專利名稱：鑒定調(diào)節(jié)雄激素受體與β-聯(lián)蛋白相互作用的化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定調(diào)節(jié)雄激素受體(AR)和P-聯(lián)蛋白之間雄激素依 賴性相互作用的化合物的測(cè)定法。本發(fā)明具體涉及鑒定分子，所述分子能 夠破壞雄激素受體和P-聯(lián)蛋白的相互作用并從而特異消除P-聯(lián)蛋白對(duì)AR 信號(hào)傳遞的影響或者消除AR對(duì)p-聯(lián)蛋白和Wnt信號(hào)傳遞的影響。
背景技術(shù)：
通常，如下鑒定核/類固醇受體結(jié)合配體篩選受試化合物影響含有 共有核受體DNA元件基因響應(yīng)該核/類固醇受體而轉(zhuǎn)錄的能力。然而，除 了它們經(jīng)典的類固醇轉(zhuǎn)錄控制機(jī)制外， 一些類固醇受體還影響非類固醇信 號(hào)途徑并且受到所述途徑的影響。在許多情況中，將有用的是具有鑒定特 定化合物的手段，所述特定化合物僅在調(diào)節(jié)與此類受體關(guān)聯(lián)的非類固醇信 號(hào)途徑中選擇性有效，或者僅在調(diào)節(jié)受體對(duì)通常響應(yīng)此類受體的基因的轉(zhuǎn) 錄活性中選擇性有效的化合物。具有此類選擇性的化合物將在如下條件中 具有潛在的藥學(xué)效用希望調(diào)節(jié)非類固醇途徑但是不希望抑制經(jīng)典的類固 醇受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，或者反之亦然。
已知例如，雄激素受體(AR)-已知激活A(yù)R響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄的經(jīng)典類 固醇受體也通過(guò)AR與p-聯(lián)蛋白的雄激素介導(dǎo)的相互作用影響Wnt信號(hào)途 徑(1，2，3)。 Wnt途徑在包括骨、腸、皮膚和毛嚢的多種組織的分化和功能
活性中起重要作用。Wnt途徑的改變與疾病狀態(tài)如骨質(zhì)疏松和前列腺和結(jié) 腸癌有關(guān)。Wnt信號(hào)傳遞可能變得改變的其他狀況包括多嚢性卵巢綜合征 中的胰島素抵抗和雄激素性脫發(fā)(4，5)。在許多這些狀況中，已經(jīng)暗示雄激 素和AR作為Wtn途徑的潛在調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明描述了用于鑒定調(diào)節(jié)雄激素受體與P-聯(lián)蛋白的相互作用的化 合物的新的篩選測(cè)定法。當(dāng)與測(cè)量經(jīng)典雄激素介導(dǎo)的AR依賴性轉(zhuǎn)錄的調(diào) 節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法結(jié)合使用時(shí)，本發(fā)明的測(cè)定法使得使用者可以鑒定新類別 的AR調(diào)節(jié)劑，其選擇性抑制AR與p-聯(lián)蛋白相互作用的能力并且調(diào)節(jié)其 活性而不影響典型的AR激動(dòng)劑或者拮抗劑活性，如通過(guò)AR的雄激素介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。僅僅使用經(jīng)典的AR轉(zhuǎn)錄測(cè)定法不能檢測(cè)到具有該選擇活性的 化合物。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了確定受試化合物是否能夠調(diào)節(jié)雄激素受體(AR)和p-聯(lián) 蛋白之間的相互作用的方法，其包括如下步驟 (a)提供細(xì)胞，其包含
(i) 編碼雜合蛋白的DNA序列，該雜合蛋白包含與(i-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)融合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，
(ii) 包含對(duì)應(yīng)于所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的上游活化序列的DNA序列， 其有效連接報(bào)道基因并且控制報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄，和
(iii) 編碼雄激素受體蛋白的DNA序列，
(b) 任選在雄激素存在下向所述細(xì)胞導(dǎo)入受試化合物；和
(c) 測(cè)量所述報(bào)道基因的表達(dá)， 其中報(bào)道基因表達(dá)的降低或者升高表明該受試化合物能夠調(diào)節(jié)雄激素受體 和p-聯(lián)蛋白之間的相互作用。
在優(yōu)選方式中，本發(fā)明還提供了一種方法，其中(i)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域包含GAL-4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；并且(ii)的有效連接到報(bào)道基因的上游活 化DNA序列包含有效連接到所述報(bào)道基因的GAL-4 UAS。
在更優(yōu)選的方式中，本發(fā)明還提供了方法，其中(i)的NH3-末端區(qū)p-聯(lián)蛋白包含人P-聯(lián)蛋白的"H^酸2到424;其中報(bào)道基因?yàn)槲灩馑孛福黄?中存在有效連接到螢光素酶基因的GAL-4 UAS序列的多個(gè)拷貝；其中通 過(guò)受試化合物完成的調(diào)節(jié)是螢光素酶基因表達(dá)的降低；并且其中步驟(b)的 雄激素是DHT。
本發(fā)明的另一方面是確定受試化合物是否能夠調(diào)節(jié)雄激素受體和p-聯(lián)蛋白之間相互作用的方法，其包括步驟
(a) 提供細(xì)胞，其包含
(i) 編碼雜合蛋白的DNA序列，該雜合蛋白包含與p-聯(lián)蛋白融合的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，
(ii) 包含對(duì)應(yīng)于所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的上游活化序列的DNA序列， 其有效連接報(bào)道基因，和
(iii) 編碼雄激素受體蛋白的DNA序列，
(b) 任選在雄激素存在下向所述細(xì)胞導(dǎo)入受試化合物；和
(c) 測(cè)量所述報(bào)道基因的表達(dá)，
其中報(bào)道基因表達(dá)的升高或者降低表明該受試化合物能夠調(diào)節(jié)雄激素受體 和p-聯(lián)蛋白之間的相互作用。
另一方面是確定受試化合物能否相對(duì)于雄激素受體信號(hào)途徑選擇性 調(diào)節(jié)(5-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑的方法，其包括
(a) 鑒定通過(guò)抑制AR介導(dǎo)的與p-聯(lián)蛋白的相互作用升高或者降低基 因表達(dá)的受試化合物，其中該受試化合物除去對(duì)Wnt信號(hào)傳遞的雄激素作 為配體的AR抑制而不抑制雄激素-AR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄；和
(b) 測(cè)定(a)的受試化合物以確定該受試化合物是否通過(guò)p-聯(lián)蛋白獨(dú) 立的雄激素受體信號(hào)途徑升高或者降低基因的表達(dá)；
其中如果(a)的受試化合物不能通過(guò)雄激素受體信號(hào)途徑升高或者降低基 因的表達(dá)，那么該受試化合物通過(guò)抑制雄激素作為配體的AR與p-聯(lián)蛋白 相互作用的能力選擇性調(diào)節(jié)p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑。
另一方面是確定受試化合物是否相對(duì)于p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑選擇
性調(diào)節(jié)雄激素受體信號(hào)途徑的方法，其包括
(a)鑒定通過(guò)雄激素受體信號(hào)途徑升高或降低基因表達(dá)的受試化合
物；和
