感染哺乳動物宿主。在某些實施方式中，所含N蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:366有至少90%相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能在哺乳動物宿主中復(fù)制。以N蛋白的全長計算氨基酸相同性。在某些實施方式中，哺乳動物MPV所含核苷酸序列編碼的N蛋白與SEQIDNO:366所示氨基酸序列有至少90%、至少95%或至少98%相同。本發(fā)明還提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV中P蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:374所示氨基酸序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%相同。所含P蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:374有至少70%相同的哺乳動物MPV能感染哺乳動物宿主。在某些實施方式中，所含N蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:374有至少70%相同的哺乳動物MPV能在哺乳動物宿主中復(fù)制。以P蛋白的全長計算氨基酸相同性。在某些實施方式中，哺乳動物MPV所含核苷酸序列編碼的P蛋白與SEQIDNO:374所示氨基酸序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%相同。本發(fā)明還提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV中M蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:358所示氨基酸序列有至少90%、至少95%或至少98%相同。所含M蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:358有至少卯％相同的哺乳動物MPV能感染哺乳動物宿主。在某些實施方式中，所含M蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:358有至少90%相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能在哺乳動物宿主中復(fù)制。以M蛋白的全長計算氨基酸相同性。在某些實施方式中，哺乳動物MPV所含核苷酸序列編碼的M蛋白與SEQIDNO:358所示氨基酸序列有至少90%、至少95%或至少98%相同。本發(fā)明還提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV中F蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:314所示氨基酸序列有至少85%、至少90%、至少95%或至少98%相同。所含F(xiàn)蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:314有至少85%相同的哺乳動物MPV能感染哺乳動物宿主。在某些實施方式中，所含F(xiàn)蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:314有至少85。/。相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能在哺乳動物宿主中復(fù)制。以F蛋白的全長計算氨基酸相同性。在某些實施方式中，哺乳動物MPV所含核苷酸序列編碼的F蛋白與SEQIDNO:314所示氨基酸序列有至少85%、至少90%、至少95%或至少98%相同。本發(fā)明還提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV中M2-l蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:338所示氨基酸序列有至少85%、至少90%、至少95%或至少98%相同。所含M2-l蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:338有至少85。/。相同的哺乳動物MPV能感染哺乳動物宿主。在某些實施方式中，所含M2-1蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:338有至少85%相同的分離的負義單鏈RNA偏肺病毒能在哺乳動物宿主中復(fù)制。以M2-1蛋白的全長計算氨基酸相同性。在某些實施方式中，哺乳動物MPV所含核苷酸序列編碼的M2-l蛋白與SEQIDNO:338所示氨基酸序列有至少85%、至少90%、至少95%或至少98%相同。本發(fā)明還提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV中M2-2蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:346所示氨基酸序列有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%相同。所含M2-2蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:346有至少60%相同的哺乳動物MPV能感染哺乳動物宿主。在某些實施方式中，所含M2-2蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO:346有至少60%相同的分離的負鏈單鏈RNA偏肺病毒能在哺乳動物宿主中復(fù)制。以M2-2蛋白的全長計算氨基酸相同性。在某些實施方式中，哺乳動物MPV所含核苷酸序列編碼的M2-2蛋白與SEQIDNO:346所示氨基酸序列有至少60%、至少70%、至少80%、至少卯％、至少95%或至少98%相同。在某些實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV，其中該負義單鏈RNA偏肺病毒編碼選自以下的至少兩種蛋白質(zhì)、至少三種蛋白質(zhì)、至少四種蛋白質(zhì)、至少五種蛋白質(zhì)或至少六種蛋白質(zhì)(i)與SEQIDNO:366具有至少90。/。氨基酸序列相同性的N蛋白；(ii)與SEQIDNO:374具有至少70。/。氨基酸序列相同性的P蛋白；(iii)與SEQIDNO:358具有至少90。/。氨基酸序列相同性的M蛋白；(iv)與SEQIDNO:314具有至少85。/。氨基酸序列相同性的F蛋白；(v)與SEQIDNO:338具有至少85%氨基酸序列相同性的M2-l蛋白；禾口(vi)與SEQIDNO:346具有至少60%氨基酸序列相同性的M2-2蛋白。本發(fā)明提供兩種亞群的哺乳動物MPV，亞群A和亞群B。本發(fā)明也提供4種變體A1、A2、B1禾卩B2。如果與分離物99-l(SEQIDNO:18)相比，某哺乳動物MPV在系統(tǒng)發(fā)育上與分離物00-1(SEQIDNO:19)更密切相關(guān)，則其可鑒定為亞群A的成員。如果與分離物00-1(SEQIDNO:19)相比，某哺乳動物MPV在系統(tǒng)發(fā)育上與分離物99-l(SEQIDNO:18)更密切相關(guān)，則其可鑒定為亞群B的成員。在其它實施方式中，可用各ORF的核苷酸序列或氨基酸序列同源性將哺乳動物MPV分類為屬于A或B亞群。可將哺乳動物MPV的不同分離物分成四種不同變體變體A1、變體A2、變體B2和變體B2。分離物00-1(SEQIDNO:19)是哺乳動物MPV變體Al的例子。分離物是99-1(SEQIDNO:18)哺乳動物MPV變體Bl的例子。采用系統(tǒng)發(fā)育分析可將某哺乳動物MPV歸類為四種變體之一。因此，如果與另一變體的成員相比，某哺乳動物MPV在系統(tǒng)發(fā)育上與哺乳動物MPV某特定變體的成員更密切相關(guān)，則該MPV屬于該特定變體?？衫萌魏蜲RF和所編碼多肽，包括N、P、L、M、SH、G、M2或F多肽的序列將MPV分離物分型為屬于特定亞群或變體。在一具體的實施方式中，可根據(jù)G蛋白的序列將某哺乳動物MPV分類為某變體。不想受理論的限制，G蛋白序列因在哺乳動物MPV不同變體之間差異程度高而良好適合于系統(tǒng)發(fā)育分析。在本發(fā)明的某些實施方式中，可通過兩條序列在下文所示特定條件下雜交的能力確定序列同源性。本發(fā)明方法可利用能與哺乳動物MPV的核酸或其反向互補核酸或其互補核酸雜交的核酸來確定它們彼此的序列同源性和相同性。在某些實施方式中，在高度嚴(yán)格的條件下雜交核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的雜交條件例如但不限于溫度、鹽濃度、pH、甲酰胺濃度(參見，例如全文納入本文作為參考的Sambrook等，1989，第9-11章，MolecularCloning,ALaboratoryManual(《分子克隆，實驗室手冊》)，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)。在某些實施方式中，在水溶液中進行雜交，溶液的離子強度維持恒定，而雜交溫度根據(jù)待雜交序列之間的序列同源性程度而不同。對于彼此100%相同且長于200個堿基對的DNA序列，在比完美雜交的解鏈溫度(Tm)約低15-25。C下進行雜交?？衫靡韵路匠淌接嬎憬怄湝囟?Tm)(Bolton和McCarthy,1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:1390):Tm=81.5°C-16.6(loglO[Na+])+(%G+C)-0.63(%甲酰胺)-(600/1)其中(Tm)是解鏈溫度，[Na+]是鈉濃度，G+C是鳥嘌呤和胞嘧啶含量，1是以堿基對計的雜交物長度?？捎肂onner等(Bonner等，1973，J.Mol.Biol.81:123-135)的公式計算序列間錯配的影響雜交物中堿基每錯配1%，解鏈溫度降低1-1.5°C。因此，通過測定兩條序列的雜交溫度，本領(lǐng)域技術(shù)人員能估計某序列與已知序列有多相似。這可以通過，例如將憑經(jīng)驗確定的雜交溫度與該已知序列與其完美匹配(序列)雜交計算的雜交溫度作比較來進行。釆用Bonner等的公式，可用雜交溫度和錯配百分比之間的關(guān)系來提供有關(guān)序列相似性的信息。例如但不限于，采用這種高嚴(yán)格性條件的方法如下所示。65°C，將含DNA的濾膜在由6XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA和500pg/ml變性鮭魚精子DNA組成的緩沖液中預(yù)雜交8小時到過夜。在65。C，將濾膜在含100pg/ml變性鮭魚精子DNA和5-20X106cpm的32P-標(biāo)記探針的預(yù)雜交混合物中雜交48小時。在37°C，用含2XSSC、0.01%PVP、0.01%Ficoll和0.01%BSA的溶液洗滌濾膜1小時。然后在50。C先用0.1XSSC洗滌45分鐘，再進行放射自顯影。本領(lǐng)域熟知可用的其它高嚴(yán)格性條件。在本發(fā)明的其它實施方式中，在技術(shù)人員熟知的中等到低嚴(yán)格性條件下進行雜交(參見，例如Sambrook等，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual(《分子克隆，實驗室手冊》)，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；也參見Ausubel等編，干U于CurrentProtocolsinMolecularBiologyseriesoflaboratorytechniquemanuals(《分子生物學(xué)最新方法，實驗室技術(shù)手冊叢書》)，1987-1997，CurrentProtocols,1994-1997，JohnWileyandSons，Inc.,二者各自全文納入本文作為參考)。示范性的低嚴(yán)格性條件為以下緩沖液系統(tǒng)所提供4(TC，在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.2%BSA、100pg/ml變性鮭魚精子DNA和10%(重量/體積)硫酸葡聚糖的緩沖液中雜交18-20小時，在55。C用由2XSSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1%SDS構(gòu)成的緩沖液洗滌1.5小時，和在6(TC用由2XSSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1%SDS構(gòu)成的緩沖液洗滌1.5小時。在某些實施方式中，可用哺乳動物MPV特定變體的特異性探針將某哺乳動物MPV可分類為變體之一。這種探針包括RT-PCT的引物和抗體。將某哺乳動物MPV鑒定為特定變體的示范性方法描述于下文章節(jié)5.9。在本發(fā)明的某些實施方式中，哺乳動物MPV的不同變體可經(jīng)由不同病毒蛋白的氨基酸序列而彼此區(qū)分。在其它實施方式中，哺乳動物MPV的不同變體可經(jīng)由該病毒基因組編碼的不同ORF的核苷酸序列而彼此區(qū)分。哺乳動物MPV的變體可以是但不限于Al、A2、Bl或B2。然而，本發(fā)明也考慮作為尚未鑒定的另一種變體成員的哺乳動物MPV分離物。本發(fā)明也考慮具有在系統(tǒng)發(fā)育上與一種變體更密切相關(guān)的一個或多個ORF和在系統(tǒng)發(fā)育上與另一種變體更密切相關(guān)的一個或多個ORF的病毒。這種病毒可分類為其大多數(shù)ORF在系統(tǒng)發(fā)育上更密切相關(guān)的變體。也可用非編碼序列來確定系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性。如果與其它病毒分離物之一相比，某哺乳動物MPV分離物在系統(tǒng)發(fā)育上與病毒分離物NL/l/99(SEQIDNO:18)更密切相關(guān)，則其分類為變體B1，所述其它病毒分離物為NL/1/00(SEQIDNO:19)、NL/17/00(SEQIDNO:20)和NL/1/94(SEQIDNO:21)?？衫貌溉閯游颩PV的一個或多個ORF將該哺乳動物MPV分類成某變體。如果某哺乳動物MPV符合以下條件，其可分類為MPV變體B1:其G蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B1的G蛋白(如原型NL/1/99(SEQIDNO:324)所示)有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其N蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Bl的N蛋白(如原型NL/1/99(SEQIDNO:368)所示)有至少98.5%、至少99%或至少99.5%相同；其P蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Bl的P蛋白(如原型NL/1/99(SEQIDNO:376)所示)有至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其M蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B1的M蛋白(如原型NL/1/99(SEQIDNO:360)所示)相同；其F蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Bl的F蛋白(如原型NL/1/99(SEQIDNO:316)所示)有至少99%相同；其M2-l蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Bl的M2-l蛋白(如原型NL/1/99(SEQIDNO:340)所示)有至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其M2-2蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Bl的M2-2蛋白(如原型NL/1/99(SEQIDNO:348)所示)有至少99%或至少99.5%相同；其SH蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Bl的SH蛋白(如原型NL/1/99(SEQIDNO:384)所示)有至少83%、至少85%、至少卯％、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；和/或其L蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B1的L蛋白(如原型NL/1/99(SEQIDNO:332)所示)有至少99%或至少99.5%相同。如果與其它病毒分離物之一相比，某哺乳動物MPV分離物在系統(tǒng)發(fā)育上與病毒分離物NL/1/00(SEQIDNO:19)更密切相關(guān)，則其分類為變體A1，所述其它病毒分離物為NL/1/99(SEQIDNO:18)、NL/17/00(SEQIDNO:20)和NL/1/94(SEQIDNO:21)。可利用哺乳動物MPV的一個或多個ORF將該哺乳動物MPV分類成某變體。如果某哺乳動物MPV符合以下條件，其可分類為MPV變體Al:其G蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Al的G蛋白(如原型NL/1/00(SEQIDNO:322)所示)有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其N蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Al的N蛋白(如原型NL/1/00(SEQIDNO:366)所示)有至少99.5%相同；其P蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Al的P蛋白(如原型NL/1/00(SEQIDNO:374)所示)有至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其M蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Al的M蛋白(如原型NL/1/00(SEQIDNO:358)所示)有至少99%或至少99.5%相同；其F蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Al的F蛋白(如原型NL/1/00(SEQIDNO:314)所示)有至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其M2-l蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Al的M2-1蛋白(如原型NL/1/00(SEQIDNO:338)所示)有至少99%或至少99.5%相同；其M2-2蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Al的M2-2蛋白(如原型NL/1/00(SEQIDNO:346)所示)有至少96%、至少99%或至少99.5%相同；其SH蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體A1的SH蛋白(如原型NL/1/00(SEQIDNO:382)所示)有至少84%、至少卯％、至少95%、至少9S%、至少99%或至少99.5%相同；和/或其L蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體Al的L蛋白(如原型NL/1/00(SEQIDNO:330)所示)有至少99%或至少99.5%相同。如果與其它病毒分離物之一相比，某哺乳動物MPV分離物在系統(tǒng)發(fā)育上與病毒分離物NL/17/00(SEQIDNO:20)更密切相關(guān)，則其分類為變體A2，所述其它病毒分離物為NL/1/99(SEQIDNO:18)、NL/1/00(SEQIDNO:19)和NL/1/94(SEQIDNO:21)?？衫貌溉閯游颩PV的一個或多個ORF將該哺乳動物MPV分類成某變體。如果某哺乳動物MPV符合以下條件，其可分類為MPV變體A2:其G蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體A2的G蛋白(如原型NL/17/00(SEQIDNO:323)所示)有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其N蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體A2的N蛋白(如原型NL/17/00(SEQIDNO:367)所示)有至少99.5%相同；其P蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體A2的P蛋白(如原型NL/17/00(SEQIDNO:375)所示)有至少％%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其M蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體A2的M蛋白(如原型NL/17/00(SEQIDNO:359)所示)有至少99%或至少99.5%相同；其F蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體A2的F蛋白(如原型NL/17/00(SEQIDNO:315)所示)有至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其M2-l蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體A2的M2-l蛋白(如原型NL/17/00(SEQIDNO:339)所示)有至少99%或至少99.5%相同；其M2-2蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體A2的M2-2蛋白(如原型NL/17/00(SEQIDNO:347)所示)有至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其SH蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體A2的SH蛋白(如原型NL/17/00(SEQIDNO:383)所示)有至少84%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；和/或其L蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體A2的L蛋白(如原型NL/17/00(SEQIDNO:331)所示)有至少99%或至少99.5%相同。如果與其它病毒分離物相比，某哺乳動物MPV分離物在系統(tǒng)發(fā)育上與病毒分離物NL/1/94(SEQIDNO:21)更密切相關(guān)，則其分類為變體B2，所述其它病毒分離物為NL/1/99(SEQIDNO:18)、NL/1/00(SEQIDNO:19)和NL/17/00(SEQIDNO:20)?？衫貌溉閯游颩PV的一個或多個ORF將該哺乳動物MPV分類成某變體。如果某哺乳動物MPV符合以下條件，其可分類為MPV變體B2:其G蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B2的G蛋白(如原型NL/1/94(SEQIDNO:325)所示)有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其N蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B2的N蛋白(如原型NL/1/94(SEQIDNO:369)所示)有至少99%或至少99.5%相同；其P蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B2的P蛋白(如原型NL/1/94(SEQIDNO:377)所示)有至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；其M蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B2的M蛋白(如原型NL/1/94(SEQIDNO:361)所示)相同；其F蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B2的F蛋白(如原型NL/1/94(SEQIDNO:317)所示)有至少99%或至少99.5%相同；其M2-l蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B2的M2-l蛋白(如原型NL/1/94(SEQIDNO:341)所示)有至少98%、至少99%或至少99.5%相同；(其M2-2蛋白的)氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B2的M2-2蛋白(如原型NL/1/94(SEQIDNO:349)所示)有至少99%或至少99.5%相同；其SH蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B2的SH蛋白(如原型NL/1/94(SEQIDNO:385)所示)有至少84°/。、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同；和/或其L蛋白的氨基酸序列與哺乳動物MPV變體B2的L蛋白(如原型NL/1/94(SEQIDNO:333)所示)有至少99%或至少99.5%相同。在某些實施方式中。序列相同性百分比是依據(jù)全長蛋白質(zhì)的排列對比。在其它實施方式中，序列相同性的百分比是依據(jù)蛋白質(zhì)的毗連氨基酸序列的排列對比，其中所述的氨基酸序列可以長25個氨基酸、50個氨基酸、75個氨基酸、100個氨基酸、125個氨基酸、150個氨基酸、175個氨基酸、200個氨基酸、225個氨基酸、250個氨基酸、275個氨基酸、300個氨基酸、325個氨基酸、350個氨基酸、375個氨基酸、400個氨基酸、425個氨基酸、450個氨基酸、475個氨基酸、500個氨基酸、750個氨基酸、1000個氨基酸、1250個氨基酸、1500個氨基酸、1750個氨基酸、2000個氨基酸或2250個氨基酸。5.2哺乳動物MPV的功能特征除了哺乳動物MPV的結(jié)構(gòu)限定外，也可通過其功能特征確定哺乳動物MPV。在某些實施方式中，本發(fā)明哺乳動物MPV能感染哺乳動物宿主。所述哺乳動物宿主可以是哺乳動物細胞、組織器官或某種哺乳動物。在一具體實施方式中，哺乳動物宿主是人或人細胞、組織或器官?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何方法檢驗哺乳動物宿主是否己受哺乳動物MPV的感染。某些實施方式檢驗該病毒黏附哺乳動物細胞的能力。某些實施方式檢驗該病毒將其基因組轉(zhuǎn)移入哺乳動物細胞中的能力。在一示范性實施方式中，可檢測性地標(biāo)記(例如，放射性標(biāo)記)該病毒基因組。然后使該病毒與哺乳動物細胞培育至少1分鐘、至少5分鐘、至少15分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少5小時、至少12小時或至少1天。隨后洗滌細胞以去除細胞上的任何病毒顆粒，再通過該可檢測標(biāo)記檢驗是否有病毒基因組存在。另一實施方式利用哺乳動物MPV特異性引物以RT-PCR檢測細胞中是否存在病毒基因組。(參見，納入本文作為參考的PCTWO02/057302，第37-44頁)。在某些實施方式中，哺乳動物病毒能感染哺乳動物宿主并將該哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)插入哺乳動物宿主的胞質(zhì)膜中。所述哺乳動物宿主可以是培養(yǎng)的哺乳動物細胞、器官、組織或哺乳動物。在一示范性實施方式中，哺乳動物細胞與哺乳動物病毒一起培育。然后在能去除細胞表面的病毒的條件下洗滌這些細胞?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何技術(shù)檢測插入哺乳動物細胞的胞質(zhì)膜的新表達病毒蛋白。例如，在感染該病毒后，將細胞培養(yǎng)在含有可檢測標(biāo)記的氨基酸的培養(yǎng)基中。然后收集、裂解細胞，將胞質(zhì)組分與膜組分分開。然后溶解膜組分中的蛋白質(zhì)，利用該哺乳動物MPV蛋白質(zhì)(例如但不限于F蛋白或G蛋白)的特異性抗體進行免疫沉淀。再對免疫沉淀的蛋白質(zhì)進行SDSPAGE。然后通過放射自顯影檢測是否存在病毒蛋白質(zhì)。在另一實施方式中，可用哺乳動物MPV蛋白質(zhì)的一種或多種特異性抗體通過免疫細胞化學(xué)方法檢測宿主細胞的胞質(zhì)膜中是否存在病毒蛋白。在其它實施方式中，本發(fā)明哺乳動物MPV能感染哺乳動物宿主和在哺乳動物宿主中復(fù)制。所述哺乳動物宿主可以是培養(yǎng)的哺乳動物細胞、器官、組織或哺乳動物?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何技術(shù)測定病毒是否能感染哺乳動物細胞和在該哺乳動物宿主體內(nèi)復(fù)制。在一具體的實施方式中，用該病毒感染哺乳動物細胞。然后培養(yǎng)這些細胞至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少5小時、至少12小時、至少1天或至少2天?？衫迷摬《净蚪M的特異性探針，采用Northern印跡分析、RT-PCR或原位雜交來監(jiān)測細胞中病毒基因組RNA的水平。病毒基因組RNA增加證明該病毒能感染哺乳動物細胞和在哺乳動物細胞中復(fù)制。在其它實施方式中，本發(fā)明哺乳動物MPV能感染哺乳動物宿主，其中該感染導(dǎo)致該哺乳動物宿主產(chǎn)生新的感染性哺乳動物MPV。所述哺乳動物宿主可以是培養(yǎng)的哺乳動物細胞或哺乳動物?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何技術(shù)測定病毒是否能感染哺乳動物宿主和導(dǎo)致該哺乳動物宿主產(chǎn)生新的感染性病毒顆粒。在一示范性實施例中，哺乳動物細胞感染有哺乳動物病毒。然后洗滌這些細胞，培育至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少5小時、至少12小時、至少1天、至少2天、至少1周或至少12天。可采用技術(shù)人員已知的任何方法監(jiān)測病毒的滴度。示范性方法見章節(jié)5.8。在某些具體實施方式中，哺乳動物MPV是人MPV。也可用人MPV進行本章節(jié)所述的檢驗。在某些實施方式中，所述人MPV能感染哺乳動物宿主，例如哺乳動物或培養(yǎng)的哺乳動物細胞。在某些實施方式中，所述人MPV能感染哺乳動物宿主而將人MPV的蛋白插入該哺乳動物宿主的胞質(zhì)膜中。在其它實施方式中，本發(fā)明的人MPV能感染哺乳動物宿主和在該哺乳動物宿主中復(fù)制。在其它實施方式中，本發(fā)明的人MPV能感染哺乳動物宿主和在該哺乳動物宿主中復(fù)制，其中所述感染和復(fù)制導(dǎo)致該哺乳動物宿主產(chǎn)生以及包裝新的感染性人MPV。在某些實施方式中，雖然哺乳動物MPV能感染哺乳動物宿主，但也能感染禽類宿主，例如鳥或培養(yǎng)的禽細胞。在某些實施方式中，哺乳動物MPV能感染禽類宿主和導(dǎo)致該哺乳動物MPV的蛋白插入該禽類宿主的胞質(zhì)膜中。在其它實施方式中，本發(fā)明哺乳動物MPV能感染禽類宿主和在該禽類宿主中復(fù)制。在其它實施方式中，本發(fā)明MPV能感染禽類宿主和在該禽類宿主中復(fù)制，其中所述感染和復(fù)制導(dǎo)致該禽類宿主產(chǎn)生以及包裝新的感染性哺乳動物MPV。5.3重組和嵌合型偏肺病毒本發(fā)明包括源自偏肺病毒(包括哺乳動物和禽變體)基因組的病毒載體所編碼的重組或嵌合型病毒。按照本發(fā)明，重組病毒是內(nèi)源性或天然基因組序列或非天然基因組序列所編碼的源自哺乳動物MPV或APV的病毒。按照本發(fā)明，非天然序列是因基因組序列中發(fā)生可能造成或不造成表型改變的一個或多個突變(包括但不限于點突變、重排、插入、缺失等)而不同于天然或內(nèi)源性基因組序列的序列。本發(fā)明重組病毒包括病毒載體編碼的那些病毒，所述病毒載體衍生自偏肺病毒(包括哺乳動物和禽變體)基因組，可包含或不包含對于該病毒基因組為非天然的核酸。按照本發(fā)明，衍生自偏肺病毒基因組的病毒載體中所含的核酸序列編碼哺乳動物偏肺病毒一個ORF的至少一部分，其中該ORF所編碼多肽與章節(jié)5.1(同上)和表1所示具有氨基酸序列相同性。按照本發(fā)明，本發(fā)明重組病毒包括源自哺乳動物偏肺病毒(MPV)，特別是人偏肺病毒基因組的病毒載體所編碼的那些病毒。在本發(fā)明的具體實施方式中，所述病毒載體衍生自偏肺病毒Al、A2、B1或B2變體的基因組。本發(fā)明的這些病毒載體可包含或不包含對于該病毒基因組為非天然的核酸。按照本發(fā)明，本發(fā)明重組病毒包括衍生自禽肺病毒(APV)，也稱為火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)的病毒載體所編碼的那些病毒。在本發(fā)明的具體實施方式中，該病毒載體衍生自APV亞群A、B、C或D的基因組。在一優(yōu)選的實施方式中，病毒載體衍生自APV亞群C的基因組。本發(fā)明的這些病毒載體可包含或不包含對于該病毒基因組為非天然的核酸。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明重組病毒包括源自APV基因組的病毒載體所編碼的那些病毒，所述基因組含有編碼APV亞群C的F-ORF的核酸序列。在某些實施方式中，源自APV基因組的病毒載體所含的核酸序列能編碼APV的N-ORF、P-ORF、M-ORF、F-ORF、M2-l-ORF、M2-2-ORF或L-ORF中至少一種。本發(fā)明的嵌合型病毒是還包含異源核苷酸序列的重組MPV或APV。本發(fā)明的嵌合型病毒由向基因組中加入了異源核苷酸序列或者用異源核苷酸序列替代了內(nèi)源性或天然核苷酸序列的核苷酸序列編碼。本發(fā)明的嵌合型病毒由還含有異源核苷酸序列的本發(fā)明病毒載體編碼。本發(fā)明的嵌合型病毒由可能包含或不包含對于該病毒基因組為非天然的核酸的病毒載體編碼。本發(fā)明的嵌合型病毒由加入、插入了異源核苷酸序列，或用異源核苷酸序列取代天然或非天然序列的病毒載體編碼。本發(fā)明的嵌合型病毒可由衍生自哺乳動物MPV不同毒株的核苷酸序列編碼。具體地說，衍生自MPV不同毒株的編碼抗原性多肽的核苷酸序列編碼該嵌合型病毒。本發(fā)明的嵌合型病毒可由衍生自APV(特別是亞群C)基因組的病毒載體編碼，所述載體還編碼異源序列，而該異源序列編碼衍生自MPV—種或多種毒株的抗原性多肽。嵌合型病毒特別可用于產(chǎn)生重組疫苗以提供保護力抵御兩種或多種病毒感染(Tao等，J.Virol.72，2955-2961;Durbin等,2000，J.Virol.74，6821-6831;Skiadopoulos等，1998，J.Virol.72，1762-1768;Teng等，2000，J.Virol.74，9317-9321)。例如，可以設(shè)想，表達另一負鏈RNA病毒，如RSV的一種或多種蛋白的MPV或APV病毒載體，或表達一種或多種MPV蛋白的RSV載體可保護接種該載體疫苗的個體抵御兩種病毒感染。對于PIV或其它副黏病毒，可以設(shè)想有相似的方法。如其它病毒所提示的，對于利用活疫苗作疫苗接種，可用減毒和復(fù)制缺陷型病毒。(參見，納入本文作為參考的PCTWO02/057302，第6和23頁)。按照本發(fā)明，要摻入編碼本發(fā)明重組或嵌合型病毒的病毒載體的異源序列包括得自或源自偏肺病毒的不同毒株，禽肺病毒各毒株和其它負鏈RNA病毒(包括但不限于RSV、PIV和流感病毒)以及其它病毒(包括麻疹病毒)的序列。在本發(fā)明的某些實施方式中，衍生自病毒基因組的病毒載體編碼本發(fā)明嵌合型或重組病毒，所述基因組中用異源或非天然序列取代了一條或多條序列、基因間區(qū)域、末端序列或部分或整個ORF。在本發(fā)明某些實施方式中，衍生自病毒基因組的病毒載體編碼本發(fā)明嵌合型病毒，其中該載體中已加入了一條或多條異源序列。在某些實施方式中，本發(fā)明病毒含有異源核酸。在一優(yōu)選實施方式中，異源核苷酸序列插入或加入該病毒基因組的位置1。在另一優(yōu)選實施方式中，異源核苷酸序列插入或加入該病毒基因組的位置2。在還有另一優(yōu)選實施方式中，異源核苷酸序列插入或加入該病毒基因組的位置3。與插入編號較高的位置相比，將核酸序列插入或加入病毒基因組中編號較低的位置因存在橫跨該病毒基因組的轉(zhuǎn)錄梯度(transcriptionalgradient)而導(dǎo)致異源核苷酸序列的表達水平較強或較高。因此，如果需要高水平地表達異源核苷酸序列，將異源核苷酸序列插入或加入到編號較低的位置是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。不想局限于理論，異源序列的插入或加入的位置可影響到重組或嵌合型病毒的復(fù)制速率。如果該異源序列插入或加入到該病毒基因組的位置2或位置1，復(fù)制速率較高。如果異源序列插入或加入到該病毒基因組的位置3、位置4、位置5或位置6,復(fù)制速率較低。不想局限于理論，病毒基因和異源序列之間的基因間區(qū)域的大小進一步?jīng)Q定了病毒的復(fù)制速率和異源序列的表達水平。在某些實施方式中，本發(fā)明的病毒載體含有兩種或多種不同的異源核苷酸序列。在一優(yōu)選實施方式中，一條異源核苷酸序列位于該病毒基因組的位置1，第二條異源核苷酸序列位于病毒基因組的位置2。在另一優(yōu)選的實施方式中，一條異源核苷酸序列位于該病毒基因組的位置1，第二條異源核苷酸序列位于位置3。在另一優(yōu)選的實施方式中，一條異源核苷酸序列位于該病毒基因組的位置2，第二條異源核苷酸序列位于位置3。在某些其它實施方式中，將異源核苷酸序列插入該病毒基因組的其它編號較高的位置。按照本發(fā)明，異源序列的位置指這些序列從病毒基因組轉(zhuǎn)錄的順序，例如位置1的異源序列是首先從基因組轉(zhuǎn)錄的基因序列?？砂凑沾委熁蛞Ｗo以抵御病毒感染的對象的物種來選擇病毒載體。如果對象是人，則可用減毒的哺乳動物偏肺病毒或禽肺病毒提供抗原性序列。按照本發(fā)明，可工程改造所述病毒載體以提供能賦予抵御偏肺病毒感染保護作用的抗原性序列，包括衍生自哺乳動物偏肺病毒，人偏肺病毒，MPV變體A1、A2、B1或B2的序列，衍生自禽肺病毒，包括APV亞群A、B、C或D的序列，雖然優(yōu)選C。可工程改造所述病毒載體以提供能賦予抵御另一種病毒，包括負鏈RNA病毒(包括流感病毒、RSV或PIV，包括PIV3)感染或疾病保護作用的抗原性序列。可工程改造病毒載體以提供一種、兩種、三種或更多種抗原性序列。本發(fā)明的抗原性序列可源自同一病毒，同一類型病毒的不同毒株或變體，或不同病毒，包括麻疹病毒。在本發(fā)明的某些實施方式中，要插入本發(fā)明病毒基因組的異源核苷酸序列源自偏肺病毒。在本發(fā)明的某些具體實施方式中，所述異源核苷酸序列源自人偏肺病毒。在另一具體實施方式中，所述異源核苷酸序列源自禽肺病毒。更具體地說，本發(fā)明異源核苷酸序列編碼人偏肺病毒的F基因。更具體地說，本發(fā)明異源核苷酸序列編碼人偏肺病毒的G基因。更具體地說，本發(fā)明異源核苷酸序列編碼禽肺病毒的F基因。更具體地說，本發(fā)明異源核苷酸序列編碼禽肺病毒的G基因。在具體的實施方式中，此異源核苷酸序列可以是SEQIDNO:1到SEQIDNO:5、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15中任一條。在某些具體的實施方式中，此核苷酸序列編碼SEQIDNO:6到SEQIDNO:13、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17中任一條所示的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明一具體實施方式中，所述異源核苷酸序列編碼嵌合型F蛋白。在一示范性實施方式中，嵌合型F-蛋白的胞外域是人MPV的胞外域，而跨膜區(qū)和腔內(nèi)域(luminaldo腿in)源自禽偏肺病毒的F蛋白。不想局限于理論，編碼由人胞外域和禽腔內(nèi)/跨膜區(qū)構(gòu)成的嵌合型F-蛋白的嵌合型人MPV因為該F-蛋白的禽部分而是減毒的，雖然其因為人胞外域而對hMPV具有高度免疫原性。在某些實施方式中，將源自偏肺病毒基因組(包括哺乳動物偏肺病毒和禽偏肺病毒)的兩種不同異源核苷酸序列插入或加入本發(fā)明病毒載體。例如，所述異源核苷酸序列衍生自人偏肺病毒、禽偏肺病毒、RSV、PIV或流感病毒。在一優(yōu)選的實施方式中，所述異源序列分別編碼人偏肺病毒、禽偏肺病毒、RSV或PIV的F-蛋白。在另一實施方式中，所述異源序列編碼流感病毒的HA蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明病毒載體含有兩種不同的異源核苷酸序列，其中第一異源核苷酸序列源自偏肺病毒，例如人偏肺病毒或禽肺病毒，第二核苷酸序列源自呼吸道合胞體病毒(參見表2)。在具體實施方式中，源自呼吸道合胞體病毒的異源核苷酸序列是呼吸道合胞體病毒的F基因。在其它具體實施方式中，源自呼吸道合胞體病毒的異源核苷酸序列是呼吸道合胞體病毒的G基因。在一具體實施方式中，源自偏肺病毒的異源核苷酸序列插入位置的編號低于源自呼吸道合胞體病毒的異源核苷酸序列。在另一具體實施方式中，源自偏肺病毒的異源核苷酸序列插入位置的編號高于源自呼吸道合胞體病毒的異源核苷酸序列。在某些實施方式中，本發(fā)明病毒含有兩種不同的異源核苷酸序列，其中第一異源核苷酸序列源自偏肺病毒，例如人偏肺病毒或禽肺病毒，第二核苷酸序列源自副流感病毒，例如但不限于PIV3(參見表2)。在具體實施方式中，源自PIV的異源核苷酸序列是PIV的F基因。在其它實施方式中，源自PIV的異源核苷酸序列是PIV的G基因。在一具體實施方式中，源自偏肺病毒的異源核苷酸序列插入位置的編號低于源自PIV的異源核苷酸序列。在另一具體實施方式中，源自偏肺病毒的異源核苷酸序列插入位置的編號高于源自PIV的異源核苷酸序列。按照本發(fā)明獲得的表達產(chǎn)物和/或重組或嵌合型病毒體可優(yōu)選用于疫苗制劑?？晒こ谈脑毂景l(fā)明的表達產(chǎn)物和嵌合型病毒體以產(chǎn)生抗廣泛病原體，包括病毒和細菌抗原、腫瘤抗原、變應(yīng)原抗原和參與自身免疫疾病的自身抗原的疫苗。具體地說，可工程改造本發(fā)明的嵌合型病毒體以產(chǎn)生能保護對象抵御PIV、RSV和/或偏肺病毒感染的疫苗。在另一實施方式中，可工程改造本發(fā)明的嵌合型病毒體以產(chǎn)生抗-HIV疫苗，其中將源自gpl60和/或HIV內(nèi)部蛋白質(zhì)的免疫原性多肽工程改造成糖蛋白HN以構(gòu)建能引發(fā)脊椎動物體液和細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗。在還有另一實施方式中，本發(fā)明涉及經(jīng)工程改造編碼突變型抗原的重組偏肺病毒載體和病毒。與衍生它的野生型病毒蛋白質(zhì)相比，突變型抗原含有至少一個氨基酸取代、缺失或添加。在某些實施方式中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明重組或嵌合型病毒的三價疫苗。在具體的實施方式中，用作三價疫苗骨架的病毒是含有源自RSV的第一異源核苷酸序列和源自PIV的第二異源核苷酸序列的嵌合型禽-人偏肺病毒或嵌合型人-禽偏肺病毒。在一示范性實施方式中，這種三價疫苗分別對以下產(chǎn)物具有特異性a)根據(jù)所用的嵌合型禽-人或嵌合型人-禽偏肺病毒，而分別對人偏肺病毒或禽肺病毒的F基因和/或G基因的基因產(chǎn)物具有特異性；b)源自RSV的異源核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)；和c)源自PIV的異源核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。在一具體實施方式中，所述第一異源核苷酸序列是呼吸道合胞體病毒的F基因，插入位置1中；所述第二異源核苷酸序列是PIV的F基因，插入位置3中。本發(fā)明包括更多的組合，其中一些示例于表2。此外，可使用編碼嵌合型F蛋白的核苷酸序列(見上文)。在一些不太優(yōu)選的實施方式中，可將所述異源核苷酸序列插入病毒基因組中編號較高的位置。表2.三價疫苗所用的病毒中異源核苷酸序列的示范性配置組合位置1位置2位置3<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>RSV的G-基因12RSV的G-基因-PIV的HN-基因13PIV的F-基因RSV的G-基因-14RSV的G-基因PIV的F-基因-15-PIV的F-基因RSV的G-基因16-RSV的G-基因PIV的F-基因17PIV的F-基因-RSV的G-基因18RSV的G-基因-PIV的F-基因19PIV的HN-基因RSV的F-基因-20RSV的F-基因PIV的HN-基因-21-PIV的HN-基因RSV的F-基因22-RSV的F-基因PIV的HN-基因23PIV的HN-基因-RSV的F-基因24RSV的F-基因-PIV的HN-基因在某些實施方式中，可工程改造本發(fā)明的表達產(chǎn)物和重組或嵌合型病毒體以產(chǎn)生抗各種病原體，包括病毒抗原、腫瘤抗原和參與自身免疫疾病的自身抗原的疫苗。實現(xiàn)此目標(biāo)的一種方法包括修飾現(xiàn)有的偏肺病毒基因，使其各自外部結(jié)構(gòu)域中含有外來序列。當(dāng)所述異源序列是病原體的表位或抗原時，可利用這些嵌合型病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生針對衍生這些決定簇病原體的保護性免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明涉及使用病毒載體和重組或嵌合型病毒來配制抗各種病毒和/或抗原的疫苗?？捎帽景l(fā)明病毒載體和嵌合型病毒來激發(fā)體液免疫應(yīng)答、細胞免疫應(yīng)答或激發(fā)對抗原的耐受，從而能調(diào)節(jié)對象的免疫系統(tǒng)。本文所用的對象指人、靈長類動物、馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、貓、禽類和嚙齒類動物?？蓪⒈景l(fā)明分成以下階段，這只是為了說明而非限制(a)構(gòu)建重組cDNA和RNA模板；(b)利用重組cDNA和RNA模板表達異源基因產(chǎn)物；(c)拯救重組病毒顆粒中的異源基因；和(d)制備和使用含有本發(fā)明重組病毒顆粒的疫苗。5.4構(gòu)建重組cDNA和RNA在某些實施方式中，所述病毒載體衍生自本發(fā)明的人或哺乳動物偏肺病毒基因組。在其它實施方式中，所述病毒載體衍生自禽肺病毒基因組。在某些實施方式中，所述病毒載體含有衍生自哺乳動物MPV和APV的序列，因而該病毒載體能編碼嵌合型人MPV/APV病毒。在一示范性實施方式中，用禽肺病毒的F-基因和/或G-基因取代人偏肺病毒的F-基因和/或G-基因以構(gòu)建嵌合型hMPV/APV病毒。在其它實施方式中，病毒載體含有源自APV和哺乳動物MPV的序列，因而該病毒載體能編碼嵌合型APV/hMPV病毒。在更多示范性實施方式中，用人偏肺病毒的F-基因和/或G-基因取代禽肺病毒的F-基因和/或G-基因以構(gòu)建嵌合型APV/hMPV病毒。本發(fā)明也包括含有衍生自哺乳動物MPV或APV基因組的病毒載體的重組病毒，所述病毒載體含有該病毒基因組的內(nèi)源性或天然序列，可以含有或不含有該病毒基因組的非天然序列。非天然序列包括與天然或內(nèi)源性序列不同，可能導(dǎo)致或不導(dǎo)致表型變化的那些序列。本發(fā)明重組病毒含有的序列可導(dǎo)致病毒具有更適用于疫苗制劑的表型，例如減毒表型或抗原性提高。這些突變和修飾可以發(fā)生在該病毒的編碼區(qū)，基因間區(qū)域及前導(dǎo)序列和尾序列(trailersequences)中。在某些實施方式中，本發(fā)明的病毒載體包含源自hMPV、APV、hMPV/APV或APV/hMPV的核苷酸序列，其中已用異源序列取代了天然核苷酸序列或者已將異源序列加入天然偏肺病毒序列中。在一更具體的實施方式中，嵌合型病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒載體，其中已加入了源自PIV的異源序列。在一更具體的實施方式中，重組病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒載體，其中已用源自PIV的異源序列取代了(天然)序列。在其它具體的實施方式中，嵌合型病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒載體，其中已加入了源自RSV的異源序列。在一更具體的實施方式中，重組病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒載體，其中已用源自RSV的異源序列取代了(天然)序列。可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)構(gòu)建側(cè)接該病毒聚合酶結(jié)合位點/啟動子的互補序列(例如本發(fā)明hMPV病毒3，-末端的互補序列或hMPV病毒3，-和5'末端的互補序歹iJ)的異源基因編碼序列。在更具體的實施方式中，本發(fā)明重組病毒含有hMPV或APV的前導(dǎo)序列或尾序列。在某些實施方式中，所述基因間區(qū)域得自hMPV或APV。得到的RNA模板可以是負極性(negative-polarity)含有能使該病毒的RNA合成部件識別該模板的合適末端序列?；蛘?，也可使用正極性(positive-polarity)的RNA模板，其含有能使該病毒的RNA合成部件識別該模板的合適末端序列?？梢钥寺『羞@些雜交序列的重組DNA分子，用DNA-指導(dǎo)的RNA合成酶，例如噬菌體T7、T3、SP6合成酶或真核生物聚合酶，如聚合酶I等轉(zhuǎn)錄，從而能在體外或體內(nèi)產(chǎn)生重組RNA模板，該模板含有能識別病毒聚合酶和具有活性的合適病毒序列。在一更具體的實施方式中，所述RNA聚合酶是禽痘病毒T7RNA聚合酶或MVAT7RNA聚合酶。構(gòu)建這些雜交分子的示范性方法是將異源核苷酸序列插入與hMPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV基因組互補的DNA中，因而該異源序列側(cè)接了病毒聚合酶活性所需的病毒序列(即病毒聚合酶結(jié)合位點/啟動子，下文稱為病毒聚合酶結(jié)合位點)和聚腺苷酸化位點。在一優(yōu)選的實施方式中，該異源編碼序列側(cè)接了含有5'和3'末端的復(fù)制啟動子、基因起始序列和基因終序列以及在5'和/或3'末端發(fā)現(xiàn)的包裝信號的病毒序列。在另一方法中，可將編碼該病毒聚合酶結(jié)合位點的寡核苷酸，例如該病毒基因組區(qū)段的3'-末端或兩末端的互補序列與異源編碼序列相連而構(gòu)建雜交分子。以上描述了通過靶序列內(nèi)存在的合適限制性酶切位點將外來基因或外來基因區(qū)段置于該靶序列內(nèi)。然而，近年來分子生物學(xué)的發(fā)展極大減少了該問題。采用定點誘變不難將限制性酶切位點置于耙序列內(nèi)任何位置(例如，參見Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82;488描述的技術(shù))。下文所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的改進也能特異性地插入序列(即，限制性酶切位點)并有助于構(gòu)建雜交分子?；蛘撸舍娪肞CR反應(yīng)制備重組模板而無需克隆。例如，可采用PCR反應(yīng)制備含有DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶啟動子(例如噬菌體T3、T7或SP6)的雙鏈DNA分子及含有異源基因和PIV聚合酶結(jié)合位點的雜交序列。然后可從該重組DNA直接轉(zhuǎn)錄RNA模板。在還有另一實施方式中，可利用RNA連接酶連接對異源基因負極性特異的RNA與病毒聚合酶結(jié)合位點來制備重組RNA模板。此外，可在非翻譯區(qū)中加入一個或多個核苷酸以滿足對于獲得病毒拯救至關(guān)重要的"六堿基規(guī)則(RuleOfSix)"。"六堿基規(guī)則"適用于許多副黏病毒，其表述為RNA核苷酸基因組必須能被6整除才能起作用?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)，例如使用商品化誘變試劑盒，如QuikChange誘變試劑盒(Stratagene)加入核苷酸。加入數(shù)量合適的核苷酸后，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化和凝膠純化來分離正確的DNA片段。以下章節(jié)描述了病毒聚合酶活性的序列要求和本發(fā)明可用的構(gòu)建物。不想局限于理論，幾種參數(shù)可影響重組病毒的復(fù)制速率和異源序列的表達水平。具體地說，hMPV、APV、hMPV/APV或APV/hMPV中異源序列的位置和側(cè)接該異源序列的基因間區(qū)域的長度決定了復(fù)制速率和該異源序列的表達水平。在某些實施方式中，與野生型病毒相比，這些病毒的前導(dǎo)序列和尾序列已作修飾。某些更具體的實施方式改變了前導(dǎo)序列和/或尾序列的長度。在其它實施方式中，與野生型病毒相比，這些病毒的前導(dǎo)序列和尾序列發(fā)生突變。更多細節(jié)見章節(jié)5.7。本發(fā)明重組病毒的產(chǎn)生依賴于負義病毒RNA(vRNA)基因組的部分或全長拷貝或其互補拷貝(cRNA)的復(fù)制。該vRNA或cRNA可從感染性病毒中分離，在體外轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生或核酸轉(zhuǎn)染后在細胞中產(chǎn)生。第二，重組負鏈病毒的產(chǎn)生依賴于功能性聚合酶復(fù)合物。肺病毒的聚合酶復(fù)合物通常由N、P、L和可能的M2蛋白(但不一定限于這些)構(gòu)成。聚合酶復(fù)合物或其組分可從病毒顆粒中分離，從表達一種或多種組分的細胞中分離，或在特定表達載體轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生。當(dāng)通過上述聚合酶復(fù)合物16復(fù)制了上述vRNA、cRNA或表達這些RNA的載體時可獲得MPV的感染性拷貝(Schnell等，1994，EMBOJ13:4195-4203;Collins等，1995，PNAS92:11563-11567;Hoffmann等，2000，PNAS97:6108-6113;Bridgen等，1996，PNAS93:15400-15404;Palese等，1996，PNAS93:11354-11358;Peeters等，1999，J.Virol.73:5001-5009;Durbin等，1997，Virology235:323-332)。本發(fā)明提供含有本發(fā)明核酸或載體的宿主細胞。用能在相關(guān)細胞類型(細菌、昆蟲細胞、真核細胞)中表達諸組分的原核細胞產(chǎn)生含有MPV的聚合酶組分(大致是N、P、L和M2，但不一定限于這些)的質(zhì)?；虿《据d體?？衫媚鼙磉_病毒核酸的原核細胞在體內(nèi)或體外產(chǎn)生含有MPV基因組的全長或部分拷貝的質(zhì)?；虿《据d體。后一種載體可含有其它病毒序列來產(chǎn)生嵌合型病毒或嵌合型病毒蛋白，可缺41失一部分病毒基因組來產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒，可含有突變、缺失或插入來產(chǎn)生減毒的病毒?？赏ㄟ^上述現(xiàn)有技術(shù)共同表達該聚合酶組分后產(chǎn)生MPV的感染性拷貝(可以是野生型、減毒的、復(fù)制缺陷型或嵌合型)。此外，可使用能暫時或穩(wěn)定表達一種或多種全長或部分MPV蛋白的真核細胞?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)染(蛋白載體或核酸載體)、感染(表達載體)或轉(zhuǎn)導(dǎo)(病毒載體)制備這種細胞，這種細胞可用于補充上述野生型、減毒的、復(fù)制缺陷型或嵌合型病毒。5.4.1要插入的異源基因序列按照本發(fā)明，可以進一步工程改造本發(fā)明病毒載體以表達異源序列。在本發(fā)明一實施方式中，異源序列得自除病毒載體以外的來源。例如但不限于，該異源序列可編碼某病毒的抗原性蛋白、多肽或肽，該病毒屬于衍生該病毒載體的病毒種類、亞群或變體以外的偏肺病毒的不同種類、亞群或變體。例如但不限于，該異源序列編碼除偏肺病毒以外某病毒的抗原性蛋白、多肽或肽。例如但不限于，該異源序列不是病毒來源的。按照該實施方式，異源序列可編碼具有所需生物學(xué)特性或活性的部分、肽、多肽或蛋白質(zhì)。這種異源序列可編碼標(biāo)簽或標(biāo)記。這種異源序列可編碼生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物，例如包括淋巴因子、白介素、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和粒細胞集落刺激因子。在某些實施方式中，要插入的異源核苷酸序列源自偏肺病毒。更具體地說，要插入的異源核苷酸序列源自人偏肺病毒和/或禽肺病毒。在某些實施方式中，該異源序列編碼PIV核衣殼磷蛋白、PIVL蛋白、PIV基質(zhì)蛋白、PIVHN糖蛋白、PIVRNA-依賴性RNA聚合酶、PIVY1蛋白、PIVD蛋白、PIVC蛋白、PIVF蛋白或PIVP蛋白。在某些實施方式中，該異源核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)與PIV核衣殼磷蛋白、PIVL蛋白、PIV基質(zhì)蛋白、PIVHN糖蛋白、PIVRNA-依賴性RNA聚合酶、PIVY1蛋白、PIVD蛋白、PIVC蛋白、PIVF蛋白或PIVP蛋白有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源。可獲得1型PIV、2型PIV或3型PIV的異源序列。在更具體的實施方式中，可獲得人l型PIV、2型PIV或3型PIV的異源序列。在其它實施方式中，該異源序列編碼RSV核蛋白、RSV磷蛋白、RSV基質(zhì)蛋白、RSV小疏水性蛋白、RSV的RNA-依賴性RNA聚合酶、RSVF蛋白、RSVG蛋白或RSVM2-l或M2-2蛋白。在某些實施方式中，該異源序列編碼的蛋白質(zhì)與RSV核蛋白、RSV磷蛋白、RSV基質(zhì)蛋白、RSV小疏水性蛋白、RSV的RNA-依賴性RNA聚合酶、RSVF蛋白或RSVG蛋白有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源?？色@得RSVA亞型和B亞型的異源序列。在更具體的實施方式中，可獲得人RSVA亞型和B亞型的異源序列。在其它實施方式中，該異源序列編碼APV核蛋白、APV磷蛋白、APV基質(zhì)蛋白、APV小疏水性蛋白、APV的RNA-依賴性RNA聚合酶、APVF蛋白、APVG蛋白或APVM2-l或M2-2蛋白。在某些實施方式中，該異源序列編碼的蛋白質(zhì)與APV核蛋白、APV磷蛋白、APV基質(zhì)蛋白、APV小疏水性蛋白、APV的RNA-依賴性RNA聚合酶、APVF蛋白或APVG蛋白有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源。禽肺病毒可以是APV的A亞群、B亞群或C亞群。在其它實施方式中，該異源序列編碼hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基質(zhì)蛋白、hMPV小疏水性蛋白、hMPV的RNA-依賴性RNA聚合酶、hMPVF蛋白、hMPVG蛋白或hMPVM2-l或M2-2。在某些實施方式中，該異源序列編碼的蛋白質(zhì)與hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基質(zhì)蛋白、hMPV小疏水性蛋白、hMPV的RNA-依賴性RNA聚合酶、hMPVF蛋白或hMPVG蛋白有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源。人偏肺病毒可以是hMPV變體Al、變體A2、變體B1或變體B2。在某些實施方式中，可將PIV、RSV、人偏肺病毒或禽肺病毒的不同異源序列的任何組合插入本發(fā)明病毒中。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方式中，要插入的異源核苷酸序列源自RSV、PIV、APV或hMPV的F基因。在某些實施方式中，該異源核苷酸序列編碼嵌合型蛋白。在更具體的實施方式中，該異源核苷酸序列編碼RSV、PIV、APV或hMPV的嵌合型F蛋白。嵌合型F蛋白可包含不同病毒，例如人偏肺病毒、禽肺病毒、呼吸道合胞體病毒和副流感病毒的F蛋白諸部分。在某些其它實施方式中，該異源序列編碼嵌合型G蛋白。嵌合型G蛋白可包含不同病毒，例如人偏肺病毒、禽肺病毒、呼吸道合胞體病毒和副流感病毒的G蛋白諸部分。在一具體實施方式中，所述F蛋白包含偏肺病毒F蛋白的胞外域、副流感病毒F蛋白的跨膜區(qū)和副流感病毒F蛋白的腔內(nèi)域。在某些具體的實施方式中，本發(fā)明的異源核苷酸序列是SEQIDNO:1到SEQIDNO:5、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15中任一條。在某些具體的實施方式中，這些核苷酸序列編碼SEQIDNO:6到SEQIDNO:13、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17中任一條所示的蛋白質(zhì)。對于源自呼吸道合胞體病毒的異源核苷酸序列，參見例如全文納入本文作為參考的PCI7US98/20230。在一優(yōu)選的實施方式中，可表達成本發(fā)明重組病毒的異源基因序列包括但不限于能導(dǎo)致呼吸道疾病的病毒的抗原性表位和糖蛋白(的基因序列)，例如流感病毒糖蛋白(特別是血凝素H5、H7)、呼吸道合胞體病毒的表位、新城疫病毒的表位、仙臺病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒(ILV)。在一優(yōu)選的實施方式中，這些異源核苷酸序列源自RSV或PIV。在本發(fā)明還有一實施方式中，可經(jīng)工程改造加入本發(fā)明嵌合型病毒中的這些異源基因序列包括但不限于以下病毒表位和病毒糖蛋白(的基因序列)，例如乙肝病毒表面抗原、甲肝或丙肝病毒表面(抗原)、E-B病毒糖蛋白、人乳頭瘤病毒糖蛋白、猿猴病毒5或腮腺炎病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒、皰疹病毒糖蛋白、脊髓灰質(zhì)炎病毒的VPI和源自慢病毒的序列，優(yōu)選但不限于1型或2型人免疫缺陷病毒(HIV)。在還有另一實施方式中，可工程改造入本發(fā)明嵌合型病毒中的異源基因序列包括但不限于馬雷克病病毒(MDV)的表位、傳染性粘液囊病病毒(IBDV)的表位、雞貧血病毒的表位、禽傳染性喉氣管炎病毒(ILV)、禽流感病毒(AIV)、狂犬病、貓白血病病毒、犬瘟熱病毒、水泡性口膜炎病毒和豬痘病毒(參見全文納入本文作為參考的Fields等(編)，1991，F(xiàn)undamentalVirologv(《基礎(chǔ)病毒學(xué)》)，第二版，RavenPress,紐約)。本發(fā)明的其它異源序列包括自身免疫疾病的特征性抗原。這些抗原通常源自哺乳動物組織的細胞表面、細胞質(zhì)、核、線粒體等，包括作為以下疾病的特征性抗原糖尿病、多發(fā)性硬化癥、全身性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性貧血、阿狄森病、硬皮病、自身免疫性萎縮性胃炎、青少年糖尿病和盤狀紅斑狼瘡?？勺鳛樽儜?yīng)原的抗原通常包括蛋白質(zhì)或糖蛋白，包括源自花粉、灰塵、霉菌、孢子、皮屑、昆蟲和食物的抗原。此外，作為腫瘤特征性抗原的抗原通常源自腫瘤組織細胞的細胞表面、細胞質(zhì)、核、細胞器等。例子包括腫瘤蛋白的特征性抗原，包括突變的致癌基因編碼的蛋白質(zhì)；腫瘤相關(guān)的病毒蛋白；和糖蛋白。腫瘤包括但不限于以下癌癥類型的那些腫瘤唇癌、鼻咽癌、咽癌和口腔癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肝癌、膽囊癌、胰腺癌、喉癌、肺和支氣管癌、皮膚的黑色素瘤、乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、膀癌胱、腎癌、子宮癌(uterus)、腦和神經(jīng)系統(tǒng)其它部分的癌癥、甲狀腺癌、前列腺癌、睪丸癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和白血病。在本發(fā)明一具體實施方式中，這些異源序列衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)，優(yōu)選1型人免疫缺陷病毒或2型人免疫缺陷病毒的基因組。在本發(fā)明的另一實施方式中，可將該異源編碼序列插入編碼病毒骨架序列的基因中，從而表達在偏肺病毒蛋白中含有異源肽序列的嵌合型基因產(chǎn)物。在本發(fā)明的這種實施方式中，異源序列也可衍生自人免疫缺陷病毒，優(yōu)選1型人免疫缺陷病毒或2型人免疫缺陷病毒的基因組。在異源序列源自HIV的情況中，這種序列可以包括但不限于源自以下基因的序列env基因(即，編碼gpl60、gpl20和/或gp41的全部或部分的序列)、pol基因(即，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸內(nèi)切酶、蛋白酶和/或整合酶的全部或部分的序列)、gag基因(即，編碼p7、p6、p55、p17/18、p24/25的全部或部分的序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr禾口/或vpx。在還有另一實施方式中，可工程改造嵌合型病毒使加入的異源基因序列包含編碼具有免疫增強活性蛋白質(zhì)的序列。免疫增強活性蛋白的例子包括但不限于細胞因子、l型干擾素、Y干擾素、集落剌激因子和白介素-1、-2、-4、-5、-6、-12。此外，可工程改造嵌合型病毒使加入的其它異源基因序列包含源自細菌的抗原(例如細菌表面糖蛋白)，源自真菌的抗原和源自各種其它病原體和寄生蟲的抗原。源自細菌病原體的異源基因序列的例子包括但不限于源自以下屬的細菌的抗原沙門菌屬(Sa/mowe〃a)、志賀菌屬0^/^//")、衣原體屬(C/z/a^yfi/a)、螺桿菌屬(//e/z'co6a"er)、耶爾森菌屬(Jerw'w'a)、博德特菌屬(BoWafc〃a)、假單胞菌屬(尸"W(i畫o"a力、奈瑟菌屬(臉&舒&)、弧菌屬(W6n.cO、嗜血桿菌屬(Z/ae脂//z/to)、支原體屬(Myco/Axswa)、鏈霉菌屬(5^e/^omyces)、密螺旋體屬(7ye/o"ema)、柯克斯體屬(Coxfe//a)、埃里希體屬(￡/zr//c/'a)、布魯桿菌屬(^"wce//。)、鏈桿菌屬(6Yr印to6ac/〃w力、梭-螺菌叢(Fww^/rac/^a)、螺菌屬(S;/n'〃wm)、脲原體屬(f>，/aymcO、螺旋體屬、支原體屬(腳co//(zy應(yīng))、方夂線菌屬04c""owyc"w)、疏螺旋體屬(5tf^re/z'a)、擬桿菌屬CSa"era/de5)、毛發(fā)菌屬(7Wc/wwora力、布蘭漢球菌屬(&""/^附6//<3)、巴斯德菌屬(尸aWe""〃a)、梭狀芽胞桿菌屬(aoWn'Wwm)、棒狀桿菌屬(Coo^e6a"en'wm)、李斯特菌屬(i:/Wer/a)、芽胞桿菌屬CSac///^)、丹毒絲菌屬(五o^;pe/o^n'x)、紅球菌屬(i/wt/ococcw力、埃希桿菌屬(&c/2m'c/z/力、克雷白桿菌屬(尺/eZmW/a)、假單胞菌屬(尸w^omfl"a力、腸細菌屬(￡>zrer。6flcfe。、沙雷菌屬(&rra"a)、葡萄球菌屬(5to/7/^/ococcw力、鏈球菌屬(5Vr印/ococcws)、軍團桿菌屬(丄egw"e〃a)、分枝桿菌屬(綺cokcen'ww)、變形菌屬(尸ra&w5)、彎曲桿菌屬(G3m/y/oZ)fl"e。、腸球菌屬(五"ferococc"5)、不云力桿菌屬G4c/"eto6a"w)、摩根菌屬(Morga"e〃fl)、莫拉菌屬(Moraxe〃a)、檸檬酸細菌屬(C"ra6"c&。、立克次氏體屬(A/cfeto/a)、(70&/,>^^)以及例如銅綠假單胞菌(尸.aerag/"wa)、大腸桿菌CE.co//)、洋蔥假單胞菌(尸.c印ac/a)、表皮葡萄球菌OS.印Wewn'力、糞腸球菌CE./fleca/的、肺炎鏈球菌p"ewmom'a力、金黃色葡萄球菌(S.awew)、腦膜炎奈瑟球菌mem'"g/,W力、釀膿葡萄球菌(S.;yoge"e力、出血敗血性巴斯德菌(尸flWewe〃amw/tocWa)、蒼白密螺旋體(7V卬o"ema/7a〃/^m)禾卩奇異變形桿菌CP.m/raM/力。源自致病性真菌的異源基因序列的例子包括但不限于源自以下真菌的抗原例如新型隱球菌(CV7/tococc"i1"eo/onwam);皮炎芽生菌(5/aj/ow少cesoferma////Gfa);We〃細ycescfer願".礎(chǔ)力；夾膜組織胞漿菌(/Z/加;/as謹(jǐn)capswto畫)；粗球孢子菌(Cocc/c//o/tfey/mmf/ls);念珠菌禾中(Cflmfe/as/ec/e5)，包括白色念珠菌(C.a/6/cww)、熱帶念珠菌(C."c^'cafc)、近平滑念珠菌(C.para/w//a^)、吉利蒙念珠菌(C.gw/〃/ermo"W/)和克魯斯念珠菌(C/b"ww/);曲霉禾中(J5pergz'〃w5^edw)，包括煙曲霉(」./wm/ga/z^)、黃曲霉04./7m^s)禾口黑曲霉(Am'ge。；根霉(iA/zo;w5s/ec/e力；根毛霄禾中(//z/zom"cor^ec〖es);小克銀漢霧禾中(Omm'"g/2amme〃aspec/e力；麟質(zhì)毒禾中(op/^om_yces，c一，包括(」.rafom3efl)、(A畫cor)禾口(Aa&Wa);申克孢子絲菌(iSpon^/znbc5cAewch7);巴西畐(J球jf包子菌CParacocc〖afo/(ies6nzs/〃em/力；波氏假阿利什菌(尸w^a〃Mc/^n'fl6o_yc///);光滑球擬酵母菌(ron^/w^g/a6rato);發(fā)癬菌種(7Wc/zo/7/z;^o"s/7e"'es);小抱菌禾中(M/cTas/7or"ms/ec/e力禾口Dermato//z,es禾中以及目前己知或?qū)龛b定為致病性的其它酵母菌或真菌。最后，源自寄生蟲的異源基因序列的例子包括但不限于源自以下的抗原例如頂復(fù)門(Apicomplexaphylum)的成員，如巴貝蟲屬(5W"fa)、弓形體屬(7bxop/a，fl)、^原蟲屬(尸/a,oAww)、艾美球蟲屬(￡/we〃'a)、等孢子球蟲屬(/雄/ora)、為xop/aj腿、囊等孢蟲屬(Cy血'my/wra)、哈蒙德蟲屬(/Z,mo"Wa)、貝諾孢子蟲屬(5"m'o"a)、肉孢子蟲屬(&wroc;^W、弗倫克蟲屬(尸""^//")、變形血原蟲屬(/Zaemo;rorez^)、住白蟲屬(iewcocytozoow)、泰勒蟲屬(77z"7e〃'a)、伯金斯蟲屬(尸erA:/w^s)禾口簇蟲屬(Gyeg(3"'"as;/7.);卡氏月市囊蟲(尸"ewmocy幼'scw/m7);微孢子門的成員，如小孢子蟲屬(A^wemfl)、腸胞蟲屬(五"^rocjtozow7)、腦胞內(nèi)原蟲屬CfiV7ce//za"tozoon)、5"e/to/a、MrazeA:/。、純抱子屬(y4m6/;;as/7ora)、」weso"、格留蟲屬(G/wgea)、具褶孢蟲屬(尸/e/Wo;/wra)和微孢子蟲屬(M/crcwponW/ww^p.);和囊孢子蟲門(Ascetosporaphylum)的成員，如隱孢子蟲屬(i/a/7/o印on'(i/wms;p.)以及包括以下的種類，鐮狀瘧原蟲(尸/a，od/ww/a/";panw0、間日瘧原蟲(尸.Wvax)、卵形瘧原蟲(尸.ova/e)、間日癥原蟲(尸.ma/an'fl);鼠弓形體(roxo;/asmago"A7);墨西哥利什曼原蟲(Le/Ama"/awex/cfl"a)、熱帶利什曼原蟲(Z."o/7z'ca)、碩大利什曼原蟲CL.wa乂or)、埃塞俄比亞利什曼原蟲(L.e^'o/'cfl)、杜氏利什曼原蟲(Z.t/o"ovam');克氏錐蟲(r，朋aso廳ctwz/)、布氏錐蟲(J!6n^ce/);曼森血吸蟲(Sc/z/s加謹(jǐn)amflwom')、埃及血吸蟲(51./zaem(3to6/"m)、S.y。;om'w/n;旋毛(線)蟲(7Wc/2/"e〃as;/rafc);班克羅夫特吳策線蟲(『"c/^m'aZw"crq/h');布魯[絲蟲]屬(5rag/amfl/a_y//);溶組織阿米巴原蟲(五/iZawoe6(3/n'Wo(y"ca);五wfcroZn'i^verm/cw/oari^;豬肉纟條蟲(raem.aso〃wm)、牛肉絳蟲(r.加g/"ato)、陰道毛滴蟲(7Wc/2omomxs1vag,wa"5)、人毛滴蟲(T./zow/"^)、口腔毛滴蟲(r.fe"a;c);蘭伯賈第蟲(GfaW/a/awW/a);小球隱孢子蟲(Co^to^onW/wmparvwm);卡氏月市囊蟲(尸"eiwocj/^car/m'/);牛巴貝蟲(5a6w'a6ov的、分歧巴貝蟲(5.Wve廠gera)、果氏巴貝蟲(B.m/cra");貝氏等包子球蟲(/sas;ora6e〃/);丄/zom〖"&;脆雙核阿米巴(Z)/emamoe6a/rag//&);旋盤尾絲蟲(O"cZwcercavo/vw/"力；人蛔蟲(y^C'S/麵6n'CO油S);美國板口線蟲屬(A^Cfltor細er/c朋/力；十二指腸鉤蟲(」"c;z/o加顯t/"otfe"a/e);糞類圓線蟲(》0"gy/0/^5tercwfir/的；菲律賓毛細線蟲(Ca////aW<3//w7zJ!pZ"em7、)；廣州圓線蟲04wg/oWrawgy/Mca"towem^);矢旦膜殼絳蟲C^ywewo/e//jwaw力；闊節(jié)裂頭絳蟲(D^/^/oZw/Z^h/w/a/wm);細粒棘球絳蟲(fc/z/"ococcwsgra"w/。5^5)、多房棘球絳蟲(五.mw/"/ocw/"r/力；衛(wèi)氏并殖吸蟲(尸aragow/wwsweWe/7na/)、卡里并殖口及蟲(尸.ca/few^j);華支睪口及蟲(C7z/oworc/w'jw.廳測；Opz,W/zon:/7&/e〃"簡；麝貓后睪吸蟲(G.P7ve".m');肝片吸蟲(Fcwc油Aepa/Zca);疥螨(&ircop&ssca6/e/);人虱(尸ed/cw/"5/mma"w5);尸/^/w'Wm1p"6/s禾口人皮蠅(Demwto^/z函My)以及目前己知或?qū)龛b定為致病性的任何其它寄生蟲。5.4.2插入異源基因序列可用異源序列完全取代或部分取代病毒編碼區(qū)或?qū)愒春塑账嵝蛄屑尤氩《净蚪M來將外來基因序列插入本發(fā)明病毒載體?？赡茏詈貌捎肞CR-指導(dǎo)的誘變實現(xiàn)完全取代。簡言之，PCR-引物A自5'到3'端含有獨特的限制性酶切位點，例如IIS類限制性酶切位點(g卩，能識別特定序列，但在該序列的上游或下游切割DNA的"移位"酶)；與待替換的基因區(qū)域互補的核苷酸延伸段；和與該異源序列羧基末端編碼部分互補的核苷酸延伸段。PCR-引物B自5'到3'端含有獨特的限制性酶切位點；與待替換的基因互補的核苷酸延伸段；和對應(yīng)于該異源或非天然基因5'編碼部分的核苷酸延伸段。用這些引物和異源或非天然基因的克隆拷貝進行PCR反應(yīng)后，可利用獨特的限制性位點切下和克隆產(chǎn)物。用IIS類酶消化和用純化的噬菌體聚合酶轉(zhuǎn)錄可得到含有該病毒基因的精確非翻譯末端的RNA分子，該分子現(xiàn)在攜帶了異源或非天然基因插入物。在另一實施方式中，可采用PCR引發(fā)的反應(yīng)來制備含有噬菌體啟動子序列和雜交基因序列的雙鏈DNA，因而可直接轉(zhuǎn)錄RNA模板而無需克隆?？蓪愒春塑账嵝蛄屑尤牖虿迦氡景l(fā)明病毒的各種位置。在一實施方式中，將異源核苷酸序列加入或插入位置1。在另一實施方式中，將異源核苷酸序列加入或插入位置2。在另一實施方式中，將異源核苷酸序列加入或插入位置3。在另一實施方式中，將異源核苷酸序列加入或插入位置4。在另一實施方式中，將異源核苷酸序列加入或插入位置5。在還有另一實施方式中，將異源核苷酸序列加入或插入位置6。本文所用的術(shù)語"位置"指異源核苷酸序列在待轉(zhuǎn)錄的病毒基因組上的位置，例如位置l表示首先轉(zhuǎn)錄基因的位置，位置2表示第二個轉(zhuǎn)錄基因的位置。與插入編號較高的位置相比，將異源核苷酸序列插入病毒中編號較低的位置會因存在橫跨病毒基因組中的轉(zhuǎn)錄梯度而導(dǎo)致該異源核苷酸序列表達較強。然而，轉(zhuǎn)錄梯度也產(chǎn)生了病毒mRNA的特定比例。插入外來基因會干擾這些比例，導(dǎo)致合成不同量的可能影響病毒復(fù)制的病毒蛋白。因此，在選擇插入位點時必須考慮轉(zhuǎn)錄梯度的影響和復(fù)制動力學(xué)。如果需要高水平地表達異源核苷酸序列，將該異源核苷酸序列插入編號較低的位置是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。在一優(yōu)選實施方式中，將異源序列加入或插入位置l、2或3。當(dāng)將異源核苷酸序列插入本發(fā)明病毒時，可改變異源基因編碼序列的末端與下游基因編碼序列的起始點之間的基因間區(qū)域以達到所需效果。本文所用的術(shù)語"基因間區(qū)域"指某一基因的終止信號與下一個下游開放讀框編碼序列的起始密碼子(例如，AUG)之間的核苷酸序列?；蜷g區(qū)域可包含某基因的非編碼區(qū)，即該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點與其編碼序列的起點(AUG)之間的區(qū)域。某些病毒基因中天然存在這種非編碼區(qū)。在各種實施方式中，可彼此獨立地工程改造異源核苷酸序列和下游基因之間的基因間區(qū)域使之長度至少為10個nt、至少20個nt、至少30個nt、至少50個nt、至少75個nt、至少100個nt、至少125個nt、至少150個nt、至少175個nt或至少200個nt。在某些實施方式中，可彼此獨立地工程改造異源核苷酸序列和下游基因之間的基因間區(qū)域使之長度最多為10個nt、最多20個nt、最多30個nt、最多50個nt、最多75個nt、最多100個nt、最多125個nt、最多150個nt、最多175個nt或最多200個nt。在各種實施方式中，也可彼此獨立地工程改造病毒基因組中所需基因的非編碼區(qū)使之長度至少為10個nt、至少20個nt、至少30個nt、至少50個nt、至少75個nt、至少100個nt、至少125個nt、至少150個nt、至少175個nt或至少200個nt。在某些實施方式中，也可彼此獨立地工程改造病毒基因組中所需基因的非編碼區(qū)使之長度最多為10個nt、最多20個nt、最多30個nt、最多50個nt、最多75個nt、最多100個nt、最多125個nt、最多150個nt、最多175個nt或最多200個nt。插入異源核苷酸序列時，可聯(lián)用位置效應(yīng)和基因間區(qū)域操作以實現(xiàn)所需效果。例如，可將異源核苷酸序列加入或插入選自位置1、2、3、4、5和6的位置，可改變異源核苷酸序列與下一個下游基因之間的基因間區(qū)域(見表3)。例如，表3顯示了本發(fā)明所包括的一些組合。表3.異源核苷酸序列的插入模式例子位置l位置2位置3位置4位置5位置6IGRa10-2010-2010-2010-2010-2010-20IGR21-4021-4021-4021-4021-4021-40IGR41-6041-6041-6041-6041-6041-60IGR61-8061-8061-8061-8061-8061-80IGR81-10081-10081-10081-10081-10081-100IGR101-120101-120101-120101-120101-120101-120IGR121-140121-140121-140121-140121-140121-140IGR141-160141-160141-160141-160141-160141-160IGR161-180161-180161-180161-180161-180161-180IGR181-200181-200181-200181-200181-200181-200IGR201-220201-220201-220201-220201-220201-220IGR221-240221-240221-240221-240221-240221-240IGR241-260241-260241-260241-260241-260241-260IGR261-280261-280261-280261-280261-280261-280IGR281-300281-300281-300281-300281-30028卜300基因間區(qū)域，以核苷酸檢測根據(jù)所插入異源核苷酸序列的目的(例如，具有強免疫原性)，可用各種指數(shù)檢測所插入異源核苷酸序列的插入位置和其基因間區(qū)域的長度，所述指數(shù)包括但不限于通過以下試驗檢測的復(fù)制動力學(xué)和蛋白質(zhì)或mRNA表達水平，所述試驗的非限制性例子是噬菌斑測定、熒光聚焦試驗、侵染中心試驗、轉(zhuǎn)化試驗、終點稀釋試驗、接種效率、電子顯微鏡、血凝、檢測病毒的酶活性、病毒中和、血凝抑制、補體結(jié)合、免疫染色、免疫沉淀和免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定、核酸檢測(例如，Southern印跡分析、Northern印跡分析、蛋白質(zhì)印跡分析)、生長曲線、利用報道基因(例如，使用報道基因，如綠色熒光蛋白(GFP)或增強型綠色熒光蛋白(eGFP)、以與感興趣異源基因相同的方式整合入病毒基因組來觀察蛋白質(zhì)表達)或它們的組合。本領(lǐng)域熟知實施這些試驗的方法(參見，例如全文納入本文作為參考的Flint等，PrinciplesOfVirology,MolecularBiology,Pathogenesis,Andcontrol(《病毒學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)病機制和控制的原理》)，2000，ASMPress,第25-56頁)，非限制性例子見下文實施例章節(jié)。例如，可通過以下步驟檢測表達水平用本發(fā)明病毒感染培養(yǎng)的細胞，然后通過，例如利用該異源序列基因產(chǎn)物的特異性抗體作蛋白質(zhì)印跡分析或ELISA檢測蛋白質(zhì)表達水平，或通過，例如用該異源序列的特異性探針作Northern印跡分析來檢測RNA表達水平。類似地，可通過感染動物模型，檢測該動物模型中本發(fā)明重組病毒中異源序列所表達的蛋白質(zhì)水平來檢測異源序列的表達水平?？赏ㄟ^獲得受感染動物的組織樣品，然后用異源序列基因產(chǎn)物的特異性抗體對該組織樣品進行蛋白質(zhì)印跡分析或ELISA來檢測蛋白質(zhì)水平。此外，如果使用動物模型，可采用技術(shù)人員己知的任何技術(shù)，包括但不限于ELISA測定該動物產(chǎn)生的抗異源序列基因產(chǎn)物的抗體滴度。由于異源序列可以與該病毒基因組中的核苷酸序列同源，應(yīng)小心探針和抗體實際上對異源序列或其基因產(chǎn)物特異。在某些具體的實施方式中，可釆用本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的任何技術(shù)測定嵌合型禽-人偏肺病毒hMPV的F-蛋白表達水平?？赏ㄟ^以下步驟檢測F-蛋白表達水平用本發(fā)明嵌合型病毒感染培養(yǎng)的細胞，通過，例如利用hMPVF-蛋白和/或G-蛋白的特異性抗體作蛋白質(zhì)印跡分析或ELISA來檢測蛋白質(zhì)表達水平，或通過，例如利用人偏肺病毒F-基因和/或G-基因的特異性探針作Northern印跡分析來檢測RNA表達水平。類似地，可利用動物模型，通過感染動物并檢測該動物模型中F-蛋白和/或G-蛋白的水平來檢測異源序列的表達水平?？赏ㄟ^獲得受感染動物的組織樣品，然后利用異源序列F-蛋白和/或G-蛋白的特異性抗體對該組織樣品進行蛋白質(zhì)印跡分析或ELISA來檢測蛋白質(zhì)水平。此外，如果使用動物模型，可采用技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，包括但不限于ELISA測定該動物產(chǎn)生的抗F-蛋白和/或G-蛋白的抗體滴度?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何技術(shù)測定本發(fā)明重組病毒的復(fù)制速率。在某些實施方式中，通過異源序列編碼的報道基因來促進鑒定異源序列在病毒基因組中的最佳位置和基因間區(qū)域的最佳長度。一旦測定了最佳參數(shù)，用編碼所選抗原的異源核苷酸序列替代該報道基因。本發(fā)明方法可使用技術(shù)人員已知的任何報道基因。更多細節(jié)可參見章節(jié)5.8?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定重組病毒的復(fù)制速率。病毒的生長速率代表了復(fù)制速率，可通過將病毒滴度對感染后時間作圖來測定復(fù)制速率?？舍娪眉夹g(shù)人員已知的任何技術(shù)檢測病毒滴度。在某些實施方式中，一起培育病毒混懸液與易受病毒感染的細胞。本發(fā)明方法可用的細胞類型包括但不限于Vero細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF1043(HEL)細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、tMK細胞、293T細胞、QT6細胞、QT35細胞或雞胚成纖維細胞(CEF)。病毒與細胞培育后，測定受感染細胞的數(shù)量。在某些具體的實施方式中，所述病毒包含報道基因。因此，表達報道基因的細胞數(shù)量代表了受感染細胞的數(shù)量。在一具體實施方式中，所述病毒包含編碼eGFP的異源核苷酸序列，采用FACS測定表達eGFP的細胞數(shù)量，即受該病毒感染的細胞數(shù)量。在某些實施方式中，相同條件下本發(fā)明重組病毒的復(fù)制速率最多是產(chǎn)生該重組病毒的野生型病毒復(fù)制速率的20%。相同條件指病毒的起始滴度相同、細胞株相同、培育溫度、生長培養(yǎng)基、細胞數(shù)量和可能影響復(fù)制速率的其它測試條件相同。例如，在位置1含有PIVF基因的APV/hMPV復(fù)制速率最多是APV復(fù)制速率的20%。在某些實施方式中，相同條件下本發(fā)明重組病毒的復(fù)制速率最多是產(chǎn)生該重組病毒的野生型病毒復(fù)制速率的5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%、80%、90%。在某些實施方式中，相同條件下本發(fā)明重組病毒的復(fù)制速率至少是產(chǎn)生該重組病毒的野生型病毒復(fù)制速率的5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%、80%、90%。在某些實施方式中，相同條件下本發(fā)明重組病毒的復(fù)制速率在產(chǎn)生該重組病毒的野生型病毒復(fù)制速率的5%-20%之間、10%-40%之間、25%-50%之間、40%-75%之間、50%-80%之間或75%-90%之間。在某些實施方式中，相同條件下本發(fā)明重組病毒中異源序列的表達水平最多是產(chǎn)生該重組病毒的野生型病毒F-蛋白表達水平的20%。相同條件指病毒的起始滴度相同、細胞株相同、培育溫度、生長培養(yǎng)基、細胞數(shù)量和可能影響復(fù)制速率的其它測試條件相同。例如，hMPV位置l中PIV3F蛋白的異源序列表達水平最多是hMPV的F-蛋白表達水平的20%。在某些實施方式中，相同條件下本發(fā)明重組病毒中異源序列的表達水平最多是產(chǎn)生該重組病毒的野生型病毒F-蛋白表達水平的5。/。、10%、20%、30%、40%、50%、75%、80%、90%。在某些實施方式中，相同條件下本發(fā)明重組病毒中異源序列的表達水平至少是產(chǎn)生該重組病毒的野生型病毒F-蛋白表達水平的5W、10M、20%、30%、40%、50%、75%、80%、90%。在某些實施方式中，相同條件下本發(fā)明重組病毒中異源序列的表達水平在產(chǎn)生該重組病毒的野生型病毒F-蛋白表達水平的5%-20%之間、10%-40%之間、25%-50%之間、40%-75%之間、50%-80%之間或75°/。-90%之間。5.4.3將異源基因序列插入G基因中G蛋白是偏肺病毒的跨膜蛋白。一具體實施方式將異源序列插入編碼胞外域的G-ORF區(qū)域中，因而其表達在病毒被膜的表面。一種方法可將此異源序列插入抗原性位點內(nèi)而無需刪除任何病毒序列。另一種方法用異源序列替代G-ORF?？蓪⑦@種構(gòu)建物的表達產(chǎn)物用于抵御外來抗原的疫苗，這些產(chǎn)物實際上可克服重組病毒在該疫苗接種宿主中增殖的相關(guān)問題。只在抗原性位點含有取代的完整G分子可行使G(分子)功能，因而能構(gòu)建活的病毒。因此，可培養(yǎng)該病毒而無需額外的輔助功能物。也可通過其它方法使病毒減毒以避免任何意外逃避的危險?？芍苽淦渌s交構(gòu)建物在細胞表面表達蛋白質(zhì)或使它們從細胞釋放。5.4.4構(gòu)建雙順反子RNA可構(gòu)建雙順反子mRNA以使從常規(guī)的末端起始位點內(nèi)部啟動病毒序列翻譯和表達外源蛋白質(zhì)編碼序列?；蛘?，可構(gòu)建雙順反子mRNA序列，其中從常規(guī)的末端開放讀框翻譯此病毒序列，而外來序列從內(nèi)部位點開始翻譯?？衫媚承﹥?nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列。所選擇的IRES序列應(yīng)足夠短，從而不干擾MPV的包裝限度。因此，這種雙順反子方法所選的IRES長度宜不超過500個核苷酸。在一具體實施方式中，IRES源自小RNA病毒，不包含任何其它小RNA病毒序列。具體IRES元件包括但不限于哺乳動物BiPIRES和丙肝病毒IRES?；蛘?，可從含有起始位點和聚腺苷酸化位點的新內(nèi)部轉(zhuǎn)錄單位表達外源蛋白。另一實施方式將外源基因插入MPV基因中，因而得到的表達產(chǎn)物是融合蛋白。5.5利用重組cDNA和RNA模板表達異源基因產(chǎn)物在各種方法中可使用上述制備的病毒載體和重組模板在合適的宿主細胞中表達異源基因產(chǎn)物，或產(chǎn)生表達該異源基因產(chǎn)物的嵌合型病毒。在一個實施方式中，可用重組cDNA轉(zhuǎn)染合適的宿主細胞，得到的RNA可指導(dǎo)異源基因產(chǎn)物高水平地表達。能提供高水平表達的宿主細胞系統(tǒng)包括能支持病毒功能的連續(xù)生長細胞系(continuouscellline),例如分別用APV或MPV超感染的細胞系，經(jīng)工程改造以補充APV或MPV功能的細胞系等。在本發(fā)明的另一實施方式中，可用重組模板轉(zhuǎn)染表達病毒聚合酶蛋白的細胞系以實現(xiàn)異源基因產(chǎn)物的表達。為此目的，可將表達聚合酶蛋白，例如L蛋白的轉(zhuǎn)化細胞系用作合適的宿主細胞。可以類似地工程改造宿主細胞以提供其它病毒功能物或額外的功能物，例如G或N。在另一實施方式中，輔助病毒可提供細胞所用的RNA聚合酶蛋白以實現(xiàn)異源基因產(chǎn)物的表達。在還有另一實施方式中，可用編碼病毒蛋白，例如N、P、L和M2-l蛋白的載體轉(zhuǎn)染細胞。5.6拯救重組病毒顆粒為制備本發(fā)明的嵌合型和重組病毒，可用編碼本發(fā)明重組或嵌合型病毒的基因組的正義或反義(minussense)cDNA轉(zhuǎn)染細胞以提供復(fù)制和拯救所需的病毒蛋白和功能物?；蛘?，可在編碼本發(fā)明重組病毒的DNA或RNA轉(zhuǎn)染之前、期間或之后用輔助病毒轉(zhuǎn)染細胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域己知的任何技術(shù)復(fù)制本發(fā)明的合成重組質(zhì)粒DNA和RNA并拯救轉(zhuǎn)變成傳染性病毒顆粒，所述技術(shù)描述于，例如1992年11月24日授權(quán)的美國專利號5,166,057;1998年12月29日授權(quán)的美國專利號5,854,037;1996年2月20日公布的歐洲專利公布EP0702085A1;美國專利申請系列號09/152,845;1997年4月3日公布的國際專利公布PCTWO97/12032;1996年11月7日公布的W096/34625;歐洲專利公布EP-A780475;1999年1月21日公布的WO99/02657;1998年11月26日公布的WO98/53078;1998年1月22曰公布的WO98/02530;1999年4月1日公布的WO99/15672;1998年4月2日公布的WO98/13501;1997年2月20日公布的WO97/06270;和1997年6月25日公布的EPO78047SAl，這些文獻各自全文納入本文作為參考。在本發(fā)明一實施方式中，可制備含負鏈病毒RNA的非編碼區(qū)(前導(dǎo)序列和尾序列)的合成重組病毒RNA,這些非編碼區(qū)對于病毒聚合酶的識別和產(chǎn)生成熟病毒體所需的包裝信號至關(guān)重要?？刹捎迷S多不同的方法將反向遺傳學(xué)方法應(yīng)用于拯救負鏈RNA病毒。首先，從重組DNA模板合成重組RNA，在體外用純化的病毒聚合酶復(fù)合物重建，從而形成可用于轉(zhuǎn)染細胞的重組核糖核蛋白(RNP)。在另一種方法中，如果在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成的RNA期間存在此病毒聚合酶蛋白，可實現(xiàn)更有效的轉(zhuǎn)染?？捎么朔椒◤腸DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄合成的RNA，這些質(zhì)粒可以在體外與編碼聚合酶蛋白的cDNA質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)錄，或者在體內(nèi)聚合酶蛋白存在下，即在瞬時或組成型表達聚合酶蛋白的細胞中轉(zhuǎn)錄。在本文所述的其它方法中，可用能表達偏肺病毒聚合酶蛋白的宿主細胞系統(tǒng)(例如，病毒/宿主細胞表達系統(tǒng)；工程改造能表達聚合酶蛋白的轉(zhuǎn)化細胞系等)復(fù)制傳染性嵌合型或重組病毒，因而能復(fù)制和拯救傳染性嵌合型或重組病毒。在此情況中，由于所表達的病毒聚合酶蛋白提供了該功能，無需使用輔助病毒。按照本發(fā)明，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的任何技術(shù)實現(xiàn)重組和嵌合型病毒的復(fù)制和拯救。一種方法包括先提供體外復(fù)制所需的病毒蛋白和功能物，再轉(zhuǎn)染宿主細胞。在這種實施方式中，提供的病毒蛋白可以是以下形式野生型病毒的、輔助病毒的、純化的病毒蛋白或重組表達的病毒蛋白。可以在轉(zhuǎn)錄編碼該嵌合型病毒的合成cDNA或RNA之前、期間或之后提供這些病毒蛋白。可用此整個混合物轉(zhuǎn)染宿主細胞。在另一方法中，可在轉(zhuǎn)錄編碼此嵌合型病毒的合成cDNA或RNA之前或期間提供復(fù)制所需的病毒蛋白和功能物。在這種實施方式中，提供的復(fù)制所需病毒蛋白和功能物是可通過感染或轉(zhuǎn)染而引入宿主細胞的以下形式野生型病毒、輔助病毒、病毒提取物，表達病毒蛋白的合成cDNA或RNA。這種感染/轉(zhuǎn)染可以在引入編碼此嵌合型病毒基因組的合成cDNA或RNA之前或同時。在特別理想的方法中，經(jīng)工程改造以表達所有病毒基因或本發(fā)明嵌合型或重組病毒(即，APV、MPV、MPV/APV或APV/MPV)的細胞可產(chǎn)生含有所需基因型的傳染性病毒；因而無需選擇系統(tǒng)。在理論上，可以用外源序列取代編碼MPV的結(jié)構(gòu)蛋白的任一ORF或任一ORF的一部分。然而，該綜合體(叫uation)必需能增殖缺陷型病毒(因正常病毒基因產(chǎn)物丟失或改變而有缺陷)?，F(xiàn)有許多方法可能克服該問題。在一種方法中，含有突變型蛋白的病毒能用構(gòu)建為組成型表達該蛋白的野生型形式細胞系培養(yǎng)。通過此方法，這些細胞系可補充此病毒中的突變。可采用類似的技術(shù)構(gòu)建能組成型表達任何MPV基因的轉(zhuǎn)化細胞系?？衫盟苽涞倪@些細胞系表達此病毒蛋白來補充嵌合型或重組病毒的缺陷，從而增殖病毒。或者，可用某些天然的宿主系統(tǒng)來增殖這些嵌合型或重組病毒。在還有另一實施方式中，作為遺傳物質(zhì)提供的復(fù)制所需病毒蛋白和功能物可以是合成的cDNA或RNA形式，因而它們可與編碼嵌合型病毒的合成cDNA或RNA共同轉(zhuǎn)錄。在一特別理想的方法中，將表達嵌合型病毒和病毒聚合酶和/或病毒功能物的數(shù)個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入宿主細胞中。例如，可將編碼基因組或反基因組APV、MPV、MPV/APV或APV/MPVRNA的質(zhì)粒(含或不含一條或多條異源序列)與編碼偏肺病毒聚合酶蛋白N、P、L或M2-1的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入宿主細胞。或者，可利用編碼T7RNA聚合酶的修飾痘苗病毒Ankara(MVA)或聯(lián)用MVA與編碼聚合酶蛋白(N、P和L)的質(zhì)粒來拯救本發(fā)明的重組病毒。例如，可將MVA-T7或禽痘-T7感染入Vero細胞、LLC-MK-2細胞、HEp-2細胞、LF1043(HEL)細胞、tMK細胞、LLC-MK2、HUT292、FRHL-2(恒河猴)、FCL-1(綠猴)、WI-38(人)、MRC畫5(人)細胞、293T細胞、QT6細胞、QT35細胞禾BCEF細胞。用MVA-T7或禽痘-T7感染后，可將編碼本發(fā)明重組病毒的全長反基因組或基因組cDNA與編碼N、P、L和M2-1的表達質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染入細胞。或者，可采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染提供此聚合酶。然后收集細胞和細胞上清液，進行一輪凍融。然后可在有l(wèi)-卩-D-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶(arabinofuranosylcytosine)(araC，一種痘苗病毒復(fù)制抑制劑)存在下用得到的細胞裂解液感染新鮮的單層Vero細胞以產(chǎn)生儲備病毒。然后可收集這些平板的上清、液和細胞，凍融一次，利用特定病毒的特異性抗血清免疫染色病毒噬斑來檢驗是否存在本發(fā)明重組病毒顆粒。增殖嵌合型或重組病毒的另一種方法可包括與野生型病毒共同培養(yǎng)。簡言之，取重組病毒，將該病毒與另一種野生型病毒共同感染細胞。野生型病毒應(yīng)能彌補提供缺陷病毒所需的基因產(chǎn)物，并使野生型病毒和重組病毒均能生長。或者，可用輔助病毒支持該重組病毒增殖。在另一種方法中，共同轉(zhuǎn)染了重組病毒的細胞中復(fù)制合成模板而表達偏肺病毒聚合酶蛋白。事實上，可采用該方法拯救本發(fā)明的重組傳染性病毒。為此目的，可用任何表達載體/宿主細胞系統(tǒng)表達偏肺病毒聚合酶，包括但不限于病毒表達載體(例如，痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒等)或表達聚合酶蛋白的細胞系(參見，例如Krystal等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2709-2713)。此外，感染能表達所有偏肺病毒蛋白的宿主細胞能產(chǎn)生傳染性嵌合型病毒顆粒。應(yīng)該注意，現(xiàn)已能構(gòu)建重組病毒而不改變病毒存活力。然后在感受態(tài)細胞中培育這些改變的病毒，無需輔助病毒即可復(fù)制。為產(chǎn)生本發(fā)明方法所用的重組病毒，必須轉(zhuǎn)錄編碼病毒基因組的遺傳物質(zhì)(轉(zhuǎn)錄步驟)。可以在體外(宿主細胞外)或體內(nèi)(宿主細胞內(nèi))進行該步驟。可從該遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)錄病毒基因組以產(chǎn)生該病毒基因組的有義拷貝(反基因組拷貝)或該病毒基因組的反義拷貝(基因組拷貝)。下一步驟需要復(fù)制該病毒基因組并將復(fù)制的基因組包裝入病毒顆粒(復(fù)制和包裝步驟)。該步驟在經(jīng)工程改造而能提供病毒復(fù)制和包裝所需的足夠水平的病毒聚合酶和結(jié)構(gòu)蛋白的宿主細胞胞內(nèi)進行。體外進行轉(zhuǎn)錄步驟，然后進行病毒基因組的胞內(nèi)復(fù)制和包裝。體內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄步驟時，可在表達編碼病毒基因組的病毒遺傳物質(zhì)之前、同時或之后轉(zhuǎn)錄該病毒基因組，所述病毒基因組可從各種來源，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法獲得或產(chǎn)生。可分離病毒本身的遺傳物質(zhì)。例如，可分離完整病毒的病毒RNA基因組和聚合酶蛋白的復(fù)合物、核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)。然后可剝?nèi)ヅc病毒RNA基因組相結(jié)合的蛋白，例如病毒RNA聚合酶和核蛋白?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)產(chǎn)生編碼該病毒基因組的遺傳物質(zhì)。該遺傳物質(zhì)可編碼全長病毒基因組或其一部分?；蛘?，該遺傳物質(zhì)可編碼側(cè)接有病毒基因組前導(dǎo)序列和/或尾序列的異源序列?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)從較小的PCR片段裝配全長病毒基因組。圖lO顯示了hMPV不同分離物的限制性圖譜。可利用其限制性位點裝配全長構(gòu)建物。在某些實施方式中，設(shè)計的PCR引物應(yīng)使PCR反應(yīng)所得的片段在接近其5'端含有一限制性位點，在接近其3'端含有一限制性位點。然后用各自的限制性酶消化該PCR產(chǎn)物，再連接毗鄰的PCR片段。為復(fù)制和包裝病毒基因組，前導(dǎo)序列和尾序列保留的病毒聚合酶識別所需信號至關(guān)重要?？蓛?yōu)化或改變病毒RNA基因組的前導(dǎo)序列和尾序列以改進和提高病毒的復(fù)制和拯救?；蛘?，可修飾前導(dǎo)序列和尾序列以降低病毒復(fù)制和包裝的效率，從而得到具有減毒表型的被拯救病毒。不同前導(dǎo)序列和尾序列的例子包括但不限于副黏病毒的前導(dǎo)序列和尾序列。在本發(fā)明一具體實施方式中，所述前導(dǎo)序列和尾序列是野生型或突變型hMPV的前導(dǎo)序列和尾序列。在本發(fā)明另一實施方式中，所述前導(dǎo)序列和尾序列是PIV、APV或RSV的前導(dǎo)序列和尾序列。在本發(fā)明還有另一實施方式中，前導(dǎo)序列和尾序列是不同病毒來源的前導(dǎo)序列和尾序列組合。例如(不表示限制可能的組合)，所述前導(dǎo)序列和尾序列可以是hMPV、PIV、APV、RSV或任何其它副黏病毒的任何前導(dǎo)序列和尾序列的組合。對前導(dǎo)序列和尾序列進行修飾的例子包括改變與病毒啟動子的間距(spacing);改變序列，例如改變G殘基的數(shù)目(通常是0-3)和利用核酶序列(包括丁型肝炎病毒(HDV)核酶序列、錘頭核酶序列或它們保留核酶催化活性的片段)與體外產(chǎn)生的失控RNA(run-offRNA)所用的限制性酶來限制其5'或3'端。在另一實施方式中，如果該病毒基因組的長度是六聚物，則可以提高病毒復(fù)制和拯救的效率。為確保病毒基因組的長度合適，可用核酶序列(包括丁型肝炎病毒(HDV)核酶序列、錘頭核酶序列或它們保留核酶催化活性的片段)與體外產(chǎn)生的失控RNA所用的限制性酶來限制其5'或3'端。為編碼待轉(zhuǎn)錄病毒基因組的遺傳物質(zhì)，可工程改造此遺傳物質(zhì)，將其置于合適轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如聚合酶識別的啟動子序列的控制下。優(yōu)選的實施方式是T7、Sp6或T3聚合酶識別啟動子序列。還有另一實施方式是細胞的DNA依賴性RNA聚合酶，例如RNA聚合酶I(PolI)或RNA聚合酶II(PolII)識別的啟動子序列?？蓪⒕幋a所述病毒基因組的遺傳物質(zhì)置于這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的控制下，因而能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生該病毒基因組的正鏈或負鏈拷貝。將編碼所述病毒基因組的遺傳物質(zhì)重組改造與表達載體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列操作性相連，所述表達載體例如是質(zhì)粒載體，如含polII啟動子的質(zhì)粒(如CMV的立即早期啟動子)，含有T7啟動子的質(zhì)粒，或病毒載體，如痘病毒載體，包括痘苗載體、MVA-T7和禽痘載體?？尚揎椌幋a病毒基因組的遺傳物質(zhì)以提高所選聚合酶的表達，例如改變前導(dǎo)序列或尾序列上游G殘基的數(shù)目(通常是0-3)以優(yōu)化T7啟動子驅(qū)動的表達。在允許病毒復(fù)制和包裝的宿主細胞胞內(nèi)進行所述病毒基因組的復(fù)制和包裝。有許多方法改造宿主細胞以提供復(fù)制和包裝所需的足夠水平病毒聚合酶和結(jié)構(gòu)蛋白，包括用合適的輔助病毒感染宿主細胞，工程改造宿主細胞以穩(wěn)定或組成型地表達該病毒聚合酶和結(jié)構(gòu)蛋白，或者工程改造宿主細胞以瞬時或可誘導(dǎo)地表達所述病毒聚合酶和結(jié)構(gòu)蛋白。MPV病毒復(fù)制和包裝所需的功能蛋白質(zhì)包括但不限于聚合酶蛋白P、N、L和M2-l。在一實施方式中，表達的蛋白質(zhì)是天然或野生型MPV蛋白。在另一實施方式中，可采用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)修飾表達的蛋白質(zhì)以提高它們的表達水平和/或聚合酶活性?；蛘?，可表達保留了聚合酶活性的聚合酶蛋白的片段、衍生物、類似物或截短形式。在還有另一實施方式中，可表達其它肺病毒，例如APV或任何其它副黏病毒的相似聚合酶蛋白。此外，可通過表達一種MPV毒株的蛋白與另一種毒株的基因組來產(chǎn)生減毒的病毒。例如，可以表達一種MPV毒株的聚合酶蛋白與另一種毒株的基因組來產(chǎn)生減毒表型?？捎幂o助病毒提供病毒聚合酶蛋白。本發(fā)明所用的輔助病毒包括天然表達聚合酶病毒蛋白的那些輔助病毒，例如MPV或APV?；蛘?，可利用已經(jīng)重組改造的輔助病毒以提供聚合酶病毒蛋白。或者，可通過表達載體提供此病毒聚合酶蛋白。工程改造編碼此病毒聚合酶蛋白的序列，將其置于聚合酶識別的合適轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如啟動子序列的控制下。優(yōu)選的實施方式是T7、Sp6或T3聚合酶識別的啟動子序列。還有另一實施方式是PolI或PolII聚合酶識別的啟動子序列。或者，是病毒聚合酶，例如CMV識別的啟動子序列。將編碼所述病毒聚合酶蛋白的序列重組改造與表達載體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列操作性相連，所述表達載體例如是質(zhì)粒載體，如CMV驅(qū)動的質(zhì)粒、T7驅(qū)動的質(zhì)粒，或病毒載體，如痘病毒載體，包括痘苗載體、MVA-T7和禽痘載體。為實現(xiàn)有效的病毒復(fù)制和包裝，優(yōu)選高水平地表達該聚合酶蛋白?？蓪⒕幋a副黏病毒蛋白的100-200ngL/pCITE、200-400ngN/pCITE、200-400ngP/pCITE和100-200ngM2-l/pCITE質(zhì)粒與2-4ug編碼全長病毒cDNA的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染入受MVA-T7感染的細胞來獲得這種高水平。另一實施方式使用0.1-2.0pg的pSH25(表達CAT)、0.1-3.0|ig的pRF542(表達T7聚合酶)、0.1-0.8pg含NcDNA插入物的pCITE載體和0.1-1.0pg含P、L禾t!M2-lcDNA插入物的三種pCITE載體中的任一種?；蛘?，可用純化的核糖核蛋白轉(zhuǎn)染細胞將一種或多種聚合酶和結(jié)構(gòu)蛋白與所述遺傳物質(zhì)一起引入細胞。優(yōu)選允許MPV病毒復(fù)制和包裝的宿主細胞。優(yōu)選的宿主細胞的例子包括但不限于293T、Vero、tMK和BHK。宿主細胞的其它例子包括但不限于LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF1043(HEL)細胞、LLC-MK2、HUT292、FRHL-2(恒河猴)、FCL-1(綠猴)、WI-38(人)、MRC-5(人)細胞、QT6細胞、QT35細胞和CEF細胞。在本發(fā)明的其它實施方式中，可采用許多方法處理宿主細胞以提高轉(zhuǎn)染和/或感染效率、蛋白質(zhì)表達水平，優(yōu)化病毒的復(fù)制和包裝。這種處理方法包括但不限于超聲處理、凍融和熱休克(heatshock)。此外，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)優(yōu)化轉(zhuǎn)染和/或感染方案，包括但不限于DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑處理、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和電穿孔。