(b)測(cè)定(a)的受試化合物以確定該受試化合物是否增強(qiáng)或減弱雄激 素作為配體的AR或者非作為配體的AR抑制p-聯(lián)蛋白/Wnt信號(hào)傳遞的能
力；
從而(a)的受試化合物選擇性調(diào)節(jié)雄激素受體信號(hào)途徑而不除去Wnt信號(hào)
聯(lián)蛋白之間的相互作用，導(dǎo)致該受試化合物在升高或降低p-聯(lián)蛋白-Wnt 信號(hào)途徑調(diào)節(jié)的基因表達(dá)中沒(méi)有活性。
附圖簡(jiǎn)述
圖l描繪了用于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中的質(zhì)粒構(gòu)建體。
圖2是蛋白質(zhì)印跡，其圖解了二氫睪酮(DHT)刺激L929細(xì)胞中AR和 卩-聯(lián)蛋白之間的相互作用。
圖3是條形圖，圖解了本發(fā)明的方法測(cè)量AR和p-聯(lián)蛋白之間的依賴 DHT的相互作用。
圖4是條形圖，圖解了 p-聯(lián)蛋白和核受體之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作 用是AR特異的。
圖5是曲線圖，圖解了通過(guò)AR拮抗劑環(huán)丙孕酮抑制AR和p-聯(lián)蛋白 之間的DHT刺激的相互作用。
圖6描繪了人p-聯(lián)蛋白的M斷列(GenBank⑧檢索號(hào)2208332A; SEQ ID NO:l)。
詳述
申請(qǐng)人在^/>開(kāi)中特別并入所有引用的參考文獻(xiàn)的完整內(nèi)容。此外， 當(dāng)量、濃度或者其他值或者參數(shù)作為范圍、優(yōu)選的范圍或者優(yōu)選的上限值 和優(yōu)選的下限值的列表給出時(shí)，這將被理解為特別公開(kāi)從任一對(duì)任一范圍
上限或優(yōu)選值和任一 范圍下限或者優(yōu)選值形成的所有范圍，不管范圍是否 單獨(dú)公開(kāi)。當(dāng)在本文中引用數(shù)值范圍時(shí)，除非另外指出，范圍意在包括其 端點(diǎn)，和該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)。本發(fā)明的范圍不意在受到定義范圍 時(shí)引用的特定值的限制。
本發(fā)明評(píng)估AR和p-聯(lián)蛋白之間的雄激素依賴性相互作用，并且利用 i)包含編碼雜合蛋白的DNA的第一種DNA序列，所述雜合蛋白包含與|5-聯(lián)蛋白融合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，ii)包含能夠識(shí)別(i)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 上游活化序列的第二種DNA序列，該DNA序列有效連接報(bào)道基因；和iii) 編碼AR蛋白質(zhì)的第三種DNA序列。本發(fā)明的方法使得可以為包含并且 能夠任選在雄激素存在下表達(dá)DNA序列i、 ii和iii的細(xì)胞提供受試化合物， 以確定該受試化合物是否能夠調(diào)節(jié)p-聯(lián)蛋白和雄激素受體的雄激素刺激的 相互作用，如通過(guò)檢測(cè)報(bào)道基因的表達(dá)來(lái)測(cè)量。如果向細(xì)胞加入受試化合 物不影響報(bào)道基因的表達(dá)，那么此類化合物不能調(diào)節(jié)p-聯(lián)蛋白和雄激素受 體的雄激素依賴性相互作用。在優(yōu)選的方式中，(i)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包 含GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；有效連接到(ii)的報(bào)道基因的上游活化序列 是GAL-4-UAS;報(bào)道基因是螢光素酶。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，上 游活化序列的多個(gè)拷貝有效連接到報(bào)道基因，并且融合到DNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的(i)的P-聯(lián)蛋白包含人p-聯(lián)蛋白的M酸2到424。
申請(qǐng)人已經(jīng)闡明他們的測(cè)定法是AR和p-聯(lián)蛋白之間雄激素依賴性相 互作用的選擇性測(cè)量。通常，在篩選模式中，將本發(fā)明的DNA序列轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞用雄激素如二氫睪酮(DHT)處理，其引起AR和p-聯(lián)蛋白的相互作 用，導(dǎo)致增強(qiáng)的才艮道子活性?？梢澡b定降低報(bào)道子活性的分子并在第二種 測(cè)定法中測(cè)定它們破壞AR和DNA應(yīng)答共有元件之間的相互作用，所述 元件結(jié)合配位的AR并且引起轉(zhuǎn)錄的激活或者抑制。在該篩選中通過(guò)該方 法學(xué)鑒定的分子可以尤其用作雄激素性脫發(fā)、前列腺癌和多嚢性卵巢綜合 征中胰島素敏感性的治療。
申請(qǐng)人的測(cè)定法類似于Fields (6，7)的雙雜和體結(jié)合測(cè)定法，其利 用包含融合到DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的一種雜合分子，和包含融合到
轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的第二種雜合分子。然而，當(dāng)前的單雜和體結(jié)合
測(cè)定法是顯著的，因?yàn)樗鼘⒂欣阼b定這樣的分子，所述分子能夠破壞AR 和P-聯(lián)蛋白的相互作用并且從而特異消除p-聯(lián)蛋白對(duì)AR信號(hào)傳遞的影響 或者消除AR對(duì)p-聯(lián)蛋白和Wnt信號(hào)傳遞的影響。此外，在優(yōu)選方式中， 僅僅P-聯(lián)蛋白編碼序列的一部分融合到GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GAL4 DBD)。因?yàn)楫?dāng)前的測(cè)定法利用全長(zhǎng)的野生型AR，所以可以利用完整AR 蛋白質(zhì)用于靶定并且受試化合物對(duì)AR的結(jié)合沒(méi)有被融合構(gòu)建體阻斷。相 反，在雙雜和體測(cè)定法(6， 7)中，使用兩種重組融合蛋白構(gòu)建體具有如下 缺點(diǎn)靶蛋白的天然構(gòu)象在融合構(gòu)建體中可以改變。
可以在例如良好表征和廣泛使用的CV-1細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞系)或 者COS細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞系)中進(jìn)行本發(fā)明的測(cè)定法，但是本領(lǐng)域技術(shù) 人員將認(rèn)識(shí)到其他細(xì)胞系也是合適的。
本發(fā)明的另一方面是確定受試化合物是否相對(duì)于雄激素受體信號(hào)途徑 選捧性調(diào)節(jié)p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑的方法。在該方法中，基于受試化合物 通過(guò)調(diào)節(jié)p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑的雄激素-AR介導(dǎo)的抑制而升高或降低 基因的表達(dá)來(lái)鑒定所述受試化合物。如本文使用的"(5-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途 徑的雄激素作為配體的雄激素受體-介導(dǎo)的調(diào)節(jié)"指導(dǎo)致任一基因的轉(zhuǎn)錄升 高或降低的信號(hào)途徑，所述基因受到通過(guò)雄激素受體/p-聯(lián)蛋白相互作用啟 動(dòng)的Wnt介導(dǎo)的信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)(見(jiàn)例如，Mulholland DJ W fl/.， / 5"/.