技術(shù)人員也熟悉優(yōu)化轉(zhuǎn)染/感染方案所用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。例如，而不限于現(xiàn)有的技術(shù)，可用的方法包括當(dāng)用病毒提供所需蛋白時，操縱相對于轉(zhuǎn)染的感染時間，操縱不同質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染時間和改變病毒與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的相對含量。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及利用除所拯救病毒以外的病毒的聚合酶從CDNA拯救或產(chǎn)生活病毒。在某些實施方式中，使用許多聚合酶，包括但不限于種間和種內(nèi)聚合酶從cDNA拯救hMPV。在某些實施方式中，用能表達hMPV復(fù)制所需最小復(fù)制單位的宿主細胞拯救hMPV。例如，可用許多聚合酶，包括但不限于RSV、APV、MPV或PIV的聚合酶從cDNA拯救hMPV。在本發(fā)明一具體實施方式中，使用RNA病毒的聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明一更具體的實施方式中，用負鏈RNA病毒的聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明甚至更具體的實施方式中，使用RSV聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明另一實施方式中，使用APV聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明還有另一實施方式中，使用MPV聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明另一實施方式中，使用PIV聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明更確定的實施方式中，使用hMPV聚合酶蛋白的復(fù)合物從cDNA拯救hMPV。例如，可利用含L、P、N和M2-1蛋白的聚合酶復(fù)合物拯救hMPV微小復(fù)制子(minireplicon)。在本發(fā)明另一實施方式中，此聚合酶復(fù)合物含L、P和N蛋白。在本發(fā)明還有另一實施方式中，可用含其它病毒(例如但不限于RSV、PIV和APV)的聚合酶蛋白的聚合酶復(fù)合物從cDNA拯救hMPV。具體地說，可用含RSV、PIV、APV、MPV的L、P、N和M2-l蛋白或它們的任何組合的聚合酶復(fù)合物從cDNA拯救hMPV。在本發(fā)明還有另一實施方式中，用于從cDNA拯救hMPV的聚合酶復(fù)合物可含RSV、PIV、APV、MPV的L、P和N蛋白或它們的任何組合。在本發(fā)明的另一實施方式中，可利用各種病毒的不同聚合酶組成此聚合酶復(fù)合物。在這種實施方式中，用于拯救hMPV的聚合酶可由RSV、PIV、APV或MPV聚合酶的不同組分構(gòu)成。例如(不表示限制構(gòu)成此復(fù)合物的可能組合)，RSV、APV、PIV或MPV的N基因編碼N蛋白，而RSV、APV、PIV或MPV的L基因編碼L蛋白，RSV、APV、PIV或MPV的P基因編碼P蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定可用于組成從cDNA拯救hMPV所需聚合酶復(fù)合物的可能組合。某些實施方式優(yōu)化病毒增殖條件以產(chǎn)生可靠且產(chǎn)量高的細胞培養(yǎng)物(這有利于，例如制備本發(fā)明的候選病毒疫苗物)。可鑒定關(guān)鍵參數(shù)，首先用小規(guī)模實驗來測定可放大性、可靠性和重現(xiàn)性來優(yōu)化生產(chǎn)工藝，然后使該工藝適應(yīng)于病毒的大規(guī)模生產(chǎn)。在某些實施方式中，采用本發(fā)明方法增殖的病毒是hMPV。在某些實施方式中，采用本發(fā)明方法增殖的病毒是重組或嵌合型hMPV。在某些實施方式中，采用本發(fā)明方法增殖的病毒是以下病毒科之一的病毒腺病毒科、沙粒病毒科、星狀病毒科、桿狀病毒科、本揚病毒科、杯狀病毒科、花椰菜花葉病毒、冠狀病毒科、囊病毒科、纖絲病毒科、黃病毒科、肝DNA病毒科、皰疹病毒科、減毒病毒科、懸鉤子病毒屬、絲形病毒科、虹彩病毒科、光滑病毒科、脂毛病毒科、黃癥病毒屬、玉米退綠斑駁病毒屬(Machlomovirus)、玉米雷亞多非納病毒屬、微病毒科、肌病毒科、壞死病毒屬、羅達病毒科、正黏病毒科、乳多空病毒科、副黏病毒科、雙組分雙鏈RNA球狀真菌病毒屬、細小病毒科、藻DNA病毒科、小RNA病毒科、原生病毒科、短尾病毒科、多DNA病毒科、馬鈴薯丫病毒科(Potyviridae)、痘病毒科、呼腸孤病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、彈狀病毒科、歐防風(fēng)黃點病毒科、長尾噬菌體科、南方菜豆花葉病毒屬、蓋病毒科、纖細病毒屬、四病毒科、煙草花葉病毒、煙草脆裂病毒、披膜病毒科、蕃茄叢矮病毒科、單組分雙鏈RNA球狀真菌病毒屬、蘋果退綠葉斑病毒(Trichovirus)、單分子負鏈RNA病毒目。在某些實施方式中，采用本發(fā)明方法增殖的病毒是RNA病毒。在某些實施方式中，所述病毒不是皰疹病毒科的病毒。在某些實施方式中，所述病毒不是HSV。與標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)溫度相比，在某些實施方式中，用感興趣的病毒或病毒構(gòu)建物感染的細胞感染后在較低培育溫度下培育。在一具體實施方式中，在33。C或約33t:(例如，33±rc)培育用感興趣的病毒構(gòu)建物感染的細胞培養(yǎng)物。在某些實施方式中，感染后培育溫度是約25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C、32°C、33。C、34°C、35°C、36。C或37。C。在某些實施方式中，通過以下步驟增殖病毒病毒感染前將細胞在細胞生長的優(yōu)化溫度下培育，用病毒感染細胞后(即感染后)，將溫度調(diào)節(jié)到較低溫度。在某些實施方式中，所述溫度調(diào)節(jié)至少rC、2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°c、icrc、lrc或至少i2'c。在某些實施方式中，所述溫度調(diào)節(jié)最多rc、2°c、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、irc或最多12°C。在一具體實施方式中，所述溫度調(diào)節(jié)4t;。在某些實施方式中，感興趣的病毒或病毒構(gòu)建物感染前，用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，用病毒或病毒構(gòu)建物感染后用不含血清的培養(yǎng)基收集細胞。不用血清培養(yǎng)受感染細胞的更多細節(jié)見名為"回收無血清培養(yǎng)基中只含質(zhì)粒的病毒"的章節(jié)。在一具體實施方式中，所述血清是胎牛血清，其濃度為培養(yǎng)液體積的5%、培養(yǎng)液體積的2%或培養(yǎng)液體積的0.5%。在某些實施方式中，通過在無血清存在時培育受病毒感染的細胞來增殖病毒。在某些實施方式中，用含血清低于5%、低于2.5%、低于1%、低于0.1%、低于0.01%或低于0.001%的培養(yǎng)基培育受病毒感染的細胞來增殖病毒。在某些實施方式中，病毒感染前用含血清培養(yǎng)基培育細胞。在某些實施方式中，病毒感染細胞后，在無血清存在下培育細胞。在其它實施方式中，首先用含血清培養(yǎng)基培育細胞，然后將細胞轉(zhuǎn)移入無血清的培養(yǎng)基，再用病毒感染細胞，接著在無病毒存在下培育。在某些實施方式中，通過去除含血清培養(yǎng)基并加入無血清培養(yǎng)基而將細胞從含血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基中。在其它實施方式中，離心細胞，除去含血清培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基。在某些實施方式中，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞以確保細胞一旦感染了病毒即在無血清存在下培育。在某些更具體的實施方式中，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞至少一次、兩次、三次、四次、五次或至少十次。在還有其它實施方式中，用病毒或病毒構(gòu)建物感染前，在細胞生長的優(yōu)化溫度下用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，用感興趣的病毒構(gòu)建物感染細胞后，在較低溫度(與相應(yīng)的病毒或病毒載體的標(biāo)準(zhǔn)培育溫度相比)下培育細胞培養(yǎng)物。在一具體實施方式中，用感興趣的病毒構(gòu)建物感染細胞前，在37'C用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，用感興趣的病毒構(gòu)建物感染細胞后，在33。C或約33。C(例如，33士rC)培育細胞培養(yǎng)物。在其它實施方式中，用病毒或病毒構(gòu)建物感染前，在細胞生長的優(yōu)化溫度下用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，用感興趣的病毒構(gòu)建物感染細胞后，在較低溫度(與相應(yīng)的病毒或病毒載體的標(biāo)準(zhǔn)培育溫度相比)無血清存在下培育細胞培養(yǎng)物。在一具體實施方式中，用感興趣的病毒構(gòu)建物感染細胞前，在37"C用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，用感興趣的病毒構(gòu)建物感染細胞后，在33。C或約33t:(例如，33士rC)無血清存在下培育細胞培養(yǎng)物。可利用本發(fā)明的病毒構(gòu)建物和方法商品化生產(chǎn)病毒，例如用于疫苗生產(chǎn)。對于疫苗的商品化生產(chǎn)，優(yōu)選該疫苗宜只含有完全不含傳染性病毒或完全未污染病毒核酸的滅活病毒或病毒蛋白，或者宜含有不能回復(fù)毒力的減毒活疫苗。也應(yīng)避免在生產(chǎn)期間引入意外物質(zhì)而污染疫苗?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的大規(guī)模生產(chǎn)病毒或病毒蛋白的方法來商品化生產(chǎn)本發(fā)明疫苗。在一實施方式中，對于商品化生產(chǎn)本發(fā)明疫苗，用生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐培養(yǎng)細胞?？捎萌莘e從1升以下到ioo升以上的生物反應(yīng)器，例如Cyto3生物反應(yīng)器(Osmonics，Minnetonka，MN);NBS生物反應(yīng)器(NewBrunswickScientific,Edison，N丄)；禾卩B.BraunBiotechInternational(B.BraunBiotech,Melsungen，德國)的實驗室與商業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器。在另一實施方式中，在商品化生產(chǎn)此病毒之前進行小規(guī)模工藝優(yōu)化研究，選擇優(yōu)化條件并用于病毒的商品化生產(chǎn)。在無血清培養(yǎng)基中拯救質(zhì)粒在本發(fā)明的某些實施方式中，可不用輔助病毒回收病毒。更具體地說，可將編碼病毒基因組的質(zhì)粒和編碼復(fù)制和拯救所需病毒蛋白的質(zhì)粒引入細胞來回收病毒。在某些實施方式中，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)和維持細胞。在某些實施方式中，通過電穿孔將質(zhì)粒引入細胞。在一具體實施方式中，通過電穿孔將在T7啟動子控制下的編碼該病毒的反基因組cDNA的質(zhì)粒，在T7啟動子控制下的編碼T7RNA聚合酶的質(zhì)粒和分別編碼N蛋白、P蛋白和L蛋白的質(zhì)粒引入SFVero細胞。Vero細胞得自ATCC，按照以下步驟(MikeBerry實驗室開發(fā))使之適應(yīng)于在無血清培養(yǎng)基中生長。1.在T-25培養(yǎng)瓶P121中用DMEM+5%v/vFBS液融化ATCCCCL-81小管；2.用DMEM+5%v/vFBSP126擴增5代；3.將FBS培養(yǎng)的細胞直接轉(zhuǎn)移至T-225瓶的OptiPRO(InvitrogenCorporation)中；4.用OptiPRO擴增7代；5.冷凍第133-7代前原始細胞庫儲液(Pre-MasterCellBankStock);6.用OptiPRO擴增4代；7.冷凍第137代原始細胞庫儲液(MasterCellBankStock);8.用OptiPRO擴增4代；9.冷凍第141代工作細胞庫儲液(WorkingCellBankStock);和10.融化和擴增以進行電穿孔和病毒擴增。拯救病毒顆粒的方法描述于名為"拯救重組病毒顆粒"的章節(jié)。在某些實施方式中，用于病毒拯救的細胞是能在不用加入動物和人的組分下生長和/或維持的細胞。在某些實施方式中，用于病毒拯救的細胞是適應(yīng)于在無血清存在下生長的細胞。在一具體實施方式中，用SFVero細胞拯救病毒。在某些實施方式中，用補加了4mML-谷氨酰胺的OptiPROSFM(InvitrogenCorporation)培養(yǎng)和/或維持細胞。在某些實施方式中，用補加了血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，但對于拯救病毒顆粒，將此細胞轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基中。在一具體實施方式中，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞以確保在無血清環(huán)境拯救該病毒。通過技術(shù)人員己知可用于細胞的任何方法將質(zhì)粒引入細胞，例如通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、電穿孔或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(參見ShortProtocolsinMolecularBiology(《分子生物學(xué)簡單方法》)的第9章，Ausubel等(編)，JohnWiley&Sons,Inc.,1999)。在具體實施方式中，采用電穿孔將質(zhì)粒DNA引入細胞。SFVero細胞耐受脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。為選出轉(zhuǎn)染了所需質(zhì)粒的細胞，這些質(zhì)粒也可攜帶某些標(biāo)記。這種標(biāo)記包括但不限于對某些抗生素(例如，卡那霉素、殺稻瘟菌素、氨節(jié)西林、潮霉素B、嘌呤霉素和Zeocin)的抗性、對不含標(biāo)記時缺乏自養(yǎng)特性的細胞賦予該特性，或者標(biāo)記也可以是細胞生長所需的基因，但該基因在質(zhì)粒所引入的細胞中已突變。病毒基因組和/或病毒基因的轉(zhuǎn)錄在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。因此，編碼此病毒基因組或病毒蛋白的序列應(yīng)與啟動子序列操作性相連。本發(fā)明方法可利用技術(shù)人員已知的任何啟動子/RNA聚合酶系統(tǒng)。在某些實施方式中，所述啟動子可以是通過細胞的內(nèi)源性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動子，例如細胞的DNA依賴性RNA聚合酶，如RNA聚合酶I(PolI)或RNA聚合酶II(PolII)識別的啟動子序列。在某些實施方式中，所述啟動子可以是可誘導(dǎo)性啟動子。在某些實施方式中，所述啟動子可以是通過細胞的非內(nèi)源性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動子。在某些更具體的實施方式中，所述啟動子是T3啟動子、T7啟動子、SP6啟動子或CMV啟動子。依照所用啟動子的類型，也可將編碼識別該啟動子的RNA聚合酶的質(zhì)粒引入細胞以提供相應(yīng)的RNA聚合酶。在具體的實施方式中，所述RNA聚合酶是T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶或CMVRNA聚合酶。在一具體實施方式中，在T7啟動子控制下轉(zhuǎn)錄此病毒基因和病毒基因組，引入編碼T7RNA聚合酶的質(zhì)粒以提供T7RNA聚合酶。能在所用細胞類型中起作用的任何啟動子系統(tǒng)均可控制所述聚合酶的轉(zhuǎn)錄。一具體實施方式利用CMV啟動子。病毒基因組可以是正取向(plusorientation)或負取向(minusorientation)。因此，可從遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)錄病毒基因組產(chǎn)生病毒基因組的有義拷貝(反基因組拷貝)或病毒基因組的反義拷貝(基因組拷貝)。在某些實施方式中，所述病毒基因組是本發(fā)明的重組、嵌合型和/或減毒病毒。在某些實施方式中，如果病毒基因組的長度是六聚物，則可以提高病毒復(fù)制和拯救的效率。為確保病毒基因組的長度合適，可用核酶序列，包括丁型肝炎病毒(HDV)核酶序列、錘頭核酶序列或它們保留核酶催化活性的片段來限制其5'或3'端。在某些實施方式中，復(fù)制和拯救所需的病毒蛋白包括N、P和L基因(的蛋白)。在某些更具體的實施方式中，復(fù)制和拯救所需的病毒蛋白包括N、P、M2-l和L基因(的蛋白)。5.7重組病毒的減毒可進一步遺傳改造本發(fā)明重組病毒使其成為減毒表型。具體地說，本發(fā)明重組病毒在給予此病毒疫苗的對象中顯示為減毒表型。可通過技術(shù)人員已知的任何方法實現(xiàn)減毒。不想局限于理論，可通過，例如使用在預(yù)期宿主中天然復(fù)制不佳的病毒(例如，在人中使用APV)，或與該病毒的野生型毒株相比，通過降低病毒基因組復(fù)制的能力，降低病毒感染宿主細胞的能力，降低病毒蛋白裝配成傳染性病毒顆粒的能力來獲得重組病毒的減毒表型。可采用微小基因組試驗(minigenomeassay)(參見章節(jié)5.8)檢測病毒的某些序列，例如前導(dǎo)序列和尾序列的存活力?？舍娪眉夹g(shù)人員已知的任何方法檢測本發(fā)明重組病毒的減毒表型(參見，例如章節(jié)5.S)。例如，可檢測候選病毒感染宿主細胞的能力或在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中復(fù)制的速率。在某些實施方式中，當(dāng)改變的基因是N、P、L、M2、F、G、M2-l、M2-2基因或它們的組合時，可使用小基因組系統(tǒng)檢驗減毒病毒。在某些實施方式中，利用不同溫度的生長曲線檢驗病毒的減毒表型。例如，減毒病毒能在35'C但不能在39。C或4(TC生長。在某些實施方式中，可用不同細胞系評估病毒的減毒表型。例如，減毒病毒只能在猴細胞系中而不能在人細胞系中生長，或者減毒病毒在不同細胞系中可達到的病毒滴度不同。在某些實施方式中，利用病毒在小動物模型(包括但不限于倉鼠、棉鼠、小鼠和豚鼠)的呼吸道中的復(fù)制(情況)評估病毒的減毒表型。在其它實施方式中，利用病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，包括但不限于抗體滴度(例如，通過噬斑減少中和試驗或ELISA來測試)評估病毒的減毒表型。在一具體實施方式中，以低劑量進行噬斑減少中和試驗或ELISA。在某些實施方式中，可檢驗重組病毒在動物模型中引發(fā)病理學(xué)癥狀的能力。病毒在動物模型系統(tǒng)中引發(fā)病理學(xué)癥狀的能力降低表明其為減毒表型。在一具體實施方式中，在猴子模型中利用粘液產(chǎn)量指標(biāo)，檢驗候選病毒的鼻部感染(情況)?？墒贡景l(fā)明病毒減毒，從而削弱該病毒的一種或多種功能特征。在某些實施方式中，與產(chǎn)生該減毒病毒的病毒的野生型毒株作比較來檢測減毒(情況)。在其它實施方式中，通過比較減毒病毒在不同宿主系統(tǒng)中的生長來測定減毒(情況)。因此，對于非限制性例子，如果與APV在人宿主中的生長相比于在禽類宿主中生長減緩時，APV可稱為減毒的。在某些實施方式中，本發(fā)明的減毒病毒能感染宿主，能在宿主中復(fù)制從而能產(chǎn)生傳染性病毒顆粒。然而，與野生型毒株相比，減毒毒株生長達到的滴度較低或生長較慢?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何技術(shù)測定減毒病毒的生長曲線并將其與野生型病毒的生長曲線比較。對于示范性方法可參見下文的實施例章節(jié)。在一具體實施方式中，減毒病毒在如實施例22所述的條件下在Vero細胞中生長達到的滴度小于105pfu/ml、小于l()4pfu/ml、小于103pfu/ml或小于102pfu/ml。在某些實施方式中，本發(fā)明減毒的病毒(例如，嵌合型哺乳動物MPV)不能在人細胞中復(fù)制，而野生型病毒(例如，野生型哺乳動物MPV)可以。然而，該減毒的病毒在缺乏干擾素的細胞系，例如Vero細胞中復(fù)制良好。在其它實施方式中，本發(fā)明的減毒病毒能感染宿主、能在宿主中復(fù)制、能將本發(fā)明病毒的蛋白質(zhì)插入胞質(zhì)膜中，但該減毒病毒不能導(dǎo)致宿主產(chǎn)生新的傳染性病毒顆粒。在某些實施方式中，該減毒病毒感染宿主、在宿主中復(fù)制和將病毒蛋白插入宿主的胞質(zhì)膜中的效率與野生型哺乳動物病毒相同。在其它實施方式中，與野生型病毒相比，減毒病毒將病毒蛋白插入宿主細胞的胞質(zhì)膜中的能力降低。在某些實施方式中，與野生型病毒相比，減毒的哺乳動物病毒在宿主中復(fù)制的能力降低。可采用技術(shù)人員已知的任何技術(shù)測定病毒是否能感染哺乳動物細胞、在宿主中復(fù)制和將病毒蛋白插入宿主的胞質(zhì)膜中。示范性方法見章節(jié)5.8。在某些實施方式中，本發(fā)明的減毒病毒能感染宿主。然而，與野生型哺乳動物MPV相反，該減毒的哺乳動物MPV不能在宿主中復(fù)制。在一具體實施方式中，該減毒的哺乳動物病毒能感染宿主，能導(dǎo)致宿主將病毒蛋白插入其胞質(zhì)膜中，但該減毒病毒不能在宿主中復(fù)制?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何方法檢驗減毒的哺乳動物MPV是否已感染哺乳動物細胞、是否已導(dǎo)致宿主將病毒蛋白插入其胞質(zhì)膜中。在某些實施方式中，與野生型病毒感染宿主相比，該減毒的哺乳動物病毒感染同一宿主的能力降低?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何技術(shù)測定病毒是否能感染宿主。示范性方法見章節(jié)5.8。在某些實施方式中，將突變(例如，錯義突變)引入病毒基因組以產(chǎn)生具有減毒表型的病毒。可將突變(例如，錯義突變)引入該重組病毒的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因中。突變可以是添加、取代、缺失或它們的組合。在具體的實施方式中，在N、P、L、F、G、M2-l、M2-2或M2蛋白中引入單氨基酸缺失突變，采用微小基因組試驗系統(tǒng)(mini-genomeassaysystem)篩選具有功能非突變，并評估其在病毒中的預(yù)期功能。在更具體的實施方式中，所述錯義突變是冷敏感突變。在其它實施方式中，所述錯義突變是熱敏感突變。一個實施方式除去了該病毒P蛋白的主要磷酸化位點。在另一實施方式中，將一個或多個突變引入該病毒的L-基因中產(chǎn)生溫度敏感性毒株。在還有另一實施方式中，使F基因的切割位點發(fā)生突變使得不能發(fā)生切割或效率非常低。在某些更具體的實施方式中，使hMPVF蛋白的氨基酸位置99-102的氨基酸序列RQSR的基序發(fā)生突變。突變可以是(但不限于)一個或多個氨基酸缺失、一個或多個氨基酸添加、一個或多個氨基酸取代(保守性或非保守性)或它們的組合。在hMPV的一些毒株中，所述切割位點是RQPR(參見實施例"P101S")。在某些實施方式中，使切割位點的氨基酸序列RQPR發(fā)生突變。在更具體的實施方式中，使hMPVF蛋白的切割位點發(fā)生突變而降低hMPV的感染力。在某些實施方式中，hMPV感染力降低的因數(shù)至少是5、10、50、100、500、103、5X103、104、5X104、105、5X1()S或至少106。在某些實施方式中，hMPV感染力降低的因數(shù)最多是5、10、50、100、500、103、5X103、104、5X104、105、5乂105或最多106。在其它實施方式中，在該重組病毒的基因組中引入缺失。在更具體的實施方式中，可在該重組病毒中引入N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因缺失。在具體的實施方式中，本發(fā)明重組病毒缺失M2-基因。在其它具體實施方式中，本發(fā)明重組病毒缺失SH-基因。在還有另一具體實施方式中，M2-基因和SH-基因均缺失。某些實施方式改變重組病毒的基因間區(qū)域。一個實施方式改變基因間區(qū)域的長度。在另一實施方式中，此基因間區(qū)域從病毒基因組的5'改組到3'端。其它實施方式改變重組病毒的一個或多個基因在基因組中的位置。在一個實施方式中，F(xiàn)或G基因移到基因組的3'端。在另一實施方式中，將N基因移到基因組的5'端。某些實施方式用不同種(例如，RSV、APV、PIV3或小鼠肺病毒)、不同亞群或不同變體病毒的同類基因替換野生型病毒的基因而實現(xiàn)該病毒的減毒。在示范性實施方式中，分別用APV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因替換哺乳動物MPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因。在其它示范性實施方式中，分別用哺乳動物MPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因替換APV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因。在一優(yōu)選的實施方式中，用不同種病毒的基因替換一個或多個聚合酶相關(guān)基因(例如，N、P、L或M2)來實現(xiàn)病毒的減毒。在某些實施方式中，用源自不同種病毒的相應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)域替換野生型病毒蛋白的一個或多個特定結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)該病毒的減毒。在一示范性實施方式中，用哺乳動物MPVF蛋白的胞外域替換APVF蛋白的胞外域。在一優(yōu)選的實施方式中，用源自不同種病毒的相應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)域替換L、N或P蛋白的一個或多個特定結(jié)構(gòu)域。某些其它實施方式通過刪除野生型病毒蛋白的一個或多個特定結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)該病毒的減毒。一具體實施方式刪除了F-蛋白的跨膜區(qū)。在本發(fā)明的某些實施方式中，可修飾本發(fā)明重組病毒的前導(dǎo)序列和/或尾序列以獲得減毒表型。在某些更具體的實施方式中，與野生型病毒相比，將所述前導(dǎo)序列和/或尾序列的長度減短至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸或至少6個核苷酸。在某些更具體的其它實施方式中，使該重組病毒的前導(dǎo)序列和/或尾序列發(fā)生突變。在一具體實施方式中，前導(dǎo)序列和尾序列彼此100%互補。在其它實施方式中，前導(dǎo)序68列和尾序列有l(wèi)個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸或IO個核苷酸彼此不互補，而其余核苷酸彼此互補。在某些實施方式中，不互補的核苷酸彼此相同。在某些實施方式中，不互補的核苷酸彼此不同。在其它實施方式中，如果尾序列中不互補的核苷酸是嘌呤，則前導(dǎo)序列中的相應(yīng)核苷酸也是嘌呤。在其它實施方式中，如果尾序列中不互補的核苷酸是嘧啶，則前導(dǎo)序列中相應(yīng)的核苷酸也是嘌呤。在本發(fā)明的某些實施方式中，可用以下序列替換本發(fā)明重組病毒的前導(dǎo)序列和/或尾序列另一病毒的前導(dǎo)序列和/或尾序列，例如RSV、APV、PIV3、小鼠肺病毒的引導(dǎo)序列和/或尾序列，或者與產(chǎn)生該重組病毒蛋白質(zhì)編碼部分的人偏肺病毒不同亞群或變體的人偏肺病毒的前導(dǎo)序列和/或尾序列。使用減毒的活疫苗也必須考慮安全性。疫苗必須不會致病。本發(fā)明可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備安全疫苗。除了減毒技術(shù)外，可采用其它技術(shù)。一個非限制性例子是利用不能摻入病毒體膜中的可溶性異源基因。例如，可利用可溶性RSVF基因的單拷貝，即缺乏跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)的RSV基因形式。由于它不能摻入病毒體膜中，預(yù)計不會改變該病毒的嗜性?？刹捎酶鞣N試驗檢驗疫苗的安全性。參見下文的章節(jié)5.8。具體地說，可采用蔗糖梯度和中和試驗來檢驗安全性?？舍娪谜崽翘荻仍囼灉y定異源蛋白質(zhì)是否插入病毒體中。如果該異源蛋白插入到病毒體中，則應(yīng)檢驗該病毒體是否能導(dǎo)致癥狀，即使親代毒株不導(dǎo)致癥狀。不想局限于理論，如果該異源蛋白摻入病毒體中，該病毒可能獲得新的致病性能。某些實施方式刪除了hMPV基因組的一個或多個基因以產(chǎn)生減毒病毒。更具體的實施方式中刪除了M2-2ORF、M2-lORF、M2基因、SH基因和/或G2基因。在其它實施方式中，將少量單氨基酸缺失引入?yún)⑴c病毒復(fù)制的基因中以產(chǎn)生減毒病毒。在更具體的實施方式中，將少量單氨基酸缺失引入N、L或P基因中。在某些更具體的實施方式中，重組hMPV的L基因(編碼的蛋白)中發(fā)生一個或多個以下氨基酸突變，從而產(chǎn)生減毒病毒氨基酸位置456的Phe、氨基酸位置749的Glu、氨基酸位置1246的Tyr、氨基酸位置1094的Met和氨基酸位置746的Lys。突變可以是，例如氨基酸缺失或取代。氨基酸取代可以是保守性氨基酸取代或非保守性氨基酸取代。保守性氨基酸替換的示范性例子是能維持這些氨基酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)和/或功能特性的氨基酸取代，例如芳族氨基酸取代另一芳族氨基酸、酸性氨基酸取代另一酸性氨基酸、堿性氨基酸取代另一堿性氨基酸和脂族氨基酸取代另一脂族氨基酸。相反，非保守性氨基酸替換是不能維持這些氨基酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)和/或功能特性的氨基酸取代，例如芳族氨基酸取代堿性、酸性或脂族氨基酸，酸性氨基酸取代芳族、堿性或脂族氨基酸，堿性氨基酸取代酸性、芳族或脂族氨基酸和脂族氨基酸取代芳族、酸性或堿性氨基酸。在甚至更具體的實施方式中，Leu替代氨基酸位置456的Phe。在某些實施方式中，取代一個核酸以編碼氨基酸更換。在其它實施方式中，取代兩個或三個核酸以編碼一個氨基酸更換。優(yōu)選取代兩個或三個核酸以降低回復(fù)成野生型蛋白質(zhì)序列的風(fēng)險。在其它實施方式中，將少量單氨基酸缺失引入?yún)⑴c病毒裝配的基因中以產(chǎn)生減毒的病毒。在更具體的實施方式中，將少量單氨基酸缺失引入M基因或M2基因中。在優(yōu)選的實施方式中，M基因發(fā)生突變。在其它實施方式中，病毒基因組中的基因順序與野生型病毒的基因順序相比發(fā)生改變，從而產(chǎn)生了減毒的病毒。在一更具體的實施方式中，F(xiàn)、SH禾n/或G基因移到病毒基因組的3'端。在另一實施方式中，N基因移到病毒基因組的5'端。在其它實施方式中，一個或多個基因起始位點(基因起始位點的位置參見，例如表8)發(fā)生突變，或者用另一病毒(例如RSV、PIV3、APV或小鼠肺病毒)或與產(chǎn)生該重組病毒的蛋白質(zhì)編碼部分的人偏肺病毒不同亞群或變體的人偏肺病毒的相似基因起始位點取代。在更具體的實施方式中，使N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和/或L-基因的基因起始位點發(fā)生突變，或用另一病毒(例如RSV、PIV3、APV或小鼠肺病毒)或與產(chǎn)生該重組病毒的蛋白質(zhì)編碼部分的人偏肺病毒不同亞群或變體的人偏肺病毒的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因分別取代。5.7.1通過取代病毒基因的減毒本發(fā)明的某些實施方式通過用不同病毒、不同毒株或不同病毒分離物的相類似基因替代病毒的一個或多個基因來實現(xiàn)減毒。在某些實施方式中，用另一種副黏病毒的一個或多個同類基因取代偏肺病毒，例如哺乳動物偏肺病毒(如hMPV或APV)的一個或多個基因。在一更具體的實施方式中，用另一病毒種類、毒株或分離物的相似基因替代哺乳動物偏肺病毒，例如hMPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-2ORF、SH-基因、G-基因或L-基因或這些基因中兩個或多個的任何組合，其中所述其它病毒種類可以是但不限于另一種哺乳動物偏肺病毒、APV或RSV。在更具體的實施方式中，用人偏肺病毒的另一分離物的一個或多個相似基因替代人偏肺病毒的一個或多個基因。例如，用不同分離物，如NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的相似基因或基因組合(即N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-2ORF、SH-基因、G-基因或L-基因)替代分離物NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-2ORF、SH-基因、G-基因或L-基因或這些基因中兩個或多個的任何組合。在某些實施方式中，用不同病毒種類、毒株或分離物基因組的相似區(qū)域替代病毒基因組的一個或多個區(qū)域。在某些實施方式中，所述區(qū)域是該病毒基因組編碼區(qū)中的區(qū)域。在其它實施方式中，所述區(qū)域是該病毒基因組的非編碼區(qū)中的區(qū)域。在某些實施方式中，如果兩個病毒的兩個區(qū)域支持該兩病毒的相同或相似功能，則兩病毒的該兩區(qū)域彼此相似。在某些其它實施方式中，如果兩種病毒的兩個區(qū)域提供該兩病毒中相同或相似的結(jié)構(gòu)元件，則兩病毒的該兩區(qū)域相似。在更具體的實施方式中，如果兩個區(qū)域編碼兩病毒中相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，則該兩區(qū)域相似，其中相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域是具有相同或相似功能和/或結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域。在某些實施方式中，用另一種副黏病毒基因組的一個或多個相似區(qū)域替代偏肺病毒，例如哺乳動物偏肺病毒(如hMPV或APV)基因組的一個或多個區(qū)域。在某些實施方式中，用哺乳動物偏肺病毒(如hMPV或APV)基因組的一個或多個相似區(qū)域替代副黏病毒基因組的一個或多個區(qū)域。在更具體的實施方式中，用另一病毒種類、毒株或分離物的相似區(qū)域替代哺乳動物偏肺病毒，例如hMPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-2ORF、SH-基因、G-基因或L-基因區(qū)域或這些基因的兩個或多個區(qū)域的任何組合，其中所述其它病毒種類可以是但不限于另一種哺乳動物偏肺病毒、APV或RSV。在更具體的實施方式中，用人偏肺病毒的另一分離物的相似區(qū)域替代人偏肺病毒的一個或多個區(qū)域。例如，用hMPV的不同分離物，如NL/1/99(99-l)、NL/l/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的相似區(qū)域替代分離物NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-2ORF、SH-基因、G-基因或L-基因的一個或多個區(qū)域或兩個或多個區(qū)域的任何組合。在某些實施方式中，所述區(qū)域的長度為至少5個核苷酸(nt)、至少10nt、至少25nt、至少50nt、至少75nt、至少100nt、至少250nt、至少500nt、至少750nt、至少1kb、至少1.5kb、至少2kb、至少2.5kb、至少3kb、至少4kb或至少5kb。在某些實施方式中，所述區(qū)域的長度為最多5個核苷酸(nt)、最多10nt、最多25nt、最多50nt、最多75nt、最多100nt、最多250nt、最多500nt、最多750nt、最多1kb、最多1.5kb、最多2kb、最多2.5kb、最多3kb、最多4kb或最多5kb。5.8本發(fā)明所用的試驗按照本發(fā)明，可釆用許多試驗來測定嵌合型或重組病毒在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、動物模型系統(tǒng)或?qū)ο笾械纳L速率。按照本發(fā)明，也可采用許多試驗來確定嵌合型和重組病毒實現(xiàn)感染、復(fù)制和病毒體包裝的要求?？刹捎帽疚乃龅脑囼瀬黼S時間檢驗病毒滴度以確定病毒的生長特征。在一具體實施方式中，通過獲得感染細胞或感染對象的樣品、制備該樣品的一系列稀釋液和用能產(chǎn)生單個噬斑的病毒稀釋液感染對該病毒易感的單層細胞來測定病毒滴度。然后可計數(shù)噬斑，病毒滴度表示為每毫升樣品的噬斑形成單位。.在本發(fā)明一具體的實施方式中，根據(jù)對象中抗該病毒抗體的滴度來估計本發(fā)明病毒在對象中的生長速率。不想局限于理論，對象中的抗體滴度不只反映對象中的病毒滴度，也反映其抗原性。如果該病毒的抗原性恒定，可利用對象中抗體滴度的升高來測定該病毒在對象中的生長曲線。在一優(yōu)選實施方式中，最好通過在感染后的多個時間點取得宿主的生物學(xué)液體樣品和檢測病毒滴度來檢驗該病毒在動物或人中的生長速率?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何技術(shù)測定細胞培養(yǎng)系統(tǒng)或?qū)ο笾挟愒椿蛐蛄械谋磉_。在某些實施方式中，通過定量測定轉(zhuǎn)錄物水平來檢測異源基因的表達?？衫棉D(zhuǎn)錄物的特異性探針或引物通過Northern印跡分析或RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄物水平。因為該病毒是反義取向而轉(zhuǎn)錄物是有義取向，故可以區(qū)分該病毒的轉(zhuǎn)錄物和基因組。在某些實施方式中，通過定量測定異源基因的蛋白產(chǎn)物水平來檢測該異源基因的表達?？衫玫鞍踪|(zhì)的特異性抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測蛋白質(zhì)水平。在一具體實施方式中，該異源基因帶有肽標(biāo)簽?？衫每闺臉?biāo)簽的抗體檢測該肽標(biāo)簽。所檢測的肽標(biāo)簽水平代表了該異源基因表達的蛋白質(zhì)水平?；蛘撸衫秒臉?biāo)簽分離該異源基因表達的蛋白質(zhì)。純化蛋白質(zhì)的量與該異源基因的表達水平相關(guān)。本領(lǐng)域熟知這種肽標(biāo)簽和分離與這種肽標(biāo)簽相融合的蛋白質(zhì)的方法?？衫帽绢I(lǐng)域己知的各種肽標(biāo)簽修飾該異源基因，所述肽標(biāo)簽是例如但不限于免疫球蛋白恒定區(qū)、多組氨酸序列(Petty,1996，Metal-chelateaffinitychromatography("金屬螯合親和層析")，刊于CurrentProtocolsinMolecularBiology(《最新分子生物學(xué)方法》)，第1-3巻，(1994-1998)，Ausubel，F(xiàn).M.，Brent,R.，Kunston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith,J.A.和Struhl，K.編,JohnWileyandsons，Inc.出版，美國，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST;Smith,1993，MethodsMol.CellBio.4:220-229)、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(Guan等，1987，Gene67:21-30)、各種纖維素的結(jié)合功能域(美國專利5,496,934;5,202,247;5,137,819;Tomme等，1994，ProteinEng.7:117-123)和FLAG表位(ShortProtocolsinMolecularBiology(《分子生物學(xué)簡單方法》)，1999，Ausubel等編，JohnWiley&Sons,Inc.,第10.11單元)等。特異性結(jié)合伴侶能識別其它肽標(biāo)簽，因而促進了通過與結(jié)合伴侶發(fā)生親和力結(jié)合而分離，該結(jié)合伴侶優(yōu)選固定和/或位于固體支持物上。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，可采用許多方法獲得上述肽標(biāo)簽的編碼區(qū)，包括但不限于DNA克隆、DNA擴增和合成方法。一些肽標(biāo)簽和檢測及分離它們的試劑可商品化購得?？赏ㄟ^技術(shù)人員已知的任何方法獲得對象的樣品。在某些實施方式中，所述樣品包括鼻抽吸物、咽喉拭子、痰或支氣管肺泡灌洗液。5.8.1小復(fù)制子構(gòu)建物從cDNA產(chǎn)生活病毒為表征hMPV，也為產(chǎn)生減毒的疫苗毒株和免疫原性化合物提供了方法。為實現(xiàn)此目的，可利用編碼含報道基因的vRNA的cDNA或小73復(fù)制子構(gòu)建物來拯救病毒，也可用于鑒定參與RNA擴增、表達和摻入病毒體的核苷酸序列和蛋白質(zhì)。本發(fā)明可使用技術(shù)人員已知的任何報道基因(參見章節(jié)5.8.2)。例如，可用的報道基因包括但不限于編碼GFP、HRP、LUC和AP的基因(報道基因的例子的更廣泛清單也參見章節(jié)5.8.2)。在一具體實施方式中，所用的報道基因編碼CAT。在本發(fā)明另一具體實施方式中，報道基因側(cè)接前導(dǎo)序列和尾序列。可用于側(cè)接報道基因的前導(dǎo)序列和尾序列可以是負義病毒，包括但不限于MPV、RSV和APV。例如，報道基因可側(cè)接與丁肝核酶(Hep-dRibo)和T7聚合酶終止(T-T7)信號相連的負義hMPV或APV的前導(dǎo)序列，所述hMPV或APV尾序列之前是T7RNA聚合酶啟動子。某些實施方式將編碼小復(fù)制子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入宿主細胞。在本發(fā)明一更具體的實施方式中，在表達T7RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2.1基因的宿主細胞中拯救hMPV。某些實施方式用編碼T7RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2.1基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞。其它實施方式將編碼小復(fù)制子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入宿主細胞并用輔助病毒感染該宿主細胞?？墒褂迷S多聚合酶(包括但不限于物種間和物種內(nèi)聚合酶)拯救hMPV小復(fù)制子。在某些實施方式中，在表達hMPV復(fù)制所需的最小復(fù)制單位的宿主細胞中拯救hMPV小復(fù)制子。例如，可用許多聚合酶，包括但不限于RSV、APV、MPV或PIV的聚合酶從cDNA拯救hMPV。在本發(fā)明一具體實施方式中，使用RNA病毒的聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明一更具體的實施方式中，使用負鏈RNA病毒的聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明甚至更具體的實施方式中，使用RSV聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明另一實施方式中，使用APV聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明還有另一實施方式中，使用MPV聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明另一實施方式中，使用PIV聚合酶拯救hMPV。在本發(fā)明另一實施方式中，使用hMPV聚合酶蛋白的復(fù)合物從cDNA拯救hMPV。例如，可用含L、P、N和M2-1蛋白的聚合酶復(fù)合物拯救hMPV小復(fù)制子。在本發(fā)明另一實施方式中，所述聚合酶復(fù)合物包含L、P和N蛋白。在本發(fā)明還有另一實施方式中，可用含其它病毒(例如但不限于RSV、PIV和APV)的聚合酶蛋白的聚合酶復(fù)合物從cDNA拯救hMPV。具體地說，可用含RSV、PIV或APV的L、P、N和M2-l蛋白的聚合酶復(fù)合物拯救hMPV小復(fù)制子。在本發(fā)明還有另一實施方式中，用于拯救hMPV小復(fù)制子的聚合酶復(fù)合物可含RSV、PIV或APV的L、P和N蛋白。在本發(fā)明另一實施方式中，可利用各種病毒的不同聚合酶組成此聚合酶復(fù)合物。在這種實施方式中，用于拯救hMPV小復(fù)制子的聚合酶可由RSV、PIV或APV聚合酶的不同組分構(gòu)成。例如(不表示限制可能的組合)，構(gòu)成復(fù)合物時，RSV、APV或PIV的N基因編碼N蛋白，而RSV、APV或PIV的L基因編碼L蛋白，RSV、APV或PIV的P基因編碼P蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定可用于構(gòu)成拯救hMPV小復(fù)制子所需的聚合酶復(fù)合物的可能組合。為確認(rèn)是否成功拯救了該病毒并表征該病毒，可檢測小復(fù)制子系統(tǒng)中的報道基因表達?？舍娪眉夹g(shù)人員已知的任何方法檢驗報道基因的表達水平和/或其活性，例如但不限于章節(jié)5.8.2所述的。在某些更具體的實施方式中，所述小復(fù)制子含有按照所列順序的以下元件T7RNA聚合酶或RNA聚合酶I、前導(dǎo)序列、基因起始點、GFP、尾序列、丁肝核酶或RNA聚合酶I終止序列。如果T7用作RNA聚合酶，丁肝核酶序列應(yīng)用作終止序列。如果使用RNA聚合酶I，RNA聚合酶I終止序列可用作終止信號。根據(jù)拯救系統(tǒng)，小復(fù)制子的序列可以是有義或反義取向。在某些實施方式中，與hMPV的野生型前導(dǎo)序列相比，可修飾前導(dǎo)序列。該前導(dǎo)序列前任選含有AC。T7啟動子序列可含有或不含G-雙聯(lián)體或三聯(lián)體，這種G-雙聯(lián)體或三聯(lián)體可增強轉(zhuǎn)錄。在一具體實施方式中，細胞在TO時感染hMPV。24小時后，用小復(fù)制子構(gòu)建物轉(zhuǎn)染該細胞。T0后第48小時和T0后第72小時，檢驗細胞中報道基因的表達。如果使用熒光報道基因產(chǎn)物(例如，GFP)，可采用FACS檢驗報道基因的表達。在另一實施方式中，在T=0時用6種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。然后在T=40小時和T=60小時收集細胞并分析CAT或GFP表達。在另一具體實施方式中，在T0時用MVA-T7轉(zhuǎn)染細胞。1小時后(T1時)，用小復(fù)制子構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細胞。TO后第24小時，用hMPV感染該細胞。TO后第72小時檢驗細胞中報道基因的表達。如果用熒光報道基因產(chǎn)物(例如，GFP)，可釆用FACS檢驗報道基因的表達。5.8.2報道基因在某些實施方式中，本發(fā)明方法可采用檢測組織培養(yǎng)物或動物模型中報道基因表達的試驗。將報道基因的核苷酸序列克隆入病毒，例如APV、hMPV、hMPV/APV或APV/hMPV，其中(i)改變報道基因的位置和(ii)改變側(cè)接該報道基因的基因間區(qū)域的長度。檢驗不同組合來確定報道基因的最佳表達速率和含報道基因的病毒的最佳復(fù)制速率。在某些實施方式中，制備含報道基因的小復(fù)制子構(gòu)建物。小復(fù)制子構(gòu)建物如本文所述構(gòu)建?？刹捎眉夹g(shù)人員己知的任何技術(shù)測定報道基因產(chǎn)物的豐度。這種技術(shù)包括但不限于分別利用所述報道基因的特異性探針或抗體作Northern印跡分析或蛋白質(zhì)印跡分析。在某些實施方式中，報道基因發(fā)射可用FACS檢測的熒光信號。FACS可用于檢測表達了報道基因的細胞。除非另有指出，實施本發(fā)明具體方面的技術(shù)可采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA操作及生產(chǎn)的常規(guī)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)實施這些技術(shù)。參見，例如Sambrook等，Molecularcloning,alaboratorymanual(《分子克隆，實驗室手冊》)，第二版，第l-3巻，(冷泉港實驗室，1989)，一本實驗室手冊，第二版；DNACloning(《DNA克隆》)，第I和II巻，(Glover編，1985);和TranscriptionandTranslation(《轉(zhuǎn)錄和翻譯》)，(Hames和Higgins編，1984)。報道基因產(chǎn)物的生物化學(xué)活性代表了報道基因的表達水平。報道基因活性的總水平也取決于本發(fā)明重組病毒的復(fù)制速率。因此，為確定重組病毒的報道基因的真實表達水平，應(yīng)將細胞培養(yǎng)物或動物模型中的總表達水平除以重組病毒的滴度。本發(fā)明方法所用的報道基因包括但不限于下表4所列的基因表4:報道基因和各報道基因產(chǎn)物的生物化學(xué)特性:報道基因蛋白質(zhì)活性與檢測CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)將放射性乙?；D(zhuǎn)移至氯霉素或用薄層層析和放射自顯影法檢測GAL(b-半乳糖苷酶)水解無色的半乳糖產(chǎn)生有色產(chǎn)物GUS(b-葡糖苷酸酶)水解無色的葡糖苷酸產(chǎn)生有色產(chǎn)物L(fēng)UC(螢光素酶)氧化熒光素，發(fā)射光子GFP(綠色熒光蛋白)無底物的熒光蛋白報道基因蛋白質(zhì)活性與檢測SEAP(分泌的堿性磷酸酶)與合適的底物或與產(chǎn)生生色團的底物進行發(fā)光反應(yīng)HRP(辣根過氧化物酶)在有氫氧化物(hydrogenoxide)存在下，氧化3,3',5，5'-四甲基聯(lián)苯胺形成有色復(fù)合物AP(堿性磷酸酶)與合適的底物或與產(chǎn)生生色團的底物進行發(fā)光反應(yīng)可通過蛋白質(zhì)印跡分析或Northem印跡分析或用于定量測定核苷酸序列轉(zhuǎn)錄、其mRNA和其蛋白豐度的任何其它技術(shù)檢測報道基因的豐度(參見ShortProtocolsinMolecularBiology(《分子生物學(xué)的簡單方法》)，Ausubel等編，JohnWiley&Sons,Inc.,第四版，1999)。某些實施方式中測定的報道基因產(chǎn)物活性為重組病毒的報道基因表達的讀出值(readout)。可利用報道基因產(chǎn)物的生物化學(xué)特征來定量測定報道基因產(chǎn)物的活性(參見表4)。技術(shù)人員熟知檢測報道基因產(chǎn)物的生物化學(xué)活性的方法。本發(fā)明方法可用的示范性報道基因的更詳細描述如下所示。5.8.3檢測感染發(fā)生率可通過本領(lǐng)域熟知的任何方法測定感染發(fā)生率，例如但不限于可分別利用抗-APV-抗原的抗體、抗-hMPV-抗原的抗體、抗-APV-抗原的抗體和/或抗該異源核苷酸序列基因產(chǎn)物的特異性抗體，通過免疫熒光試驗(IFA)檢驗臨床樣品(如鼻拭子)中是否存在本發(fā)明病毒。在某些實施方式中，可直接加工含完整細胞的樣品，而對于不含完整細胞的分離物應(yīng)首先用允許細胞系(例如，HEp-2細胞)培養(yǎng)。在一示范性實施方式中，應(yīng)離心(例如室溫下，300Xg，5分鐘)以澄清培養(yǎng)的細胞混懸液，然后在同一條件下用PBS，pH7.4(無Ca十+和Mg++)洗滌。將細胞沉淀物重懸在小體積PBS中用于分析。將含完整細胞的原始臨床分離物與PBS混合，室溫下以300Xg離心5分鐘。用無菌移液管吸頭除去界面的粘液，在同一條件下用PBS洗滌細胞沉淀物多次。然后將沉淀物重懸在小體積PBS中用于分析。在丙酮洗滌的12-孔HTC超硫化(supercured)載玻片的每個5mm孔上點樣5-10微升各細胞混懸液，風(fēng)干。用冷(-20")丙酮固定載玻片10分鐘。向各孔加入PBS-l。/c)BSA阻斷反應(yīng)，然后在室溫下培育10分鐘。用PBS-0.1。/。吐溫-20洗滌載玻片三次，風(fēng)干。每孔加入用封閉緩沖液稀釋至250ng/ml的10微升各第一抗體試劑，反應(yīng)物在加濕的37。C環(huán)境中培育30分鐘。然后用PBS-0.1。/。吐溫-20更換洗滌載玻片三次，風(fēng)干。每孔中加入用封閉緩沖液稀釋至250ng/ml的10微升合適的第二抗體試劑，反應(yīng)物在加濕的37'C環(huán)境中再培育30分鐘。然后用PBS-0.1%吐溫-20更換洗滌載玻片三次。每個反應(yīng)孔中加入5微升PBS-50。/。甘油-10mMTrispH8.0-1mMEDTA。給載玻片加上蓋玻片。然后用熒光顯微鏡的B-2A濾鏡(EX450-490nm)放大200倍分析各反應(yīng)孔。根據(jù)未染色細胞或只用第二抗體試劑染色的細胞自發(fā)熒光(autofluorescent)背景對陽性反應(yīng)評分。陽性反應(yīng)的特征為受感染細胞的胞質(zhì)中小包涵體發(fā)出標(biāo)點狀鮮明熒光。5.8.4檢測血清滴度可采用本領(lǐng)域熟知的方法測定血清抗體滴度，例如但不限于可通過夾心ELISA定量測定血清樣品中抗體或抗體片段的含量。簡言之，ELISA包括用能識別血清中的抗體或抗體片段的抗體包被微量滴定板，4°〇過夜。然后在室溫用PBS-吐溫-0.5。/。BSA封閉各板約30分鐘。使用以PBS-吐溫-BSA稀釋的純化抗體或抗體片段和以PBS-BSA稀釋的樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入試驗平板的雙復(fù)孔中，在室溫培育約1小時。然后在室溫用PBS-吐溫洗去未結(jié)合的抗體，用標(biāo)記的第二抗體(例如，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗-他IgG)處理結(jié)合的抗體約1小時。加入該標(biāo)記物的特異性生色底物并測量底物轉(zhuǎn)化速率(例如，利用分光光度計)來檢測標(biāo)記抗體的結(jié)合情況?？赏ㄟ^比較特定稀釋度時樣品的底物轉(zhuǎn)化速率與標(biāo)準(zhǔn)曲線的底物轉(zhuǎn)化速率來測定血清中抗體的濃度或抗體片段水平。5.8.5血清學(xué)檢驗本發(fā)明某些實施方式檢測是否存在能與哺乳動物MPV的組分結(jié)合的抗體。具體地說，可檢測對象中是否存在針對哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)的抗體來診斷該對象中是否存在哺乳動物MPV?？刹捎眉夹g(shù)人員已知的任何方法檢測是否存在針對哺乳動物MPV某組分的抗體。在另一實施方式中，可使懷疑感染了MPV的宿主樣品與抗MPV或其組分的抗體接觸，檢測形成的復(fù)合物來進行血清學(xué)檢驗。在這種實施方式中，血清學(xué)檢驗可檢測是否存在針對MPV接觸的宿主抗體應(yīng)答。可采用本領(lǐng)域已知的任何方法制備本發(fā)明試驗用于檢測宿主抗體或MPV組分的抗體?？晒こ谈脑爝@種抗體來檢測各種表位，包括但不限于核酸、氨基酸、糖、多核苷酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物或它們的組合。在本發(fā)明另一實施方式中，可通過使懷疑感染了MPV的宿主樣品與MPV的某組分接觸，檢測形成的復(fù)合物來進行血清學(xué)檢驗。本領(lǐng)域熟知這種方法的例子，包括但不限于直接免疫熒光法、ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫層析法。一示范性實施方式將哺乳動物MPV的組分與固體支持物相連。在一具體實施方式中，所述哺乳動物MPV的組分可以是但不限于F蛋白或G蛋白。然后，在有助于抗體與哺乳動物MPV組分結(jié)合的條件下培育待測物質(zhì)與所述固體支持物來檢測是否存在針對哺乳動物MPV的抗體。接著在能除去任何非特異性結(jié)合抗體的條件下洗滌該固體支持物。洗滌步驟后，采用技術(shù)人員已知的任何技術(shù)檢測是否存在結(jié)合的抗體。在一具體實施方式中，在有助于可檢測標(biāo)記的抗體與結(jié)合了哺乳動物MPV組分的抗體結(jié)合的條件下，培育哺乳動物MPV蛋白-抗體復(fù)合物與能識別對象種類所產(chǎn)生抗體的可檢測標(biāo)記抗體，例如，如果對象是棉鼠，該可檢測標(biāo)記抗體是抗大鼠抗體。在一具體實施方式中，該可檢測標(biāo)記抗體與酶活性偶聯(lián)。在另一實施方式中，放射性標(biāo)記可檢測標(biāo)記抗體。然后洗滌哺乳動物MPV蛋白-抗體-可檢測標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再通過技術(shù)人員已知的任何技術(shù)定量測定是否存在可檢測標(biāo)記的抗體，其中所用的技術(shù)取決于可檢測標(biāo)記抗體的標(biāo)記物類型。5.8.6BIACORE試驗可通過，例如將含0.05%吐溫-20的HBS緩沖液配制的各種濃度的250pL單克隆抗體("mAb")注射到其上固定了抗原的傳感器芯片表面來測定抗體結(jié)合的動力學(xué)參數(shù)。所述抗原可以是哺乳動物MPV的任何組分。在一具體實施方式中，所述抗原可以是但不限于哺乳動物MPV的F蛋白或G蛋白。流速可以恒定維持在75pL/分鐘。收集15分鐘，或更長時間(如果需要)的解離數(shù)據(jù)。每輪注射/解離后，簡單地用1分鐘稀酸(通常是10-100mMHCl)脈沖從抗原表面除去結(jié)合的mAb，雖然如果條件許可可以使用其它再生劑。更具體地說，為檢測締合速率0^)和解離速率(/:。#)，采用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)方法，即EDC/NHS法(EDC=N-二乙基氨基丙基)-碳二亞胺)將抗原直接固定在傳感器芯片表面。簡言之，用10mMNaOAc，pH4或pH5制備5-100nM抗原溶液，使之流過EDC/NHS-激活的表面，直至固定了約30-50RU(Biacore共振單位)值的抗原。接著注射lMEt-NH2除去(capoff)未反應(yīng)的活性酯。在相同固定條件下制備不含抗原的空白表面作參比。一旦制備了合適的表面，用HBS/吐溫-20制備各抗體試劑的一系列合適稀釋液，使之流過串聯(lián)的抗原和參比小室表面。制備的抗體濃度范圍根據(jù)估計的平衡結(jié)合常數(shù)KD而不同。如上所述，每輪注射/解離后用合適的再生劑除去結(jié)合的抗體。一旦收集了完整的數(shù)據(jù)，采用儀器制造商BIAcore，Inc.(Piscataway，新澤西)提供的算法整體擬合得到的結(jié)合曲線。所有數(shù)據(jù)擬合成l:1朗繆爾結(jié)合模型。這些算法計算出々。和接著從和々。//推導(dǎo)作為兩種速率常數(shù)之比(即A。y^")的表觀平衡結(jié)合常數(shù)KD。如何得到各速率常數(shù)的更詳細處理方法見BIA評估軟件手冊(BIAcore，Inc.,Piscataway，新澤西)。5.8.7微量中和試驗可通過微量中和試驗測定抗體或其抗原結(jié)合片段中和病毒傳染力的能力。該微量中和試驗是Anderson等(1985，J.Clin.Microbiol.，22:1050-1052，其內(nèi)容全文納入本文作為參考)所述方法的改進形式。Johnson等(1999，J.InfectiousDiseases180:35-40，其內(nèi)容全文納入本文作為參考)也描述了該方法。使用96-孔板制備一式三份的抗體稀釋液。37"將106TCID5()的哺乳動物MPV與待檢驗的抗體或其抗原結(jié)合片段的連續(xù)稀釋液在96-孔板的孔中培育2小時。然后向每孔加入易受哺乳動物MPV感染的細胞，例如但不限于Vero細胞(2,5X104)，37°C，在5%(302中培養(yǎng)5天。5天后，抽出培養(yǎng)液，用80%甲醇和20。/。PBS洗滌細胞并固定于平板。然后通過病毒抗原，例如F蛋白的表達測定病毒復(fù)制。培育固定的細胞與生物素-偶聯(lián)的抗病毒抗原，例如抗-F蛋白的單克隆抗體(如，泛F蛋白，C-位點特異性MAb133-1H),洗滌，將辣根過氧化物酶偶聯(lián)的親和素加入各孔。再次洗滌各孔，在450nm檢測底物TMB(硫代硝基苯甲酸)的轉(zhuǎn)化情況。中和滴度表達為與只有病毒的對照細胞相比，導(dǎo)致450nm吸光度(0045())至少降低50%的抗體濃度。本文所述的微量中和試驗是僅有的例子?；蛘?，可采用標(biāo)準(zhǔn)中和試驗測定抗體對病毒的影響有多顯著。5.8.8病毒融合抑制試驗該試驗大體上與微量中和試驗相同，除了先用各種病毒感染細胞4小時，再加入抗體，讀取有或沒有融合細胞存在時的吸光度(Taylor等，1992，J.Gen.Virol.73:2217-2223)。5.8.9等溫滴定量熱法從抗體與其各自抗原的相互作用的等溫滴定量熱法(ITC)測量值測定熱力學(xué)結(jié)合親和力與焓。用透析液稀釋抗體，利用消光系數(shù)為217,000NT1cm"的Perkin-ElmerLambda4B分光光度計測量280nm的紫外光譜吸光度峰值來測定濃度。由于其消光系數(shù)太低因而不能確定精確濃度，從原始樣品質(zhì)量與稀釋樣品質(zhì)量之比計算稀釋的哺乳動物MPV-抗原濃度而無需使用及損失大量樣品。ITC檢測使用Microcal,Inc.VP滴定熱量計從ITC測量值測定抗體的結(jié)合熱力學(xué)(特性)。VP滴定熱量計由絕熱外殼包圍的一對匹配的樣品容器和參比容器(1.409ml)以及將配體溶液滴入樣品容器所用的旋振攪拌-注射器(rotatingstirrer-syringe)構(gòu)成。ITC檢測在25。C和35'C進行。樣品容器含有磷酸緩沖液配制的抗體，而參比容器只含有緩沖溶液。磷酸緩沖溶液是HyClone，Inc的鹽水67mMP04，pH7.4。以3-4分鐘為間隔將5或10pl等份試樣的0.05-0.1mMRSV抗原、PIV-抗原和/或hMPV抗原溶液滴入抗體樣品溶液中，直至熱交換信號消失表明結(jié)合已飽和。按照以下方程(I)，利用Microcal,Inc.,Origin5.0的非線性最小二次方最小化軟件程序?qū)⒖偀崃縌t的第i次滴定的漸增熱量(AQ(i))擬合成總滴定濃度Xt，從而得到Kb、AHb。禾Qn的值Qt=nCtAHb。V{1+Xt/nCt+l/nKbCt-[(l+Xt/nCt+l/nKbCt)2-4Xt/nCt]1/2}/2(la)△Q(i)=Q(i)+dVi/2V(Q(i)+Q(i-l)}-Q(i-l)(lb)其中Ct是樣品容器中的初始抗體濃度，V是樣品容器的體積，n是結(jié)合反應(yīng)的化學(xué)計量。測定樣品濃度Kb的最佳范圍取決于Kb的值，其限定關(guān)系如下所示CtKbn^500(2)因此，1(^M時可測定的Kb到小于2.5X10SM'1。如果加入第一種滴定抗原不能與結(jié)合等溫線擬合，將其在最終分析中省去，因為它可能反映了注射器開口的溶液界面有氣泡釋放。5.8.10免疫測定免疫沉淀方法通常包括用裂解緩沖液，例如補加了蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(如EDTA、PMSF、159抑肽酶、釩酸鈉)的RIPA緩沖液(1%NP-40或TritonX-IOO，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，0.15MNaCl，0.01M磷酸鈉、pH7.2，1。/4寺斯樂(Trasylol))裂解細胞群，向細胞裂解液中加入感興趣的抗體，4'C培育一定時間(例如，4小時)，向細胞裂解液中加入A蛋白和/或G蛋白瓊脂糖珠，4t:培育約l小時或更多時間，用裂解緩沖液洗滌珠，將這些珠重懸在SDS/樣品緩沖液中?？赏ㄟ^，例如蛋白質(zhì)印跡分析評估感興趣抗體免疫沉淀特定抗原的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道可以改進這些參數(shù)以提高抗體與抗原的結(jié)合，降低背景(例如，事先用瓊脂糖珠澄清細胞裂解液)。有關(guān)免疫沉淀方法的進一步討論參見，例如Ausubel等編，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《最新分子生物學(xué)方法》)，第l巻，JohnWiley&Sons,Inc.,紐約，第10,16,1頁。蛋白質(zhì)印跡分析通常包括制備蛋白質(zhì)樣品，用聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質(zhì)樣品進行電泳(例如，根據(jù)抗原的分子量進行8。/。-20。/。SDS-PAGE)，將蛋白質(zhì)樣品從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至膜，例如硝酸纖維素膜、PVDF或尼龍膜，用封閉溶液(例如，含3%BSA的PBS或脫脂奶)封閉膜，用洗滌緩沖液(例如PBS吐溫20)洗滌膜，培育膜與用封閉緩沖液稀釋的第一抗體(感興趣的抗體)，用洗滌緩沖液洗滌該膜，培育該膜與用封閉緩沖液稀釋的與酶物質(zhì)(例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)或放射性分子(例如，"P或1211)偶聯(lián)的第二抗體(能識別第一抗體，例如抗-人抗體)，用洗滌緩沖液洗滌膜和檢測是否存在抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道可改進這些參數(shù)以增強檢測信號，降低背景噪聲。有關(guān)蛋白質(zhì)印跡方法的進一步討論參見，例如Ausubel等編，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《最新分子生物學(xué)方法》)，第l巻，JohnWiley&Sons,Inc.,紐約，第10.8.1頁。ELISA包括制備抗原，用抗原包被96-孔微量滴定板的孔，洗去未與孔結(jié)合的抗原，將與可檢測化合物，例如酶物質(zhì)(如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)偶聯(lián)的感興趣抗體加入各孔并培育一定時間，洗去未結(jié)合的抗體或非特異性結(jié)合的抗體，和檢測是否存在與包被孔的抗原特異性結(jié)合的抗體。在ELISA中，感興趣的抗體不與可檢測化合物偶聯(lián)；而是將與可檢測化合物偶聯(lián)的第二抗體(能識別感興趣的抗體)加入孔。此外，不用抗原包被孔，而是用抗體包被孔。在此情況中，可檢測分子可以是與可檢測化合物，例如酶物質(zhì)(如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)偶聯(lián)的抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可以改進這些參數(shù)以增強檢測的信號以及ELISA的其它變化。ELISA的進一步討論參見，例如Ausubel等編，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《最新分子生物學(xué)方法》)，第1巻，JohnWiley&Sons,Inc.,紐約，第11.2.1頁?？赏ㄟ^競爭性結(jié)合試驗測定抗體(包括scFv或含有或由抗體片段構(gòu)成的其它分子或其變體)對抗原的結(jié)合親和力與抗體-抗原相互作用解離速率。競爭性結(jié)合試驗的一個例子是放射性免疫測定，包括在含量增加的未標(biāo)記抗原存在下培育標(biāo)記抗原(例如，3H或1211)與感興趣抗體，和檢測與標(biāo)記抗原結(jié)合的抗體。5.8.11蔗糖梯度試驗可采用技術(shù)人員己知的任何生物化學(xué)試驗進一步研究所述異源蛋白是否摻入到病毒體中。在一具體實施方式中，釆用蔗糖梯度試驗確定異源蛋白是否摻入病毒體?？蓪⒏腥炯毎牧呀庖涸?0-60%蔗糖梯度中分級，收集各組分并通過，例如蛋白質(zhì)印跡分析法分析異源蛋白和載體蛋白的存在和分布情況。也可通過噬斑試驗檢驗各組分和病毒蛋白的峰值病毒滴度。如果所述異源蛋白與病毒體共同遷移，則該異源蛋白與病毒體結(jié)合。5.9鑒定MPV新分離物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及哺乳動物MPV，特別是hMPV。雖然本發(fā)明表征了MPV的兩種血清學(xué)亞群，A和B以及表征了四種變體A1、A2、Bl禾tlB2，但本發(fā)明不限于這些亞群和變體。本發(fā)明包括MPV的任何尚未鑒定的分離物，包括經(jīng)表征屬于本文所述亞群和變體，或?qū)儆谏形幢碚鞯膩喨夯蜃凅w的那些分離物?？刹捎妹庖邷y定來表征給定樣品中存在的蛋白質(zhì)組分。使用所鑒定病毒的肽組分的免疫測定是比較病毒分離物的有效方法。例如，本發(fā)明提供鑒定本文提供的MPV其它分離物的方法，該方法包括用原型分離物1-2614或相關(guān)的分離物接種基本上未感染MPV或無特異性病原體的豚鼠或雪貂(在發(fā)明詳述中，鼻內(nèi)接種動物，但也可能采用其它接種方式，例如肌肉內(nèi)或真皮內(nèi)接種以及使用其它實驗動物)。在第O天、接種兩周和三周后收集動物的血清。可利用病毒中和(VN)試驗(VN試驗的例子見實施例16)檢測到特異性血清轉(zhuǎn)化的動物，針對各分離物1-2614進行間接IFA(IFA的例子見實施例11或14)和用血清轉(zhuǎn)化動物的血清來免疫學(xué)檢測所述的其它分離物。例如，本發(fā)明表征了副黏病毒科的新成員，可在人類中導(dǎo)致嚴(yán)重RTI的人偏肺病毒或偏肺病毒樣病毒(由于其最終分類學(xué)尚待病毒分類學(xué)委員會討論，本文將MPV(例如)描述為在分類學(xué)上對應(yīng)于APV)(MPV)。MPV所致疾病的臨床體征基本上類似于hRSV所致體征，例如咳嗽、肌痛、嘔吐、發(fā)熱、支氣管炎或肺炎、可能的結(jié)膜炎或它們的組合。如hRSV感染的兒童所見的一樣，特別年幼的兒童可能需要住院治療。本文提供2001年1月19日由CNCM(InstitutePasteur(巴斯德研究院)，巴黎)保藏為1-2614的MPV或其在系統(tǒng)發(fā)育上相應(yīng)的病毒分離物作為例子。于是，本發(fā)明提供的病毒含有在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于SEQIDNO:19所示核酸序列或在結(jié)構(gòu)上對應(yīng)于該核酸序列的核酸或功能片段。具體地說，本發(fā)明提供病毒的特征在于系統(tǒng)樹分析(其中用100個自展引導(dǎo)(bootstrap)和3個混雜(jumble)產(chǎn)生最大相似性樹)檢驗后，發(fā)現(xiàn)其在系統(tǒng)發(fā)育上更接近對應(yīng)于CNCM(巴黎)保藏為1-2614的病毒分離物，而不是禽肺病毒(APV)，也稱為火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)(禽鼻氣管炎的病原體)的病毒分離物。將AVP-C病毒分離物用作所述系統(tǒng)樹分析的遠交群特別有用，它親緣最近，雖然其基本上是非哺乳動物病毒。5.9.1序列的生物信息學(xué)對比可通過BLAST(Altschul,S.F.等，1990，J.Mol.Biol.215:403-410)比較兩條或多條氨基酸序列來確定它們彼此的序列同源性和序列相同性?？赏ㄟ^BLAST(Altschul,S.F.等，1990，J.Mol.Biol.215:403-410)比較兩條或多條核苷酸序列來確定它們彼此的序列同源性和序列相同性?？刹捎肅lustalW方法(MacVector(tm))執(zhí)行BLAST比較。在某些實施方式中，通過計算機程序?qū)Ρ葍蓷l或多條序列后可以進行手工再調(diào)整。可采用數(shù)學(xué)算法確定兩條序列間的相同性百分比。用于比較兩條序列的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選非限制性例子是由Karlin和Altschul(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877)改進的Karlin和Altschul(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268)算法。Altschul等(1990，J.Mol.Biol.215:403-410)的NBLAST和XBLAST程序整合了這種算法?？衫肗BLAST程序執(zhí)行BLAST核苷酸比較?？衫肵BLAST程序執(zhí)行BLAST氨基酸序列比較。為獲得比較目的的空位對比，可進行如Altschul等(1997，NucleicAcidsRes.25:3389-3402)所述的空位BLAST?；蛘撸衫肞SI-Blast執(zhí)行迭代檢索來檢測分子之間的遠親關(guān)系(Altschul等，1997，同上)。使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序時，可采用各程序(例如，XBLAST禾PNBLAST)的默認(rèn)參數(shù)(參見http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一優(yōu)選非限制性例子是Myers和Miller(1988，CABIOS4:11-17)的算法。作為GCC序列對比軟件包的ALIGN程序(2.0版)整合了這種算法。當(dāng)利用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可利用PAM120加權(quán)殘差表(weightresiduetable)。技術(shù)人員可設(shè)定空位長度罰分。可采用與上述相似的技術(shù)(設(shè)有或不設(shè)空位)測定兩條序列間的相同性百分比。在計算相同性百分比時，一般只計算精確的匹配。5.9.2雜交條件本發(fā)明方法可利用能與哺乳動物MPV的核酸、或其反向互補核酸或其互補核酸雜交的核酸來測定它們彼此的序列同源性和相同性。在某些實施方式中，這些核酸可在高度嚴(yán)格的條件下雜交。例如(不限于)采用這種高度嚴(yán)格性條件的方法如下所示。65°C，在由6XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA和500|ig/ml變性鮭魚精子DNA組成的緩沖液中將含DNA的濾膜預(yù)雜交8小時到過夜。65°C，在含IOO嗎/ml變性鮭魚精子DNA和5-20X106cpm32P-標(biāo)記探針的預(yù)雜交混合物中雜交濾膜48小時。37°C，用含2XSSC、0.01%PVP、0.01%Ficoll和0.01%BSA的溶液洗滌濾膜1小時。然后在37"先用0.1XSSC洗滌45分鐘，再進行放射自顯影。本領(lǐng)域熟知可采用的其它高度嚴(yán)格性條件。本發(fā)明的其它實施方式在中等到低嚴(yán)格性條件下進行雜交，技術(shù)人員熟知這種條件(參見，例如Sambrook等，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual(《分子克隆，實驗室手冊》)，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；也參見Ausubel等編，刊于CurrentProtocolsinMolecularBiologyseriesoflaboratorytechniquemanuals(《最新分子生物學(xué)方法的實驗室技術(shù)手冊叢書》)，1987-1997CurrentProtocols,1994-1997JohnWileyandSons,Inc.)。5.9.3系統(tǒng)發(fā)育分析本發(fā)明涉及推定哺乳動物MPV分離物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系?？刹捎迷S多方法分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；這些方法包括遠距、最大可能性和最大簡約方法(Swofford，DL.等，PhylogeneticInference(系統(tǒng)發(fā)育推定)，刊于MolecularSystematics(《分子系統(tǒng)學(xué)》)，Hillis，DM,Mortiz，C禾卩Mable，BK編，1996,SinauerAssociates:Massachusetts,美國，第407-514頁；Felsenstein,J.，1981，J.Mol.Evol.17:368-376)。此外，自引技術(shù)是制備和檢測所得系統(tǒng)樹的置信區(qū)間的有效方法(Felsenstein,J.，1985，Evolution.29:783-791)。利用核苷酸序列或肽序列信息來比較哺乳動物MPV分離物的任何方法可用于建立系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，所述方法包括但不限于遠距、最大可能性和最大簡約方法?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法分析系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)，包括但不限于自引的質(zhì)量。系統(tǒng)發(fā)育方法所用的核苷酸或肽序列數(shù)據(jù)的對比包括但不限于手工對比、計算機配對對比和計算機多重對比。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉根據(jù)所需信息和允許的時間而使用的優(yōu)選對比方法或系統(tǒng)發(fā)育方法。一個實施方式采用DNA最大可能性方法來推定hMPV分離物之間的關(guān)系。另一實施方式采用自引技術(shù)測定用所述系統(tǒng)發(fā)育方法產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)的確定性。另一實施方式先將混雜技術(shù)應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育方法，再輸入數(shù)據(jù)以盡可能降低序列指令進入(sequenceorderentry)對系統(tǒng)發(fā)育分析的影響。一具體實施方式采用含有自展引導(dǎo)的DNA最大可能性方法。另一具體實施方式采用具有自展引導(dǎo)和混雜的DNA最大可能性方法。另一更具體的實施方式采用含有50個自展引導(dǎo)的DNA最大可能性方法。另一具體實施方式采用具有50個自展引導(dǎo)和3個混雜的DNA最大可能性方法。另一具體實施方式采用含有100個自展引導(dǎo)和3個混雜的DNA最大可能性方法。一個實施方式比較或?qū)Ρ攘薶MPV分離物的核酸序列或肽序列或與其它hMPV分離物的序列。所述氨基酸序列可以是L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白或F蛋白的氨基酸序列。另一實施方式比較或?qū)Ρ攘艘粋€hMPV分離物或多個hMPV分離物的核酸序列或肽序列信息或與其它病毒的序列。另一實施方式將系統(tǒng)發(fā)育方法應(yīng)用于序列對比數(shù)據(jù)，從而可推定系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和/或構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用核苷酸序列或肽序列信息來比較MPV分離物的任何方法可用于推定所述系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，所述方法包括但不限于遠距、最大可能性和最大簡約方法。系統(tǒng)發(fā)育分析的其它方法公開于以WO02/057302公布的國際專利申請PCT/NL02/00040中，其內(nèi)容全文納入本文作為參考。具體地說，PCT/NL02/00040在第12頁、第27行到第19頁、第29行公開了適用于系統(tǒng)發(fā)育分析的核酸序列，其納入本文作為參考。對于系統(tǒng)發(fā)育分析，獲得非MPV的核酸序列作為遠交群與病毒比較是最有用的，非常有用的遠交群可以得自禽肺病毒血清型C(APV-C)?？衫帽绢I(lǐng)域已知的許多方法和程序推定系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，包括但不限于BioEdit、ClustalW、TreeView和NJPlot。用于對比序列并產(chǎn)生系統(tǒng)樹或關(guān)系的方法需要輸入待比較的序列信息。可釆用本領(lǐng)域已知的許多方法或格式輸入序列信息，包括但不限于FASTA、NBRF、EMBL/SWISS、GDE蛋白、GDE核苷酸、CLUSTAL和GCG/MSF。用于對比序列并產(chǎn)生系統(tǒng)樹或關(guān)系的方法需要輸出結(jié)果?？刹捎迷S多方法或格式輸出信息或結(jié)果，包括但不限于CLUSTAL、NBRF/PIR、MSF、PHYLIP禾口GDE。一個實施方式聯(lián)用ClustalW與具有100個自引和3個混雜的DNA最大可能性方法來產(chǎn)生系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。5.10產(chǎn)生抗體本發(fā)明也涉及產(chǎn)生抗哺乳動物MPV所編碼蛋白的抗體。具體地說，本發(fā)明涉及制備抗所有MPV抗原，包括哺乳動物MPV的F蛋白、N蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、G蛋白或P蛋白的抗體。按照本發(fā)明，可利用哺乳動物MPV編碼的任何蛋白質(zhì)、其衍生物、類似物或片段作為免疫原來產(chǎn)生能與這種免疫原免疫特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合型抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、Fab表達文庫產(chǎn)生的片段、抗獨特型(抗-Id)抗體(包括，例如抗本發(fā)明抗體的抗-Id抗體)和表位結(jié)合片段。本文所用的術(shù)語"抗體"指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分，即含有能與抗原免疫特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亞類(例如，IgG,、IgG2、IgG3、IgG4、IgA,和IgA2)的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分的例子包括可用例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的酶處理抗體而產(chǎn)生的F(ab)和F(ab')2片段。一具體實施方式產(chǎn)生抗人MPV所編碼蛋白質(zhì)的抗體。另一實施方式產(chǎn)生了抗人MPV所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域的抗體?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的各種方法產(chǎn)生抗哺乳動物MPV編碼蛋白質(zhì)、其衍生物、類似物或片段的多克隆抗體。為產(chǎn)生抗體，可注射天然蛋白質(zhì)或其合成形式或衍生物(例如，片段)來免疫各種宿主動物，包括但不限于家兔、小鼠、大鼠等。按照宿主種類，可用各種佐劑增強免疫應(yīng)答，包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全)，礦物凝膠，如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚陰離子；肽，油乳劑，匙孔蜮藍蛋白，二硝基苯酚和可能有用的人佐劑，如BCG(卡介苗)禾口短小棒狀桿菌(corynebacteriumparv腿)。為制備針對哺乳動物MPV編碼蛋白質(zhì)、其衍生物、類似物或片段的單克隆抗體，可采用培養(yǎng)連續(xù)細胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)。例如，可釆用Kohler和Milstein(1975，Nature256:495-497)首先開發(fā)的雜交瘤技術(shù)以及三源雜交瘤技術(shù)(triomatechnique)、人B-細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，ImmunologyToday4:72)和EBV-雜交瘤技術(shù)來產(chǎn)生人單克隆抗體(Cole等，1985，刊于MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy(《單克隆抗體和癌癥治療》)，AlanR.Liss，Inc.,第77-96頁)。在本發(fā)明其它實施方式中，可采用最新技術(shù)(PCT/US90/02545)在無菌動物中產(chǎn)生單克隆抗體。按照本發(fā)明，可利用人雜交瘤(Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026-2030)或用EBV病毒體外轉(zhuǎn)染人B細胞(Cole等，1985，刊于MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy(單克隆抗體和癌癥治療)，AlanR.Liss，第77-96頁)以獲得可用的人抗體。事實上，按照本發(fā)明，可釆用為產(chǎn)生"嵌合型抗體"而開發(fā)的技術(shù)(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851-6855;Neuberger等，1984，Nature312:604-608;Takeda等，1985，Nature314:452-454)，該技術(shù)剪接對哺乳動物MPV所編碼蛋白質(zhì)、其衍生物、類似物或片段具有特異性的小鼠抗體分子的基因與具有合適生物學(xué)活性的人抗體分子的基因；這種抗體屬于本發(fā)明的范圍。按照本發(fā)明，可改進美國專利號4,946,778所述產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)來產(chǎn)生特異性單鏈抗體。本發(fā)明另一實施方式釆用構(gòu)建Fab表達文庫所述的技術(shù)(Huse等，1989，Science246:1275-1281)來快速而簡單地鑒定對哺乳動物MPV所編碼蛋白質(zhì)、其衍生物、類似物或片段具有所需特異性的單克隆Fab片段?？赏ㄟ^已知技術(shù)產(chǎn)生含獨特型分子的抗體片段。例如，這種片段包括但不限于胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab')2片段；通過還原F(ab')2片段的二硫鍵而產(chǎn)生的Fab'片段；用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子所產(chǎn)生的Fab片段；和Fv片段。在制備抗體的過程中，可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)，例如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)篩選所需抗體。例如，為選出能識別哺乳動物MPV所編碼蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)域的抗體，可檢驗所制備雜交瘤的產(chǎn)物是否能與哺乳動物MPV所編碼并含有這種結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)片段結(jié)合。本發(fā)明提供的抗體可用于檢測MPV以及治療MPV感染的治療方法?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)檢驗本發(fā)明方法所產(chǎn)生抗體的特異性和結(jié)合親和力。在某些實施方式中，可如章節(jié)5.8.5、5.8.6、5.8.7、5.8.8或5,8.9所述檢驗本發(fā)明方法所產(chǎn)生抗體的特異性和結(jié)合親和力。5.11鑒定抗病毒劑的篩選試驗本發(fā)明提供鑒定能抑制哺乳動物MPV感染宿主或宿主細胞的化合物的方法。在某些實施方式中，本發(fā)明提供鑒定能降低哺乳動物MPV在宿主或宿主細胞中復(fù)制能力的化合物的方法?？刹捎眉夹g(shù)人員熟知的任何技術(shù)篩選能消除或降低哺乳動物MPV感染宿主或宿主細胞和/或在宿主或宿主細胞中復(fù)制的化合物。在一具體實施方式中，所述哺乳動物MPV是人MPV。在某些實施方式中，本發(fā)明提供鑒定能抑制哺乳動物MPV在宿主或宿主細胞中復(fù)制的化合物的方法。更具體地說，本發(fā)明提供鑒定能抑制哺乳動物MPV感染哺乳動物或哺乳動物細胞的化合物的方法。在某些實施方式中，本發(fā)明提供鑒定能抑制哺乳動物MPV在哺乳動物細胞中復(fù)制的化合物的方法。在一具體實施方式中，所述哺乳動物細胞是人細胞?？捎糜跍y定病毒滴度的試驗的詳述見章節(jié)5.7。在某些實施方式中，使細胞與檢驗化合物接觸并用哺乳動物MPV感染。在某些實施方式中，在沒有檢驗化合物存在下用哺乳動物病毒感染對照培養(yǎng)物?？稍谟貌溉閯游颩PV感染之前、同時或之后使細胞與檢驗化合物接觸。在一具體實施方式中，所述細胞是哺乳動物細胞。在甚至更具體的實施方式中，所述細胞是人細胞。在某些實施方式中，細胞與檢驗化合物培育至少1分鐘、至少5分鐘、至少15分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少5小時、至少12小時或至少1天?？稍谠囼炂陂g的任何時間檢測病毒滴度。某些實施方式測定了培養(yǎng)液中病毒生長的時程。如果檢驗化合物的存在使病毒生長受抑制或降低，則該檢驗化合物鑒定為能有效抑制或降低哺乳動物MPV的生長或感染。一具體實施方式檢驗?zāi)芤种苹蚪档筒溉閯游颩PV生長的化合物抑制或降低其它病毒生長速率的能力來檢驗其對哺乳動物MPV的特異性。在某些實施方式中，將檢驗化合物給予模型動物，并用哺乳動物MPV感染該模型動物。在某些實施方式中，用哺乳動物病毒感染對照模型動物而不給予檢驗化合物?？稍诓溉閯游颩PV感染之前、同時或之后給予檢驗化合物。在一具體實施方式中，所述模型動物是哺乳動物。在一甚至更具體的實施方式中，所述模型動物可以是但不限于棉鼠、小鼠或猴子。可在試驗期間的任何時間檢測病毒滴度。某些實施方式測定了培養(yǎng)液中病毒生長的時程。如果檢驗化合物的使病毒生長受抑制或降低，則該檢驗化合物鑒定為能有效抑制或降低哺乳動物MPV的生長或感染。一具體實施方式檢驗?zāi)芤种苹蚪档筒溉閯游颩PV在模型動物中生長的化合物抑制或降低其它病毒生長速率的能力來檢驗其對哺乳動物MPV的特異性。5.12疫苗、抗體和抗病毒制劑在一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供由本發(fā)明核酸編碼的蛋白分子或偏肺病毒特異性病毒蛋白或其功能片段。例如，有用的蛋白分子源自可從本發(fā)明病毒獲得的任何基因或基因組片段。例如，本文提供的這種分子或其抗原性片段可用于診斷方法或試劑盒以及藥物組合物中(例如，亞單位疫苗)。對于例如抗原或亞單位免疫原的包涵體，特別有用的是F、SH和/或G蛋白或其抗原性片段，但也可用滅活的完整病毒。為系統(tǒng)發(fā)育分析而鑒定的重組核酸片段所編碼的那些蛋白質(zhì)物質(zhì)也特別有用，當(dāng)然優(yōu)選屬于系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析所用的優(yōu)選ORF邊界內(nèi)的，特別是無論在體內(nèi)(例如，為保護目的或提供診斷性抗體)或體外(例如，通過噬菌體展示技術(shù)或用于產(chǎn)生合成抗體另一種技術(shù))均能引發(fā)MPV特異性抗體或T細胞應(yīng)答的那些蛋白物質(zhì)。本文也提供抗體，其可以是能與含有本發(fā)明蛋白分子或其MPV-特異性功能片段的抗原特異性反應(yīng)的天然多克隆或單克隆或合成(例如，(噬菌體)文庫衍生的結(jié)合分子)抗體。這種抗體可用于鑒定病毒分離物，例如MPV的方法，包括將所述病毒分離物或其組分與本文提供的抗體反應(yīng)。例如，這可采用ELISA、RIA、FACS或不同形式的抗原檢測試驗(CurrentProtocolsinImmunology(《最新免疫學(xué)方法》)，利用純化或未純化的MPV或其諸組分(蛋白質(zhì)、肽)來實現(xiàn)?；蛘?，可采用經(jīng)典免疫熒光或免疫組織化學(xué)技術(shù)，用受感染的細胞或細胞培養(yǎng)物來鑒定病毒抗原。例如，可將含有本發(fā)明病毒、核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗體的藥物組合物用于MPV感染和/或呼吸道疾病的治療或預(yù)防方法，包括提供給個體本發(fā)明藥物組合物。當(dāng)所述個體包括人時，特別是當(dāng)所述人在5歲以下時最有用，因為這種嬰兒和幼兒最易受本文提到的人MPV感染。在急性階段，患者通?；加幸赘腥酒渌粑兰膊』蚱渌膊?dǎo)致的上呼吸道癥狀。也可能發(fā)生易感染更多其它嚴(yán)重疾病導(dǎo)致的下呼吸道疾病?？捎帽景l(fā)明組合物治療免疫力受損的個體，包括癌癥患者、移植受者和老年人。本發(fā)明也提供獲得可用于治療呼吸道疾病的抗病毒劑的方法，包括建立含本發(fā)明病毒的細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游铮煤蜻x的抗病毒劑處理所述培養(yǎng)物或動物，測定所述抗病毒劑對所述病毒或其感染的培養(yǎng)物或動物的作用。這種抗病毒劑的例子包括本文提供的MPV-中和抗體或其功能組分，但也獲得了其它性質(zhì)的抗病毒劑。本發(fā)明也提供本發(fā)明抗病毒劑在制備可用于治療或預(yù)防MPV感染或呼吸道疾病方法中的藥物組合物，特別是制備治療呼吸道疾病(特別是該疾病由MPV感染所致)或相關(guān)疾病的藥物組合物中的應(yīng)用，以及提供含本發(fā)明抗病毒劑的藥物組合物用于治療或預(yù)防MPV感染或呼吸道疾病的方法，所述方法包括提供給個體這種藥物組合物。在本發(fā)明的某些實施方式中，本發(fā)明疫苗包含本文定義的哺乳動物偏肺病毒。在某些更具體的實施方式中，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。在一優(yōu)選實施方式中，所述哺乳動物偏肺病毒可用于具有減毒表型的疫苗制劑中。獲得減毒表型的方法參見章節(jié)5.6。本發(fā)明提供用于預(yù)防和治療PIV、RSV、APV和/或MPV感染的疫苗制劑。在某些實施方式中，本發(fā)明疫苗含有本發(fā)明重組和嵌合型病毒。在某些實施方式中，所述病毒是減毒的。在一具體實施方式中，所述疫苗含有APV，該疫苗可用于預(yù)防和治療人hMPV感染。不想局限于理論，因為APV的F蛋白與hMPV的F蛋白同源性高，APV感染會導(dǎo)致宿主產(chǎn)生能與hMPV交叉反應(yīng)的抗體而保護宿主抵御hMPV感染和相關(guān)疾病。在另一具體實施方式中，所述疫苗含有hMPV，該疫苗可用于預(yù)防和治療鳥，例如但不限于火雞的APV感染。不想局限于理論，因為APV的F蛋白與hMPV的F蛋白同源性高，hMPV感染會導(dǎo)致宿主產(chǎn)生能與APV交叉反應(yīng)的抗體而保護宿主抵御APV感染和相關(guān)疾病。在一具體實施方式中，本發(fā)明包括將經(jīng)修飾的重組和嵌合型APV/hMPV病毒用于疫苗制劑中以賦予抵御APV和/或hMPV的保護作用。某些實施方式將APV/hMPV用于要給予鳥類的疫苗中以保護鳥類抵御APV感染。不想局限于理論，用hMPV基因或核苷酸序列取代APV基因或核苷酸序列可獲得能將該嵌合型病毒用作疫苗的減毒表型。在其它實施方式中，將APV/hMPV嵌合型病毒給予人。不想局限于理論，APV病毒載體在人中提供減毒表型，hMPV序列的表達能引發(fā)hMPV特異性免疫應(yīng)答。在一具體實施方式中，本發(fā)明包括將經(jīng)修飾的重組和嵌合型hMPV/APV病毒用于疫苗制劑中以賦予抵御APV和/或hMPV的保護作用。某些實施方式將hMPV/APV用于要給予人類的疫苗中以保護人類抵御hMPV感染。不想局限于理論，用APV基因或核苷酸序列取代hMPV基因或核苷酸序列可獲得能將該嵌合型病毒用作疫苗的減毒表型。在其它實施方式中，將hMPV/APV嵌合型病毒給予鳥類。不想局限于理論，hMPV骨架在鳥中可提供減毒表型，APV序列的表達能引發(fā)APV特異性免疫應(yīng)答。某些優(yōu)選的實施方式利用本發(fā)明疫苗制劑提供保護以抵御偏肺病毒感染和相關(guān)疾病。更具體地說，利用本發(fā)明疫苗制劑提供保護以抵御人偏肺病毒和/或禽肺病毒感染和相關(guān)疾病。在某些實施方式中，利用本發(fā)明疫苗制劑提供保護以抵御以下病毒感染(a)人偏肺病毒和呼吸道合胞體病毒；和減(b)禽肺病毒和呼吸道合胞體病毒。在某些實施方式中，利用本發(fā)明疫苗制劑提供保護以抵御(a)人偏肺病毒和人副流感病毒；和/或(b)禽肺病毒和人副流感病毒感染，以及相關(guān)疾病。在某些實施方式中，利用本發(fā)明疫苗制劑提供保護以抵御(a)人偏肺病毒、呼吸道合胞體病毒和人副流感病毒；和/或(b)禽肺病毒、呼吸道合胞體病毒和人副流感病毒感染，以及相關(guān)疾病。在某些實施方式中，利用本發(fā)明疫苗制劑提供保護以抵御人偏肺病毒、呼吸道合胞體病毒和人副流感病毒感染以及相關(guān)疾病。在某些其它實施方式中，利用本發(fā)明疫苗制劑提供保護以抵御禽肺病毒、呼吸道合胞體病毒和人副流感病毒感染以及相關(guān)疾病。由于不同病毒種類的F蛋白之間的高度同源性，可利用本發(fā)明疫苗制劑提供保護以抵御與產(chǎn)生編碼F蛋白的異源核苷酸序列的病毒不同的病毒感染。在一具體的示范性實施方式中，疫苗制劑所含的病毒含有源自A型禽肺病毒的異源核苷酸序列，可用該疫苗制劑提供保護以抵御A型禽肺病毒和B型禽肺病毒所致感染。本發(fā)明包括要給予人和動物的疫苗制劑，所述制劑可用于提供保護以抵御APV(包括APV-C和APV-D)、hMPV、PIV、流感病毒、RSV、仙臺病毒、腮腺炎(病毒)、禽傳染性喉氣管炎病毒、猿猴病毒5、人乳頭瘤病毒、麻疹(病毒)、腮腺炎(病毒)及其它病毒和病原體以及相關(guān)疾病。本發(fā)明還包括要給予人和動物的疫苗制劑，所述制劑可提供保護以抵御人偏肺病毒感染和禽肺病毒感染以及相關(guān)疾病。在一個實施方式中，本發(fā)明包括可用于抵御引起家養(yǎng)動物疾病的致病因子，包括狂犬病病毒、貓白血病病毒(FLV)和犬瘟熱病毒的疫苗制劑。在還有另一實施方式中，本發(fā)明的疫苗制劑可用于保護家畜抵御水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒、牛瘟麻疹病毒、豬痘病毒，還能保護野生動物抵御狂犬病病毒感染?？刹捎梅聪蜻z傳學(xué)方法產(chǎn)生的減毒病毒可用于本文所述的疫苗和藥物制劑中。也可采用反向遺傳學(xué)技術(shù)在產(chǎn)生疫苗至關(guān)重要的其它病毒基因中加入突變，即可將有用的疫苗毒株變體的表位經(jīng)工程改造加入減毒病毒中?；蛘撸蓪⑼暾耐庠幢砦唬ㄔ醋云渌《净蚍遣《静≡w的抗原經(jīng)工程改造加入減毒株中。例如，可將不相關(guān)病毒的抗原，如HIV(gp160、gpl20、gp41)、寄生蟲抗原(如瘧原蟲)、細菌或真菌抗原或腫瘤抗原經(jīng)工程改造加入減毒株中?；蛘呖蓪⒏淖儾《倔w內(nèi)嗜性的表位經(jīng)工程改造加入本發(fā)明的嵌合型減毒病毒中。實際上可將任何異源基因序列構(gòu)建入用于疫苗的本發(fā)明嵌合型病毒中。部分和肽最好用作生物反應(yīng)修飾劑。能誘導(dǎo)針對各種病原體的保護性免疫應(yīng)答的表位或能結(jié)合中和抗體的抗原可由該嵌合型病毒表達或表達為嵌合型病毒的一部分。例如，可構(gòu)建入本發(fā)明嵌合型病毒中的異源基因序列包括但不限于流感和副流感血凝素神經(jīng)氨酸酶和融合糖蛋白(的基因)，例如人PIV3的HN基因和F基因。在還有另一實施方式中，可經(jīng)工程改造入嵌合型病毒中的異源基因序列包括編碼具有免疫調(diào)節(jié)活性蛋白質(zhì)的那些序列。免疫調(diào)節(jié)活性蛋白質(zhì)的例子包括但不限于細胞因子、l型干擾素、Y干擾素、集落刺激因子、白介素-1、-2、-4、-5、-6、-12和這些因子的拮抗劑。此外，可構(gòu)建加入用于疫苗的本發(fā)明嵌合型病毒中的異源基因序列包括但不限于源自人免疫缺陷型病毒(HIV)，優(yōu)選1型或2型的序列。在一優(yōu)選的實施方式中，可將可能作為抗原來源的HIV-衍生的免疫原性肽構(gòu)建加入嵌合型PIV中，再用于引發(fā)脊椎動物免疫應(yīng)答。這種HIV-衍生的肽可包括但不限于源自env基因(即，編碼gpl60、gpl20和/或gp41的全部或部分的序列)、pol基因(即，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸內(nèi)切酶、蛋白酶和/或整合酶的全部或部分的序列)、gag基因(即，編碼p7、p6、p55、p17/18、p24/25的全部或部分的序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr禾口/或vpx的序列。其它異源序列可源自乙肝病毒表面抗原(HBsAg);甲肝或丙肝病毒表面抗原；EB病毒的糖蛋白；人乳頭瘤病毒的糖蛋白；呼吸道合胞體病毒、副流感病毒、仙臺病毒、猿猴病毒5或腮腺炎病毒的糖蛋白；流感病毒的糖蛋白；皰疹病毒的糖蛋白；脊髓灰質(zhì)炎病毒的VP1;非病毒病原體，例如細菌和寄生蟲的抗原性決定簇，僅舉幾例。在另一實施方式中，可以表達免疫球蛋白基因的所有或一部分。例如，可將能模擬這種表位的抗獨特型免疫球蛋白的可變區(qū)構(gòu)建加入本發(fā)明嵌合病毒中。其它異源序列可源自腫瘤抗原，可產(chǎn)生的嵌合型病毒在體內(nèi)誘導(dǎo)能導(dǎo)致腫瘤消退的抗腫瘤細胞免疫應(yīng)答。為治療腫瘤，可聯(lián)用這些疫苗和其它治療方案，包括但不限于化療、放療、外科手術(shù)、骨髓移植等。按照本發(fā)明，可工程改造重組病毒以表達腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，包括但不限于T細胞能識別的人腫瘤抗原(全文納入本文作為參考的Robbins禾卩Kawakami，1996，Curr.Opin.Immunol.8:628-636)，黑色素瘤譜系蛋白，包括gp100，MART-l/MelanA，TRP-1(gp75)，酪氨酸酶；廣泛共有的腫瘤特異性抗原，MAGE-1、MAGE-3，BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶-V、pl5;突變的腫瘤特異性抗原、(3-連環(huán)蛋白、MUM-l、CDK4;乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌和胰腺癌的非黑色素瘤抗原、HER-2/neu、人乳頭瘤病毒-E6、-E7、MUC-1。在甚至其它實施方式中，異源核苷酸序列源自偏肺病毒，例如人偏肺病毒和/或禽肺病毒。在甚至其它實施方式中，本發(fā)明病毒含有兩種不同的異源核苷酸序列，其中一種源自偏肺病毒，例如人偏肺病毒和/或禽肺病毒，另一種源自呼吸道合胞體病毒。所述異源核苷酸序列編碼各病毒的F蛋白或G蛋白。在一具體實施方式中，異源核苷酸序列編碼嵌合型F蛋白，所述嵌合型F蛋白含有偏肺病毒F蛋白的胞外域和副流感病毒F蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域以及腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域。可以配制重組活病毒疫苗或滅活的重組病毒疫苗。優(yōu)選活疫苗，因為在宿主中擴增導(dǎo)致的長期刺激與天然感染中發(fā)生的刺激在類型和幅度上相似，因而能賦予實質(zhì)上持續(xù)時間長的免疫力。可采用常規(guī)方法制備這種重組的活病毒疫苗制劑，包括在細胞培養(yǎng)物或雞胚的尿囊中增殖病毒，然后純化。在一具體實施方式中，重組病毒對于所給予的對象不致病。就這點而言，用于疫苗目的經(jīng)遺傳工程改造的病毒可能需要這些毒株存在減毒特征。將合適的突變(例如，缺失)引入用于轉(zhuǎn)染的模板中可提供具有減毒特征的新型病毒。例如，可在缺失突變中制作與溫度敏感性或冷適應(yīng)性有關(guān)的特異性錯義突變。這些突變應(yīng)比冷適應(yīng)或溫度敏感性突變體有關(guān)的點突變更穩(wěn)定，回復(fù)頻率應(yīng)極低。或者，可構(gòu)建具有"自殺"特征的嵌合型病毒。這種病毒在宿主體內(nèi)只復(fù)制一輪或幾輪。當(dāng)將該重組病毒用作疫苗時，其可經(jīng)歷有限的幾輪復(fù)制并誘導(dǎo)足夠水平的免疫應(yīng)答，但它在人宿主中不會再復(fù)制而致病。與野生型毒株相比，分別缺乏野生型APV和hMPV的一種或多種基因或具有突變基因的重組病毒不能連續(xù)復(fù)制。缺陷型病毒可以在能永久表達這樣的一種或多種基因的細胞系中復(fù)制。缺乏必須基因的病毒可以在這些細胞系中復(fù)制，但當(dāng)給予人宿主時不能完成一輪復(fù)制。這種制品可以轉(zhuǎn)錄和翻譯(在該不完整的輪次中)足夠數(shù)量的基因來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答?；蛘?，可以給予大量的毒株，從而這些制品可用作滅活(殺傷)病毒疫苗。對于滅活疫苗，優(yōu)選將異源基因產(chǎn)物表達為病毒組分，從而使得該基因產(chǎn)物可與病毒體結(jié)合。這種制品的優(yōu)點在于它們是天然病毒并且不必在生產(chǎn)殺傷病毒疫苗過程中用福爾馬林或其它試劑處理使之滅活?；蛘?，從cDNA制備的本發(fā)明重組病毒可以高度減毒，因而其只能復(fù)制幾輪。在某些實施方式中，本發(fā)明疫苗包含減毒的哺乳動物MPV。不想局限于理論，減毒病毒可以是有效的疫苗，即使該減毒病毒不能使細胞產(chǎn)生新的傳染性病毒顆粒，因為病毒蛋白插入宿主的胞質(zhì)膜，從而刺激了免疫應(yīng)答。在本發(fā)明該方面的另一實施方式中，可采用常規(guī)技術(shù)"殺傷"嵌合型病毒來制備滅活疫苗制劑。在其傳染力被破壞的意義上，滅活疫苗是"死的"。優(yōu)選破壞病毒的傳染力而不影響其免疫原性?？捎眉毎囵B(yǎng)物或雞胚的尿囊培養(yǎng)該嵌合型病毒，然后進行區(qū)帶超離心純化，甲醛或P-丙內(nèi)酯滅活以及合并。得到的疫苗通常肌肉內(nèi)接種。可用合適的佐劑配制滅活的病毒以增強免疫應(yīng)答。這種佐劑可包括但不限于礦物凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚陰離子；可能有用的人佐劑，例如BCG、短小棒狀桿菌、ISCOMS和病毒顆粒?？刹捎迷S多方法引入上述疫苗制劑，這些方法包括但不限于口服、真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)皮和鼻內(nèi)以及吸入途徑。優(yōu)選通過設(shè)計該疫苗的病原體天然感染途徑接種此嵌合型病毒疫苗制劑。在某些實施方式中，本發(fā)明涉及免疫原性組合物。該免疫原性組合物含有哺乳動物MPV。在一具體實施方式中，該免疫原性組合物含有人MPV。在某些實施方式中，該免疫原性組合物含有減毒的哺乳動物MPV或減毒的人MPV。在某些實施方式中，該免疫原性組合物還含有藥學(xué)上可接受的載體。5.13劑量方案、給藥和制劑本發(fā)明提供含有能表達一種或多種異源或非天然抗原序列的MPV和APV的疫苗和免疫原性制品，包括減毒形式的病毒、重組形式的MPV和APV、嵌合型MPV和APV。本發(fā)明疫苗或免疫原性制品包括單價疫苗或多價疫苗，包括雙價和三價疫苗。本發(fā)明疫苗或免疫原性制劑可用于提供抵御各種病毒感染的保護作用。特別是，本發(fā)明疫苗或免疫原性制劑可在宿主中提供抵御呼吸道感染的保護作用?？蓡为毥o予本發(fā)明的重組病毒和/或疫苗或免疫原性制劑，或可與其它疫苗聯(lián)合給予。