Ore柳.277:17933-43 (2002); Yang F. " / C7^附.277:11336-44
(2002); Song L-N " a/.， Mo/. CW/.23:1674-87 (2003))。
優(yōu)選用評(píng)估雄激素受體與P-聯(lián)蛋白的相互作用的方法來(lái)鑒定能夠升高 或者降低基因表達(dá)的受試化合物，所述化合物通過(guò)調(diào)節(jié)AR和P-聯(lián)蛋白的 相互作用，導(dǎo)致阻抑或者抑制對(duì)p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑的雄激素-AR介 導(dǎo)的阻抑實(shí)現(xiàn)所述基因表達(dá)的升高或降低。在細(xì)胞類型特異性背景中，AR 和P-聯(lián)蛋白之間的相互作用可以對(duì)Wnt信號(hào)傳遞或者AR介導(dǎo)的信號(hào)傳遞 具有陽(yáng)性作用。在該實(shí)施方案中，AR-P-聯(lián)蛋白相互作用的陽(yáng)性調(diào)節(jié)物將 作為Wnt活化劑開(kāi)發(fā)。
然后測(cè)定積極或消極影響雄激素作為配體的AR調(diào)節(jié)p-聯(lián)蛋白-Wnt 轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳遞的能力的受試化合物，以確定受試化合物是否通過(guò)雄激素受 體信號(hào)途徑升高或降低基因的表達(dá)。如本文使用的"雄激素受體信號(hào)途徑" 或者"AR信號(hào)途徑"指雄激素受體的常規(guī)的轉(zhuǎn)錄途徑。在應(yīng)答配體結(jié)合時(shí)， 雄激素受體遷移到細(xì)胞的細(xì)胞核中，在核中形成同型二聚體。當(dāng)作為同型 二聚體結(jié)合到雄激素應(yīng)答元件(ARE)時(shí)，激動(dòng)劑結(jié)合的AR通過(guò)募集大的 酶輔激活物復(fù)合體而刺激轉(zhuǎn)錄，所述復(fù)合體包括GRIP1/TIF2、 CBP/p300 和其他輔激活物。此外，配體結(jié)合的AR還可以通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體如 AP1， NF-kB，和Ets家族通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用抑制轉(zhuǎn)錄。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到AR信號(hào)途徑評(píng)估的任一種測(cè)定法可以用于 本發(fā)明。
不能通過(guò)雄激素信號(hào)途徑升高或者降低基因表達(dá)的受試化合物在天然 內(nèi)源性或外源雄激素存在或不存在下，選擇性調(diào)節(jié)p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途 徑。"不能升高或降低基因的表達(dá)"意指通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的測(cè) 定技術(shù)沒(méi)有觀察到基因表達(dá)的升高或降低，所述技術(shù)為如RNA印跡、蛋 白質(zhì)印跡、DNA印跡、質(zhì)粒報(bào)道子測(cè)定法或者聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，或 者通過(guò)觀察體內(nèi)(動(dòng)物)器官系統(tǒng)形態(tài)或者已知被雄激素或者p-聯(lián)蛋白調(diào)節(jié) 的功能的總體改變。雄激素的已知的動(dòng)物模型效果的實(shí)例將是AR調(diào)節(jié)劑 和Wnt調(diào)節(jié)劑對(duì)嚙齒動(dòng)物/哺乳動(dòng)物前列腺生長(zhǎng)/重量的影響，其中AR激 動(dòng)劑增加前列腺細(xì)胞生長(zhǎng)和器官重量并且AR拮抗劑抑制雄激素的該作 用。
一個(gè)備選實(shí)施方案是確定受試化合物是否相對(duì)于p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào) 途徑選擇性調(diào)節(jié)雄激素受體信號(hào)途徑的方法。在該方法中，通過(guò)本領(lǐng)域技 術(shù)人員公知的方法，基于受試化合物通過(guò)雄激素受體信號(hào)途徑升高或者降 低基因表達(dá)的能力來(lái)鑒定所述受試化合物。然后測(cè)定積極或者消極影響AR 信號(hào)傳遞的受試化合物以確定受試化合物是否通過(guò)如上述的AR-介導(dǎo)的p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑升高或者降低基因的表達(dá)。
在申請(qǐng)人公開(kāi)的上下文內(nèi)，除非另外指出，術(shù)語(yǔ)將具有本領(lǐng)域中它們的常規(guī)的^^支術(shù)含義。在下文進(jìn)一步闡明本發(fā)明的一些術(shù)語(yǔ)和方面。
術(shù)語(yǔ)"雄激素受體"或者"AR，，指AR蛋白質(zhì)，如通過(guò)在活性或者天然結(jié) 構(gòu)構(gòu)象中它的保守的氛基酸編碼序列定義。
"雜交"包括反應(yīng)，其中一種或多種多核苷酸反應(yīng)形成復(fù)合體，其通過(guò) 核苷酸殘基的堿基之間的氬鍵結(jié)合穩(wěn)定化。通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)、 Hoogstein結(jié)合或者以任何其他序列特異方式可以發(fā)生氬鍵結(jié)合。復(fù)合體可 以包含形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的兩條鏈、形成多鏈復(fù)合體的三條或以上的鏈，單 條自身雜交鏈，或者這些的任一組合。雜交反應(yīng)可以構(gòu)成更廣泛的方法中 的步驟，如PCR反應(yīng)的起始，或者核酶對(duì)多核苷酸的酶促切割。
可以在不同"嚴(yán)格性"的條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性包括 用任意兩種核酸分子將相互雜交的困難性。在嚴(yán)格條件下，相互至少65%， 70%， 75%或更高同一性的核酸分子保持相互雜交，而具有低百分比同一性 的分子不能保持雜交。高嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選的非限制性實(shí)例是在約45°C 在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著在0.2x SSC， 0.1% SDS中50。C下， 優(yōu)選55。C下，更優(yōu)選60。C下，甚至更優(yōu)選65。C下洗滌一次或多次。
當(dāng)在兩條單鏈多核苷酸之間以反平行的構(gòu)型發(fā)生雜交時(shí)，將反應(yīng)稱作 "退火"并且將那些多核苷酸描述為"互補(bǔ)的"。如果在第一種多核苷酸和第 二種多核苷酸的一條鏈之間可以發(fā)生雜交，那么雙鏈多核苷酸可以與另一 多核苷酸是"互補(bǔ)的"或者"同源的"。根據(jù)通常接受的堿基配對(duì)原則，按照 在相對(duì)的鏈中預(yù)期相互氯鍵結(jié)合的堿基的比例，可以定量"互補(bǔ)性"或者同 源性。
術(shù)語(yǔ)"p-聯(lián)蛋白，，用于包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，其例如在人蛋白質(zhì)中包含781 個(gè)氬基酸和如圖6(SEQID NO:l)中公開(kāi)的p-聯(lián)蛋白M酸序列的片段。該 蛋白質(zhì)的優(yōu)選形式尤其包括氨基酸約1到約423。在其他實(shí)施方案中，p-聯(lián)蛋白與SEQ ID NO:l中顯示的M酸序列或者其部分具有至少65%， 至少70%氨基酸同一性，更優(yōu)選80%氨基酸同一性，更優(yōu)選90%，甚至 更優(yōu)選95 %氨基酸同 一性。