本發(fā)明疫苗或免疫原性制劑優(yōu)選與能提供抵御呼吸道疾病保護作用的其它疫苗或免疫原性制劑聯(lián)合給予，所述其它疫苗或免疫原性制劑例如但不限于呼吸道合胞體病毒疫苗、流感疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、肺炎球菌疫苗、立克次氏體疫苗、葡萄球菌疫苗、百日咳疫苗或抵御呼吸道癌癥的疫苗。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明病毒和/或疫苗與相應(yīng)年齡推薦的兒科疫苗同時給予。例如，在2、4或6月齡時，將本發(fā)明病毒禾Q/或疫苗與DtaP(肌肉內(nèi))、Hib(肌肉內(nèi))、脊髓灰質(zhì)炎疫苗(IPV或OPV)和乙肝疫苗(肌肉內(nèi))同時給予。在12或15月齡時，將本發(fā)明病毒和/或疫苗與Hib(肌肉內(nèi))、脊髓灰質(zhì)炎疫苗(IPV或OPV)、MMRII(SubQ)、Varivax(SubQ)和乙肝疫苗(肌肉內(nèi))同時給予。以下各種出版物總結(jié)了本發(fā)明方法可用的疫苗，例如，TheJordanReport2000(《喬丹報告》)，DivisionofMicrobiologyandInfectiousDiseases(微生物和傳染性疾病分冊)，NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases(國家變態(tài)反應(yīng)和傳染性疾病研究院)，NationalInstitutesofHealth(國家衛(wèi)生研究院)，美國，其內(nèi)容全文納入本文作為參考?？蓪⒈景l(fā)明疫苗或免疫原性制劑本身單獨給予或以藥物組合物或治療性組合物的形式給予?？赏ㄟ^常規(guī)的混合、溶解、成粒、制錠、研磨、乳化、包裹、截留或凍干方法生產(chǎn)含有佐劑和本發(fā)明免疫原性抗原(例如，病毒、嵌合型病毒、突變病毒)的藥物組合物?？捎糜兄趯⒈景l(fā)明抗原制備成藥學(xué)上可用的制品的一種或多種生理上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或輔助物質(zhì)，以常規(guī)方式配制藥物組合物。合適的制劑取決于所選擇的給藥途徑等。當(dāng)本發(fā)明疫苗或免疫原性組合物包含佐劑或與一種或多種佐劑一起給予時，可用的佐劑包括但不限于礦物鹽佐劑或礦物鹽凝膠佐劑、顆粒佐劑、微粒佐劑、粘膜佐劑和免疫刺激性佐劑。佐劑的例子包括但不限于氫氧化鋁、磷酸鋁凝膠、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、角鯊烯或角鯊烯水包油佐劑制劑、生物可降解和生物相容的聚酯、多聚脂質(zhì)體、三萜糖苷或皂苷(如QuilA和QS-21，也以商品名STIMULON、ISCOPREP銷售)、N-乙?；?胞壁酰基-L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(蘇氨?；?MDP，以商品名TERMURTIDE出售)、LPS、單磷酰脂質(zhì)A(3D-MLA，以商品名MPL出售)。本發(fā)明疫苗或免疫原性組合物所給予的對象優(yōu)選哺乳動物、最優(yōu)選人，但也可以是非人動物，包括但不限于靈長類動物、牛、馬、綿羊、豬、家禽(如雞、火雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、小鼠和嚙齒類動物。可采用許多方法引入本發(fā)明疫苗或免疫原性組合物，包括但不限于口服、真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、鼻內(nèi)和吸入途徑以及通過劃痕法(例如，使用分叉針頭在皮膚表層劃痕)。如本領(lǐng)域熟知的那樣，對于局部給藥，可將本發(fā)明疫苗或免疫原性制品配制成溶液、凝膠、軟膏、乳膏、混懸液等。對于鼻內(nèi)或吸入給藥，本發(fā)明所用的制品不難以氣溶膠噴劑形式遞送，所述氣溶膠用合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲垸、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體裝在加壓袋或噴霧器中。以加壓氣溶膠為例，可用閥門確定單位劑量來遞送計量用量?？稍谟糜谖肫骰虼等肫鞯?例如)明膠膠囊和藥盒中裝入由化合物和合適粉基，例如乳糖或淀粉構(gòu)成的粉末混合物。對于注射，可用水溶液，優(yōu)選生理相容的緩沖液，例如漢克斯液、林格液或生理鹽水緩沖液配制疫苗或免疫原性制品。所述溶液可含有配制劑(formulatoryagent)，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸鞍踪|(zhì)可以是粉末形式，從而能在臨用前用合適的載體，例如無菌無熱原水構(gòu)建。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知如何確定給予的疫苗或免疫原性制劑的有效量，特別是借鑒本文的詳述。首先可通過體外試驗估計有效劑量。例如，可釆用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)在動物模型中確定誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的劑量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本文所述結(jié)果不難優(yōu)化各種動物種類的給藥?？蓚€別調(diào)整劑量和間隔。例如，當(dāng)用作免疫原性組合物時，合適劑量是如上所述給予該組合物時能引發(fā)抗體反應(yīng)的用量。當(dāng)用作疫苗時，可在1-36周內(nèi)分成約1-3劑量給予本發(fā)明疫苗或免疫原性制劑。優(yōu)選以約2周-約4個月的間隔給予1或2劑量，此后可定期給予加強接種。交替方案可能適合于單個動物。合適劑量是如上所述給予時，能在免疫動物體內(nèi)產(chǎn)生足以保護該動物免遭感染至少4-12個月的免疫應(yīng)答的疫苗制劑用量。一劑量中存在的抗原量一般是每公斤宿主體重約1pg-約100mg，通常是約10pg-約1mg，優(yōu)選約100pg-約1嗎。合適的劑量范圍根據(jù)注射途徑和患者體積而有所不同，但通常是約0.1mL-約5mL。在一具體實施方式中，給予本發(fā)明病毒和/或疫苗的起始單劑量是至少103TCID5Q、至少104TCID5Q、至少105TCID5Q、至少106TCID5Q。另一具體實施方式給予多劑量的本發(fā)明病毒和/或疫苗。一優(yōu)選實施方式采用在第2、4和6月齡給予初免給藥方案，在出生第二年開始時給予加強劑量。更優(yōu)選多劑量方案中每劑量給予了至少105TCIDso或至少106TCID50。5.13.1攻擊研究采用本試驗確定本發(fā)明重組病毒和本發(fā)明疫苗在動物模型，例如但不限于棉鼠或倉鼠中防止下呼吸道病毒感染的能力?？赏ㄟ^靜脈內(nèi)(IV)途徑、肌肉內(nèi)(IM)途徑或鼻內(nèi)途徑(IN)給予該重組病毒和/或疫苗?？赏ㄟ^技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)給予該重組病毒和/或疫苗。也可采用該試驗使抗體的血清濃度與結(jié)合該抗體的病毒的肺滴度降低相關(guān)聯(lián)。在第0天，通過肌肉內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射或鼻內(nèi)途徑給予各動物組，例如但不限于棉鼠(&'gmocfo"/z^/^，平均體重100g)、彌猴(平均體重2.0kg)感興趣的重組病毒或疫苗或BSA。可在給予本發(fā)明重組病毒或疫苗之前、同時或隨后用野生型病毒感染動物，其中所述野生型病毒是用于產(chǎn)生該疫苗的病毒。在某些實施方式中，給予本發(fā)明重組病毒和/或疫苗至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、l周或l個月或幾個月后用野生型病毒感染動物。感染后，處死棉鼠，收集它們的肺組織，通過噬斑滴定測定肺部病毒滴度。10mg/kg的牛血清白蛋白(BSA訴作陰性對照。釆用夾心ELISA測定攻擊時血清中抗體的濃度。類似地，檢測彌猴的鼻和肺灌洗液中的病毒滴度。5.13.2靶群體在本發(fā)明的某些實施方式中，通過年齡確定本發(fā)明治療和診斷方法的靶群體。在某些實施方式中，本發(fā)明治療和/或診斷方法的靶群體的特征是患有除呼吸道感染外的疾病。在一具體實施方式中，靶群體包括小于2歲的幼兒。在一更具體的實施方式中，小于2歲的兒童未患除呼吸道感染以外的疾病。在其它實施方式中，靶群體包括大于5歲的患者。在一更具體的實施方式中，大于5歲的患者患有其它疾病或病癥，包括囊性纖維化、白血病和非霍奇金淋巴瘤或最近接受了骨髓或腎臟移植。在本發(fā)明一具體實施方式中，耙群體包括其中hMPV感染伴有宿主免疫抑制的對象。在一具體實施方式中，所述對象是免疫受損的個體。在某些實施方式中，本發(fā)明方法的靶群體包括老年人。在一具體實施方式中，要用本發(fā)明方法治療或診斷的對象在冬季受到hMPV感染。5.13.3臨床試驗還可在正常健康成年志愿者組中評估經(jīng)體外試驗和動物模型檢驗的本發(fā)明疫苗或其片段的安全性、耐受性和藥物動力學(xué)?？山?jīng)肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或肺部遞送系統(tǒng)給予志愿者單劑量的本發(fā)明重組病毒和/或本發(fā)明疫苗。各志愿者在接受單劑量的本發(fā)明重組病毒和/或本發(fā)明疫苗之前至少監(jiān)測24小時，各志愿者在臨床部位接受劑量后至少監(jiān)測48小時。然后在給藥后第3、7、14、21、28、35、42、49和56天監(jiān)測作為門診病人的志愿者。在以下間隔時通過留置導(dǎo)管或用10ml紅頭Vacutainer試管直接靜脈穿刺收集血樣(1)給予本發(fā)明重組病毒和/或本發(fā)明疫苗劑量前；(2)給予本發(fā)明重組病毒和/或本發(fā)明疫苗劑量期間；(3)給予本發(fā)明重組病毒和/或本發(fā)明疫苗劑量5分鐘、IO分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時、和48小時后；和(4)給予本發(fā)明重組病毒和/或本發(fā)明疫苗劑量3天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天和56天后。使樣品在室溫下凝固，離心后收集血清?？赏ㄟ^ELISA定量測定患者樣品中本發(fā)明重組病毒和/或本發(fā)明疫苗產(chǎn)生的抗體量。也可監(jiān)測PBMC和肺及鼻灌洗液中的T-細胞免疫力(細胞毒性和輔助應(yīng)答)。從給予本發(fā)明重組病毒和/或本發(fā)明疫苗劑量后各收集間隔的血清抗體水平中扣除給藥前血清抗體水平(背景水平)來校正志愿者血清中抗體的濃度水平。按照不依賴于模型的方法(Gibaldi等編，1982，Pharmacokinetics(《藥物動力學(xué)》),第二版，MarcelDekker，紐約)從校正的血清抗體濃度或抗體片段濃度計算各志愿者的藥物動力學(xué)參數(shù)。5.14哺乳動物MPV的檢測和診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供診斷和/或檢測MPV的手段和方法，所述手段和方法用于檢測MPV、其組分及其轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達、增殖和代謝過程的產(chǎn)物。更具體地說，本發(fā)明提供診斷哺乳動物和人MPV感染的手段和方法，所述手段和方法包括但不限于檢測MPV的各組分、MPV生命周期的產(chǎn)物和宿主對MPV表達或感染起反應(yīng)的產(chǎn)物。本領(lǐng)域熟知用于檢測MPV或其組分及其轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達、增殖和代謝過程的產(chǎn)物的方法，包括但不限于分子方法、抗體方法和細胞方法。分子方法的例子包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實時RT-PCR、核酸序列擴增(NASBA)、寡核苷酸探針、sourthern印跡雜交、northern印跡雜交、涉及使樣品與MPV互補的或與MPV相似或相同的核酸接觸的方法和這些方法彼此或與本領(lǐng)域那些方法的任何組合?？捎帽疚拿枋龅谋绢I(lǐng)域也熟知的相同或相似核酸來區(qū)分MPV與其它病毒和生物的基因組物質(zhì)或相關(guān)產(chǎn)物?？贵w方法的例子包括但不限于使抗體與懷疑含MPV的樣品接觸，直接免疫熒光法(DIF)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡分析、免疫層析。細胞方法的例子包括但不限于當(dāng)與MPV、其組分或其產(chǎn)物接觸時能發(fā)出信號的報道試驗。在另一實施方式中，所述報道試驗是體外試驗，從而在與MPV、其組分或其產(chǎn)物接觸后表達報道(基因)產(chǎn)物。本領(lǐng)域熟知上述方法的例子，本文也描述了這些例子。一更具體的實施方式利用NASBA擴增總核酸庫的特異性RNA或DNA。在一個實施方式中，本發(fā)明提供診斷和檢測MPV的手段和方法，所述手段和方法包括但不限于檢測與MPV相關(guān)或互補的基因組物質(zhì)和其它核酸，檢測MPV的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物(所述產(chǎn)物經(jīng)過加工或未加工)，檢測宿主對MPV接觸或感染起反應(yīng)的組分。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過制備和使用與MPV基因組中存在的核酸序列及核酸序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的寡核苷酸來檢測MPV。此外，本發(fā)明涉及利用所述寡核苷酸作為引物拷貝或擴增MPV基因組及其轉(zhuǎn)錄物的特定區(qū)域來檢測MPV基因組及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在的核酸或其序列?？煽截惢驍U增的MPV基因組及其轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域包括但不限于以下一個或多個基因的完整和不完整的延伸段N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一具體實施方式中，為鑒定目的，將寡核苷酸用作引物結(jié)合拷貝或擴增MPV的N-基因或其轉(zhuǎn)錄物的方法。所述方法包括但不限于利用MPV的遺傳物質(zhì)或其轉(zhuǎn)錄物和互補物作為延伸所述寡核苷酸核酸序列的模板的PCR試驗、RT-PCR試驗、實時RT-PCR試驗、引物延伸或連綴試驗、NASBA和其它方法。另一實施方式采用組合方法檢測樣品中是否存在MPV。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉各試驗的要求和適用性。例如，PCR和RT-PCR可用于擴增或檢測核酸。一更具體的實施方式采用實時RT-PCR來常規(guī)而可靠地定量測定PCR產(chǎn)物。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及通過制備和使用與MPV基因組中存在的核酸序列及核酸序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的寡核苷酸來檢測MPV。此外，本發(fā)明涉及利用所述寡核苷酸序列作為探針雜交和檢測MPV基因組及其轉(zhuǎn)錄物內(nèi)或與之互補的特定區(qū)域來檢測MPV基因組及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在或與之互補的核酸或其序列?？衫秒s交探針檢測的MPV基因組及其轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域包括但不限于以下一個或多個基因的完整和不完整的延伸段N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一具體實施方式中，為鑒定目的，將寡核苷酸用作探針，聯(lián)合檢測MPV的N-基因或其轉(zhuǎn)錄物或與N-基因或其轉(zhuǎn)錄物退火或雜交。所述方法包括但不限于利用MPV的遺傳物質(zhì)或其轉(zhuǎn)錄物和互補物作為靶標(biāo)來雜交、退火或檢測MPV基因組內(nèi)或與其互補的序列或序列延伸段的Northern印跡、Sourthern印跡和其它方法。本發(fā)明方法可用能與哺乳動物MPV的核酸雜交的核酸或其反向互補物或其互補物來檢測是否存在哺乳動物MPV。在某些實施方式中，核酸在高度嚴(yán)格性條件下雜交。例如(但不限于)，釆用這種高度嚴(yán)格性條件的方法如下所示。65°C，將含DNA的濾膜在由6XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA和500嗎/ml變性鮭魚精子DNA組成的緩沖液中預(yù)雜交8小時到過夜。65。C，將濾膜在含100pg/ml變性鮭魚精子DNA和5-20X106cpm的32P-標(biāo)記探針的預(yù)雜交混合物中雜交48小時。37。C，用含2XSSC、0.01%PVP、0.01%Ficoll和0.01%BSA的溶液洗滌濾膜1小時。然后在5(TC先用0.1XSSC洗滌45分鐘，再進行放射自顯影。本領(lǐng)域熟知可用的其它高嚴(yán)格性條件。在本發(fā)明的其它實施方式中，在技術(shù)人員熟知的中等到低嚴(yán)格性條件下進行雜交(參見，例如Sambrook等，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual(《分子克隆，實驗室手冊》)，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；也參見Ausubel等編，干U于CurrentProtocolsinMolecularBiologyseriesoflaboratorytechniquemanuals(《分子生物學(xué)最新方法，實驗室技術(shù)手冊叢書》)，1987-1997，CurrentProtocols,1994-1997，JohnWileyandSons,Inc.,二者各自全文納入本文作為參考)。本發(fā)明方法可用任何大小的寡核苷酸。如本文所述，這種寡核苷酸可用于各種方法，例如作為各種檢測或分析方法的引物或探針。在優(yōu)選的實施方式中，寡核苷酸探針和引物長至少5個、至少8個、至少10個、至少12個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少70個、至少80個、至少100個、至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個或至少5000個堿基。在另一更可靠的實施方式中，寡核苷酸探針和引物含有至少5個、至少8個、至少10個、至少12個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少70個、至少80個、至少100個、至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個或至少5000個堿基，與耙序列，例如MPV基因組序列或其互補序列有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少卯％、至少99%、至少99.5%同源。在另一具體實施方式中，用作引物或探針的寡核苷酸可以是任何長度，在嚴(yán)格性條件下可通過其大多數(shù)3'末端堿基的至少8個與靶序列特異性雜交。在另一具體實施方式中，用作引物或探針的寡核苷酸可以是任何長度，在嚴(yán)格性條件下可通過其大多數(shù)3'末端堿基的至少IO個與靶序列特異性雜交。在另一具體實施方式中，用作引物或探針的寡核苷酸可以是任何長度，在嚴(yán)格性條件下可通過其大多數(shù)3'末端堿基的至少12個與靶序列特異性雜交。在另一具體實施方式中，用作引物或探針的寡核苷酸可以是任何長度，在嚴(yán)格性條件下可通過其大多數(shù)3'末端堿基的至少15個與靶序列特異性雜交。在另一具體實施方式中，用作引物或探針的寡核苷酸可以是任何長度，在嚴(yán)格性條件下可通過其大多數(shù)3'末端堿基的至少20個與靶序列特異性雜交。在另一具體實施方式中，用作引物或探針的寡核苷酸可以是任何長度，在嚴(yán)格性條件下可通過其大多數(shù)3'末端堿基的至少25個與靶序列特異性雜交。另一實施方式利用寡聚物的簡并組(degenerateset)來取代特定位置或核苷酸。簡并可發(fā)生在嚴(yán)格性條件下能與耙序列雜交區(qū)域任何位置或任何數(shù)量的位置，最優(yōu)選在至少一個位置，但也可在至少兩個位置、至少三個位置、至少十個位置。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉本領(lǐng)域已知試驗對寡核苷酸上結(jié)構(gòu)的要求。也可用多種系統(tǒng)方法設(shè)計寡核苷酸引物和探針。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)優(yōu)選的試驗或退火溫度和寡聚物，即序列的結(jié)構(gòu)能確定寡核苷酸引物或探針的合適長度和序列。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過調(diào)節(jié)試驗的溫度能確定試驗所用寡核苷酸引物或探針的特異性，從而能根據(jù)溫度增強或減弱該寡聚物對耙序列的特異性。一優(yōu)選實施方案采用本領(lǐng)域已知方法測定引物或探針的退火溫度后，在所述退火溫度進行該試驗。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些方法來計算寡核苷酸與其特異性靶序列結(jié)合的退火溫度。例如，可通過將與靶序列雜交的寡核苷酸中各G或C核苷酸的退火溫度設(shè)定為4°C來粗略計算退火溫度。在另一實例中，可通過將與耙序列雜交的寡核苷酸中各A或T核苷酸的退火溫度設(shè)定為2'C來粗略計算退火溫度。寡核苷酸的退火溫度必定依賴于該寡核苷酸的長度和序列，也依賴于該寡聚物與其靶序列的互補程度，因此退火溫度只考慮寡聚引物或探針之間的結(jié)合情況。本文所述計算退火溫度的例子只是例子，不表示本發(fā)明不包括測定退火溫度的其它方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉其它的可用方法，此外，本文描述了計算寡核苷酸退火溫度或解鏈溫度的其它更復(fù)雜的方法。在一更具體的實施方式中，寡核苷酸探針和引物在至少3(TC、至少35t:、至少4(TC、至少45t、至少5(TC、至少55。C、至少60。C、至少65。C、至少7(TC、至少8(TC、至少90。C或至少99。C的溫度下退火。本發(fā)明提供鑒定或檢測樣品中MPV的細胞試驗和無細胞試驗。可采用各種方法進行本發(fā)明的細胞試驗和無細胞試驗，包括但不限于利用報道(基因)的那些方法。本文描述了報道(基因)的例子，這些報道(基因)可用于高通量篩選MPV的鑒定或檢測，也可用于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的其它目的。本發(fā)明報道試驗可采用許多方法。例如，可使樣品與包含核酸序列(其含有報道基因)的細胞接觸，和檢測與MPV或MPV的組分接觸后該報道基因的表達來進行細胞試驗，其中所述報道基因與MPV基因的啟動子相連，或與MPV基因產(chǎn)物所識別的啟動子相連。在細胞試驗的另一實施方式中，用編碼一種或多種報道基因的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染MPV能感染的宿主細胞，因而報道基因可在有MPV或MPV組分存在下表達。在這種實施方式中，報道基因與MPV或其組分所識別的核酸序列操作性相連，從而導(dǎo)致該報道基因表達?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法檢測樣品中MPV誘導(dǎo)的報道基因表達，本文也描述了這些報道基因(章節(jié)5.8.2)。在細胞檢測試驗中可用于轉(zhuǎn)染的宿主細胞例子包括但不限于Vero、tMK、C0S7細胞。在另一實施方式中，宿主細胞是可用MPV感染的任何細胞。因此，報道基因表達表明存在MPV或其組分。在無細胞試驗中，使樣品與含報道基因的核酸接觸，所述報道基因與該核酸序列操作性相連，因而存在的MPV或其組分誘導(dǎo)了報道基因的體外表達。例如，可使懷疑含有MPV或其組分的樣品與含報道基因的核酸接觸，和檢測與MPV或MPV的組分接觸后該報道基因的表達來進行無細胞試驗，其中所述報道基因與MPV基因的啟動子相連，或與MPV基因產(chǎn)物識別的啟動子相連。因此，報道基因的表達表明存在MPV或其組分。盡管本領(lǐng)域已知大量報道化合物，但本文提供了各種例子(參見，例如章節(jié)5.8.2)。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及利用小復(fù)制子系統(tǒng)檢測MPV感染。例如，可用編碼一種或多種報道基因的hMPV小復(fù)制子構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細胞，因而報道基因在有hMPV或hMPV聚合酶存在下表達。本文在章節(jié)5.8.2描述了報道基因的例子。在這種實施方式中，hMPV用作輔助病毒來促進小復(fù)制子系統(tǒng)所編碼的一種或多種報道基因表達。不想局限于理論，hMPV提供的聚合酶能驅(qū)動小復(fù)制子系統(tǒng)的拯救，因而驅(qū)動了一種或多種報道基因的表達。在某些實施方式中，將用編碼報道基因的hMPV小復(fù)制子系統(tǒng)轉(zhuǎn)染的宿主細胞與懷疑含有hMPV的樣品接觸?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法檢測樣品中存在hMPV誘導(dǎo)的報道基因表達，本文也描述了這些報道基因(章節(jié)5.8.2)。宿主細胞的例子包括但不限于Vero、tMK、C0S7細胞。在另一實施方式中，宿主細胞是能用hMPV感染任何細胞。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及通過制備和使用特異性能識別MPV或其基因產(chǎn)物的特征性肽或核酸的抗體，例如單克隆抗體(MAb)來檢測動物或人宿主中的MPV感染。所述MAb識別的表位或抗原性決定簇包括但不限于參與MPV生命周期和增殖的代謝過程中合成的蛋白與核酸產(chǎn)物。可用作抗原性決定簇來產(chǎn)生合適抗體的蛋白或核酸產(chǎn)物包括但不限于以下一種或多種MPV組分的完整和不完整轉(zhuǎn)錄和表達產(chǎn)物N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一具體實施方式中，將產(chǎn)生的針對G-基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其諸部分的MAb與其它方法聯(lián)用來檢測或驗證生物學(xué)樣品，例如體液中MPV表達的G肽。所述方法包括但不限于利用MPV基因的轉(zhuǎn)錄或表達產(chǎn)物作為耙標(biāo)來檢測產(chǎn)生的抗所述靶標(biāo)或其諸部分及相關(guān)物質(zhì)的MAb的ELISA、放射性免疫或競爭試驗、免疫沉淀和其它方法。在本發(fā)明的另一實施方式中，可用于檢測hMPV的抗體能識別所有四種亞型的F、G、N、L、M、M2-l、P和SH蛋白。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及檢測宿主對MPV接觸或感染的免疫應(yīng)答有關(guān)的和特征性的因素。接觸或感染MPV后，宿主的免疫系統(tǒng)對所述接觸或感染引發(fā)應(yīng)答反應(yīng)，包括宿主產(chǎn)生的能消除或減輕病毒作用和/或增殖的抗體。本發(fā)明提供通過檢測宿主因接觸或感染MPV而產(chǎn)生的上述抗體來診斷MPV相關(guān)疾病的手段和方法。所述抗體識別的表位包括但不限于宿主免疫應(yīng)答可接近并且在宿主對病毒產(chǎn)生免疫應(yīng)答中可用作抗原性決定簇的肽及其暴露的表面?？捎米鞅砦徽T導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體的一些蛋白質(zhì)與核酸物質(zhì)包括但不限于以下一種或多種MPV組分的產(chǎn)物N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一個實施方式中，在宿主樣品中檢測到針對MPVN-基因編碼肽的部分或完全可接近部分的抗體。在一具體實施方式中，將針對G-基因的蛋白產(chǎn)物或其諸部分與其它方法聯(lián)用來檢測生物學(xué)樣品，例如體液中存在的宿主抗體。所述方法包括但不限于利用MPV基因的轉(zhuǎn)錄或表達產(chǎn)物作為耙標(biāo)來檢測識別所述產(chǎn)物并在生物學(xué)樣品中發(fā)現(xiàn)的宿主抗體的ELISA、放射性免疫或競爭試驗和其它方法。本發(fā)明也提供診斷試驗用的手段和方法，或檢驗試劑盒以檢測各種來源，包括但不限于生物學(xué)樣品，例如體液中MPV感染的方法。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及適用于鑒定MPV核酸或其互補物的試驗、試劑盒、方法和工藝。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及適用于鑒定MPV表達的肽或其一部分的試驗、試劑盒、方法和工藝。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及適用于鑒定針對MPV接觸或感染的宿主免疫應(yīng)答諸組分的試驗、試劑盒、方法和工藝。除了診斷性驗證宿主的MPV感染外，本發(fā)明也提供將MPV分類成不同系統(tǒng)發(fā)育群或亞群的手段和方法。在一個實施方式中，優(yōu)選利用該特征區(qū)分MPV的不同變體，變體A1、A2、B1和B2來設(shè)計更有效的亞群特異性治療方法。可根據(jù)以下一種或多種基因的核苷酸序列或氨基酸序列來區(qū)分MPV的變體N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一具體實施方式中，可利用G基因或糖蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列和使用也能識別G糖蛋白的單克隆抗體的中和檢驗將MPV分成具體亞群。在一個實施方式中，釆用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)，例如免疫測定診斷人的MPV感染。可用于分析免疫特異性結(jié)合與交叉反應(yīng)性的免疫測定包括但不限于采用以下技術(shù)的競爭性和非競爭性試驗系統(tǒng):例如蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、夾心免疫測定、免疫沉淀試驗、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴散沉淀反應(yīng)、免疫擴散試驗、凝集試驗、補體結(jié)合試驗和熒光免疫測定，僅舉幾例。這些試驗是本領(lǐng)域常規(guī)和熟知的(參見，例如全文納入本文作為參考的Ausubel等編，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《最新分子生物學(xué)方法》)，第一巻，JohnWiley&Sons,Inc.,紐約)，免疫測定的非限制性例子描述于章節(jié)5.8.。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及聯(lián)用寡核苷酸檢測MPV感染和用PCR或引物延伸方法來拷貝或擴增MPV基因組的區(qū)域，所述區(qū)域包括但不限于基因或基因的諸部分，例如N、M、F、G、L、M、P和M2基因。在一具體實施方式中，聯(lián)用寡核苷酸與RT-PCR方法。在另一實施方式中，可用與特定序列互補的寡核苷酸檢測擴增產(chǎn)物和/或遺傳物質(zhì)，所述特定序列是各hMPV毒株之間保守的或在各hMPV毒株之間獨特的序列。后一組寡核苷酸可以鑒定導(dǎo)致宿主感染的特定MPV毒株。本發(fā)明提供區(qū)分能感染宿主的hMPV不同亞群和變體的方法。一具體實施方式將導(dǎo)致宿主感染的hMPV分類成特定亞群，例如亞群A或亞群B。另一具體實施方式將導(dǎo)致宿主感染的hMPV分成某亞群的特定變體，例如變體Al、A2、Bl和B2。在另一實施方式中，本發(fā)明提供將導(dǎo)致宿主感染的hMPV分類成新亞群和/或新的或現(xiàn)有亞群新變體的手段和方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知將hMPV毒株分類成亞群和/或變體群的方法。在一個實施方式中，利用多克隆抗體將感染病原分類為hMPV某毒株，利用第二抗體將所述毒株區(qū)分為hMPV新的或已知的亞群和/或新的或已知的變體。一個實施方式聯(lián)用對hMPV具有選擇性的抗體與免疫反應(yīng)試驗，例如ELISA或RIA來鑒定生物學(xué)樣品中是否接觸或感染了hMPV。另一實施方式利用對hMPV蛋白的肽序列中特定表位具有選擇性的第二抗體將鑒定的所述hMPV感染的病原進一步分類成亞群或變體。在一具體實施方式中，利用產(chǎn)生的針對hMPV所有亞群之間共有的肽表位的抗體將感染病原鑒定為hMPV。在另一具體實施方式中，利用產(chǎn)生的針對hMPV不同亞群和/或變體的獨特肽表位的抗體將導(dǎo)致宿主感染的hMPV鑒定為已知的或新的亞群和/或變體。在一具體實施方式中，能區(qū)分hMPV不同亞群和/或變體的抗體能識別亞群或變體獨特hMPV肽的諸區(qū)段，所述肽包括但不限于N、M、F、G、L、M、P和M2基因編碼的那些肽?？衫酶鞣NhMPV蛋白的已知肽序列中的差異與親水性圖來選擇可用于產(chǎn)生能區(qū)分不同hMPV亞群或變體的抗體的肽或肽區(qū)段，所述親水性圖可用于鑒定預(yù)計在診斷試驗中溶劑可接觸或可接近的合適肽區(qū)段。在一個實施方式中，能區(qū)分hMPV不同亞群的抗體能識別hMPV不同亞群F蛋白中的獨特差異，例如全長F蛋白的286、296、312、348和404位的氨基酸。在另一具體實施方式中，能區(qū)分hMPV不同亞群和/或變體的抗體能識別hMPV特定亞群或變體G蛋白中獨特的區(qū)段，例如可利用對應(yīng)于SEQIDNO:119氨基酸50-60的G肽序列區(qū)分亞群A和B以及變體A1、A2、B1和B2。本發(fā)明另一實施方式利用hMPV分離物的核苷酸序列區(qū)分hMPV的不同亞群和/或不同變體。一個實施方式聯(lián)用與hMPV基因組中序列相互補的寡核苷酸序列、引物和/或探針和本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法，例如RT-PCR、PCR、引物連綴試驗和各種印跡技術(shù)將hMPV感染病原分類為不同亞群和/或變體。一具體實施方式采用RT-PCR，利用生物學(xué)樣品拷貝或擴增hMPV基因組的特定區(qū)段。另一實施方式獲得了所述區(qū)段的序列，將其與hMPV的己知序列比較，采用所述比較將hMPV毒株分類為不同亞群或變體或?qū)MPV毒株分類為新的亞群或變體。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及可用于區(qū)分hMPV不同亞群和/或變體的診斷試劑盒。一優(yōu)選實施方式用對導(dǎo)致所述感染的所述具體病毒最特異的試劑診斷和/或治療該病毒感染。在此情況中，這表示優(yōu)選用對MPV最特異的試劑進行MPV感染的診斷和/或治療。然而，這絕非表示不能使用特異性較低但交叉反應(yīng)性足夠的試劑，例如因為這些試劑易于獲得并足以解決手頭的任務(wù)。例如，本文在詳述中提供了利用源自APV的試劑，特別是源自APV-C的試劑進行病毒學(xué)和/或血清學(xué)診斷哺乳動物的MPV感染，例如已證明采用專為檢測鳥類APV抗體設(shè)計的ELISA進行血清學(xué)診斷哺乳動物的MPV感染足夠可靠。為此目的的特別有用的檢驗是為檢測APV抗體(例如，在血清或蛋黃中)設(shè)計的ELISA檢驗，已知其一種可商品化購得的形式是SVANOVABiotechAB(UppsalScienceParkGluntenSE-75183Uppsala，瑞典)生產(chǎn)的APV-AbSVANOVIR。反過來也是一樣，例如，本文在詳述中提供了利用MPV衍生的試劑進行病毒學(xué)和/或血清學(xué)診斷哺乳動物的APV感染，例如已證明采用為檢測MPV抗體設(shè)計的ELISA進行血清學(xué)診斷鳥類的APV感染足夠可靠?？紤]到抗原和抗體具有鎖與鑰匙的關(guān)系，可選擇具有足夠交叉反應(yīng)性的合適抗體來檢測各種抗原。當(dāng)然，由于依賴于這種交叉反應(yīng)性，最好選擇對各種病毒的各種(糖)蛋白之間存在同源性氨基酸的試劑(例如，抗原或抗體)，因而與最高同源性蛋白相關(guān)的試劑在依賴于所述交叉反應(yīng)性的檢驗中最有用。核酸檢測甚至更簡單，無需根據(jù)各種病毒的異源核酸序列設(shè)計引物或探針，因而檢測實質(zhì)上哺乳動物或禽偏肺病毒之間的差異足以根據(jù)顯示高度同源性的病毒特異性核酸序列的那些延伸段設(shè)計或選擇引物或探針。對于核酸序列，90%或更高的同源性百分比通常能保證采用嚴(yán)格雜交條件的診斷檢驗具有充分交叉反應(yīng)性。例如，本發(fā)明提供病毒學(xué)診斷動物，特別是哺乳動物，更具體地說是人的MPV感染的方法，包括通過使所述樣品與MPV特異性核酸或本發(fā)明抗體反應(yīng)來測定所述動物樣品中是否存在病毒分離物或其組分；還提供血清學(xué)診斷哺乳動物MPV感染的方法，包括通過使所述樣品與MPV特異性蛋白分子或其片段或本發(fā)明抗原反應(yīng)來測定所述哺乳動物的樣品中是否存在特異性抗MPV或其組分的抗體。本發(fā)明也提供診斷MPV感染的診斷試劑盒，所述試劑盒中裝有MPV、MPV-特異性核酸、蛋白分子或其片段、本發(fā)明抗原和/或抗體，優(yōu)選裝有檢測所述MPV、MPV-特異性核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗體的裝置，例如，所述裝置含有可激發(fā)的基團，如本領(lǐng)域使用的熒光團或酶檢測系統(tǒng)(合適的診斷試劑盒形式的例子包括IF、ELISA、中和試驗、RT-PCR試驗)。為確定尚未鑒定的病毒組分或其合成類似物，例如核酸、蛋白分子或其片段是否能鑒定為MPV特異性，采用本文提供的(例如)系統(tǒng)發(fā)育分析通過與已知的MPV序列和已知的非MPV序列(優(yōu)選用APV-C)進行序列同源性比較，足以分析所述組分的核酸序列或氨基酸序列，例如對于所述核酸或所述氨基酸的延伸段，分別優(yōu)選比較至少10個、更優(yōu)選至少25個、還要優(yōu)選至少40個核苷酸或氨基酸?？梢愿鶕?jù)所述MPV或非MPV序列的相關(guān)程度鑒定該組分或合成類似物。本發(fā)明也提供病毒學(xué)診斷哺乳動物MPV感染的方法，包括通過使所述樣品與源自APV(優(yōu)選血清型C)的交叉反應(yīng)性核酸反應(yīng)，或能與所述APV反應(yīng)的交叉反應(yīng)性抗體反應(yīng)來測定所述哺乳動物樣品中是否存在病毒分離物或其組分；還提供血清學(xué)診斷哺乳動物MPV感染的方法，包括使所述樣品與源自APV的蛋白分子或其片段或抗原反應(yīng)來測定所述哺乳動物的樣品中是否存在也對APV或其組分具有交叉反應(yīng)性的抗體。此外，本發(fā)明提供最初為檢測AVP或AVP-抗體設(shè)計的診斷試劑盒在診斷MPV感染，特別是檢測人的MPV感染中的應(yīng)用。本發(fā)明也提供病毒學(xué)診斷鳥類APV感染的方法，包括使所述鳥類樣品與源自MPV的交叉反應(yīng)性核酸或能與所述MPV反應(yīng)的交叉反應(yīng)性抗體反應(yīng)來測定所述樣品中是否存在病毒分離物或其組分；還提供血清學(xué)診斷鳥類APV感染的方法，包括使所述鳥類樣品與源自MPV的蛋白分子或其片段或抗原反應(yīng)來測定所述樣品中是否存在也對MPV或其組分具有交叉反應(yīng)性的抗體。此外，本發(fā)明提供最初為檢測MPV或MPV-抗體設(shè)計的診斷試劑盒在診斷APV感染，特別是檢測家禽，例如雞、鴨或火雞的APV感染中的應(yīng)用。對于用于治療的診斷，特別是當(dāng)手頭條件造成不能直接釆用更同源的方法時，可利用不同哺乳動物MPV間的高度同源性和MPV與其它病毒，例如APV之間的高度同源性。得不到所需疫苗接種，例如抵御MPV感染的緊急疫苗，如當(dāng)無法得到更具同源性的MPV疫苗時，可用源自APV(優(yōu)選C型)分離物的疫苗制品，反之亦然，可考慮用源自MPV的疫苗制品接種來抵御APV感染。反向遺傳技術(shù)也可能產(chǎn)生用作疫苗的嵌合型APV-MPV病毒構(gòu)建物，其與待減毒至理想水平的各毒株的現(xiàn)場分離物(fieldisolate)十分不同。相似的反向遺傳技術(shù)也可能產(chǎn)生用于疫苗制品的嵌合型副黏病毒-偏肺病毒構(gòu)建物，例如RSV-MPV或P13-MPV構(gòu)建物。這些構(gòu)建物尤其可用作組合疫苗來抵御呼吸道疾病。由于實際上不能區(qū)分tMK或其它細胞培養(yǎng)物中MPV導(dǎo)致的CPE與hRSV或hPIV-l導(dǎo)致的CPE，迄今為止未能充分注意到MPV。由于tMK(第三代猴腎細胞，即細胞培養(yǎng)中第三代的MK細胞)與原代或二代培養(yǎng)物相比成本較低而優(yōu)選使用。此種CPE以及經(jīng)典副黏病毒科產(chǎn)生的一些CPE特征在于形成合胞體，然后細胞顯示快速內(nèi)部破裂，隨后細胞從單層脫離。感染此病毒的細胞通常(但不總是)在原始病毒傳代3次后(接種后第10-14天)出現(xiàn)CPE，稍晚于其它病毒，例如hRSV或hPIV-l所致的CPE。例如，本發(fā)明提供的28位嚴(yán)重RTI患兒的鼻咽抽吸物樣品中以前未鑒定到副黏病毒。這些兒童的臨床癥狀很大程度上類似于hRSV導(dǎo)致的那些癥狀。27位患者是5歲以下的兒童，這些患者中有一半年紀(jì)在l-12個月之間。另一患者18歲。所有個體患有上呼吸道RTI，癥狀從咳嗽、肌痛、嘔吐和發(fā)熱到支氣管炎和嚴(yán)重的肺炎。這些患者中的大多數(shù)住院治療l-2周。這些患者的病毒分離物在負對比電子顯微鏡(negativecontrastelectronmicrosc叩y)中顯示副黏病毒形態(tài)，但不與已知的人和動物副黏病毒的特異性抗血清反應(yīng)。用產(chǎn)生的針對兩種分離物的血清作間接免疫熒光試驗(IFA)測定它們彼此緊密相關(guān)。這些分離物中9種的序列分析揭示此病毒與APV稍許相關(guān)。根據(jù)病毒學(xué)數(shù)據(jù)、序列同源性以及基因組構(gòu)成，我們提出此病毒是偏肺病毒屬的成員。血清學(xué)檢測顯示該病毒是一種相當(dāng)常見的病原體，因為在荷蘭5歲人的血清陽性率接近100%。此外，發(fā)現(xiàn)1958年收集的人血清中血清陽性率同樣高，表明在人群中已流行了40年以上。鑒定到偏肺病毒屬所提出的新成員也為開發(fā)病毒性呼吸道感染的診斷試驗或檢驗試劑盒和疫苗或血清或抗體組合物的裝置和方法，及檢驗或篩選用于治療MPV感染的抗病毒劑的方法提供了依據(jù)。本文提供的病毒學(xué)或血清學(xué)方法和手段特別可用于診斷MPV感染的診斷試劑盒。例如，這種試劑盒或試驗可包含本發(fā)明病毒、核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗體。本發(fā)明病毒、核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗體也可用于產(chǎn)生，例如治療或預(yù)防MPV感染和/或治療或預(yù)防呼吸道疾病(特別是人中)的藥物組合物。為此目的開發(fā)的己有方法可實現(xiàn)病毒的減毒，包括但不限于利用其它種類的相關(guān)病毒，通過實驗室動物或/和組織/細胞培養(yǎng)物連續(xù)傳代，分子克隆的定點誘變及相關(guān)病毒之間的基因或基因片段交換。已描述了hMPV的四種不同亞型，稱為亞型A1、A2、B1禾BB2。本發(fā)明涉及利用對所有四種亞型敏感的一次試驗檢測宿主的hMPV感染?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法檢測宿主中是否存在hMPV。本發(fā)明一更具體的實施方式采用靈敏的Taqman試驗檢測宿主中是否存在hMPV。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于這種試驗中的寡核苷酸和探針的設(shè)計要求?？蓪⑦@種寡核苷酸和探針設(shè)計成能特異性識別hMPV基因組的任何區(qū)域、其轉(zhuǎn)錄物或加工和未加工產(chǎn)物。在本發(fā)明一更具體實施方式中，本發(fā)明寡核苷酸和探針與hMPV所有亞型中的某序列、其轉(zhuǎn)錄物或其加工和未加工產(chǎn)物，例如A1、Bl、A2和B2互補、相同或相似。具體地說，所述寡核苷酸和探針與hMPV所有四種亞型的序列、其轉(zhuǎn)錄物或加工和未加工產(chǎn)物的負拷貝(negativecopy)或正拷貝(positivecopy)有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或99.5%相同。在另一實施方式中，其與hMPV所有四種亞型的序列的負拷貝或正拷貝互補。任何長度的寡核苷酸和探針可用于本發(fā)明檢測試驗。本領(lǐng)域已知可用的典型雜交和洗滌條件。這些條件優(yōu)選能使探針特異性結(jié)合和防止非特異性結(jié)合或易于清除非特異性結(jié)合。在本發(fā)明還有另一更具體的實施方式中，本發(fā)明寡核苷酸和探針與hMPV基因組內(nèi)的任何開放讀框，包括但不限于N-基因、P-基因、F-基因、M-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因，或其加工和未加工產(chǎn)物互補。在本發(fā)明甚至更具體的實施方式中，本發(fā)明寡核苷酸和探針識別N-基因、其轉(zhuǎn)錄物或其加工和未加工產(chǎn)物。在還有另一實施方式中，以相同特異性識別所有四種亞型的hMPV。可分離獲自宿主的任何生物學(xué)樣品中的病毒。在本發(fā)明一更具體的實施方式中，收集宿主鼻咽樣品用于本發(fā)明檢測試驗。為檢測目的可用能支持hMPV的各種細胞系，包括但不限于Vero和tMK細胞增殖病毒。可采用技術(shù)人員已知的許多方法檢測病毒RNA。在一具體實施方式中，采用TaqmanPCR方法檢測病毒RNA。5.15本發(fā)明組合物與哺乳動物偏肺病毒組分本發(fā)明也涉及哺乳動物MPV的核酸序列、哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)和針對哺乳動物MPV的抗體。本發(fā)明還涉及哺乳動物MPV的核酸序列的同系物和哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)的同系物。本發(fā)明還涉及編碼融合蛋白核酸序列，其中所述融合蛋白含有哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)或其片段和并非源自哺乳動物MPV的一種或多種肽或蛋白質(zhì)。在一具體實施方式中，本發(fā)明融合蛋白含有哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)或其片段和肽標(biāo)簽，例如但不限于聚組氨酸標(biāo)簽。本發(fā)明還涉及融合蛋白，其中所述融合蛋白含有哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)或其片段和并非源自哺乳動物MPV的一種或多種肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及編碼哺乳動物MPV蛋白質(zhì)的核酸的衍生物。本發(fā)明也涉及哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)的衍生物。衍生物可以是但不限于蛋白質(zhì)的突變形式，例如但不限于添加、缺失、截短、取代和翻轉(zhuǎn)。衍生物還可以是嵌合形式的哺乳動物MPV蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的至少一個結(jié)構(gòu)域衍生自不同蛋白質(zhì)。衍生物也可以是與另一種分子，例如藥物共價或非共價相連的哺乳動物MPV蛋白質(zhì)形式。稱為NL/l/00(也稱為OO-l)的病毒分離物是哺乳動物MPV的變體Al，其基因組序列見SEQIDNO:19。稱為NL/17/00的病毒分離物是哺乳動物MPV的變體A2，其基因組序列見SEQIDNO:20。稱為NL/l/99(也稱為99-1)的病毒分離物是哺乳動物MPV的變體B1，其基因組序列見SEQIDNO:18。稱為NL/1/94的病毒分離物是哺乳動物MPV的變體B2，其基因組序列見SEQIDNO:21。本申請中公開了序列表及相應(yīng)的SEQIDNo見表14。哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)可以是N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白或M2-2蛋白或其片段。哺乳動物MPV蛋白質(zhì)片段的長度可以是至少25個氨基酸、至少50個氨基酸、至少75個氨基酸、至少100個氨基酸、至少125個氨基酸、至少150個氨基酸、至少175個氨基酸、至少200個氨基酸、至少225個氨基酸、至少250個氨基酸、至少275個氨基酸、至少300個氨基酸、至少325個氨基酸、至少350個氨基酸、至少375個氨基酸、至少400個氨基酸、至少425個氨基酸、至少450個氨基酸、至少475個氨基酸、至少500個氨基酸、至少750個氨基酸、至少1000個氨基酸、至少1250個氨基酸、至少1500個氨基酸、至少1750個氨基酸、至少2000個氨基酸或至少2250個氨基酸。哺乳動物MPV蛋白質(zhì)的片段的長度可以是最多25個氨基酸、最多50個氨基酸、最多75個氨基酸、最多IOO個氨基酸、最多125個氨基酸、最多150個氨基酸、最多175個氨基酸、最多200個氨基酸、最多225個氨基酸、最多250個氨基酸、最多275個氨基酸、最多300個氨基酸、最多325個氨基酸、最多350個氨基酸、最多375個氨基酸、最多400個氨基酸、最多425個氨基酸、最多450個氨基酸、最多475個氨基酸、最多500個氨基酸、最多750個氨基酸、最多1000個氨基酸、最多1250個氨基酸、最多1500個氨基酸、最多1750個氨基酸、最多2000個氨基酸或最多2250個氨基酸。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是N蛋白，該N蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近哺乳動物MPV的N蛋白，例如SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21(SEQIDNo的描述也參見表14)所示病毒基因組編碼的N蛋白，而不是C型APV的N蛋白。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是P蛋白，該P蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近哺乳動物MPV的P蛋白，例如SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的P蛋白，而不是C型APV的P蛋白。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是M蛋白，該M蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近哺乳動物MPV的M蛋白，例如SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的M蛋白，而不是C型APV的M蛋白。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是F蛋白，該F蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近哺乳動物MPV的P蛋白，例如SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的F蛋白，而不是C型APV的F蛋白。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是M2-1蛋白，該M2-1蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近哺乳動物MPV的M2-l蛋白，例如SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的M2-l蛋白，而不是C型APV的M2-1蛋白。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是M2-2蛋白，該M2-2蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近哺乳動物MPV的M2-2蛋白，例如SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的M2-2蛋白，而不是C型APV的M2-2蛋白。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是G蛋白，該G蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近哺乳動物MPV的G蛋白，例如SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的G蛋白，而不是C型APV的任何蛋白。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是SH蛋白，該SH蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近哺乳動物MPV的SH蛋白，例如SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的SH蛋白，而不是C型APV的任何蛋白。