在另一實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"p-聯(lián)蛋白"用于包括與編碼SEQIDNO:l的
酸編碼的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或者其片段。優(yōu)選地，所述條件是4吏得相互至少65% ， 優(yōu)選至少約70%，更優(yōu)選至少約80%,甚至更優(yōu)選至少約85%或者90% 同源的序列通常保持相互雜交。優(yōu)選地,在嚴(yán)格條件下與編碼SEQ ID NO:l 的M^列的多核苷酸序列或者其片段或者互補(bǔ)序列雜交的P-聯(lián)蛋白多 核苷酸對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。
除了可能在群體中存在的P-聯(lián)蛋白序列的天然存在的等位基因變體 夕卜，技術(shù)人員將還明白通過(guò)突變可以向編碼例如SEQIDNO:l的M^ 列的多核苷酸序列中導(dǎo)入微小改變，從而導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)的氨基^ 列的改變，而不改變p-聯(lián)蛋白的功能活性。例如，可以在編碼SEQ ID NO:l 的氨基酸序列的多核苷酸序列中進(jìn)行核苷酸替代，其導(dǎo)致"非必需，，氨基酸 殘基處的氨基酸替代。"非必需"氨基酸殘基是可以從p-聯(lián)蛋白多核苷酸(例 如，編碼SEQ ID NO:l的^J^酸序列的多核苷酸)的野生型序列改變而不 改變p-聯(lián)蛋白分子的功能活性的殘基。非必需的并且因此服從替代的示例
確定^;守的殘基來(lái)鑒定。:匕類殘基因?yàn)椴皇潜Ｊ氐亩赡躛從替代,
因此，術(shù)語(yǔ)"(5-聯(lián)蛋白"還涉及編碼含有氨基酸殘基的改變的p-聯(lián)蛋白 蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述氨基酸殘基對(duì)于p-聯(lián)蛋白活性不是必需的。此類 P-聯(lián)蛋白與SEQ IDNO:l的M斷列不同，然而保留內(nèi)在的(5-聯(lián)蛋白活 性。通過(guò)向編碼SEQ ID NO:l的M酸序列的多核脊酸序列中引入一個(gè)或 多個(gè)核苷酸替代、添加或者缺失使得向編碼的蛋白質(zhì)中引入一個(gè)或多個(gè)氨 基酸替代、添加或者缺失，可以產(chǎn)生分離的編碼p-聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)的非天然 變體的多核苷酸。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如位點(diǎn)定向誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變可 以向SEQIDNO:l中引入突變。優(yōu)選地，在一個(gè)或多個(gè)非必需氮基酸殘基 進(jìn)行保守氨基酸替代。"保守氨基酸替代"是這樣的替代，其中將氨基酸殘 基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸家族已經(jīng)在 本領(lǐng)域中定義，包括堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè) 鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、
谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙 氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨 酸)、P分枝側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如，酪 氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。從而，j5-聯(lián)蛋白多肽中非必需氨基酸 殘基優(yōu)選用來(lái)自相同側(cè)鏈家族的另一M酸殘基替換。
備選地，在另一實(shí)施方案中，沿著P-聯(lián)蛋白編碼序列的全部或者部分， 如通過(guò)飽和i秀變可以隨機(jī)引入突變。
術(shù)語(yǔ)"P-聯(lián)蛋白的NBb-末端區(qū)"包含從p-聯(lián)蛋白的氨基酸1到能夠與雄 激素受體相互作用的犰狳(armadillo)重復(fù)區(qū)的任一連續(xù)的氨基酸序列。 從而，NH3-末端區(qū)可以包含例如氨基酸1到氨基酸424, M酸2到氨基 酸424，氨基酸3到氛基酸424,氨基酸1到氨基酸423,氛基酸2到氨基 酸423,氨基酸3到氨基酸423，等等。NH3-末端區(qū)優(yōu)選包含p-聯(lián)蛋白的 犰狳重復(fù)l-6，更優(yōu)選p-聯(lián)蛋白的犰狳重復(fù)l-7，甚至更優(yōu)選p-聯(lián)蛋白的犰 狳重復(fù)1-12。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，NH3-末端區(qū)是人p-聯(lián)蛋白的氨基酸 2-424。 NH3-末端區(qū)可以包含來(lái)自僅僅犰狳重復(fù)區(qū)的^J^酸序列。還設(shè)想包 含與p-聯(lián)蛋白的C-末端區(qū)的至少一部分連續(xù)的NH3-末端區(qū)氨基酸序列的 實(shí)施方案，只要p-聯(lián)蛋白的C-末端反式激活結(jié)構(gòu)域是無(wú)活性的。還設(shè)想氨 基酸的保守替代、缺失或者插入，只要保持p-聯(lián)蛋白和雄激素受體之間的 相互作用。
典型的替代包括例如，將氨基酸用具有相似電荷、疏水或者立體化學(xué) 特征的M酸替代。例如，"保守氨基酸替代"可以涉及將天然氨基酸殘基 用非天然殘基替代，從而對(duì)該位置氨基酸殘基極性或電荷有很小影響或者 沒(méi)有影響。在需要此類替代時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定所需要的氨基酸 替代(保守或非保守替代)。例如，可以用氨基酸替代鑒定分子序列的重要 的殘基，或者增加或者減小本文描述的分子的親和性。在一些實(shí)施方案中， 保守M酸替代還包括非天然存在的氨基酸替代，其通常通過(guò)化學(xué)肽合成 而不是通過(guò)生物系統(tǒng)中的合成摻入。
術(shù)語(yǔ)"與雄激素受體相互作用，，指AR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和p-聯(lián)蛋白的
犰狳區(qū)域之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。這兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用由
AR蛋白質(zhì)二級(jí)/三級(jí)構(gòu)象的改變引起，所述構(gòu)象受到結(jié)合AR的雄激素的 刺激。
術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"包括活性的降低或者升高；例如，如果本發(fā)明的測(cè)定法中 此類受試化合物的存在導(dǎo)致螢光素酶基因表達(dá)的減少或者增加，那么可以 認(rèn)為受試化合物調(diào)節(jié)雄激素受體和(5-聯(lián)蛋白之間的相互作用。
術(shù)語(yǔ)"DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域"描述了具有保守的DNA結(jié)合基序的任一蛋白 質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述DNA結(jié)合基序以序列特異性方式結(jié)合到它的保守的 上游活化序列，也稱作"DNA應(yīng)答元件"，其含有被蛋白質(zhì)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域識(shí)別的特異核苷酸序列或者"識(shí)別序列"。將DNA應(yīng)答元件置于報(bào)導(dǎo)質(zhì) 粒中使得結(jié)合DNA應(yīng)答元件的蛋白質(zhì)能夠通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用使 轉(zhuǎn)錄活化劑與報(bào)道子接近，導(dǎo)致報(bào)道子轉(zhuǎn)錄的活化。