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是L蛋白，該L蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近哺乳動物MPV的L蛋白，例如SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的SH蛋白，而不是C型APV的任何蛋白。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是N蛋白，該N蛋白與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的N蛋白的氨基酸序列(各N蛋白的氨基酸序列公開于SEQIDNO:366-369;也參見表14)有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是N蛋白，該P蛋白與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的P蛋白的氨基酸序列(各P蛋白的氨基酸序列公開于SEQIDNO:374-377;也參見表14)有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是M蛋白，該M蛋白與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的M蛋白的氨基酸序列(各M蛋白的氨基酸序列公開于SEQIDNO:358-361;也參見表14)有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是F蛋白，該F蛋白與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的F蛋白的氨基酸序列(各F蛋白的氨基酸序列公開于SEQIDNO:314-317;也參見表14)有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是M2-1蛋白，該M2-1蛋白與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的M2-l蛋白的氨基酸序列(各M2-l蛋白的氨基酸序列公開于SEQIDNO:338-341;也參見表14)有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是M2-2蛋白，該M2-2蛋白與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的M2-2蛋白的氨基酸序列(各M2-2蛋白的氨基酸序列公開于SEQIDNO:346-349;也參見表14)有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是G蛋白，該G蛋白與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的G蛋白的氨基酸序列(各G蛋白的氨基酸序列公開于SEQIDNO:322-325;也參見表14)有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是SH蛋白，該SH蛋白與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的SH蛋白的氨基酸序列(各SH蛋白的氨基酸序列公開于SEQIDNO:382-385;也參見表14)有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在本發(fā)明的某些實灘方式中，所述哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)是L蛋白，該L蛋白與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因組編碼的L蛋白的氨基酸序列(各L蛋白的氨基酸序列公開于SEQIDNO:330-333;也參見表14)有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。哺乳動物MPV蛋白質(zhì)的片段與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒編碼的同源性蛋白在該蛋白與該片段同源的部分上有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在一具體的示范性實施方式中，本發(fā)明提供含有F蛋白胞外域的哺乳動物MPV的F蛋白片段及其同源物。所述含有胞外域的F蛋白片段的同源物與含有SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒編碼的F蛋白胞外域(各F蛋白的氨基酸序列公開于SEQIDNO:314-317;也參見表14)的相應(yīng)片段有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在某些實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的蛋白及其片段。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的N蛋白，該N蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒編碼的N蛋白，而不是SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所編碼病毒編碼的N蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的G蛋白，該G蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒編碼的G蛋白，而不是SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所編碼病毒編碼的G蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的P蛋白，該P蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒編碼的P蛋白，而不是SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所編碼病毒編碼的P蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的M蛋白，該M蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒編碼的M蛋白，而不是SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所編碼病毒編碼的M蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的N蛋白，該F蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒編碼的F蛋白，而不是SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所編碼病毒編碼的F蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的M2-l蛋白，該M2-l蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒編碼的M2-l蛋白，而不是SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所編碼病毒編碼的M2-l蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的M2-2蛋白，該M2-2蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒編碼的M2-2蛋白，而不是SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所編碼病毒編碼的M2-2蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的SH蛋白，該SH蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒編碼的SH蛋白，而不是SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所編碼病毒編碼的SH蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的L蛋白，該L蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒編碼的L蛋白，而不是SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所編碼病毒編碼的L蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群B的蛋白及其片段。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群B的N蛋白，該N蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:18或SEQIDNO:2所示病毒編碼的N蛋白，而不是SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所編碼病毒編碼的N蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的G蛋白，該G蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒編碼的G蛋白，而不是SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所編碼病毒編碼的G蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的P蛋白，該P蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒編碼的P蛋白，而不是SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所編碼病毒編碼的P蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的M蛋白，該M蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒編碼的M蛋白，而不是SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所編碼病毒編碼的M蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的N蛋白，該F蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒編碼的F蛋白，而不是SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所編碼病毒編碼的F蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的M2-l蛋白，該M2-l蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒編碼的M2-l蛋白，而不是SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所編碼病毒編碼的M2-l蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的M2-2蛋白，該M2-2蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒編碼的M2-2蛋白，而不是SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所編碼病毒編碼的M2-2蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的SH蛋白，該SH蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒編碼的SH蛋白，而不是SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所編碼病毒編碼的SH蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV亞群A的L蛋白，該L蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒編碼的L蛋白，而不是SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所編碼病毒編碼的L蛋白。本發(fā)明還提供哺乳動物MPV變體A1、A2、B1和B2的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的某些實施方式中，哺乳動物MPV不同變體的蛋白質(zhì)可通過它們的氨基酸序列相同性而彼此相區(qū)分。哺乳動物MPV的變體可以是但不限于Al、A2、Bl或B2。然而，本發(fā)明也考慮了哺乳動物MPV的另一變體成員的分離物。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1的G蛋白，該哺乳動物MPV變體B1的G蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B1的原型(分離物NL/1/99)G蛋白，而不是變體A1的原型(分離物NL/1/00)G蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)G蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)G蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1的G蛋白，該G蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/99(SEQIDNO:324)所示哺乳動物MPV變體Bl的G蛋白有至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Bl的N蛋白，該哺乳動物MPV變體B1的N蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B1的原型(分離物NL/1/99)N蛋白，而不是變體A1的原型(分離物NL/1/00)N蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)N蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)N蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1的N蛋白，該N蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/99(SEQIDNO:368)所示哺乳動物MPV變體B1的N蛋白有至少98.5%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Bl的P蛋白，該哺乳動物MPV變體B1的P蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B1的原型(分離物NL/1/99)P蛋白，而不是變體A1的原型(分離物NL/1/00)P蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)P蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)P蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Bl的P蛋白，該P蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/99(SEQIDNO:376)所示哺乳動物MPV變體B1的P蛋白有至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1的M蛋白，該哺乳動物MPV變體B1的M蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B1的原型(分離物NL/1/99)M蛋白，而不是變體A1的原型(分離物NL/1/00)M蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)M蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)M蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1.的M蛋白，該M蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/99(SEQIDNO:360)所示哺乳動物MPV變體B1的M蛋白相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1的F蛋白，該哺乳動物MPV變體B1的F蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B1的原型(分離物NL/1/99)F蛋白，而不是變體A1的原型(分離物NL/1/00)F蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)F蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)F蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1的F蛋白，該F蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/99(SEQIDNO:316)所示哺乳動物MPV變體Bl的F蛋白有至少99%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1的M2-1蛋白，該哺乳動物MPV變體Bl的M2-l蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體Bl的原型(分離物NL/1/99)M2-1蛋白，而不是變體Al的原型(分離物NL/1/00)M2-1蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)M2-1蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)M2-1蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Bl的M2-l蛋白，該M2-l蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/99(SEQIDNO:340)所示哺乳動物MPV變體Bl的M2-l蛋白有至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1的M2-2蛋白，該哺乳動物MPV變體Bl的M2-2蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體Bl的原型(分離物NL/l/99)M2-2蛋白，而不是變體Al的原型(分離物NL/l/00)M2-2蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)M2-2蛋白或B2的原型(分離物NL/l/94)M2-2蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Bl的M2-2蛋白，該M2-2蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/99(SEQIDNO:348)所示哺乳動物MPV變體Bl的M2-2蛋白有至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Bl的SH蛋白，該哺乳動物MPV變體B1的SH蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B1的原型(分離物NL/1/99)SH蛋白，而不是變體A1的原型(分離物NL/1/00)SH蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)SH蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)SH蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Bl的SH蛋白，該SH蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/99(SEQIDNO:384)所示哺乳動物MPV變體B1的SH蛋白有至少83。/。、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5。/4目同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1的L蛋白，該哺乳動物MPV變體Bl的L蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體Bl的原型(分離物NL/1/99)L蛋白，而不是變體Al的原型(分離物NL/1/00)L蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)L蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)L蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B1的L蛋白，該L蛋白的氨基酸序列與原型NL/l/99(SEQIDNO:332)所示哺乳動物MPV變體B1的L蛋白有至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的G蛋白，該哺乳動物MPV變體Al的G蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A1的原型(分離物NL/1/00)G蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)G蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)G蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)G蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A1的G蛋白，該G蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/00(SEQIDNO:322)所示哺乳動物MPV變體Al的G蛋白有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的N蛋白，該哺乳動物MPV變體A1的N蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體Al的原型(分離物NL/1/00)N蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)N蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)N蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)N蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A1的N蛋白，該N蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/00(SEQIDNO:366)所示哺乳動物MPV變體Al的N蛋白有至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A1的P蛋白，該哺乳動物MPV變體A1的P蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A1的原型(分離物NL/1/00)P蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)P蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)P蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)P蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A1的P蛋白，該P蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/00(SEQIDNO:374)所示哺乳動物MPV變體Al的P蛋白有至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的M蛋白，該哺乳動物MPV變體A1的M蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A1的原型(分離物NL/1/00)M蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)M蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)M蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)M蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的M蛋白，該M蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/00(SEQIDNO:358)所示哺乳動物MPV變體Al的M蛋白相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的F蛋白，該哺乳動物MPV變體A1的F蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A1的原型(分離物NL/1/00)F蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)F蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)F蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)F蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A1的F蛋白，該F蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/00(SEQIDNO:314)所示哺乳動物MPV變體Al的F蛋白有至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的M2-l蛋白，該哺乳動物MPV變體Al的M2-1蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A1的原型(分離物NL/1/00)M2-1蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/1/99)M2-1蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)M2-1蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)M2-1蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的M2-l蛋白，該M2-l蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/00(SEQIDNO:338)所示哺乳動物MPV變體A1的M2-1蛋白有至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的M2-2蛋白，該哺乳動物MPV變體Al的M2-2蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體Al的原型(分離物NL/l/00)M2-2蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/l/99)M2-2蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)M2-2蛋白或B2的原型(分離物NL/l/94)M2-2蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的M2-2蛋白，該M2-2蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/00(SEQIDNO:346)所示哺乳動物MPV變體Al的M2-2蛋白有至少96%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的SH蛋白，該哺乳動物MPV變體Al的SH蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體Al的原型(分離物NL/1/00)SH蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)SH蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)SH蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)SH蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的SH蛋白，該SH蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/00(SEQIDNO:382)所示哺乳動物MPV變體Al的SH蛋白有至少84%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體Al的L蛋白，該哺乳動物MPV變體Al的L蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體Al的原型(分離物NL/1/00)L蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/1/99)L蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)L蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)L蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A1的L蛋白，該L蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/00(SEQIDNO:330)所示哺乳動物MPV病毒變體Al的L蛋白有至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的G蛋白，該哺乳動物MPV變體A2的G蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A2的原型(分離物NL/17/00)G蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/1/99)G蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)G蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)G蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的G蛋白，該G蛋白的氨基酸序列與原型NL/17/00(SEQIDNO:332)所示哺乳動物MPV變體A2的G蛋白有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的N蛋白，該哺乳動物MPV變體A2的N蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A2的原型(分離物NL/17/00)N蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)N蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)N蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)N蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的N蛋白，該N蛋白的氨基酸序列與原型NL/17/00(SEQIDNO:367)所示哺乳動物MPV變體A2的N蛋白有至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的P蛋白，該哺乳動物MPV變體A2的P蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A2的原型(分離物NL/17/00)P蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)P蛋白、A1的原型(分離物NL/1/00)P蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)P蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的P蛋白，該P蛋白的氨基酸序列與原型NL/17/00(SEQIDNO:375)所示哺乳動物MPV變體A2的P蛋白有至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的M蛋白，該哺乳動物MPV變體A2的M蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A2的原型(分離物NL/17/00)M蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/1/99)M蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)M蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)M蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的M蛋白，該M蛋白的氨基酸序列與原型NL/17/00(SEQIDNO:359)所示哺乳動物MPV變體A2的M蛋白相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的F蛋白，該哺乳動物MPV變體A2的F蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A2的原型(分離物NL/17/00)F蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)F蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)F蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)F蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的F蛋白，該F蛋白的氨基酸序列與原型NL/17/00(SEQIDNO:315)所示哺乳動物MPV變體A2的F蛋白有至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的M2-l蛋白，該哺乳動物MPV變體A2的M2-l蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A2的原型(分離物NL/17/00)M2-1蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/1/99)M2-1蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)M2-1蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)M2-1蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的M2-l蛋白，該M2-l蛋白的氨基酸序列與原型NL/17/00(SEQIDNO:339)所示哺乳動物MPV變體A2的M2-1蛋白有至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的M2-2蛋白，該哺乳動物MPV變體A2的M2-2蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A2的原型(分離物NL/17/00)M2-2蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/l/99)M2-2蛋白、Al的原型(分離物NL/l/00)M2-2蛋白或B2的原型(分離物NL/l/94)M2-2蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的M2-2蛋白，該M2-2蛋白的氨基酸序列與原型NL/17/00(SEQIDNO:347)所示哺乳動物MPV變體A2的M2-2蛋白有至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的SH蛋白，該哺乳動物MPV變體A2的SH蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A2的原型(分離物NL/17/00)SH蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/1/99)SH蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)SH蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)SH蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的SH蛋白，該SH蛋白的氨基酸序列與原型NL/17/00(SEQIDNO:383)所示哺乳動物MPV變體A2的SH蛋白有至少84%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的L蛋白，該哺乳動物MPV變體A2的L蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體A2的原型(分離物NL/17/00)L蛋白，而不是變體的Bl原型(分離物NL/1/99)L蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)L蛋白或B2的原型(分離物NL/1/94)L蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體A2的L蛋白，該L蛋白的氨基酸序列與原型NL/17/00(SEQIDNO:331)所示哺乳動物MPV病毒變體A2的L蛋白有至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的G蛋白，該哺乳動物MPV變體B2的G蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B2的原型(分離物NL/1/94)G蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)G蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)G蛋白、或A2的原型(分離物NL/17/00)G蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的G蛋白，該G蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/94(SEQIDNO:325)所示哺乳動物MPV變體B2的G蛋白有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的N蛋白，該哺乳動物MPV變體B2的N蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B2的原型(分離物NL/1/94)N蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)N蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)N蛋白或A2的原型(分離物NL/17/00)N蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的N蛋白，該N蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/94(SEQIDNO:369)所示哺乳動物MPV變體B2的N蛋白有至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的P蛋白，該哺乳動物MPV變體B2的P蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B2的原型(分離物NL/1/94)P蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)P蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)P蛋白或A2的原型(分離物NL/17/00)P蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的P蛋白，該P蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/94(SEQIDNO:377)所示哺乳動物MPV變體B2的P蛋白有至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的M蛋白，該哺乳動物MPV變體B2的M蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B2的原型(分離物NL/1/94)M蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/1/99)M蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)M蛋白或A2的原型(分離物NL/17/00)M蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的M蛋白，該M蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/94(SEQIDNO:361)所示哺乳動物MPV變體Bl的M蛋白相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的F蛋白，該哺乳動物MPV變體B2的F蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B2的原型(分離物NL/1/94)F蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/1/99)F蛋白、A1的原型(分離物NL/1/00)F蛋白或A2的原型(分離物NL/17/00)F蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的F蛋白，該F蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/94(SEQIDNO:317)所示哺乳動物MPV變體B2的F蛋白有至少99%或至少99.5。/。相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的M2-1蛋白，該哺乳動物MPV變體B2的M2-l蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B2的原型(分離物NL/1/94)M2-1蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/1/99)M2-1蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)M2-1蛋白、A2的原型(分離物NL/17/00)M2-1蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的M2-1蛋白，該M2-1蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/94(SEQIDNO:341)所示哺乳動物MPV變體B2的M2-l蛋白有至少98%、至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的M2-2蛋白，該哺乳動物MPV變體B2的M2-2蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B2的原型(分離物NL/l/94)M2-2蛋白，而不是變體B2的原型(分離物NL/l/94)M2-2蛋白、Al的原型(分離物NL/l/00)M2-2蛋白或A2的原型(分離物NL/17/00)M2-2蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的M2-2蛋白，該M2-2蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/94(SEQIDNO:349)所示哺乳動物MPV變體B2的M2-2蛋白有至少99%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的SH蛋白，該哺乳動物MPV變體B2的SH蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B2的原型(分離物NL/1/94)SH蛋白，而不是變體Bl的原型(分離物NL/1/99)SH蛋白、Al的原型(分離物NL/1/00)SH蛋白或A2的原型(分離物NL/17/00)SH蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的SH蛋白，該SH蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/94(SEQIDNO:385)所示哺乳動物MPV變體B2的SH蛋白有至少84%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少12599%或至少99.5%相同。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的L蛋白，該哺乳動物MPV變體B2的L蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上更接近變體B2的原型(分離物NL/1/94)L蛋白，而不是變體B1的原型(分離物NL/1/99)L蛋白、A1的原型(分離物NL/1/00)L蛋白或A2的原型(分離物NL/17/00)L蛋白。本發(fā)明提供哺乳動物MPV變體B2的L蛋白，該L蛋白的氨基酸序列與原型NL/1/94(SEQIDNO:333)所示哺乳動物MPV變體B2的L蛋白有至少99%或至少99.5%相同。在某些實施方式中，序列相同性百分比依據(jù)全長蛋白質(zhì)的對比。在其它實施方式中，序列相同性百分比依據(jù)蛋白質(zhì)的毗連氨基酸序列的對比，所述氨基酸序列的長度可以是25個氨基酸、50個氨基酸、75個氨基酸、IOO個氨基酸、125個氨基酸、150個氨基酸、175個氨基酸、200個氨基酸、225個氨基酸、250個氨基酸、275個氨基酸、300個氨基酸、325個氨基酸、350個氨基酸、375個氨基酸、400個氨基酸、425個氨基酸、450個氨基酸、475個氨基酸、500個氨基酸、750個氨基酸、IOOO個氨基酸、1250個氨基酸、1500個氨基酸、1750個氨基酸、2000個氮基酸或2250個氨基酸。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV的G蛋白，該G蛋白具有SEQIDNO:119-153;SEQIDNO:322-325所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV的F蛋白，該F蛋白具有SEQIDNO:234-317所示氨基酸序列之一。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV的L蛋白，該L蛋白具有SEQIDNO:330-333所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV的M2-l蛋白，該M2-l蛋白具有SEQIDNO:338-341所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV的M2-1蛋白，該M2-2蛋白具有SEQIDNO:346-349所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV的M蛋白，該M蛋白具有SEQIDNO:358-361所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV的N蛋白，該N蛋白具有SEQIDNO:366-369所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV的P蛋白，該P蛋白具有SEQIDNO:374-377所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供哺乳動物MPV的SH蛋白，該SH蛋白具有SEQIDNO:382-385所示氨基酸序列之一或其片段。在本發(fā)明的某些實施方式中，片段的長度至少為25個氨基酸、50個氨基酸、75個氨基酸、100個氨基酸、125個氨基酸、150個氨基酸、175個氨基酸、200個氨基酸、225個氨基酸、250個氨基酸、275個氨基酸、300個氨基酸、325個氨基酸、350個氨基酸、375個氨基酸、400個氨基酸、425個氨基酸、450個氨基酸、475個氨基酸、500個氨基酸、750個氨基酸、1000個氨基酸、1250個氨基酸、1500個氨基酸、1750個氨基酸、2000個氨基酸或2250個氨基酸。在本發(fā)明的某些實施方式中，片段的長度最多為25個氨基酸、50個氨基酸、75個氨基酸、IOO個氨基酸、125個氨基酸、150個氨基酸、175個氨基酸、200個氨基酸、225個氨基酸、250個氨基酸、275個氨基酸、300個氨基酸、325個氨基酸、350個氨基酸、375個氨基酸、400個氨基酸、425個氨基酸、450個氨基酸、475個氨基酸、500個氨基酸、750個氨基酸、1000個氨基酸、1250個氨基酸、1500個氨基酸、1750個氨基酸、2000個氨基酸或2250個氨基酸。本發(fā)明還提供源自哺乳動物MPV的核酸序列。本發(fā)明也提供源自哺乳動物MPV的核酸序列的衍生物。在某些具體實施方式中，所述核酸經(jīng)修飾。在某些實施方式中，本發(fā)明核酸編碼上述哺乳動物MPV的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明核酸編碼上述哺乳動物MPV亞群A的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明核酸編碼上述哺乳動物MPV亞群B的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明核酸編碼上述哺乳動物MPV變體Al的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明核酸編碼上述哺乳動物MPV變體A2的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明核酸編碼上述哺乳動物MPV變體B1的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明核酸編碼上述哺乳動物MPV變體B2的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明提供的核苷酸序列與SEQIDNO:1S、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示核苷酸序列有至少50%、至少55%、至少60°/。、至少65%、至少70%、至少75%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95°/。、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。在某些實施方式中，本發(fā)明核苷酸序列與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示核苷酸序列的片段有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同，其中所述片段的長度為至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少75個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少750個核苷酸、至少1，000個核苷酸、至少1，250個核苷酸、至少1,500個核苷酸、至少1，750個核苷酸、至少2,000個核苷酸、至少2,00個核苷酸、至少3,000個核苷酸、至少4,000個核苷酸、至少5,000個核苷酸、至少7,500個核苷酸、至少10,000個核苷酸、至少12，500個核苷酸或至少15,000個核苷酸。在一具體實施方式中，本發(fā)明核苷酸序列與以下所示核苷酸序列有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%或100。/。相同SEQIDNO:84-118;SEQIDNO:154-233;SEQIDNO:318-321;SEQIDNO:326-329;SEQIDNO:334-337;SEQIDNO:342-345;SEQIDNQ:350-353;SEQIDNO:354-357;SEQIDNO:362-365;SEQIDNO:370-373;SEQIDNO:378-381;或SEQIDNO:386-389。