術(shù)語(yǔ)"上游活化序列"或者"UAS"包括能夠結(jié)合DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任 一DNA序列，其已經(jīng)被選擇在所述測(cè)定法中作為與p-聯(lián)蛋白的融合蛋白。
術(shù)語(yǔ)"報(bào)道基因"以本領(lǐng)域中公知的方式使用以描述能夠表達(dá)可被檢測(cè) 和定量的蛋白質(zhì)或者氨基酸序列的任一遺傳編碼序列?？梢杂糜诒景l(fā)明的 測(cè)定法中的公知的報(bào)導(dǎo)基因產(chǎn)生的實(shí)例包括例如，螢光素酶、氯霉素乙酰 轉(zhuǎn)移酶和p-半乳糖苷酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道許多其他合適的報(bào)道基因。
術(shù)語(yǔ)"受試化合物"包括具有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)但是不一定具有已知的功 能或者生物學(xué)活性的化合物。受試化合物也可以具有未鑒定的結(jié)構(gòu)或者是 未知化合物的混合物，例如，來(lái)自粗制的生物樣品，如植物提取物?？梢?從"化學(xué)文庫(kù)"隨機(jī)篩選多種化合物，"化學(xué)文庫(kù)"指純化的化合物集合或者 來(lái)自多種來(lái)源的粗提物的集合。化學(xué)文庫(kù)可以含有化學(xué)合成的或者從天然 產(chǎn)物純化的化合物?；衔锟梢园瑹o(wú)機(jī)或者有機(jī)小分子或者更大的有機(jī) 化合物，如蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、類固醇、脂類、磷脂、核酸和脂蛋白。 測(cè)試的化合物的量可以取決于化學(xué)文庫(kù)而變，但是對(duì)于純化的(同質(zhì)的)化 合物文庫(kù)，10 jiM通常是測(cè)試的最高初始劑量。
向細(xì)胞中導(dǎo)入受試化合物的方法是本領(lǐng)域中公知的。
術(shù)語(yǔ)"雄激素"包括具有雄激素活性的所有已知的化合物?？梢砸远喾N
方法測(cè)定化合物的雄激素活性，所述方法包括基于細(xì)胞的AR轉(zhuǎn)錄測(cè)定法 和生物活性測(cè)定法，其中化合物可以表明具有與已知的雄激素活性相似的 活性?？梢允褂脛?dòng)物或者組織進(jìn)行這些測(cè)定法。例如，在前列腺中具有雄 激素活性的化合物能夠在嚙齒動(dòng)物中刺激前列腺生長(zhǎng)?？梢允褂镁哂猩?活性的天然雄激素代謝物，并且其包括例如，睪酮、雄甾烯二酮、雄甾烷 二酮、和二氫睪酮(DHT)，尤其優(yōu)選DHT。
該測(cè)定法耐受寬濃度范圍的雄激素。在優(yōu)選方式中，DHT劑量為lnm 以篩選化合物。0.1到10 nM的雄激素可以用作最初劑量以優(yōu)化細(xì)胞系中 的測(cè)定法。
不存在雄激素時(shí)，本發(fā)明的測(cè)定法還可以用于鑒定刺激AR和P-聯(lián)蛋 白之間相互作用的化合物。例如，具有類似于DHT的活性的化合物將通 過(guò)AR和p-聯(lián)蛋白之間的相互作用的刺激激活報(bào)道子活性。
術(shù)語(yǔ)"有效連接"指核酸分子，即DNA和一種或多種調(diào)節(jié)序列(如啟動(dòng)
許mRNA從該核酸分子轉(zhuǎn)錄或者允許該核酸分子的產(chǎn)物(即多肽)的表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)"表達(dá)構(gòu)建體"指設(shè)計(jì)成轉(zhuǎn)錄RNA的任何雙鏈DNA或者雙鏈 RNA,例如，含有有效連接下游基因或者目的編碼區(qū)(例如，編碼蛋白質(zhì)的 cDNA或者基因組DNA片段或者任何目的RNA)的至少一個(gè)啟動(dòng)子的構(gòu)建 體。表達(dá)構(gòu)建體向受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化允許細(xì)胞表達(dá)該表達(dá)構(gòu)建體編 碼的RNA或者蛋白質(zhì)。表達(dá)構(gòu)建體可以是遺傳工程化的質(zhì)粒、病毒，或 者來(lái)自例如噬菌體、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒或者皰瘆病毒的人工染 色體，或者在下面"表達(dá)載體"中描述的其他實(shí)施方案。表達(dá)構(gòu)建體可以在 活細(xì)胞中復(fù)制，或者它可以人工制備。為了本申請(qǐng)的目的，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)構(gòu)建 體"、"表達(dá)栽體"、"載體，，和"質(zhì)粒，，可互換使用以在一般的闡明性意義上闡 明本發(fā)明的應(yīng)用，并且不意在將本發(fā)明限制于具體類型的表達(dá)構(gòu)建體。此 外，術(shù)語(yǔ)表達(dá)構(gòu)建體或者載體意在還包括這樣的情況，其中用于該測(cè)定法 的細(xì)胞已經(jīng)內(nèi)源包含此類DNA序列。
如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"和"寡核苷酸"可以互換使用，并且包 括任何長(zhǎng)度的核苷酸的多聚形式，為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苦酸，或 者其類似物。多核苷酸可以具有任一三維結(jié)構(gòu)，并且可以進(jìn)行任何已知或
者未知的功能。下面是多核苷酸的非限制性實(shí)例基因或基因片段、外顯 子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、 重組多核苷酸、分枝的多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、 任何序列的分離的RNA、核酸探針、和引物。多核苷酸可以包含經(jīng)修飾的 核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，在聚合物裝配之前 或之后給予核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分中斷。 多核普酸可以在聚合后進(jìn)一步修飾，如通過(guò)用標(biāo)記組分綴合。該術(shù)語(yǔ)還包 括雙鏈和單鏈分子。除非另外指出或者需要，本發(fā)明的為多核苷酸的任一 實(shí)施方案包含雙鏈形式和兩個(gè)互補(bǔ)單鏈形式的每一個(gè)，其已知或者被預(yù)測(cè) 形成雙鏈形式。
多核苷酸由下面四種核苷酸堿基的特定序列組成腺噪呤(A)、胞嗜啶 (C)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，當(dāng)多核苷酸是RNA時(shí)，用尿嘧啶(U)代替 鳥(niǎo)噤呤。從而，術(shù)語(yǔ)"多核苷M列"是多核苷酸分子的字母表示。
"基因"包括至少一個(gè)可讀框的多核苷酸，其在轉(zhuǎn)錄和翻譯后能夠編碼 特定多肽或者蛋白質(zhì)。本文描述的任一種多核苷酸序列可以用于鑒定它們 結(jié)合的基因的較大的片段或者全長(zhǎng)編碼區(qū)。分離較大片段序列的方法是本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的， 一些在本文描述。