在本發(fā)明的具體實施方式中，本發(fā)明核苷酸序列能在低嚴(yán)格性、中等嚴(yán)格性或高度嚴(yán)格性條件下與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示核酸序列之一雜交。在本發(fā)明的具體實施方式中，本發(fā)明核苷酸序列能在低嚴(yán)格性、中等嚴(yán)格性或高度嚴(yán)格性條件下與以下核酸序列之一雜交SEQIDNO:84-118;SEQIDNO:154-233;SEQIDNO:318-321;SEQIDNO:326-329;SEQIDNO:334-337;SEQIDNO:342-345;SEQIDNO:350-353;SEQIDNO:354-357;SEQIDNO:362-365;SEQIDNO:370-373;SEQIDNO:378-381;或SEQIDNO:386-389。在某些實施方式中，核酸與SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示核酸序列雜交的長度為至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少75個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少750個核苷酸、至少l，OOO個核苷酸、至少1,250個核苷酸、至少1,500個核苷酸、至少1,750個核苷酸、至少2,000個核苷酸、至少2,00個核苷酸、至少3，000個核苷酸、至少4，000個核苷酸、至少5,000個核苷酸、至少7,500個核苷酸、至少10，000個核苷酸、至少12，500個核苷酸或至少15,000個核苷酸。本發(fā)明還提供能與哺乳動物MPV的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體和抗原結(jié)合片段。本發(fā)明抗體能與哺乳動物MPV的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特異性結(jié)合。在具體實施方式中，所述抗體是人抗體或人源化抗體。在某些實施方式中，本發(fā)明抗體能與哺乳動物MPV亞群A病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特異性結(jié)合。在某些實施方式中，本發(fā)明抗體能與哺乳動物MPV亞群B病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特異性結(jié)合。在某些更具體的實施方式中，本發(fā)明抗體能與哺乳動物MPV變體A1病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特異性結(jié)合。在其它實施方式中，本發(fā)明抗體能與哺乳動物MPV變體A2病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特異性結(jié)合。在某些實施方式中，本發(fā)明抗體能與哺乳動物MPV變體B1病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特異性結(jié)合。在某些其它實施方式中，本發(fā)明抗體能與哺乳動物MPV變體B2病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特異性結(jié)合。5.16利用七殘基重復(fù)序列抑制病毒細胞融合病毒-宿主細胞融合是包括MPV在內(nèi)的許多被膜病毒感染生命周期的必須階段。因此，抑制病毒細胞融合代表了控制這些病毒的新方法。該抑制方法代表了防止MPV在宿主中增殖和MPV感染宿主的其它方法。抑制病毒-細胞融合有賴于所需結(jié)合蛋白的類型。Wang等，BiochemBiophysResComm302(2003)469-475。因此，本發(fā)明的一個實施方式采用試驗鑒定病毒細胞融合對各種結(jié)合蛋白的依賴性。在某些實施方式中，本發(fā)明提供預(yù)防、治療或控制對象感染hMPV的方法，所述方法包括給予藥學(xué)上有效量的七殘基重復(fù)序列(HR)肽。在某些實施方式中，藥學(xué)上有效量的(七殘基重復(fù)序列肽)能降低病毒宿主細胞融合至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、至少99.5%。在一具體實施方式中，所述HR是導(dǎo)致對象感染的病毒HR。在一特定實施方式中，所述HR是A1亞型hMPV的HR。在一更具體的實施方式中，所述HR序列是hMPV的F蛋白的HR序列(命名為HRA或HRB)之一，其中HRA是該肽N末端附近的七重復(fù)序列，HRB是C末端附近的七重復(fù)序列。在某些實施方式中，給予對象以治療、預(yù)防或控制hMPV感染的HR是Al、A2、Bl或B2亞型hMPV的HR。在某些實施方式中，所述HR與導(dǎo)致對象感染的病毒HR有至少50。/。、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或至少99.5%相同。某些實施方式可用HR衍生物防止病毒融合。這種衍生物包括但不限于已用非天然氨基酸取代的、截短除去了氨基酸延伸段的或添加了單個氨基酸(singleaminoacids)或其延伸段而延長的HR肽。還有另一實施方式利用一種HR肽治療、控制或預(yù)防hMPV感染。在另一實施方式中，給予HR肽混合物來治療、控制或預(yù)防hMPV感染?？刹捎孟率鰴z驗來確定HR在防止hMPV與細胞融合中的效力，因此可用這些檢驗來確定哪種HR或其類似物或衍生物最適用于治療、預(yù)防或控制hMPV感染對象。在本發(fā)明另一實施方式中，檢驗可溶性合成HR肽來確定這些肽是否能防止病毒-細胞融合?？捎萌魏蜨R序列抑制hMPV病毒-細胞融合，包括但不限于針對RSV、PIV、APV和hMPV的HR序列。在一優(yōu)選的實施方式中，所述HR序列是hMPV的HR序列。在一更具體的實施方式中，所述HR序列是hMPV的F蛋白的HR序列(命名為HRA或HRB)之一，其中HRA是該肽N末端附近的七重復(fù)序列，HRB是C末端附近的七重復(fù)序列。在本發(fā)明的另一實施方式中，用于抑制hMPV病毒-細胞融合的HRA和HRB衍生肽包括但不限于RSV、APV和PIV的HRA和HRB肽。本發(fā)明的另一實施方式利用HRA和HRB肽的衍生物來抑制hMPV病毒-細胞融合。例如，利用HRA或HRB肽中的至少一個氨基酸殘基突變制備的衍生物來抑制hMPV病毒-細胞融合。本發(fā)明的另一實施方式通過截短或切除HRA或HRB肽的特定區(qū)域來制備衍生物。在還有另一實施方式中，采用內(nèi)源性HR序列延長的HRA或HRB肽。另一實施方式利用多組由HRA或HRB肽不同區(qū)域的序列組成的短肽來抑制hMPV病毒-細胞融合。本發(fā)明的另一實施方式利用hMPVHRA和HRB衍生肽來抵御hMPV的同源毒株或hMPV的異源毒株。本發(fā)明的另一實施方式聯(lián)用HRA和HRB肽或其類似物或衍生物來抑制病毒-細胞融合。一更優(yōu)選的實施方式單用HRA肽或HRB肽或其類似物或衍生物。在另一實施方式中，所用的HRA肽或HRB肽的衍生物與內(nèi)源性HR肽有至少卯Q/。、80%、70%、60%或50%相同。為測定七重復(fù)序列抑制病毒融合的能力，可表達并純化七重復(fù)序列從而能檢驗它們抑制病毒融合的能力?？杀磉_并純化可溶性七重復(fù)序列，然后用于試驗與內(nèi)源性七重復(fù)序列競爭以檢驗對病毒融合的阻斷作用。在本發(fā)明一實施方式中，可制備合成的重組DNA來編碼hMPV的F蛋白的七重復(fù)序列(分別命名為HRA或HRB)。在本發(fā)明的另一實施方式中，可制備合成的重組DNA來編碼hMPV的F蛋白的七重復(fù)序列，該序列也含有用于促進純化的序列尾標(biāo)。在本發(fā)明一優(yōu)選的實施方式中，促進七重復(fù)序列純化的尾標(biāo)不干擾其活性。在本發(fā)明還有另一實施方式中，所述尾標(biāo)由一系列組氨酸構(gòu)成，例如位于肽末端之一的6個毗連組氨酸，稱為組氨酸尾標(biāo)。可采用許多不同的方法表達并純化可溶性HRA和HRB。首先，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備編碼HRA和HRB的DNA載體。隨后，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入合適的表達宿主細胞中，例如大腸桿菌菌株BL21(DE3)，采用本領(lǐng)域常規(guī)方法表達并純化此蛋白質(zhì)。例如，可用IPTG誘導(dǎo)pET載體中編碼含組氨酸尾標(biāo)的HR肽的基因表達。然后裂解細胞，固定到Ni-螯合瓊脂糖親和柱后用反荷電(countercharged)物質(zhì)，例如咪唑洗脫來分離表達的肽。為測定表達的七重復(fù)序列肽抑制病毒融合的潛在效力，可用試驗證實HR肽之間裝配成的復(fù)合物。該方法優(yōu)于細胞試驗，因為能無細胞地篩選肽來測定其抑制病毒融合的效力。在本發(fā)明的一個實施方式中，同時將HR肽培育一段時間使之足以形成復(fù)合物。在一更具體的實施方式中，28'C培育1小時以形成復(fù)合物?？刹捎?31本領(lǐng)域已知的任何方法檢測復(fù)合物形成，所述方法包括但不限于層析、紫外-可見光光譜、NMR光譜、X-射線晶體學(xué)、離心或電泳。在本發(fā)明的另一具體實施方式中，采用凝膠過濾方法結(jié)合電泳檢測復(fù)合物形成來測定復(fù)合物的分子量。本發(fā)明還有另一實施方式采用該復(fù)合物形成試驗來鑒定用于抑制病毒融合的候選對象，例如測定突變的HR肽抑制病毒融合的效力。本發(fā)明還有另一實施方式采用該復(fù)合物形成試驗來檢測HR肽衍生物抑制病毒融合的效力。已知這些肽的七重復(fù)序列區(qū)段天然是螺旋構(gòu)象。為此原因，可釆用許多方法來測定表達的HR肽是否能形成oc螺旋來鑒定用于抑制病毒融合的合適候選對象。這種方法包括但不限于光譜學(xué)、X-射線晶體學(xué)和顯微鏡法。本發(fā)明的一個實施方式釆用CD(圓二色性)光譜法來測定HR肽的結(jié)構(gòu)特征。可采用細胞試驗測HR肽抑制病毒融合的效力。該試驗可用能被MPV感染的任何細胞，包括但不限于tMK、Hep2或Vero細胞。在一具體實施方式中，所用的細胞類型是Hep2細胞。用MPV感染宿主細胞后，將細胞與HR蛋白質(zhì)制品一起培育，培育合適的時間后對融合情況評分。然后染色細胞的合胞體/多核體形成以測定病毒-細胞融合是否成功。參考以下作為本發(fā)明示范而提供的非限制性實施例可更好地理解本發(fā)明。給予以下實施例是為了更全面地說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。然而，它們決不應(yīng)理解為限制了本發(fā)明的范圍。6.實施例人偏肺病毒融合(F)蛋白的推定切割位點的S101P取代是在Vero細胞中不依賴胰蛋白酶生長的主要決定因素材料與方法細胞和病毒.用補加了10%胎牛血清(FBS)(Hyclone)、2mML-谷氨酰胺(GibcoBRL)、非必需氨基酸(GibcoBRL)和2%青霉素/鏈霉素(Biowhittaker)的極限必需培養(yǎng)基中(MEM)(JHRBiosciences)培養(yǎng)Vero細胞。用補加了10%FBS、5。/o胰蛋白月示磷酸肉湯(tryptosephosphatebroth)(Sigma)、非必需氨基酸和2%青霉素/鏈霉素的GlasgowMEM(GibcoBRL)培養(yǎng)BSR/T7細胞(由KKConzelmann博士饋贈)。如現(xiàn)有技術(shù)所述(vandenHoogen等，2001)培養(yǎng)tMK細胞。在Vero細胞中用optiMEM(Gibco/BRL)和2%青霉素/鏈霉素培養(yǎng)液增殖hMPV和嵌合型b/hPIV3病毒。一些病毒用0.2ug/mlTPCK胰蛋白酶(Sigma)增殖。用SPG(10XSPG是2.18M蔗糖、0.038MKH2P04、0.072MK2HP04、0.054ML-谷氨酸，pH7.1)將細胞和上清液一起刮下，終濃度為1XSPG，-70°C冷凍。病毒分離物whMPV/NL/l/93、>WhMPV/NL/1/94、wfhMPV/NL/1/99和wfhMPV/NL/1/OO如現(xiàn)有技術(shù)(Hersft等，2004;vandenHoogen，2001)所述。利用反向遺傳技術(shù)從全長cDNA質(zhì)粒制備以下重組病毒rhMPV/NL/l/00/101P、rhMPV/NL/l/00/101S、rhMPV/NL/l/99/101S、rhMPV/93K/101S、rhMPV/93K/101P、b/hPIV3/hMPVF/101P和b/hPIV3/hMPVF/101S。變體病毒vhMPV/93K/101P和vhMPV/100K/101P衍生自rhMPV/93K/101P。通過免疫染色hMPV噬斑滴定.通過Vero細胞的噬斑試驗測定病毒滴度(噬斑形成單位(PFU)/ml)。在TC6-孔板中培養(yǎng)Vero細胞接近匯合。35'C用optiMEM稀釋的病毒吸附1小時后，用2%甲基纖維素(用含2°/。青霉素/鏈霉素的optiMEM作l:l稀釋)覆蓋細胞，35r培育6天。為進行免疫染色，除去覆蓋層，用甲醇固定細胞15分鐘。用得自WhMPV/NL/1/00(MedlmmuneVaccines,Inc.)免疫的雪貂的hMPV抗血清免疫染色噬斑。用含5。/。奶粉(w/v)的PBS(PBS-milk)約1:500稀釋的抗血清。然后依次用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-雪貂Ab(Dako)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)(Dako)培育細胞來目測觀察計數(shù)噬斑。構(gòu)建全長hMPVcDNA質(zhì)粒.按照現(xiàn)有技術(shù)(Herfst等，2004)所述構(gòu)建hMPV/NL/1/OO(含有IOIS)和hMPV/NL/1/99(含有IOIS)的cDNA，用于回收命名為rhMPV/NL/l/00/101S和rhMPV/NL/l/99/101S的重組病毒。為構(gòu)建用于回收重組病毒rhMPV/NL/1/00/101P的質(zhì)粒，用引物GCAAATTGAAAATCCCAGACAACCTAGATTCGTTCTAGG及其反義引物將編碼hMPVF糖蛋白的預(yù)計氨基酸序列中S101P的核苷酸取代T3367C引入。類似地，用引物GCTGATCAACTGGCAAGAGAGAAGCAAATTGAAAATCCC及其反義引物將編碼hMPVF糖蛋白中預(yù)計氨基酸取代E93K的核苷酸取代G3343A引入。通過反向遺傳技術(shù)回收重組hMPV病毒.通過如現(xiàn)有技術(shù)(Herfst等，2004)所述的反向遺傳技術(shù)回收重組病毒。簡言之，將用含10uL脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000(Invitrogen)的500uLoptiMEM配制的1.2ugpCITEhMPVN、1.2ugpCITEhMPVP、0.9ugpCITEhMPVM2、0.6ugpCITEhMPVL禾口5ug全長cDNA質(zhì)粒施加于10eBSR/T7細胞單層上。轉(zhuǎn)染15小時后，用optiMEM替換培養(yǎng)基，35。C培育2-3天。一輪凍融后，用細胞和上清液感染90%匯合的Vero細胞單層，培育6天以擴增所拯救的病毒。使用抗hMPV的雪貂多克隆Ab，通過陽性免疫染色驗證回收的病毒。以0.1PFU/細胞的感染復(fù)數(shù)(MOI)接種Vero細胞，加入叩tiMEM和35'C培育擴增回收的病毒，6天后收集中。一些轉(zhuǎn)染和培育(操作)在有0.2ug/mlTPCK胰蛋白酶(Sigma)存在下進行?；厥詹《镜腞T-PCR.以0.1PFU/細胞的MOI的hMPV病毒接種Vero細胞單層來制備測序用DNA。接種6天后收集細胞和上清液，進行一輪凍融。按照生產(chǎn)商的使用說明書用Trizol試劑提取RNA。用一步RT-PCR試劑盒(Invitrogen)和多組重疊引物進行RT-PCR。用凝膠提取試劑盒(Qiagen凝膠提取試劑盒)從瓊脂糖凝膠分離DNA，產(chǎn)生RT-PCR片段的色譜圖。hMPV病毒在Vero細胞中的多輪生長.在含或不含0.2ug/mlTPCK胰蛋白酶(Sigma)時，將用optiMEM稀釋的hMPV病毒以0.1PFU/細胞的MOI接種于TC6-孔板中的Vero細胞亞匯合單層。抽出病毒接種液，每孔細胞加入2mloptiMEM+/-0.2ug/mlTPCK胰蛋白酶。24小時間隔收集細胞和上清液，共6天，-7(TC冷凍。在Vero細胞(+/-0.2ug/mlTPCK胰蛋白酶)中滴定收集的樣品。用上述雪貂抗-hMPV多克隆Ab(MedlmmuneVaccines,Inc.)免疫染色來目測觀察噬斑。hMPVF糖蛋白表面表達的免疫染色.將Vero細胞接種在玻璃蓋玻片上。以5PFU/細胞的MOI接種Vero細胞亞匯合單層。抽出病毒接種液，給細胞加入含2%青霉素/鏈霉素的optiMEM。35。C培育3天后，用3%多聚甲醛固定細胞10分鐘。然后用PBS洗滌單層，用PBS-牛奶封閉。室溫下將細胞與用PBS-牛奶作1:250稀釋的抗-hMPVF單克隆抗體(Mab)121-1017-133(未發(fā)表)培育1小時，然后用PBS洗滌2次。然后在室溫將細胞與用PBS-牛奶作1:1000稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗-亞美尼亞倉鼠Ab(JacksonLaboratories)培育1小時，用PBS洗滌2次。用10uLVecta-屏蔽封固劑(shieldmountingmedium)(VectorLaboratories)將翻轉(zhuǎn)的蓋玻片固定在玻璃載玻片上，用NikoneclipseTE2000-U顯微鏡觀察。hMPVF蛋白的蛋白質(zhì)印跡.用0.1PFU/細胞的MOI用hMPV病毒感染TC6-孔組織培養(yǎng)皿中的Vero細胞亞匯合單層，35。C培育。感染4-6天后，收集細胞和上清液，-70。C冷凍。融化樣品，用含5%|3-巰基乙醇(Sigma)的Laemmli緩沖液(Bio-Rad)裂解，用12。/。聚丙烯酰胺Tris-HCl即用凝膠(ReadyGel)(Bio-Rad)分離，用潮濕轉(zhuǎn)移室(Bio-Rad)轉(zhuǎn)移至Hybond-PPVDF膜(AmershamBiosciences)。用含5%(w/v)奶粉的PBS(PBS-牛奶)封閉膜，與用PBS-牛奶作1:1000稀釋的抗-hMPVFMabl21-1017-133培育，然后與用PBS-牛奶作1:1000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗倉鼠Mab培育。用含0.5%(v/v)吐溫20(Sigma)的PBS洗滌膜4次，用化學(xué)發(fā)光底物(AmershamBiosciences)顯影，曝光BiomaxMR膠片(柯達)來目測觀察hMPVF蛋白。b/hPIV3/hMPVF2全長cDNA.b/hPIV3/hMPVF2(表達含101S的hMPVF)如現(xiàn)有技術(shù)(Tang等，2003)所述。簡言之，將hMPVF基因插入嵌合型牛/人3型副流感病毒(b/hPIV3)cDNA的N和P基因之間(Haller等，2000;Haller等，2001)。利用快速誘變試劑盒(Stratagene)將對應(yīng)于hMPV/NL/1/00基因組中T3367C的核苷酸突變引入b/hPIV3/hMPVF2的hMPVF基因中，得到的b/hPIV3/hMPV/F2/101P表達的hMPVF的101位氨基酸是脯氨酸。定量測定Vero細胞中融合的核.以3PFU/細胞的MOI接種TC6-孔板中的Vero細胞單層匯合或模擬感染，一式兩份。35'C培育1小時后，抽去接種物，用2%甲基纖維素(與含2%青霉素/鏈霉素+/-0.2ug/mlTPCK胰蛋白酶(Sigma)的optiMEM進行1:1混合)覆蓋細胞。在48小時或72小時，抽去培養(yǎng)基，用甲醇固定單層15分鐘。用PBS洗滌固定的單層，用Hoechst染色溶液(PBS配制的0.25ug/ml雙苯酰亞胺H33258(Sigma))培育1小時，用裝配有DAPI透鏡的NikoneclipseTE2000-U顯微鏡檢測。計數(shù)10個隨機選擇的視野中融合與未融合的核(總和超過2000個核)，計算融合核的百分比。結(jié)果w/hMPV的四個代表性亞型在Vero細胞中生長的胰蛋白酶要求不同.代表所有4個亞型Al、A2、Bl和B2的hMPV的生物學(xué)衍生毒株能在Vero細胞中生長。分別代表亞型Al禾nBl的wfhMPV/NL/1/OO和MhMPV/NL/1/99在沒有與有胰蛋白酶存在下均能生長至峰值滴度106-107PFU/ml。在1%甲基纖維素下的Vero細胞中生長6天后，通過免疫染色目測觀察到噬斑大小約為0.3-0.5mm直徑(圖1)。明顯相反的是，分別代表亞型A2禾BB2的hMPV/NL/1/93和wfhMPV/NL/1/94只在培養(yǎng)基中有胰蛋白酶存在時生長。WhMPV/NL/1/93生長的峰值滴度在1()6-107pFU/ml之間，MhMPV/NL/1/94低一個對數(shù)。此外，當(dāng)培養(yǎng)基覆蓋層中胰蛋白酶不存在時，不產(chǎn)生噬斑。MhMPV/NL/1/93和WhMPV/NL/1/94在有胰蛋白酶存在時產(chǎn)生的噬斑直徑明顯小于hMPV/NL/1/00或wzhMPV/NL/1/99在有或沒有胰蛋白酶存在時產(chǎn)生的噬斑(圖1)。預(yù)計所有4種hMPV亞型的F糖蛋白的公開序列在推定的切割位點為RQSR基序。正如所料，F(xiàn)基因測序證明hMPV/NL/1/93和WhMPV/NL/1/94(分別是亞型A2禾BB2)具有預(yù)計的RQSR序列。然而，WhMPV/NL/1/OO和WhMPV/NL/1/99(分別是亞型Al和Bl)的序列獲得T3367C突變，導(dǎo)致F蛋白中有預(yù)計的S101P氨基酸取代，因而推定的切割位點是RQPR。進一步表征了S101P取代對hMPV不依賴胰蛋白酶生長的作用。rhMPV/NL/l/00/101P而非rhMPV/NL/l/00/101S能不用胰蛋白酶從cDNA回收.為研究hMPVF中S101P氨基酸取代對hMPV/NL/1/OO不依賴胰蛋白酶生長的作用，我們在核苷酸3367處引入一個T以產(chǎn)生rhMPV/NL/l/00/101S，或在核苷酸3367處引入一個C以產(chǎn)生rhMPV/NL/l/00/101P。在沒有胰蛋白酶存在時，不難回收rhMPV/NL/l/00/101P，形成的噬斑與wfhMPV/NL/1/OO相當(dāng)。明顯相反的是，只在有胰蛋白酶存在下才回收到rhMPV/NL/l/00/101S，其形成的噬斑明顯小于r固PV/NL/l層101P的噬斑(圖2A)。比較rhMPV/NL/l/00/101S和rhMPV/NL/l/00/101P在Vero細胞中的復(fù)制.為表征在F蛋白中含有101S或101P的重組hMPV/NL/1/OO病毒不依賴胰蛋白酶的生長，制作了該病毒在有或沒有胰蛋白酶存在下的多輪生長曲線。通過噬斑試驗定量測定在有或沒有胰蛋白酶存在下各時間點的感染性病毒(圖2B)。在有胰蛋白酶存在下，rhMPV/NL/l/00/101S和rhMPV/NL/l層101P均顯示了有效的多輪生長。rhMPV/NL/l/00/101P在第3天達到峰值滴度為7.8log10PFU/ml，而rhMPV/NL/l/00/101S在第5天達到峰值滴度為7log10PFU/ml(圖2B)。在沒有胰蛋白酶存在下，只有rhMPV/NL/l/00/101P經(jīng)歷多輪生長，在第3136天達到峰值滴度7.6l0g^類似于在有胰蛋白酶存在下的生長情況。當(dāng)噬斑試驗中省去胰蛋白酶時，未檢測到rhMPV/NL/l/00/101S(圖2B)。然而，rhMPV/NL/l/00/101S看來在沒有胰蛋白酶存在下發(fā)生了一輪生長，因為在沒有胰蛋白酶的生長期間收集到的病毒加入胰蛋白酶后在噬斑試驗中形成了傳染性細胞灶。這提示在沒有胰蛋白酶的復(fù)制期間產(chǎn)生了rhMPV/NL/l/00/101S的病毒顆粒，然而除非在培養(yǎng)基中加入胰蛋白酶，否則它們不具傳染性。沒有胰蛋白酶時，rhMPV/NL/l層I01S增殖的峰值滴度比細PV/NL/固/101P低約2log,"圖2B)。S101P對rhMPV-感染的細胞中hMPVF蛋白的表面表達的影響.副流感病毒融合蛋白轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜而促進膜融合。為測定hMPVF的細胞表面表達受損是否導(dǎo)致rhMPV/NL/l/00/101S生長不佳，以5PFU/細胞的MOI接種Vero細胞，接種3天后固定進行免疫染色。有和沒有胰蛋白酶時，接種了rhMPV/NL/l/00/101P的細胞中幾乎100%檢測到hMPVF。在有胰蛋白酶存在下，接種了rhMPV/NL/l/00/101S的Vero細胞中觀察到hMPVF的表達水平相似(圖2C)。相反，沒有胰蛋白酶時，感染rhMPV/NL/l/00/101S的單層中只有少數(shù)幾個細胞的質(zhì)膜上檢測到F蛋白的表面表達(圖2C)。這提示，沒有胰蛋白酶時，hMPVF/101S確實表達在質(zhì)膜上，但導(dǎo)致rhMPV/NL/l/00/101S感染不足而不擴散至毗鄰細胞。在沒有胰蛋白酶存在下，hMPVF/101S不能促進rhMPV/NL/l/00/101S感染猛烈擴散的原因部分是不能產(chǎn)生傳染性病毒顆粒。然而，細胞與細胞融合和病毒感染的擴散也要求有效切割該融合蛋白前體。與rhMPV/NL/l/00/101P相比，切割rhMPV/NL/l/00/101S的hMPVF蛋白.不想局限于理論，將F。前體切割成F,和F2片段暴露出融合活性和多輪病毒生長所需的F1片段N末端融合肽。為證明S101P取代對F切割效率的作用，在有或沒有胰蛋白酶時以O(shè).lPFU/細胞的MOI接種Vero細胞。感染5天后，收集細胞和上清液，采用蛋白質(zhì)印跡分析來目測觀察hMPVF的相對切割。對于含101P的F蛋白，約一半含量的全長hMPVF蛋白(Fo)被切割成對應(yīng)于推定F,片段預(yù)計大小的諸F物質(zhì)。含101P的F蛋白的加工效率在有或沒有胰蛋白酶時相當(dāng)(圖2D)。相反，含有101S的hMPVF只在該蛋白接觸胰蛋白酶時被切割。與hMPVF/101P相比，相對切割效率明顯較低(圖2D)。發(fā)現(xiàn)在有和沒有胰蛋白酶時，含101S的F蛋白的相對切割量因所加入的胰蛋白酶比活性有差異而在各實驗之間不同。然而，hMPVF/101S的相對切割總是低于hMPVF/101P。當(dāng)從b/hPIV3病毒載體表達時，含hMPV/101S與含hMPV/101P的F蛋白的切割比較.為測定hMPVF切割是否依賴于其它hMPV病毒蛋白所提供的天然病毒環(huán)境(viralcontext),將含有預(yù)計的101S或101P的hMPVF蛋白克隆入b/hPIV3，一種F和HN基因被人PIV3F和HN基因取代的牛PIV3病毒中。以前的研究顯示b/hPIV3能插入各種副黏病毒融合糖蛋白(Skiad叩oulos等，2002;Tang等，2003，2004a和2004b)。感染細胞的裂解液的蛋白質(zhì)印跡檢測到，在未外源性加入胰蛋白酶時，Vero細胞中載體表達的(vectored)hMPV/NL/l層101PF蛋白被部分切割，而hMPV亂/l/00/101SF蛋白未被切割(圖3)。然而，與hMPV感染的細胞中hMPVF/101PF蛋白的切割相比，載體表達的hMPVF/101P蛋白的切割程度降低(比較圖70D和71)。加入胰蛋白酶時，該差異不再明顯。在有胰蛋白酶存在時，hMPV/NL/l/00/101P和hMPV/NL/l/00/101S載體表達的F蛋白的部分被切割的程度與WhMPV/NL/1/OO表達的F蛋白相同(圖3)。hMPV/NL/1/OO的自發(fā)hMPVF變體.rhMPV/NL/l/00/101P在融合蛋白的推定切割位點處RQPR基序的上游或下游快速產(chǎn)生了其它密碼子改變。rhMPV/NL/l/00/101P的一種儲備物自發(fā)產(chǎn)生了編碼F蛋白中預(yù)計的E93K氨基酸取代的突變G3343A(圖4C中有框的密碼子)。第二種儲備物產(chǎn)生了編碼F蛋白中預(yù)計的Q100K取代的突變G3364A(圖4D中帶圈的密碼子)。在Vero細胞中再傳代10次，這些突變能保持遺傳學(xué)穩(wěn)定。在這些傳代中，F(xiàn)蛋白中未檢測到其它突變。完整測序這些變體病毒之一，vhMPV/93K/101P(排除基因組3，和5，端盡頭的30個核苷酸)，唯一檢測到的突變是G3343A。在其它hMPVORF或非編碼區(qū)中未發(fā)現(xiàn)其它突變，提示通過聚合酶復(fù)合物復(fù)制hMPV基因組本身不易出錯。在獨立拯救的rhMPV/NL/l/00/101P儲備物中，G3343A處最頻繁觀察到多態(tài)性。rhMPV/NL/l/00/101P的5種不同病毒儲備物中也發(fā)現(xiàn)在該推定切割位點的上游核苷酸處有5種其它多態(tài)性，雖然頻率低于G3343A。G3340A、A3344T、T3350G、G3352A和A3355C可編碼預(yù)計的氨基酸取代E92K、E93V、195S、E96K和N97H(表20a和20b)。產(chǎn)生這些多態(tài)性之一的rhMPV/NL/l/00/101P的各病毒儲備物只含有這些額外突變中的一種(從不是兩種或多種)，在細胞培養(yǎng)物中傳代不到6次即產(chǎn)生突變。因此，任何這些額外的突變各自能在Vero細胞中具有生長優(yōu)勢。表20a和20b:rhMPV/NL/l/00/101P、》WhMPV/NL/1/00和WhMPV/NL/1/99的hMPVF基因的突變和多態(tài)性.所示hMPV病毒的儲備物在Vero細胞中傳代不到6次即在其F基因中產(chǎn)生了多態(tài)性。各列的上端標(biāo)明了hMPVF蛋白中的突變和隨之預(yù)計的氨基酸取代。表20a病毒胰蛋白酶E92KG3340AE93KG3343AE93VA3344TQ94KC3346AQ94HA3348CrhMPV亂/l/00/101P-XX+XXwthMPV/NL/1/00-XXXwthMPV/NL/1/99-X表20b病毒I95ST3350GE96KG3352AN97HA3355CN97KT3357AQ100KC3364AS101PT3367CrhMPV/NL/l層101PXXXXXXwt固PV肌/畫XXXwthMPV/NL/1/99XX為證明沒有胰蛋白酶的生長對rhMPV/NL/l/00/101P發(fā)生自發(fā)突變提供了選擇壓力，在有胰蛋白酶時用同樣的全長cDNA克隆獨立轉(zhuǎn)染10次，在沒有胰蛋白酶時也進行10次。有或沒有胰蛋白酶時病毒回收同等有效。然而，沒有胰蛋白酶時，傳代3次后，10個病毒儲備物中有7個產(chǎn)生了含G3343A或C3364A突變的亞群，而有胰蛋白酶培養(yǎng)時10個病毒儲備物中只有1個產(chǎn)生了突變，該突變是G3343A。類似地，對于rhMPV/NL/l/00/101S，在有胰蛋白酶時用同樣的全長cDNA克隆獨立轉(zhuǎn)染IO次，在沒有胰蛋白酶時也進行10次。沒有胰蛋白酶時未回收到病毒。測序有胰蛋白酶時回收和擴增的10個獨立拯救的rhMPV/NL/l/00/101S儲備物的RT-PCR片段，顯示即使連續(xù)傳代IO次后F基因中也沒有突變。這些數(shù)據(jù)顯示沒有胰蛋白酶時，快速產(chǎn)生的rhMPV/NL/l/00/101P的G3343A或C3364A變體促進更有效地切割該融合蛋白。有胰蛋白酶存在時，hMPVF切割的功能推測是通過外源性蛋白酶而避免了切割增強型突變的選擇壓力。研究了whMPV/NL/1/OO和WhMPV/NL/1/99融合基因中的核苷酸多態(tài)性。在第三代猴腎細胞中傳代3次，在Vero細胞中再傳代3次獲得了WhMPV/NL/1/OO病毒儲備物("P6")。事先已對該P6病毒儲備物的全部基因組進行了序列分析，顯示101位為脯氨酸(圖4E中帶下劃線的密碼子)。精密檢査圖譜，發(fā)現(xiàn)在F基因的核苷酸3343和3364處有多態(tài)性(圖4E中有框和帶圈的密碼子)。用源自WhMPV/NL/1/00P6儲備物的RT-PCR片段(跨越nt3200-nt3500)進行克隆分析。對于分析的20個克隆，9個含有C3364A突變(Q100K)，4個含有G3343A突變(E93K)。這兩種突變與rhMPV/NL/1/OO中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢突變相同。其余的克隆中3個含有A3344T，1個含有A3348C，1個含有T3357A，分別編碼E93V、Q94H和N97K(表20)?？寺∽疃嗪羞@些突變中的1種。分離vv,hMPV/NL/1/00噬斑的努力未獲成功，因為hMPV感染的細胞病變效應(yīng)不佳。這些結(jié)果顯示，擴增至P6的WhMPV/NL/1/OO是一混合群體，含有兩種優(yōu)勢準(zhǔn)種。因此，生物學(xué)衍生的和重組的hMPV不難在hMPVF基因中獲得促進它們在組織培養(yǎng)中生長的突變。E93K和Q100K對hMPVF切割的影響.為測定E93K和Q100K對hMPVF切割的影響，在有或沒有胰蛋白酶時用野生型、重組和變體hMPV/NL/1/OO病毒接種Vero細胞。感染6天后收集細胞和上清液，采用蛋白質(zhì)印跡分析來目測觀察hMPVF蛋白的相對切割效率(圖5A)。沒有胰蛋白酶時，與只含101P取代的融合蛋白相比，在含E93K或Q100K氨基酸取代的變體病毒中含101P的F蛋白切割明顯更有效(比較圖5的泳道3、4和5與泳道2)。有胰蛋白酶存在時，野生型和突140變型hMPVF蛋白的相對切割相當(dāng)(圖5A的泳道6-10)。胰蛋白酶未進一步提高含切割增強型E93K或Q100K氨基酸取代的hMPVF的切割效率。單一E93K不足以賦予hMPVF不依賴胰蛋白酶的切割.在重組hMPV/NL/l/00/101P中E93K是最頻繁觀察到的突變，含E93K的變體F蛋白導(dǎo)致切割活性增強。將核苷酸突變G3343A引入各全長cDNAhMPV/NL/l/00/101S禾口hMPV/NL/l/00/101P中。采用反向遺傳方法回收重組病毒rhMPV/93K/101P和rhMPV/93K/101S，在Vero細胞中傳代10次后顯示它們的基因型穩(wěn)定。蛋白質(zhì)印跡分析顯示沒有胰蛋白酶存在時，含101P的病毒F蛋白部分被切割，而含101S的F蛋白未被切割(圖5B)。存在E93K極大提高了hMPVF/101P切割的效率(泳道11和12，圖5B)。然而，E93K不能提高hMPVF/101S的切割效率(泳道13和14，圖5B)。因此，只在101位是脯氨酸時E93K取代才能提高hMPVF的切割效率，證明IOIP和93K之間對hMPVF蛋白加工有協(xié)同作用。Vero細胞中E93K和Q100K對生長動力學(xué)的影響.為測定F蛋白不依賴胰蛋白酶切割的提高對hMPV在Vero細胞中多輪生長的影響，在沒有胰蛋白酶時用rhMPV/NL/l/00/101P、vhMPV/93K/101P、rhMPV/93K/101P、vhMPV/100K/101P或w,hMPV/NL/1/00以0.1PFU/細胞的MOI感染細胞。獲得沒有胰蛋白酶存在時的病毒滴度。含S101P的不依賴胰蛋白酶的各病毒生長曲線相似，表明病毒峰值滴度或生長動力學(xué)未提高，而hMPVF的切割效率的提高是獲得E93K或Q100K突變所致(圖6)。hMPVF切割提髙與hMPV感染Vero細胞的融合活性增強相關(guān).與其它副黏病毒類似，將全長hMPVF蛋白(Fo)切割成兩片段(F,和F2)暴露出促進細胞間融合的F,片段N末端的融合肽(Morrison，2003;White,1990)。目測觀察WhMPV/NL/1/OO感染的Vero細胞單層顯示在第2-3天，大多數(shù)細胞融合形成許多大的合胞體，而rhMPV/NL/l/00/101S-感染的細胞顯示合胞體少且小。為證明細胞與細胞的融合活性增強與F蛋白切割提高有關(guān)，在有或沒有胰蛋白酶時用野生型、重組和變體hMPV/NL/l/00病毒接種Vero細胞匯合單層。通過計數(shù)10個隨機選擇的視野中融合與未融合的核來定量測定野生型和變體病毒的融合活性。至lj48小時，感染vhMPV/93K/101P、rhMPV/93K/101P、vhMPV/100K/101P或WhMPV/NL/1/00的Vero細胞單層中觀察到巨大合胞體。讓其生長到80小時，多核的合胞體100%覆蓋了感染這些病毒的單層。為計數(shù)融合與未融合的核，在融合低于100%的48小時時固定細胞(圖7)。對于一個代表性實驗，沒有胰蛋白酶時65-75%感染vhMPV/93K/101P、rhMPV/93K/101P、vhMPV/100K/101P或WhMPV/NL/1/OO的Vero細胞顯示核融合，有胰蛋白酶時，80。/。和90%的細胞融合(圖7)。對于不含hMPVF切割增強型突變的rhMPV/NL/l/00/101P，合胞體形成明顯減少；沒有胰蛋白酶時融合核的百分比是13%,有胰蛋白酶時是25%。對于rhMPV/NL/l/00/101S，只在有胰蛋白酶時觀察到小合胞體形成，融合核占20%(圖7)。圖7所示數(shù)據(jù)代表3個獨立進行的實驗之一的結(jié)果。由于hMPVF切割的增強未提高hMPV的復(fù)制效率，hMPVF切割的效率與形成合胞體的融合活性之間直接相關(guān)。表征在F蛋白的RQSR切割基序中含S101P取代的Bl亞型hMPV/NL/1/99.以上實驗所用的hMPV/NL/1/OO是Al亞型。也發(fā)現(xiàn)生物學(xué)衍生的wrhMPV/NL/1/99(—種代表性Bl亞型)在其F蛋白的預(yù)計RQSR切割位點中含有S101P取代?，F(xiàn)有技術(shù)(Herfst等，2003)描述了與hMPV/NL/1/OO相比，hMPV/NL/1/99的生長情況。與vWhMPV/NL/1/99相比，rhMPV/NL/l/99/101S的生長特征.與rhMPV/NL/1/00/101S相似，rhMPV/NL/1/99/101S也需要外源性加入胰蛋白酶才能在Vero細胞中形成噬斑、進行多輪生長、細胞與細胞傳播和F蛋白切割(圖8A-D)。相反，WfhMPV/NL/l/99(含有IOIP)在沒有胰蛋白酶時能有效生長。即使有胰蛋白酶存在下，rhMPV/NL/l/99/101S的峰值滴度也比WhMPV/NL/1/99所顯示的峰值滴度低約21og!o(圖76B)。Bl亞型hMPVF的蛋白質(zhì)印跡也顯示S101P取代導(dǎo)致切割提高而無需加入外源性胰蛋白酶。在沒有胰蛋白酶存在下hMPVF/101S顯示不被切割，但在有胰蛋白酶存在下，不難觀察到F1片段。此外，針對hMPVF的Mab也能識別遷移到31kDa標(biāo)記以下的小條帶(可能是胰蛋白酶切割的產(chǎn)物)(圖8D)。測序源自WhMPV/NL/1/99的F基因RT-PCR片段表明有兩個核苷酸多態(tài)性，C3346A和G3352A，二者分別編碼F中預(yù)計的Q94K和E96K氨基酸取代。因此，Al和B1二亞型融合蛋白的切割位點處RQSR基序中的S101P改變了蛋白酶特異性，從而導(dǎo)致hMPV能在沒有胰蛋白酶存在下有效生長。討論據(jù)報道，hMPV生長需要胰蛋白酶(Bastien等，2003a禾卩2003b;Biacchesi等，2003;Boivin等，2002;Hamelin等,2004;Peret等，2002和2004;Skiadolopous等，2004;vandenHoogen等，2001和2004b)。然而，觀察到有或沒有胰蛋白酶存在時hMPV/NL/1/00(亞型Al)和hMPV/NL/1/99(亞型Bl)在第三代猴腎細胞中傳代3次，在Vero細胞中傳代3次(毒株"P6")顯示生長動力學(xué)和峰值滴度相當(dāng)。對于另一種副黏病毒一仙臺病毒，己證明改變?nèi)诤系鞍浊绑w(Fo)切割位點的突變明顯影響了病毒生長對胰蛋白酶的需求(Ishida和M.Homma，1978;Kido等，1992;Tashiro和M.Homma,1983;Tashiro，M.等，1988和1992)。為證明hMPV/NL/1/00和hMPV/NL/1/99不依賴胰蛋白酶生長的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，測序hMPV融合基因以鑒定氨基酸突變(vandenHoogen，2001，2002)。發(fā)現(xiàn)推定的F,/F2切割位點RQSR基序附近的幾個核苷酸和其中的一個核苷酸顯示了核苷酸多態(tài)性。這些核苷酸突變之一編碼RQSR基序中101位的S到P取代。通過與其它副黏病毒融合蛋白類比，在RQS/PR基序處切割可能暴露出宿主細胞膜融合、合胞體形成和病毒有效擴增所需的位于F,片段N末端處的融合結(jié)構(gòu)域(Morrison，T.，2003;Scheid和Choppin，1974和1977)。為研究S101P取代對(病毒在)Vero細胞中不依賴胰蛋白酶生長的作用，制備了在RQSR基序中101位含有絲氨酸或脯氨酸的重組hMPV/NL/1/00病毒。與rhMPV/NL/l/00/101P明顯相反，發(fā)現(xiàn)不加入胰蛋白酶時表達含101S的融合蛋白的hMPV不能啟動多輪生長。rhMPV/NL/l/00/101P顯示在有和沒有外源性胰蛋白酶時的生長動力學(xué)和平均峰值滴度相當(dāng)，這與hMPVF/101P在有和沒有胰蛋白酶存在下的切割效率相當(dāng)有關(guān)。相反，只要加入外源性胰蛋白酶切割了hMPVF/101S，rhMPV/NL/l/00/F101S即能啟動多輪生長。因此，RQSR基序的S101P取代是不依賴胰蛋白酶生長表型的主要決定因素，其在促進hMPVF,/F2切割中起主要作用。表達hMPVF/101P的hMPV能在推定的F2片段(而不是片段)的其它氨基酸位置快速獲得突變。大多數(shù)這些突變毗鄰RQPR基序，雖然Q100K突變在該基序內(nèi)。在RQPR基序外發(fā)生的F2突變中，最頻繁鑒定到E93K，經(jīng)工程改造而能表達hMPVF/93K/101P的hMPV顯示FQ加工和細胞融合活性增強。能提高hMPVF切割的突變的產(chǎn)生速度顯示它們能在Vero細胞培養(yǎng)中賦予生長優(yōu)勢。雖然該生長優(yōu)勢在以0.1的MOI接種產(chǎn)生的比較性多輪生長曲線上不明顯，但當(dāng)在有胰蛋白酶時比較rhMPV/NL/l/00/101P和rhMP窗L/l層101S的生長，hMPVF切割效率提高確實產(chǎn)生了更多的傳染性病毒(圖2)。然而，rhMPV/NL/l/00/101P的生長效率可能足夠，因而進一步提高hMPVF切割效率不可能明顯提高峰值滴度(圖6)。對于hMPV/NL/1/99，一種Bl亞型hMPV也觀察到該表型。Al和Bl亞型的F蛋白的氨基酸同源性為94%,大多數(shù)非同源氨基酸位于包含推定跨膜區(qū)的hMPVF蛋白C末端(vandenHoogen等，2004a和b)。雖然該融合蛋白中101位的S到P取代也導(dǎo)致hMPV/NL/1/99不依賴胰蛋白酶的生長，但測序P6儲備物顯示大多數(shù)F2多態(tài)性發(fā)生在氨基酸94和96處，而不是在Al亞型hMPVF中的93和100處。由于兩種亞型的F蛋白在F一F2切割位點附近高度保守，發(fā)現(xiàn)不同的切割增強型突變出乎意料。不想局限于理論，hMPV/NL/l/99/F101P更廣泛地傳代可導(dǎo)致類似于Al亞型F2片段中發(fā)現(xiàn)的氨基酸取代。然而，F(xiàn)2突變中的差異可能反映了結(jié)合能催化hMPVF切割的蛋白酶的靈活性或hMPVFAl禾卩Bl糖蛋白該區(qū)域中順序構(gòu)象的差異(orderconformationaldifference)較高。S101P取代也提高了從嵌合型牛/人PIV3病毒載體表達后hMPVF的切割效率，表明hMPV融合蛋白的切割不存在與其它hMPV蛋白的相互作用。然而，源自PIV3感染細胞的hMPVF,片段量低于受hMPV感染的細胞中觀察到的量，顯示與其它hMPV蛋白的相互作用也可能導(dǎo)致切割活性更高。其它可能性包括PIV3蛋白的抑制作用或hMPV與PIV3感染誘導(dǎo)的細胞狀態(tài)存在的差異。然而，這些觀察結(jié)果進一步證實Vero細胞中hMPVF的RQSR基序中S101P取代是切割活性的重要決定因素。hMPVF/101S的表面表達提示未切割的hMPVFQ前體被運輸?shù)郊毎砻?。在Vero細胞中，即使有胰蛋白酶存在時，也有相當(dāng)數(shù)量的hMPVFo前體未被切割，這與RSV融合蛋白的加工相反(Gonzalez-Reyes，2001;Collins,1991)。這提示hMPVF前體加工不充分和/或hMPVF()在hMPV的體外復(fù)制周期中有作用。在與外源性加入的胰蛋白酶接觸后，hMPVF/101S顯示可在胞外被切割。然而，hMPVF/101P是在胞內(nèi)或胞外被切割尚不清楚。據(jù)認(rèn)為，該切割位點含有多個堿性殘基的其它副黏病毒融合蛋白是通過胞內(nèi)蛋白酶，例如弗林蛋白酶切割(Bosch，1981;Kawaoka等，1984;Klenk,1988和1994)。對于副黏病毒融合蛋白，切割FQ前體是其傳染力和致病性的先決條件(Kido等，1996;Klenk，1994)。對于一些呼吸道病毒，例如流感病毒、新城疫病毒(NDV)、2型副流感病毒(PIV2)和仙臺病毒(SeV)，F(xiàn)蛋白中組織特異性蛋白酶(例如支氣管上皮分泌的克拉拉類胰蛋白酶)所識別基序改變?yōu)榉翘禺愋员樵诘鞍酌?例如弗林蛋白酶)識別基序的突變將導(dǎo)致毒力增強。(Bosch等，1981;Collins等，1993和2001;Glickman等，1988;Kawoaka等，1984;Klenk等，1988和1994;Nagai等，1989，Seal等，2000;Toyoda等，1987;Towatari等，2002)。參考文獻Barr，P.J.1991.Mammaliansubtilisins:thelong-soughtdibasicprocessingendoproteases(哺乳動物枯草桿菌蛋白酶長期找尋的二元加工內(nèi)切酶).Cell.66:1-3.Bastien,N.,S.Normand,T.Taylor,D.Ward,T.C工Peret，G.Boivin,L,J.Anderson,Y.Li.2003a.SequenceanalysisoftheN，P，MandFgenesofCanadianhumanmetapneumovirusstrains(力口拿大人偏月市病毒毒株的N、P、M禾口F基因的序列分析)，VimsResearch.93:51-62.Bastien,N，D.Ward,P.VanCaeseele，K.Brandt,S.H.Lee,G.McNabb,B.Klisko，E.Chan禾口Y.Li.2003b.HumanmetapneumovirusinfectionintheCanadianpopulation(加拿大人中的人群偏肺病毒感染).J.Clin.Microbiol.41:4642-4646.Biacchesi,S.,M.H.Skiadopoulos，G.Boivin,C.T.Hanson,B.R.Murphy,P丄.Collins禾口U.J.Buchholz.2003.Geneticdiversitybetweenhumanmetapneumovirussubgroups(人偏肺病毒亞群之間的遺傳多樣性).Virology315:1-9.Boivin,G.,Y.Abed,G.Pelletier,LRuel,D.Moisan，S.Cote，T.C.T.Peret,D.D.Erdman禾口L丄Anderson.2002.Virologicalfeaturesandclinicalmanifestationsassociatedwithhumanmetapeumovirus:anewparamyxovirusresponsibleforacuterespiratory-tractinfectionsinallagegroups(人偏月市病毒相關(guān)的病毒學(xué)特征和臨床表現(xiàn)在所有年齡組中導(dǎo)致急性呼吸道感染的一種新副黏病毒)，J.Infect.Dis.186:1330-1334.Boivin,G.,G.DeSerres,S.Cote,R.Gilca,Y.Abed,L.Rochette，M.G.Bergeron禾口P.Dery.2003.Humanmetapneumovirusinfectionsinhospitalizedchildren(住院治療兒童中的人偏肺病毒感染).Emerg.Infect.Dis.9:634-640.Bosch,F.S.,W.Garten,H,D.Klenk禾口R.Rott.1981.Proteolyticcleavageofinfluenzavirushemagglutinin(流感病毒血凝素的蛋白水解切割).PrimarystructureoftheconnectingpeptidebetweenHAlandHA2determinesproteolyticcleavabilityandpathogenicityofavianinfluenzaviruses(HAl禾口HA2之間的連接肽的一級結(jié)構(gòu)決定禽流感病毒的蛋白水解可切割性和致病性).Virology113:725-735.Chen,Y.,M.Shiota,M.Ohuchi，T.Towatari,J.Tashiro,M.Murakami,M.Yano,B.Yang禾卩H.Kido.2000.MastcelltryptasefrompiglungstriggersinfectionbypneumotropicSendaiandinfluenzaAviruses(豬月市的月巴大細胞類胰蛋白酶激發(fā)親肺仙臺和甲型流感病毒感染).Eur.J.Biochem.267:3189-3197.Collins,M.S.,J.B.Bashiruddin,D.J.Alexander.1993.DeducedaminoacidsequencesatthefusionproteincleavagesiteofNewcastlediseasevirusesshowingvariationinantigenicityandpathogenicity(抗原性和致病性變化的新城疫病毒融合蛋白切割位點的推導(dǎo)氨基酸序列).Arch.Virol.128:363-370.Collins,P丄.禾口G.Mottett.1991.Posttranslationalprocessingandoligomerizationofthefusionglycoproteinofhumanrespiratorysyncytialvirus(人呼吸道合胞體病毒的融合糖蛋白翻譯后加工和寡聚化).J.Gen.Virol.72:3095-4101.Collins,P丄.，R.M.Chanock,B.R.Murphy.2001.Respiratorysyncytialvirus(呼吸道合胞體病毒).刊于Knipe，D.M.，Howley,P.M.,D.EGriffin,R.A.Lamb,M.A.Martin,B.Roizman和S.E.Straus(編)，F(xiàn)ieldsVirology(《現(xiàn)場病毒146學(xué)》)，第四版，LippincottWilliamsandWilkins，費城，賓夕法尼亞州，第1443-1486頁.Glickman,R丄.，R丄Syddall,R.M.Iorio，J.P.Sheehan和M.A.Bratt.1988.Quantitativebasicresiduerequirementsinthecleavage-activationsiteofthefusionglycoproteinasadeterminantofvirulenceforNewcastlediseasevims(作為親j城疫病毒毒力決定因素的融合糖蛋白的切割活化位點中的定量堿性殘基要求).J.Virol.62:354-356.Gonzalez-Reyes,L.,M.B.Ruiz-Arguello，B.Garcia-Barreno，L.Calder,J.A.Lopez，J.P.Albar，J.J.Skehel,D.C.Wiley和J.A.Melero.2001,Cleavageofthehumanrespiratorysyncytialvirusfusionproteinattwodistinctsitesisrequiredforactivationofmembranefusion(激活膜融合需要切割人呼吸道合胞體病毒融合蛋白的兩個不同位點).PNAS.98:9859-9864.Haller,A.A.,T.Miller,M.Mitiku禾口K.Coelingh.2000.Expressionofthesurfaceglycoproteinsofhumanparainfluenzavirustype3bybovineparainfluenzavirustype3,anovelattenuatedvirusvaccinevector(通過3型牛畐llf荒感病毒，一種新型減毒病毒疫苗載體表達3型人副流感病毒的表面糖蛋白).J.Virol.74:11626-11635.Haller,A.A.，M.MacPhail,M.Mitiku禾口R.S.Tang.2001.Asingleaminoacidsubstitutionintheviralpolymerasecreatesatemperature-sensitiveandattenuatedrecombinantbovineparainfluenzavirustype3(病毒聚合酶中的單個氨基酸取代產(chǎn)生溫度敏感的和減毒的3型重組牛副流感病毒).Virology.288:342-350.Hamelin,M-E.，Y.Abed禾口G.Boivin.2004.Humanmetapneumovirus:anewplayeramongrespiratoryviruses(人偏月市病毒卩乎吸道病毒中的新手).ClinicalInfectiousDiseases38:983-990.Herfst,S.，M.deGraaf,J.H.Schickli,R.S.Tang,J.Kaur,R.R.Spaete，A.A.Haller,B.G.vandenHoogen,A.D.M.E.Osterhaus和R.A.M.Fouchier.2004.RecoveryofhumanmetapneumovirusgeneticlineagesAandBfromclonedcDNA(從克隆的cDNA中回收人偏肺病毒遺傳譜系A(chǔ)和B).J.Virol.78:8264-8270.Howe,M.2002.Australianfindsuggestsworldwidereachformetapneumovirus(澳大利亞的發(fā)現(xiàn)提示偏肺病毒遍布全球).LancetInfect.Dis.2:202.IJpma,F.F.,D.Beekhuis,M.F.Cotton,C.H.Pieper,J丄.Kimpen,B.G.vandenHoogen,G.J.vanDoornum和D.M.Osterhaus.2004.HumanmetapneumovirusinfectioninhospitalreferredSouthAfricanchildren(援引南非住院兒童中的人偏肺病毒感染).J.Med.Virol.73:486Ishida,N.和M.Homma.1978.Sendaivirus(仙臺病毒).Adv.VirusRes.23:349-383.Kawaoka,T.,C.W.Naeve禾卩R.G.Webster.1984.IsvirulenceofH5N2influenzavirusesinchickensassociatedwithlossofcarbohydratefromthehemagglutinin(H5N2流感病毒在雞中的毒力是否與血凝素中的碳水化合物喪失有關(guān)).Virology139:303-316.Kido，H.