如本文使用的，"表達(dá)"包括多核苷酸被轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成肽、多 肽或者蛋白質(zhì)的過(guò)程。如果多核苷酸來(lái)自基因組DNA,如果選擇合適的真 核宿主，那么表達(dá)可以包括mRNA的剪接。表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件包括啟動(dòng) 子序列以結(jié)合RNA聚合酶和用于核糖體結(jié)合的轉(zhuǎn)錄起始序列。例如，細(xì) 菌表達(dá)載體包括啟動(dòng)子如lac啟動(dòng)子和用于轉(zhuǎn)錄起始的SD序列和起始密碼 子AUG(Sambrook, J.， Fritsh, E. F.， and Maniatis， T.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd， ed.， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)。 類似
地，真核表達(dá)載體包括RNA聚合酶II的異源或者同源啟動(dòng)子、下游多聚 腺苷酸化信號(hào)、起始密碼子AUG，和用于核糖體脫離的終止密碼子。此類
下面關(guān)于構(gòu)建一般的載體所述的方法中描述的序列裝配得到。
實(shí)施例
本發(fā)明在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步定義。將理解這些實(shí)施例盡管指出本 發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，但是僅為了闡明給出。從上面的討論和這些實(shí)施例， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的優(yōu)選特征(并且不背離其精神和范圍)可 以進(jìn)行本發(fā)明的多種改變和修飾以使其適應(yīng)多種用途和條件。
實(shí)施例1
該實(shí)施例闡明了優(yōu)選的實(shí)施方案，其中將培養(yǎng)的細(xì)胞用GAL4 DNA 應(yīng)答元件-螢光素酶報(bào)道質(zhì)粒、表達(dá)與人p-聯(lián)蛋白的氨基酸2-424的cDNA 編碼區(qū)融合的GAL4 DBD的編碼區(qū)(GAI^-p-聯(lián)蛋白)的質(zhì)粒和表達(dá)全長(zhǎng)野 生型人AR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(

圖1)。使用pcDNA3.1卩-聯(lián)蛋白表達(dá)載體(Invitrogen) 作為模板和分別含有Bam HI和Xba I限制性位點(diǎn)的單鏈DNA引物，通過(guò) PCR擴(kuò)增人P-聯(lián)蛋白的氨基酸2-424的DNA編碼序列，得到P-聯(lián)蛋白 cDNA片段。將擴(kuò)增的DNA片段插入到pM質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，該質(zhì)粒用 限制酶Bam HI和Xba I (Promega)線性化并且含有所述多克隆位點(diǎn)上游 GAL4 DBD的編碼序列。通過(guò)將GAL4上游活化序列(UAS)的5個(gè)拷貝亞 克隆到含有螢光素酶的cDNA編碼序列的pGL3-Basic (Promega)中制備凈艮 道質(zhì)粒。AR表達(dá)載體是從Leonard Freedman (Sloan Kettering)得到的 pcDNA3 (Invitrogen)中的人全長(zhǎng)AR cDNA。人AR的cDNA序列可以從 基因序列信息網(wǎng)站GenBank (Accession No. M35884，引入本文作為參考) 得到。
將CV-1細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板上并在24小時(shí)后用表達(dá)和報(bào)道質(zhì)粒，使 用lipofectamine方法(Invitrogen)轉(zhuǎn)染。在該方法中，根據(jù)生產(chǎn)商(Invitrogen)
的使用說(shuō)明，將使用的三種不同的質(zhì)粒構(gòu)建體在細(xì)胞培養(yǎng)基和
lipofectamine中混合并培養(yǎng)15分鐘。用培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒-lipofectamine混 合物，加入細(xì)胞中，并培養(yǎng)4小時(shí)。沖洗細(xì)胞，然后用培養(yǎng)基處理。轉(zhuǎn)染 后24小時(shí)，用雄激素激動(dòng)劑和拮抗劑或者載體處理細(xì)胞。18小時(shí)后，收 獲細(xì)胞裂解物并使用營(yíng)光素酶試劑(Promega)和發(fā)光計(jì)(Wallac)測(cè)定螢 光素酶活性?？梢允褂闷渌阎霓D(zhuǎn)染技術(shù)，包括例如，磷酸鉀沉淀轉(zhuǎn)染 技術(shù)。
用于單雜和體測(cè)定法的質(zhì)粒構(gòu)建體在圖1中顯示。虛線表示用于單雜 和體法測(cè)定中的已知的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)-DNA相互作用區(qū)。箭頭 表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。
實(shí)施例2
用L929細(xì)胞測(cè)定DHT是否刺激內(nèi)源表達(dá)AR和|5-聯(lián)蛋白的細(xì)胞系中 這兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用。將表達(dá)內(nèi)源AR和P-聯(lián)蛋白的L929細(xì)胞 用10 nM DHT， 300 nM羥基氟利坦(flut)， DHT加上flut，或載體(veh)處理 17小時(shí)。收獲細(xì)胞裂解物，用蛋白質(zhì)A/G sepharose預(yù)清除，并用綴合到 瓊脂糖的抗P-聯(lián)蛋白的山羊多克隆IgG(Santa Cruz Biotechnology)免疫沉 淀p-聯(lián)蛋白。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析免疫沉淀物并使用Santa Cruz 的抗體按照說(shuō)明對(duì)AR和p-聯(lián)蛋白(p-cat)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(圖2)。發(fā)現(xiàn) 10nM的雄激素激動(dòng)劑DHT刺激AR和p-聯(lián)蛋白之間的相互作用。不存在 DHT時(shí)，在這些蛋白質(zhì)之間沒(méi)有檢測(cè)到相互作用。當(dāng)存在比DHT30倍過(guò) 量的AR拮抗劑羥基氟利坦(300 nM)時(shí)，用DHT處理細(xì)胞時(shí)，蛋白質(zhì)-蛋 白質(zhì)相互作用減弱(圖2)。這些結(jié)果表明通過(guò)雄激素激動(dòng)劑DHT刺激AR 和p-聯(lián)蛋白相互作用。結(jié)果還表明該相互作用易于受到小分子如羥基氟利 坦的-皮壞。
實(shí)施例3
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定CV-1細(xì)胞中螢光素酶活性需要每種表達(dá)載體。
闡明本發(fā)明的測(cè)定法測(cè)量AR和p-聯(lián)蛋白之間依賴DHT的相互作用。 在如所指出的雄激素受體表達(dá)載體(AR)、 GAL4-DBD - P-聯(lián)蛋白融合蛋白 表達(dá)載體(GAL4-p-聯(lián)蛋白)存在或不存在下，將含有處于5XGAL4-UAS DNA應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄控制下的螢光素酶基因的報(bào)道質(zhì)粒(GAL4-螢光素酶) 轉(zhuǎn)染到CV-1細(xì)胞中。將細(xì)胞用1 nMDHT(+)或載體(-)處理18小時(shí)。收 獲細(xì)胞裂解物并分析螢光素酶活性。當(dāng)將AR和GAL4-p-聯(lián)蛋白表達(dá)栽體 轉(zhuǎn)染到具有5XGAL4-營(yíng)光素酶報(bào)道子的細(xì)胞中時(shí)，DHT (1 nM)引起報(bào)道 子活性的很大激活(圖3)。不存在GAL4-P-聯(lián)蛋白表達(dá)載體時(shí)，AR和DHT 對(duì)報(bào)道子活性沒(méi)有影響，表明不存在AR和DHT對(duì)GAL4啟動(dòng)子-報(bào)道子 構(gòu)建體的直接作用(圖3)。
實(shí)施例4
還測(cè)試了雄激素受體(ER)和孕酮受體(RP)與P-聯(lián)蛋白相互作用的能 力，這通過(guò)測(cè)量它們對(duì)報(bào)道子活性的影響來(lái)進(jìn)行(圖4)，并且表明(3-聯(lián)蛋白 和核受體之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用對(duì)于AR是特異的。不存在核受體 表達(dá)載體(-)、存在AR、 AR或者ER表達(dá)質(zhì)粒下，用5XGAL4-螢光素酶 報(bào)道子和GAL4-p-聯(lián)蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CV-l細(xì)胞。用載體、10nm DHT， 10nM曲美孕酮(Trim)，或10 nM 17p-雌二醇(E2)如所指出的處理細(xì)胞18 小時(shí)。收獲細(xì)胞裂解物并分析螢光素酶活性。存在曲美孕酮、17(i-雌二醇 或者DHT時(shí)，在單雜和體測(cè)定法中ER和PR受體沒(méi)有活性。當(dāng)將DHT 加入AR表達(dá)細(xì)胞時(shí)報(bào)道子活性有很大升高，但是用10nM17p-雌二醇或 者曲美孕酮沒(méi)有引起報(bào)道子活性升高。這些結(jié)果表明在該測(cè)定中，當(dāng)與ER 和PR比較時(shí)，(3-聯(lián)蛋白與核受體的相互作用似乎是AR特異的。
實(shí)施例5
為了確定申請(qǐng)人的測(cè)定法是否具有鑒定破壞AR和P-聯(lián)蛋白之間的 DHT依賴性相互作用的化合物的潛力，在DHT存在下，測(cè)試AR拮抗劑 環(huán)丙孕酮(CA)的作用(圖5)。
用圖1中描述的AR和GAL4-p-聯(lián)蛋白表達(dá)質(zhì)粒和螢光素酶報(bào)道質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染CV-1細(xì)胞。將細(xì)胞用(+)或者不用(-)1 nM DHT和所指出濃度的AR 拮抗劑環(huán)丙孕酮處理。收獲細(xì)胞裂解物并分析螢光素酶活性。DHT刺激的 AR和P-聯(lián)蛋白之間的相互作用受到AR拮抗劑環(huán)丙孕酮的抑制。不存在 CA時(shí)，lnM的DHT引起報(bào)道子活性的很大激活。DHT的該作用被1到 1000 nM之間的CA劑量依賴性逆轉(zhuǎn)(圖5)。
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7. U.S. Patent No. 5,468,614， Fields, " aA， "System to Detect Protein-Protein Interactions".
參考文獻(xiàn)
權(quán)利要求
1.確定受試化合物是否能夠調(diào)節(jié)雄激素受體和β-聯(lián)蛋白之間相互作用的方法，該方法包括步驟(a)提供細(xì)胞，其包含(i)編碼雜合蛋白的DNA序列，該雜合蛋白包含與β-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)融合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，(ii)包含對(duì)應(yīng)于所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的上游活化序列的DNA序列，所述DNA序列有效連接報(bào)道基因并且控制該報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄，和(iii)編碼雄激素受體蛋白的DNA序列，(b)任選在雄激素存在下，向所述細(xì)胞導(dǎo)入受試化合物；和(c)測(cè)量所述報(bào)道基因的表達(dá)，其中所述報(bào)道基因表達(dá)的升高或者降低表明所述受試分子能夠調(diào)節(jié)雄激素受體和β-聯(lián)蛋白之間的相互作用。
2. 4又利要求1的方法，其中(i)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含GAL-4DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中(ii)的有效連接到報(bào)道基因的上游活化序 列包含GAL-4 UAS。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中存在有效連接到報(bào)道基因的GAL-4 UAS 序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中所述報(bào)道基因是螢光素酶。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中(i)的P-聯(lián)蛋白的NBb-末端區(qū)包含人|3-聯(lián) 蛋白的氨基酸2到424。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中(i)的P-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)包含核苷酸 序列，該核苷酸序列編碼與SEQIDNO:l的氨基酸2-424具有至少65%同 一性的氨基^列。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中(i)的P-聯(lián)蛋白的NHb-末端區(qū)包含核苦酸 序列，該核苷酸序列編碼與SEQ IDNO:l的氮基酸2-424具有至少75 %同 一性的氨基酸序列。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中(i)的(5-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)包含核苷酸 序列，該核苷酸序列編碼與SEQ ID NO:l的氣基酸2-424具有至少85 %同 一性的M酸序列。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中(i)的P-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)包含核苷 酸序列，該核苷酸序列編碼與SEQ ID NO:l的氨基酸2-424具有至少95 %同一性的氨基酸序列。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中(i)的P-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)包含核苷酸 序列，該核苷酸序列與編碼SEQIDNO:l的氨基酸2-424的核苷酸序列在 下面的條件下雜交45。C下6xSSC和50。C下用0.2xSSC, 0.1% SDS洗 滌至少一次。
12. 權(quán)利要求ll的方法，其中(i)的P-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)包含核苷 酸序列，該核苷酸序列與編碼SEQ ID NO:l的氨基酸2-424的核苷酸序列 在下面的條件下雜交45 °C下6xSSC和55 。C下用0.2xSSC， 0.1% SDS 洗滌至少一次。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中(i)的P-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)包含核苷 酸序列，該核脊酸序列與編碼SEQ ID NO:l的氨基酸2-424的核苷酸序列 在下面的條件下雜交45 。C下6xSSC和65 。C下用0.2xSSC, 0.1% SDS 洗滌至少一次。
14. 權(quán)利要求l的方法，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
16. 權(quán)利要求1的方法，其中所述報(bào)道基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是表達(dá)的降低。
17. 權(quán)利要求l的方法，其中步驟(b)的所述雄激素是DHT。