，T.Yokogoshi,K.Sakai,M.Tashiro,Y.A.Kishino，A.Fukutomi禾口N.Katunuma.1992.Isolationandcharacterizationofanoveltrypsin-likeproteasefoundinratbronchiolarepithelialClaracells:apossibleactivatoroftheviralfusionglycoprotein(大鼠支氣管上皮卡拉拉細胞中發(fā)現(xiàn)的新型胰蛋白酶樣蛋白酶的分離與表征該病毒融合糖蛋白的可能激活物).J.Biol.Chem.267:13573-13579.Kido,H.,Y.Niwa,Y.Beppu禾CIT.Towatari.1996.Cellularproteasesinvolvedinthepathogenicityofenvelopedanimalviruses,humanimmunodeficiencyvirus,influenzavirusAandSendaivirus(參與被膜云力物病毒、人免疫缺陷病毒、甲型流感病毒和仙臺病毒致病性的細胞蛋白酶).Adv.AnzymeRegul.36:325-47.Klenk，H-D.禾卩W.Garten.1994.Hostcellproteasescontrollingviruspathogenicity(控制病毒致病性的宿主細胞蛋白酶).TrendsMicrobiol.2(2):39-43.Klenk，H.-D.禾卩R.Rott.1988.Themolecularbiologyofinfluenzaviruspathogenicity(流感病毒致病性的分子生物學(xué)).Adv.VirusRes.34:247-281.Lamb,R.A.1993.Paramyxovirusfusion:Ahypothesisforchanges(畐,病毒融合變化的假說).Virology.197:1-11.Maggi,F.,M.Pifferi,M.Vatteroni,C.Fornai,E.Tempestini，S.Anzilotti,L.Lanini,EAndreoli，V.Ragazzo,M.Pistello,S.Specter,M.Bendinelli.2003.Humanmetapneumovirusassociatedwithrespiratorytractinfectionsina3-yearstudyofnasalswabsfrominfantsinItaly(意大利嬰兒鼻拭子的3年研究中與呼吸道感染有關(guān)的人偏肺病毒).J.ClinicalMicrobiology.41:2987-2991.Morrison,T.G.,2003.Structureandfunctionofaparamyxovirusfusionprotein(副黏病毒融合蛋白的結(jié)構(gòu)與功能).BiochimicaetBiophysicaActa1614:73-84.Nagai，Y.,M.Hamaguchi禾口T.Toyoda.1989.MolecularbiologyofNewcastlediseasevims(新城疫病毒的分子生物學(xué)).Prog.Vet.Microbiol.5:16-64.Nagai，Y.,H,D.Klenk禾口R.Rott.1976.ProteolyticcleavageoftheviralglycoproteinsanditssignificanceforthevirulenceofNewcastlediseasevirus(病毒糖蛋白的蛋白水解切割及其對新城疫病毒毒力的意義).Virology72:494-508.NissenM.D.,D丄Siebert，I.M.,Mackay，T.P.,Sloots禾口S丄Withers.2002.EvidenceofhumanmetapneumovimsinAustralianchildren(澳大禾ll亞兒童中人偏肺病毒的證據(jù)).Med.J.Aust.176:188.Okada，H.，J.T.Seto，N丄.McQueen,H,D.Klenk，R.Rott和M.Tashiro.1998.DeterminantsofpantropismoftheFl-RmutantofSendaivirus:specificmutationsinvolvedareintheFandMgenes(仙臺病毒Fl-R突變體泛嗜性的決定因素所包括的特異性突變發(fā)生在F和M基因中).Arch.Virol.143:2342-2352.Peiris，J.S.，W.H.Tang，K.H.Chan，P丄.Khong，Y.Guan,Y丄.Lau和S.S.Chiu.20023,ChildrenwithrespiratorydiseaseassociatedwithmetapneumovimsinHongKong(與偏肺病毒有關(guān)的香港呼吸道疾病患兒).Emerg.Infect.Dis.9:628-633.Peret,T.C.T.，G.Boivin，Y.Li,M.Couillard，C.Humphrey,A.D.M.E.Osterhaus,D.D.Erdman禾QL丄Anderson.2002.CharacterizationofhumanmetapneumovirusesisolatedfrompatientsinNorthAmerica(表征北美患者的人偏肺病毒分離物).J.Infect.Dis.185:1660-1663.Peret,T.C.T.,Y.Abed,L丄Anderson,D.D.Erdman和G.Boivin.2004.SequencepolymorphismofthepredictedhumanmetapneumovirusGglycoprotein(預(yù)計的人偏肺病毒G糖蛋白的序列多態(tài)性).J.GenVirol.85:679-686.Russell,C丄，T.S.Jardertzky,R.A.Lamb.2001.Membranefusionmachinesofparamyxoviruses:captureofintermediatesoffusion(畐(]黍占病毒的月莫鬲蟲合機制捕捉融合中間體).EMBO.J.20:4024-4034.Seal,B.S.,H.S.Sellers,R丄Meinersmann,2000.FusionproteinpredictedaminoacidsequenceofthefirstUSavianpneumovirusisolateandlackofheterogeneityamongotherUSisolates(首份美國禽肺病毒分離物融合蛋白的預(yù)計氨基酸序列在其它美國分離物中無異質(zhì)性).Virus.Res.66:139-147.Scheid，A和P.W.Choppin.1974.Identificationofthebiologicalactivitiesofparamyxovirusglycoproteins(鑒定副黏病毒糖蛋白的生物學(xué)活性).Activationofcellfusion,hemolysisandinfectivitybyproteolyticcleavageofaninactiveprecursorproteinofSendaivims(通過蛋白水解切割仙臺病毒的無活性前體蛋白激活了細胞融合、溶血作用和傳染力).Virology,57:475-490.Scheid,A禾口P.W.Choppin，1977.TwodisulfidelinkedpolypeptidechainsconstitutetheactiveFproteinofparamyxoviruses(兩條二硫鍵連接的多肽鏈構(gòu)成了副黏病毒的活性F蛋白).Virology80:54-66.Skiadopoulos,M.H.，S.Biacchesi,U丄Buchholz,J.M,Riggs,S.R.Surman,E.Amaro-Carambot,J.M.McAuliffe,W.R.Elkins，M.St.Claire，P丄.Collins禾口B.RMurphy.2004.Thetwomajorhumanmetapneumovirusgeneticlineagesarehighlyrelatedantigenically，andthefusion(F)proteinisamajorcontributortothisantigenicrelatedness(兩種主要的人偏肺病毒遺傳譜系在抗原性上高度相關(guān)和主要是融合(F)蛋白導(dǎo)致此抗原性相關(guān)).J.V.78:6927-6937.Skiadopoulos,M.H.,S.R.Surman,J.M.Riggs，C.Orvell,P丄.Collins禾口B.R.Murphy.2002.Evaluationofthereplicationandimmunogenicityofrecombinanthumanparainfluenzavirustype3vectorsexpressinguptothreeforeignglycoproteins(評估最多表達3種外源糖蛋白的重組3型人副流感病毒的復(fù)制和免疫原性).Virology297:136-152.Stockton,J.I.Stephenson,D.Fleming,M.Zambon,2002.Humanmetapneumovirusasacauseofcommunity-acquiredrespiratoryillness(作為社區(qū)獲得性呼吸道疾病因子的人偏肺病毒).Emerg.Infect.Dis.8，897-901.Tang,R.S.,M.MacPhail,J.H.Schickli,J.Kaur,C丄.Robinson,H.A.Lawlor,J.M.Guzzetta，R.R.Spaete禾口A.A.Haller.2004a.Parainfluenzavirustype3expressingthenativeorsolublefusion(F)proteinofrespiratorysyncytialvirus(RSV)confersprotectionfromRSVinfectioninAfricangreenmonkeys(表達呼吸道合胞體病毒(RSV)的天然或可溶性融合(F)蛋白的3型副流感病毒賦予了峰值RSV感染非洲綠猴的保護力).J.Virol.78:11198-11207.Tang,R.S.，K.Mahmood,M.MacPhail,J.M.Guzzetta,A.A.Haller,H.Liu，J.Kaur,H.A.Lawlor,E.A.Stillman，J.H.SchickliR.A.M.Fouchier,A.D.M.E.Osterhaus,R.R.Spaete.2004b.AHost-rangerestrictedparainfluenzavirustype3(PIV3)expressingthehumanmetapneumovirus(hMPV)fusionproteinelicitsprotectiveimmunityinAfricangreenmonkeys(表達人偏月市病毒(hMPV)融合蛋白的宿主范圍限制性3型副流感病毒能在非洲綠猴中引發(fā)保護性免疫力).Vaccine(印刷中)Tang,R.S.,J.H.Schickli,M.MacPhail,F.Fernandes，L.Bicha，J.Spaete，R.A.M.Fouchier,A.D.M.E.Osterhaus,R.Spaete和A.A.Haller.2003.Effectsofhumanmetapneumovirusandrespiratorysyncytialvirusantigninsertionintwo3，proximalgenomepositionsofbovine/humanparainfluenzavimstype3onvirusreplicationandimmimogenicity(將人偏肺病毒和呼吸道合胞體病毒抗原插入3型牛/人副流感病毒的兩個3'近端基因組位置對病毒復(fù)制和免疫原性的影響).J.Virol.77:10819-10828Tashiro,M.禾口M.Homma.1983.PneumotropismofSendaivirusinrelationtoprotease-mediatedactivationinmouselungs(小鼠月巿中仙臺病毒的親月市性與蛋白酶介導(dǎo)的活化有關(guān)).Infect.Immun.39:879-888.Tashiro,M.,N.L.McQueen,J.T.Seto,H,D.Klenk禾QR.Rott.1996.InvolvementofthemutatedMproteininalteredbuddingpolarityofapantropicmutant,Fl-R,ofSendaivirus(突變型M蛋白參與仙臺病毒泛嗜性突變體Fl-R的出芽極性改變).J.ofVir.70:5990-5997.Tashiro,M.，E.Pritzer,M.A.Khoshnan,M.Yamakawa，K.Kuroda,H.-D.Klenk,R.Rott禾口J.T.Seto.1988.CharacterizationofapantropicvariantofSendaivirusderivedfromahost-rangemutant(表征源自宿主范圍突變體的仙臺病毒的泛嗜性變體).Virology165:577-583.Tashiro,M.J.T.Seto，S.Choosakul,M.Yamakawa,H,D.Klenk和R.Rott.1992a.BuddingsiteofSendaivimsinpolarizedepithelialcellsisoneofthedeterminantsfortropismandpathogenicityinmice(極化上皮細胞中仙臺病毒的出芽部位是小鼠中嗜性和致病性的決定因素之一).Virology187:413-422.Tashiro,M.,S.T.Seto，H.-D.Klenk禾口R.Rott.1993.PossibleinvolvementofmicrotubuledisruptioninbipolarbuddingofaSendaivirusmutant,Fl-R,inepithelialMDCKcells(在上皮MDCK細胞中微管破壞可能參與仙臺病毒突變體Fl-R的雙極性出芽).J.ofVir.67:5卯2-5910.Tashiro,M.,M.Yamakawa,K.Tobita,H,D.Klenk，R.Rott禾PJ.T.Seto,1990OrgantropismofSendaivirusinmice:proteolyticactivationofthefusionglycoproteininmouseorgansandbuddingsiteatthebronchialepithelium(仙臺病毒在小鼠中的器官嗜性小鼠器官中融合糖蛋白的蛋白水解激活和支氣管上皮的出芽部位).J.ofVir.64:3627-3634.Tashiro,M.,Y.Yokogoshi，K.Tobita，J.T.Seto,R.Rott和H.Kondo.1992b.TryptaseClara:anactivatingproteaseforSendaivirusinratlungsthatisinvolvedinpneum叩athogenicity(卡拉拉類胰蛋白酶參與仙臺病毒在大鼠肺中肺致病性的活化蛋白酶).J.Viro.66:7211-7216.Toquin，D.，C.deBoisseson,V.Beven,D.A.Senne禾卩NEterradossi.2003.SubgroupCavianmetapneumovirus(MPV)andtherecentlyisolatedhumanMPVexhibitacommonorganizationbuthaveextensivesequencedivergenceintheirputativeSHandGgenes(C亞群禽肺病毒(MPV)和最近分離的人MPV顯示有共152同的結(jié)構(gòu)，但在它們的推定SH和G基因中有廣泛的序列差異).J.ofGeneralVirology.84:2169-2178.Towatari，T,，M.Ide,K.Ohba，Y.Chiba,M.Murakami,M.Shiota,M,Kawachi，H.Yamada禾口H.Kido.2002.IdentificationofectopicanionictrypsinIinratlungspotentiatingpneumotropicvirusinfectivityandincreasedenzymelevelaftervimsinfection(鑒定大鼠肺中能增強親肺病毒傳染力和提高病毒感染后酶水平的異位陰離子胰蛋白酶I).Eur.J.Biochem.269:2613-2621.Toyoda,T.，T.Sakaguchi,K.Imai，N.M.Inocencio,B.Gotoh,M.Hamaguchi禾口T.Nagai.1987.Structuralcomparisonofthecleavage-activationsiteofthefusionglycoproteinbetweenvirulentandavimlentstrainsofNewcastlediseasevirus(新城疫病毒毒力和無毒力毒株之間融合糖蛋白切割激活位點的結(jié)構(gòu)比較).Virology158:242-247.vandenHoogen,B.G.，T.M.Bestebroer,A.D.M.E.Osterhaus禾卩R.A.M.Fouchier.2002.Analysisofthegenomicsequenceofhumanmetapneumovirus(分析人偏肺病毒的基因組序列).Virology.295:119-132.vandenHoogen,B.G.,G丄vanDoornum,J.C.Fockens，J.J.Cornelissen，W.E.Beyer,R.deGroot,A.D.Osterhaus禾卩R.A.Fouchier.2003.Prevalenceandclinicalsymptomsofhumanmetapneumovirusinfectioninhospitalizedpatients(住院患者中人偏肺病毒感染的流行和臨床癥狀).J.Infect.Dis.188:1571-1577.vandenHoogen,B.G.,S.Herfst，L.Sprong,P.A.Cane,E.Forleo-Neto，R丄.deSwart,A.D.M.E.Osterhaus禾卩R.A.M.Fouchier.2004a.Antigenicandgeneticvariabilityofhumanmetapneumoviruses(人偏月巿病毒的抗原性禾口遺傳變異性)2004b.EmergingInfectiousDiseases(新出現(xiàn)的傳染性疾病)，10:658-666.vandenHoogen,B.G.，J.C.deJong,J.Groen,T.Kuiken，R.deGroot，R.A.M.Fouchier禾口A.D.M.E.Osterhaus.2001.Anewlydiscoveredhumanpneumovirusisolatedfromyoungchildrenwithrespiratorytractdisease(從患卩乎吸道疾病的幼兒分離到新發(fā)現(xiàn)的人肺病毒).Nat.Med.7:719-724.vandenHoogen,B.G.,A.D.M.E.Osterhaus禾卩R.A.M.Fouchier.2004b.ClinicalimpactanddiagnosisofhMPVinfections(hMPV感染的臨床影響和診斷).PediatricInfectiousDiseaseJournal,23:S25-32.White,J.M.1990.Viralandcellularmembranefusionproteins(病毒禾口細胞膜融合蛋白).AnnualReviewPhysiology.52:675-697.Willams,J.V.，P.A.Harris,S丄Tollefson,L丄.Halburnt-Rush,J.M.Pingsterhaus,K.M.Edwards,P.F.Wright禾卩J.E.CroweJr.2004.Humanmetapneumovirusandlowerrespiratorytractdiseaseinotherwisehealthyinfantsandchildren(健康嬰兒和兒童中的人偏肺病毒和下呼吸道疾病).N.Engl.J.Med.350:443-450.Wolf,D.,Z.Zakay-Rones,A.Fadeela，D.Greenberg禾口R.Dagan.2003.HighseroprevalenceofhumanmetapneumovirusamongyoungchildreninIsrael(以色列幼兒中人偏肺病毒的血清陽性率高).J.Inf.Dis.188:1865-1867.引用的參考文獻本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可對本發(fā)明作出許多改進和變化而不脫離其構(gòu)思和范圍。給予本文所述的具體實施方式只是舉例，本發(fā)明只受限于附加的權(quán)利要求書的條款連同這些權(quán)利要求所賦予的等同全部范圍。這種改進應(yīng)屬于附加的權(quán)利要求書的范圍。如同各篇單獨的出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾垖ｉT且單獨表明出于所有目的全文納入本文作為參考的程度一樣，本文引用的所有參考文獻、專利和非專利出于所有目的全文納入本文作為參考。此外，2004年4月23日提交，2005年1月27日作為US2005/0019891Al公布的，名為"MetapneumovirusStrainsAndTheirUseInVaccineFormulationsAndAsVectorsForExpressionOfAntigenicSequencesAndMethodsForPropagatingVirus"(偏肺病毒毒株及其在疫苗制劑中和作為表達抗原性序列的載體的應(yīng)用以及增殖病毒的方法)的美國專利申請系列號10/831,780全文納入本文作為參考。表14:序列表的圖例SEQIDNO:l人偏肺病毒分離物00-1基質(zhì)蛋白(M)和融合蛋白(F)基因SE(5IDNO:2禽肺病毒融合蛋白基因，部分cdsSE<51DNO:3禽肺病毒分離物lb融合蛋白mRNA，完整的cdsSEQIDNO:4火雞鼻氣管炎病毒的融合蛋白(F1和F2亞基)基因，完整的cdsSEQIDNO:5禽肺病毒基質(zhì)蛋白(M)基因，部分cds和禽肺病毒融合糖蛋白(F)基因，完整的cdsSE(JIDNO:6副黏病毒F蛋白hRSVBSEQ1DNO:7副黏病毒F蛋白hRSVA2SECIDNO:8人偏肺病毒01-71(部分序列)SEqIDNO:9人偏肺病毒分離物00-1基質(zhì)蛋白(M)和融合蛋白(F)基因SEQIDNO:IO禽肺病毒融合蛋白基因，部分cdsSEQIDNO:ll禽肺病毒分離物lb融合蛋白mRNA，完整的cdsSEQIDNO:12火雞鼻氣管炎病毒的融合蛋白(F1和F2亞基)基因，完整的cdsSE<5IDNO:13禽肺病毒融合糖蛋白(F)基因，完整的cdsSE(5IDNO:14火雞鼻氣管炎病毒(毒株CVL14/1)連接蛋白(G)mRNA，完整的cdsSEQIDNO:15火雞鼻氣管炎病毒(毒株6574)連接蛋白(G)，完整的cdsSEQ1DNO:16火雞鼻氣管炎病毒(毒株CVL14/1)連接蛋白(G)mRNA，完整的cdsSEGIDNO:17火雞鼻氣管炎病毒(毒株6574)連接蛋白(G)，完整的cdsSEQIDNO:8分離物NL/1/99(99-1)HMPV(人偏肺病毒)cDNA序列SEQIDNO:19分離物NL/1/00(00-1)HMPVcDNA序列SE(JIDNO:20分離物NL/17/00HMPVcDNA序列SE(5IDNQ:21分離物NL/1/94HMPVcDNA序列SEQIDNO:22RT-PCR弓|物TR1SEQIDNO:23RT-PCR引物NlSEQIDNO:24RT-PCR弓I物N2SEQ1DNO:25RT-PCR引物MlSEQDNO:26RT-PCR引物M2SEQIDNO:27RT-PCR引物FlSEQIDNO:28RT-PCR弓I物N3SEQIDNO:29RT-PCR引物N4SEQIDNO:30RT-PCR引物M3SEQIDNO:31RT-PCR引物M4SEQIDNO:32RT-PCR引物F7SEQ1DN0:33RT-PCR弓I物F8SEQDNO:34RT-PCR弓|物L(fēng)6SEQIDNO:35RT-PCR引物L(fēng)7SEQIDNO:36寡核苷酸探針MSEQIDNO:37寡核苷酸探針NSEQIDNO:38寡核苷酸探針LSEQ1DN0:39分離物NL/l/00、BI/1/01、FI/4/01、NL/8/01、FI/2/01的T叫Man引物和探針序列SEQIDNO:40分離物NL/30/01的T叫Man引物和探針序列SEQIDNO:41分離物NL/22/01和NL/23/01的TaqMan引物和探針序列SEQIDNO:42分離物NL/17/01的TaqMan引物和探針序列SEQ1DNO:43分離物NL/17/00的的T叫Man引物和探針序列SEQIDNO:44分離物NL/9/01、NL/21/01和NL/5/01的T叫Man引物和探針序列SEQIDNO:45分離物FI/1/01和FI/10/01的TaqMan引物和探針序列SEQIDNO:46引物ZF1SEQIDNO:47引物ZF4SEQIDNO:48引物ZF7SEQIDNO:49引物ZFIOSEQIDNO:50引物ZF13SEQ1DN0:51引物ZF6SEQIDNO:52引物CS1SEQIDNO:53引物CS4SEQIDNO:54引物CS7SEQIDNO:55引物CSIOSEQfDNO:56引物CS13SEQIDNO:57引物CS16SEQIDNO:58擴增HPIV-1的正向引物SEQIDNO:59擴增HPIV-1的反向引物156SE<QIDNO:60擴增HPIV-2的正向引物SE(3IDNO:61擴增HPIV-2的反向引物SE<3IDNO:62擴增HPIV-3的正向引物SE(5IDNO:63擴增HPIV-3的反向引物SEC5IDNO:64擴增HPIV-4的正向引物SEQIDNO:65擴增HPIV-4的反向引物SEPIDNO:66擴增腮腺炎病毒的正向引物SE(3IDNO:67擴增腮腺炎病毒的反向引物SEQDNO:68擴增NDV的正向引物SEQIDNO:69擴增NDV的反向引物SEQIDNO:70擴增T叩aia的正向引物SEGIDNO:71擴增Tupaia的反向引物SECJ1DNO:72擴增Mapuera的正向引物SEQ1DNO:73擴增M叩uera的反向引物SEpIDNO:74擴增Hendra的正向引物SEGIDNO:75擴增Hendra的反向引物SEqIDNO:76擴增Nipah的正向引物SEGIDNO:77擴增Nipah的反向引物SEQIDNO:78擴增HRSV的正向引物SEQiDNO:79擴增HRSV的反向引物SEGIDNO:80擴增麻疹病毒的正向引物SE(5IDNO:81擴增麻疹病毒的反向引物SECIDNO:82擴增普通副黏病毒(generalparamyxoviridaevimses)的正向引物SEQIDNO:83擴增普通副黏病毒的反向引物SEQIDNO:84分離物NL/1/00(Al)的G-基因編碼序列SEQIDNO:85分離物BR/2/01(Al)的G-基因編碼序列SE(5IDNO:86分離物FL/4/01(Al)的G-基因編碼序列SEQDNO:87分離物FL/3/01(Al)的G-基因編碼序列SEQIDNO:88分離物FL/8/01(Al)的G-基因編碼序列SE(5IDNO:89SE<5IDNO:90SEQIDNO:91SEqIDNO:92SEGIDNO:93SE(5IDNO:94SEQIDNO:95SEQIDNO:96SEgIDNO:97SEqIDNO:98SEQ[DNO:99SECJIDNO:IOOSECIDNO:IOISEGIDNO:102SEQIDNO:103SEQIDNO:104SEgIDNO:105SE<5IDNO:106SE(5IDNO:107SEQIDNO:108SEQ1DNO:109SEQIDNO:llOSEQIDNO:lllSEQIDN0:112SEQIDNO:113SEQ1DNO:114SEQIDNO:115SEQIDNO:116SEQIDNO:in分離物FL/10/01(Al)的G-基因編碼序列分離物NL/10/01(Al)的G-基因編碼序列分離物NL/2/02(Al)的G-基因編碼序列分離物NL/17/00(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/1/81(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/1/93(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/2/93(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/3/93(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/1/95(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/2/96(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/3/96(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/22/01(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/24/01(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/23/01(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/29/01(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/3/02(A2)的G-基因編碼序列分離物NL/1/99(Bl)的G-基因編碼序列分離物NL/11/00(Bl)的G-基因編碼序列分離物NL/12/00(Bl)的G-基因編碼序列分離物NL/5/01(Bl)的G-基因編碼序列分離物NL/9/01(Bl)的G-基因編碼序列分離物NL/21/01(Bl)的G-基因編碼序列分離物NL/1/94(B2)的G-基因編碼序列分離物NL/1/82(B2)的G-基因編碼序列分離物NL/1/96(B2)的G-基因編碼序列分離物NL/6/97(B2)的G-基因編碼序列分離物NL/9/00(B2)的G-基因編碼序列分離物NL/3/01(B2)的G-基因編碼序列分離物NL/4/01(B2)的G-基因編碼序列SEQIDNO:118SEQIDNO:119SEC}IDNO:120SEGIDNO:121SEQIDNO:122SEQIDNO:123SEQIDNO:124SEQIDNO:125SE(JIDNO:126SEQIDNO:127SEQIDNO:128SEGIDNO:129SEC)IDNO:130SE(JIDNO:131SEQIDNO:132SEQIDNO:133SEGIDNO:134SEgIDNO:135SEQIDNO:136SEQIDNO:137SE(5IDNO:138SEQIDNO:139SEGIDNO:140SEQIDNO:141SEQIDNO:142SEQIDNO:143SEC)IDNO:144SEQIDNO:145SEQIDNO:146分離物UK/5/01(B2)的G-基因編碼序列分離物NL/1/00(Al)的G蛋白序列分離物BR/2/01(Al)的G蛋白序列分離物FL/4/01(Al)的G蛋白序列分離物FL/3/01(Al)的G蛋白序列分離物FL/8/01(Al)的G蛋白序列分離物FL/10/01(Al)的G蛋白序列分離物NL/10/01(Al)的G蛋白序列分離物NL/2/02(Al)的G蛋白序列分離物NL/17/00(A2)的G蛋白序列分離物NL/1/81(A2)的G蛋白序列分離物NL/1/93(A2)的G蛋白序列分離物NL/2/93(A2)的G蛋白序列分離物NL/3/93(A2)的G蛋白序列分離物NL/1/95(A2)的G蛋白序列分離物NL/2/%(A2)的G蛋白序列分離物NL/3/96(A2)的G蛋白序列分離物NL/22/01(A2)的G蛋白序列分離物NL/24/01(A2)的G蛋白序列分離物NL/23/01(A2)的G蛋白序列分離物NL/29/01(A2)的G蛋白序列分離物NL/3/02(A2)的G蛋白序列分離物NL/1/99(Bl)的G蛋白序列分離物NL/11/00(Bl)的G蛋白序列分離物NL/12/00(Bl)的G蛋白序列分離物NL/5/01(Bl)的G蛋白序列分離物NL/9/01(Bl)的G蛋白序列分離物NL/21/01(Bl)的G蛋白序列分離物NL/1/94(B2)的G蛋白序列SEQIDNO:147SEQIDNO:148SEQIDNO:149SEG1DNO:150SEQ1DNO:151SEGIDNO:152SE(5IDNO:153SEQIDNO:154SEC1DNO:155SEQ1DNO:156SEQIDNO:157SEQIDNO:158SEQDNO:159SEQIDNO:160SEQIDNO:161SE(5IDNO:162SEQDNO:163SE(5IDNO:164SEQIDNO:165SE(5IDNO:166SE<3fDNO:167SEQIDNO:168SEQIDNO:169SEQIDNO:170SEQIDNO:171SEQIDNO:172SE()IDNO:173SEQIDNO:174SEGIDNO:175分離物NL/1/82(B2)的G蛋白序列分離物NL/1/96(B2)的G蛋白序列分離物NL/6/97(B2)的G蛋白序列分離物NL/9/00(B2)的G蛋白序列分離物NL/3/01(B2)的G蛋白序列分離物NL/4/01(B2)的G蛋白序列分離物NL/5/01(B2)的G蛋白序列分離物NL/1/00的F-基因編碼序列分離物UK/1/00的F-基因編碼序列分離物NL/2/00的F-基因編碼序列分離物NL/13/00的F-基因編碼序列分離物NL/14/00的F-基因編碼序列分離物FL/3/01的F-基因編碼序列分離物FL/4/01的F-基因編碼序列分離物FL/8/01的F-基因編碼序列分離物UK/1/01的F-基因編碼序列分離物UK/7/01的F-基因編碼序列分離物FL/10/01的F-基因編碼序列分離物NL/6/01的F-基因編碼序列分離物NL/8/01的F-基因編碼序列分離物NL/10/01的F-基因編碼序列分離物NL/14/01的F-基因編碼序列分離物NL/20/01的F-基因編碼序列分離物NL/25/01的F-基因編碼序列分離物NL/26/01的F-基因編碼序列分離物NL/28/01的F-基因編碼序列分離物NL/30/01的F-基因編碼序列分離物BR/2/01的F-基因編碼序列分離物BR73/01的F-基因編碼序列SE<5IDNO:176SEGIDNO:177SEQIDNO:178SEQIDNO:179SEQfDNO:180SEQIDNO:181SEGIDNO:182SEQIDNO:183SE<51DNO:184SEC5IDNO:185SE(5IDNO:186SE(5IDNO:187SEQIDNO:188SEQIDNO:189SE(5IDNO:190SEGIDNO:191SEGIDNO:192SEQIDNO:193SEQIDNO:194SEQ1DNO:195SEQIDNO:196SE<5IDNO:197SE(5IDNO:198SEQIDNO:199SEQIDNO:200SEQIDNO:201SEqIDNO:202SEQIDNO:203SEQIDNO:204分離物NL/2/02的F-基因編碼序列分離物NL/4/02的F-基因編碼序列分離物NL/5/02的F-基因編碼序列分離物NL/6/02的F-基因編碼序列分離物NL/7/02的F-基因編碼序列分離物NL/9/02的F-基因編碼序列分離物FL/1/02的F-基因編碼序列分離物NL/1/81的F-基因編碼序列分離物NL/l/93的F-基因編碼序列分離物NL/2/93的F-基因編碼序列分離物NL/4/93的F-基因編碼序列分離物NL/1/95的F-基因編碼序列分離物NL/2/96的F-基因編碼序列分離物NL/3/96的F-基因編碼序列分離物NL/1/98的F-基因編碼序列分離物NL/17/00的F-基因編碼序列分離物NL/22/01的F-基因編碼序列分離物NL/29/01的F-基因編碼序列分離物NL/23/01的F-基因編碼序列分離物NL/17/01的F-基因編碼序列分離物NL/24/01的F-基因編碼序列分離物NL/3/02的F-基因編碼序列分離物NL/3/98的F-基因編碼序列分離物NL/1/99的F-基因編碼序列分離物NL/2/99的F-基因編碼序列分離物NL/3/99的F-基因編碼序列分離物NL/11/00的F-基因編碼序列分離物NL/12/00的F-基因編碼序列分離物NL/1Z01的F-基因編碼序列161SEGIDNO:205SEQ1DNO:206SEQIDNO:207SEQIDNO:208SEC)IDNO:209SEQIDNO:210SE(JIDNO:211SEQIDNO:212SEG1DNO:213SEQIDNO:214SEQIDNO:215SEqIDNO:216SEQIDNO:217SEQIDNO:218SEQIDNO:219SEGIDNO:220SEGIDNO:221SEQ1DNO:222SEQIDNO:223SEGIDNO:224SEQIDNO:225SEGIDNO:226SE(3IDNO:227SEgiDNO:228SEgIDNO:229SEQIDNO:230SE(5IDNO:231SEQIDNO:232SEQIDNO:233分離物NL/5/01的F-基因編碼序列分離物NL/9/01的F-基因編碼序列分離物NL/19/01的F-基因編碼序列分離物NL/21/01的F-基因編碼序列分離物UK/11/01的F-基因編碼序列分離物FL/1/01的F-基因編碼序列分離物FL/2/01的F-基因編碼序列分離物FL/5/01的F-基因編碼序列分離物FL/7/01的F-基因編碼序列分離物FL/9/01的F-基因編碼序列分離物UK/10/01的F-基因編碼序列分離物NL/1/02的F-基因編碼序列分離物NL/1/94的F-基因編碼序列分離物NL/1/96的F-基因編碼序列分離物NL/6/97的F-基因編碼序列分離物NL/7/00的F-基因編碼序列分離物NL/9/00的F-基因編碼序列分離物NL/19/00的F-基因編碼序列分離物NL/28/00的F-基因編碼序列分離物NL/3/01的F-基因編碼序列分離物NL/4/01的F-基因編碼序列分離物NL/11/01的F-基因編碼序列分離物NL/15/01的F-基因編碼序列分離物NL/18/01的F-基因編碼序列分離物FL/6/01的F-基因編碼序列分離物UK/5/01的F-基因編碼序列分離物UK/8/01的F-基因編碼序列分離物NL/12/02的F-基因編碼序列分離物HK/1/02的F-基因編碼序列SEQIDNO:234SEQIDNO:235SEQIDNO:236SEQIDNO:237SE(3IDNO:238SEQIDNO:239SEQIDNO:240SEC)IDNO:241SEqIDNO:242SE()IDNO:243SEQIDNO:244SE<5IDNO:245SEQIDNO:246SE(JIDNO:247SEQIDNO:248SEQ1DNO:249SE(5IDNO:250SEQIDNO:251SE(5fDNO:252SEQIDNO:253SEQ1DNO:254SEQIDNO:255SEQIDNO:256SEQIDNO:257SEQIDNO:258SEQIDNO:259SEQIDNO:260SE(5IDNO:261SEQIDNO:262分離物NL/1/00的F-蛋白序列分離物UK/1/00的F-蛋白序列分離物NL/2/00的F-蛋白序列分離物NL/13/00的F-蛋白序列分離物NL/14/00的F-蛋白序列分離物FL/3/01的F-蛋白序列分離物FL/4/01的F-蛋白序列分離物FL/8/01的F-蛋白序列分離物UK/1/01的F-蛋白序列分離物UK/7/01的F-蛋白序列分離物FL/畫1的F-蛋白序列分離物NL/6/01的F-蛋白序列分離物NL/8/01的F-蛋白序列分離物NL/10/01的F-蛋白序列分離物NL/14/01的F-蛋白序列分離物NL/20/0的F-蛋白序列分離物NL/25/01的F-蛋白序列分離物NL/26/01的F-蛋白序列分離物NL/28/01的F-蛋白序列分離物NL/30/01的F-蛋白序列分離物BR/2/01的F-蛋白序列分離物BR/3/01的F-蛋白序列分離物NL/2/02的F-蛋白序列分離物NL/4/02的F-蛋白序列分離物NL/5/02的F-蛋白序列分離物NL/6/02的F-蛋白序列分離物NL/7/02的F-蛋白序列分離物NL/9/02的F-蛋白序列分離物FL/1/02的F-蛋白序列SEQIDNO:263SEQIDNO:264SEQIDNO:265SEQIDNO:266SEQIDNO:267SEQIDNO:268SEGDNO:269SEQIDNO:270SEqIDNO:271SE(JIDNO:272SEQIDNO:273SEQIDNO:274SEQIDNO:275SE<5IDNO:276SEQIDNO:277SEQIDNO:278SEGIDNO:279SEQIDNO:280SEQIDNO:281SEQIDNO:282SEqIDNO:283SEQIDNO:284SEQIDNO:285SEQIDNO:286SEQIDNO:287SEGIDNO:288SEQIDNO:289SEQIDNO:2卯SEqIDNO:291分離物NL/1/81的F-蛋白序列分離物NL/1/93的F-蛋白序列分離物NL/2/93的F-蛋白序列分離物NL/4/93的F-蛋白序列分離物NL/1/95的F-蛋白序列分離物NL/2/96的F-蛋白序列分離物NL/3/96的F-蛋白序列分離物NL/1/98的F-蛋白序列分離物NL/17/00的F-蛋白序列分離物NL/22/01的F-蛋白序列分離物NL/29/01的F-蛋白序列分離物NL/23/01的F-蛋白序列分離物NL/17/01的F-蛋白序列分離物NL/24/01的F-蛋白序列分離物NL/3/02的F-蛋白序列分離物NL/3/98的F-蛋白序列分離物NL/l/99的F-蛋白序列分離物NL/2/99的F-蛋白序列分離物NL/3/99的F-蛋白序列分離物NL/11/00的F-蛋白序列分離物NL/12/00的F-蛋白序列分離物NL/1/01的F-蛋白序列分離物NL/5/01的F-蛋白序列分離物NL/9/01的F-蛋白序列分離物NL/19/01的F-蛋白序列分離物NL/21/01的F-蛋白序列分離物UK/11/01的F-蛋白序列分離物FL/1/01的F-蛋白序列分離物FL/2/01的F-蛋白序列164SEGIDNO:292分離物SEQIDNO:293分離物SEQIDNO:294分離物SE<5IDNO:295分離物SEQIDNO:296分離物SEGIDNO:297分離物SEGIDNO:298分離物SEQIDNO:299分離物SEQDNO:300分離物SEQIDNO:301分離物SEQIDNO:302分離物SE(5IDNO:303分離物SEQDNO:304分離物SEQIDNO:305分離物SEQIDNO:306分離物SE(JIDNO:307分離物SEQIDNO:308分離物SE<5IDNO:309分離物SEQIDNO:310分離物SEgIDNO:311分離物SEQDNO:312分離物SEGIDNO:313分離物SE<5IDNO:314HMPVSEGIDNO:315HMPVSE(J1DNO:316HMPVSE(5IDNO:317HMPVSE()IDNO:318HMPVSEGIDNO:319HMPVSEQIDNO:320畫PVFL/5/01的F-蛋白序列FL/7/01的F-蛋白序列FL/9/01的F-蛋白序列UK/10/01的F-蛋白序列NL/1/02的F-蛋白序列NL/1/94的F-蛋白序列NL/1/96的F-蛋白序列NL/6/97的F-蛋白序列NL/7/00的F-蛋白序列NL/9/00的F-蛋白序列NL/19/00的F-蛋白序列NL/28/00的F-蛋白序列NL/3/01的F-蛋白序列NL/4/01的F-蛋白序列NL/11/01的F-蛋白序列NL/15/01的F-蛋白序列NL/18/01的F-蛋白序列FL/6/01的F-蛋白序列UK/5/01的F-蛋白序列UK/8/01的F-蛋白序列NL/12/02的F-蛋白序列HK/1/02的F-蛋白序列分離物NL/1/00的F蛋白序列分離物NL/17/00的F蛋白序列分離物NL/1/99的F蛋白序列分離物NL/1/94的F蛋白序列分離物NL/1/00的F基因序列分離物NL/17/00的F基因序列分離物NL/1/99的F基因序列SE<5IDNO:321SEQIDNO:322SEQIDNO:323SEQIDNO:324SE(5IDNO:325SEQIDNO:326SEgIDNO:327SEQIDNO:328SEGIDNO:329SEQIDNO:330SE(5IDNO:331SE(5IDNO:332SEQIDNO:333SEQIDNO:334SEQIDNO:335SEQIDNO:336SE<5IDNO:337SEQDNO:338SEQIDNO:339SEGIDNO:340SEQIDNO:341SEQIDNO:342SE(51DNO:343SEQIDNO:344SEQIDNO:345SEQIDNO:346SEQIDNO:347SEQIDNO:348SEC)IDNO:349HMPV分離物NL/1/94的F基因序列HMPV分離物NL/1/00的G蛋白序列HMPV分離物NL/17/00的G蛋白序列HMPV分離物NL/1/99的G蛋白序列HMPV分離物NL/1/94的G蛋白序列HMPV分離物NL/1/00的G基因序列HMPV分離物NL/17/00的G基因序列HMPV分離物NL/1/99的G基因序列HMPV分離物NL/1/94的G基因序列HMPV分離物NL/1/00的L蛋白序列HMPV分離物NL/17/00的L蛋白序列HMPV分離物NL/1/99的L蛋白序列HMPV分離物NL/1/94的L蛋白序列HMPV分離物NL/1/00的L基因序列HMPV分離物NL/17/00的L基因序列HMPV分離物NL/1/99的L基因序列HMPV分離物NL/1/94的L基因序列HMPV分離物NL/1/00的M2-1蛋白序列HMPV分離物NL/17/00的M2-1蛋白序列HMPV分離物NL/1/99的M2-l蛋白序列HMPV分離物NL/1/94的M2-l蛋白序列HMPV分離物NL/1/00的M2-l基因序列HMPV分離物NL/17/00的M2-l基因序列HMPV分離物NL/1/99的M2-l基因序列畫PV分離物NL/1/94的M2-l基因序列HMPV分離物NL/1/00的M2-2蛋白序列HMPV分離物NL/17/00的M2-2蛋白序列HMPV分離物NL/1/99的M2-2蛋白序列HMPV分離物NL/1/94的M2-2蛋白序列SEQIDNO:350SE<51DNO:351SECIDNO:352SE(3IDNO:353SEQIDNO:354SEQIDNO:355SE(DNO:356SEQIDNO:357SEGIDNO:358SEQIDNO:359SEGIDNO:360SEQIDNO:361SECIDNO:362SE(IDNO:363SEQIDNO:364SEQIDNO:365SEQIDNO:366SEQIDNO:367SEQ1DNO:368SEQIDNO:369SEQIDNO:370SEQIDNO:371SEQIDNO:372SE(5IDNO:373SEq1DNO:374SECIDNO:375SEQDNO:376SEQIDNO:377SEQIDNO:378HMPV分離物NL/1/00的M2-2基因序列HMPV分離物NL/17/00的M2-2基因序列HMPV分離物NL/1/99的M2-2基因序列HMPV分離物NL/1/94的M2-2基因序列HMPV分離物NL/1/00的M2基因序列HMPV分離物NL/17/00的M2基因序列HMPV分離物NL/1/99的M2基因序列HMPV分離物NL/1/94的M2基因序列HMPV分離物NL/1/00的M蛋白序列HMPV分離物NL/17/00的M蛋白序列HMPV分離物NL/1/99的M蛋白序列HMPV分離物NL/1/94的M蛋白序列HMPV分離物NL/1/00的M基因序列HMPV分離物NL/17/00的M基因序列HMPV分離物NL/1/99的M基因序列HMPV分離物NL/1/94的M基因序列HMPV分離物NL/1/00的N蛋白序列HMPV分離物NL/17/00的N蛋白序列HMPV分離物NL/1/99的N蛋白序列HMPV分離物NL/1/94的N蛋白序列HMPV分離物NL/1/00的N基因序列HMPV分離物NL/17/00的N基因序列HMPV分離物NL/1/99的N基因序列HMPV分離物NL/1/94的N基因序列HMPV分離物NL/1/00的P蛋白序列HMPV分離物NL/17/00的P蛋白序列HMPV分離物NL/1/99的P蛋白序列HMPV分離物NL/1/94的P蛋白序列HMPV分離物NL/1/00的P基因序列SEQIDNO:379SEQIDNO:380SEQIDNO:381SEQ1DNO:382SE(3IDNO:383SEQIDNO:384SEQIDNO:385SEQIDNO:386SEqIDNO:387SEQIDNO:388SEQIDNO:389HMPV分離物NL/17/00的P基因序列HMPV分離物NL/1/99的P基因序列HMPV分離物NL/1/94的P基因序列HMPV分離物NL/1/00的SH蛋白序列HMPV分離物NL/17/00的SH蛋白序列HMPV分離物NL/1/99的SH蛋白序列HMPV分離物NL/1/94的SH蛋白序列HMPV分離物NL/1/00的SH基因序列HMPV分離物NL/17/00的SH基因序列HMPV分離物NL/1/99的SH基因序列HMPV分離物NL/1/94的SH基因序列權(quán)利要求1.一種增殖哺乳動物偏肺病毒的方法，其中所述方法包括在胰蛋白酶比活低于20毫單位/毫升培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該哺乳動物偏肺病毒。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基中不外源性加入胰蛋白酶。4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基中不加入血清。5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物偏肺病毒的F蛋白切割位點中的RQSR切割基序含有至少一個氨基酸取代。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，與SEQIDNO:314相比，所述哺乳動物偏肺病毒的F蛋白含有至少一個額外的氨基酸取代。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，RQSR切割基序中的氨基酸取代是絲氨酸被脯氨酸取代，從而得到RQPR序列。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，F(xiàn)蛋白中的所述額外氨基酸取代是E93K、Q100K、E92K、E93V、195S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H中至少一個。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，F(xiàn)蛋白中的所述額外氨基酸取代是E93K。10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述額外氨基酸取代穩(wěn)定了RQSR基序中的氨基酸取代。11.一種分離的哺乳動物偏肺病毒，其中所述哺乳動物偏肺病毒能在沒有胰蛋白酶存在時生長。12.如權(quán)利要求11所述的病毒，其特征在于，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏月巿病毒。13.如權(quán)利要求11或12所述的病毒，其特征在于，所述哺乳動物偏肺病毒的F蛋白切割位點中的RQSR切割基序含有至少一個氨基酸取代。14.如權(quán)利要求13所述的病毒，其特征在于，與SEQIDNO:314相比，所述哺乳動物偏肺病毒的F蛋白含有至少一個額外的氨基酸取代。15.如權(quán)利要求13所述的病毒，其特征在于，RQSR切割基序中的氨基酸取代是絲氨酸被脯氨酸取代，從而得到RQPR序列。16.如權(quán)利要求14所述的病毒，其特征在于，F(xiàn)蛋白中的所述額外氨基酸取代是E93K、Q100K、E92K、E93V、195S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H中至少一個。17.如權(quán)利要求14所述的病毒，其特征在于，所述額外氨基酸取代穩(wěn)定了RQSR基序中的氨基酸取代。18.如權(quán)利要求16所述的病毒，其特征在于，F(xiàn)蛋白中的所述額外氨基酸取代是E93K。19.一種分離的核酸，其中所述分離的核酸編碼哺乳動物偏肺病毒的F蛋白，其中所述F蛋白含有S101P氨基酸取代和以下氨基酸取代中的至少一個E93K、Q100K、E92K、E93V、195S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H。20.如權(quán)利要求19所述的核酸，其特征在于，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏月市病毒。21.—種鑒定哺乳動物偏肺病毒F蛋白的方法，該F蛋白支持該哺乳動物偏肺病毒在沒有胰蛋白酶存在下穩(wěn)定生長，所述方法包括(a)在沒有胰蛋白酶存在下培養(yǎng)所述哺乳動物偏肺病毒，至少傳代兩次，其中所述哺乳動物偏肺病毒在F蛋白的切割位點中含有RQPR基序；和(b)檢測合胞體形成；其中與步驟(a)之前哺乳動物偏肺病毒的合胞體形成相比，合胞體形成增加表明所述哺乳動物偏肺病毒F蛋白已獲得支持所述哺乳動物偏肺病毒在沒有胰蛋白酶存在下穩(wěn)定生長的額外氨基酸取代。22.—種鑒定哺乳動物偏肺病毒F蛋白的方法，所述F蛋白支持該哺乳動物偏肺病毒在沒有胰蛋白酶存在下穩(wěn)定生長，所述方法包括(a)在沒有胰蛋白酶存在下培養(yǎng)所述哺乳動物偏肺病毒，至少傳代兩次，其中所述哺乳動物偏肺病毒在F蛋白的切割位點中含有RQPR基序；和(b)檢測F蛋白的切割；其中與步驟(a)之前哺乳動物偏肺病毒的F蛋白切割相比，F(xiàn)蛋白切割增加表明所述哺乳動物偏肺病毒F蛋白已獲得支持所述哺乳動物偏肺病毒在沒有胰蛋白酶存在下穩(wěn)定生長的額外氨基酸取代。23.—種鑒定哺乳動物偏肺病毒F蛋白突變體的方法，該F蛋白突變體提高F蛋白不依賴胰蛋白酶的切割，其中所述F蛋白在切割位點中含有RQPR基序，所述方法包括(a)在沒有胰蛋白酶存在下培養(yǎng)所述哺乳動物偏肺病毒，至少傳代兩次；和(b)檢測所述F蛋白的切割效率，其中所述F蛋白的切割效率提高表明所述F蛋白己獲得提高F蛋白不依賴胰蛋白酶切割的突變。24.—種鑒定催化哺乳動物偏肺病毒F蛋白切割的蛋白酶的方法，其中所述F蛋白在切割位點中含有RQPR基序，所述方法包括(a)使所述F蛋白與檢驗蛋白酶接觸；和(b)檢測是否發(fā)生了所述F蛋白的切割；其中所述F蛋白發(fā)生切割表明該蛋白酶催化所述F蛋白的切割。25.如權(quán)利要求21、22、23或24所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物偏肺病毒是人偏肺病毒。26.如權(quán)利要求21、22、23或24所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物偏肺病毒攜帶有S101P突變。全文摘要本發(fā)明涉及副黏病毒科副黏病毒亞科中的哺乳動物負鏈RNA病毒，偏肺病毒(MPV)的改良毒株。本發(fā)明還涉及沒有胰蛋白酶存在時增殖哺乳動物MPV的方法?？衫帽景l(fā)明方法和組合物制備抗，例如MPV感染的疫苗。文檔編號C12N7/00GK101548009SQ200680015321公開日2009年9月30日申請日期2006年3月9日優(yōu)先權(quán)日2005年3月10日發(fā)明者J·H·?？死暾埲?米迪繆尼有限公司