18. 權(quán)利要求1的方法，其中(i)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含GAL-4 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域；其中(i)的p-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)包含人p-聯(lián)蛋白的氨基酸2 到424;其中有多于一個(gè)拷貝的有效連接到報(bào)道基因的上游活化序列GAL-4UAS;其中所述報(bào)il^因是螢光素酶；其中步驟(b)的雄激素是 DHT;并且其中所述調(diào)節(jié)是表達(dá)的降低。
19. 權(quán)利要求1的方法，其中(5-聯(lián)蛋白的NHr末端區(qū)包含犰狳重復(fù) 1-12。
20. 權(quán)利要求1的方法，其中p-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)包含犰狳重復(fù)1-7。
21. 權(quán)利要求1的方法，其中(5-聯(lián)蛋白的NHr末端區(qū)包含犰狳重復(fù)1-6。
22. 確定受試化合物是否能夠調(diào)節(jié)雄激素受體和P-聯(lián)蛋白之間相互 作用的方法，其包括步驟(a) 提供細(xì)胞，其包含(i) 編碼雜合蛋白的DNA序列，該雜合蛋白包含與(5-聯(lián)蛋白融合的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，(ii) 包含對(duì)應(yīng)于所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的上游活化序列的DNA序列， 該DNA序列有效連接報(bào)道基因并且控制該報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄，和(iii) 編碼雄激素受體蛋白的DNA序列，(b) 任選在雄激素存在下，向所述細(xì)胞導(dǎo)入受試化合物；和(c) 測(cè)量所述報(bào)道基因的表達(dá)，其中報(bào)道基因表達(dá)的升高或者降低表明該受試分子能夠調(diào)節(jié)雄激素受 體和P-聯(lián)蛋白之間的相互作用。
23. 確定受試化合物是否相對(duì)于雄激素受體信號(hào)途徑選擇性調(diào)節(jié)p-聯(lián) 蛋白-Wnt信號(hào)途徑的方法，其包括(a) 鑒定通過(guò)抑制AR介導(dǎo)的與p-聯(lián)蛋白的相互作用升高或者降低基 因表達(dá)的受試化合物，其中該受試化合物消除對(duì)Wnt信號(hào)傳遞的雄激素作 為配體的AR抑制而不抑制雄激素-AR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄；和(b) 測(cè)定(a)的受試化合物以確定該受試化合物是否通過(guò)p-聯(lián)蛋白獨(dú)立 的雄激素受體信號(hào)途徑升高或者降低基因的表達(dá)；其中如果(a)的受試化合物不能通過(guò)雄激素受體信號(hào)途徑升高或者降低基因的表達(dá)，那么該受試化合物通過(guò)抑制雄激素作為配體的AR與(3-聯(lián)蛋 白相互作用的能力選擇性調(diào)節(jié)p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中步驟(a)包括步驟(A) 提供細(xì)胞，其包含(i) 編碼雜合蛋白的DNA序列，該雜合蛋白包含與p-聯(lián)蛋白融合 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，(ii) 包含對(duì)應(yīng)于所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的上游活化序列的DNA序 列，所述DNA序列有效連接報(bào)道基因并且控制該報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄，和(iii) 編碼雄激素受體蛋白的DNA序列，(B) 任選在雄激素存在下，向所述細(xì)胞導(dǎo)入受試化合物；和(C) 測(cè)量所述報(bào)道基因的表達(dá)，其中所述報(bào)道基因表達(dá)的升高或者降低表明該受試化合物能夠調(diào)節(jié)雄 激素受體和p-聯(lián)蛋白之間的相互作用。
25. 權(quán)利要求24的方法，其中(i)的DNA序列編碼雜合蛋白，該雜合 蛋白包含融合到J5-聯(lián)蛋白的NH3-末端區(qū)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
26. 確定受試化合物是否相對(duì)于p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑選擇性調(diào)節(jié)雄激素受體信號(hào)途徑的方法，其包括(a)鑒定通過(guò)雄激素受體信號(hào)途徑升高或者降低基因表達(dá)的受試化合 物j和(b)測(cè)定(a)的受試化合物以確定該受試化合物是否升高或降低雄激素 作為配體的AR或非作為配體的AR抑制p-聯(lián)蛋白/Wnt信號(hào)傳遞的能力；其中(a)的受試化合物選擇性調(diào)節(jié)雄激素受體信號(hào)途徑而不除去Wnt 信號(hào)傳遞的雄激素作為配體的AR抑制或者不存在AR激動(dòng)劑時(shí)，不促進(jìn) AR和p-聯(lián)蛋白之間的相互作用，導(dǎo)致所述受試化合物在升高或者降低p-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)中沒(méi)有活性。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中步驟(b)包括步驟 (A)提供細(xì)胞，其包含(i) 編碼雜合蛋白的DNA序列，該雜合蛋白包含與p-聯(lián)蛋白融合 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，(ii) 包含對(duì)應(yīng)于所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的上游活化序列的DNA序 列，所述DNA序列有效連接報(bào)道基因并且控制該報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄，和(iii) 編碼雄激素受體蛋白的DNA序列；(B) 任選在雄激素存在下，向所述細(xì)胞導(dǎo)入(a)的受試化合物；和(C) 測(cè)量所述報(bào)道基因的表達(dá)，其中報(bào)道基因表達(dá)的升高或者降低表明該受試分子能夠調(diào)節(jié)雄激素受 體和P-聯(lián)蛋白之間的相互作用。
28.權(quán)利要求27的方法，其中(i)的DNA序列編碼雜合蛋白，該雜合 蛋白包含融合到P-聯(lián)蛋白的NHr終止區(qū)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
公開(kāi)了確定受試化合物是否能夠調(diào)節(jié)雄激素受體和β-聯(lián)蛋白之間相互作用的方法。還公開(kāi)了確定受試化合物相對(duì)于β-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑選擇性調(diào)節(jié)雄激素受體信號(hào)途徑還是相對(duì)于雄激素受體信號(hào)途徑選擇性調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白-Wnt信號(hào)途徑的方法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101175854SQ200680016934
公開(kāi)日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2006年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月19日
發(fā)明者E·J·基爾鮑納, T·J·貝羅丁 申請(qǐng)人:惠氏公司