專利名稱：磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磷酸腺苷酰硫酸還原酶(phosphoadenylyl sulfate reductase)基因及其用途，特別是涉及制造香味穩(wěn)定性優(yōu)異的酒精飲料的釀造酵母、 用該酵母制造的酒精飲料、以及制造所述飲料方法等。更具體而言，本發(fā) 明涉及通過控制釀造酵母的磷酸腺苷酰硫酸還原酶Metl6p的編碼基因 MET16特別是啤酒酵母的特征性non-ScMET16基因的表達量，來控制有助 于產(chǎn)品香味穩(wěn)定化的亞硫酸鹽的生成能力的酵母、使用該酵母的酒精飲料 制造方法等。
背景技術(shù)：
已知亞硫酸鹽是抗氧化作用強的化合物，作為抗氧劑在食品、飲料、 醫(yī)藥品等領(lǐng)域被廣泛使用[例如日本特開平06-040907號公報(專利文獻l)、 日本特開2000-093096號公報(專利文獻2)等]。在酒精飲料中，亞硫酸 鹽也被作為抗氧劑利用，例如，在需長期陳釀的葡萄酒中，因在其品質(zhì)保 持上發(fā)揮重要作用，所以日本國內(nèi)經(jīng)厚生勞動省批準，允許添加到殘留濃 度350ppm以下。而且，還已知在啤酒釀造中保質(zhì)期隨產(chǎn)品中含有的亞硫酸 鹽濃度而變化，強化該物質(zhì)對香味穩(wěn)定性等方面非常重要。使產(chǎn)品中的亞硫酸鹽含量增大的最簡單的方法是添加亞硫酸鹽，但這 種情況需作為食品添加劑處理，在商品開發(fā)的自由度、消費者對食品添加 劑的不良印象等方面均成為問題。但是，酵母能生物合成自身生命活動所必須的含硫化合物，亞硫酸鹽 作為其中間代謝產(chǎn)物而被生成。即，通過利用酵母的這種能力，無需從外 部添加即可使產(chǎn)品中的亞硫酸鹽量增加。作為在釀造工序中提高發(fā)酵液中的亞硫酸鹽濃度的方法，包括1)過程控制法和2)酵母育種法。過程控制法，是指由于釀造中亞硫酸鹽的生成與 初期供氧量成反比，所以降低向發(fā)酵液的供氧量，使亞硫酸鹽的生成量增 加的同時抑制其氧化的方法。另一方面，酵母育種法利用基因操作技術(shù)。在酵母的硫代謝中，亞硫 酸鹽是含硫氨基酸和含硫維生素生物合成的中間體，從細胞外攝取的硫酸 根離子經(jīng)三步反應(yīng)被還原后生成亞硫酸鹽。這里，MET3基因是編碼催化第1反應(yīng)的酶的基因，MET14基因是編 碼催化第2反應(yīng)的酶的基因，MET16是編碼催化第3反應(yīng)的酶的基因。Korch 等進行了如下嘗試通過使上述MET3、 MET14基因的表達量增加來提高 酵母亞硫酸鹽生成能力，并證實MET14更有效(C. Korch et al., Proc. Eur. Brew. Conv. Conger.， Lisbon, 201-208,1991 :非專利文獻1)。 Donalies等構(gòu)建 了 MET16基因高表達酵母，但生成的亞硫酸鹽濃度無論在使用合成培養(yǎng)基 還是麥汁的情況下均無增加(Donalies and Stahl， Yeast， 19, 475-484， 2002:非 專利文獻2)。 Hansen等進行了如下嘗試通過破壞編碼亞硫酸鹽根離子還 原酶的MET10基因，防止生成的亞硫酸鹽根離子還原，以增加亞硫酸鹽生 成量(J.Hansen et al., Nature Biotech., 1587-1591，1996:非專利文獻3)。另外，藤村等進行了如下嘗試通過提高酵母的編碼亞硫酸鹽根離子 排出泵的SSU1基因中特別是啤酒酵母特有的nonScSSUl基因的表達量， 以促進菌體內(nèi)生成的亞硫酸鹽向菌體外排出，使啤酒中的亞硫酸鹽濃度增 加(藤村等，2003年度日本農(nóng)藝化學(xué)會年度大會要旨集，159， 2003:非專 利文獻4。日語原文「藤村b、2003年度日本農(nóng)蕓化學(xué)會年次大會要旨集、 159、 2003」)。[非專利文獻1] C. Korch et al., Proc. Eur. Brew. Conv. Conger" Lisbon, 201-208, 1991[非專利文獻2] Donalies and Stahl，Yeast, 19,475-484,2002 [非專利文獻3] J. Hansen et al., Nature Biotech,， 1587-1591,1996[非專利文獻4]藤村等，2003年度日本農(nóng)藝化學(xué)會年度大會要旨集， 159， 2003。日語原文「藤村b、 2003年度日本農(nóng)蕓化學(xué)會年次大會要旨6集、159、 2003」。[專利文獻1]日本特開平06-040907號公報 [專利文獻2]日本特開2000-093096號公報發(fā)明內(nèi)容然而，需要能提高酵母產(chǎn)生的亞硫酸鹽量從而使通過酵母生產(chǎn)的酒精 飲料的保質(zhì)期和香味穩(wěn)定性優(yōu)異的新方法和新材料。如上所述，使產(chǎn)品中 的亞硫酸鹽含量增大的最簡單的方法是添加非酵母生產(chǎn)的亞硫酸鹽，但近 年來，消費者更熱衷于無食品添加劑和使用天然材料，希望最低限度地使 用食品添加劑。因此，希望利用酵母自身的生命活動，不從外部添加亞硫 酸鹽即可達到對香味穩(wěn)定性有效的亞硫酸鹽濃度。但是，上述過程控制法 由于氧不足導(dǎo)致酵母的增殖速度下降，有時引起發(fā)酵延遲、品質(zhì)下降，因 此并不實用。另外，據(jù)報道，利用基因操作技術(shù)的酵母育種得到了達到親株10倍以 上的亞硫酸鹽濃度的結(jié)果(J. Hansen et al.， Nature Biotech., 1587-1591,1996)，但另一方面，也出現(xiàn)了發(fā)酵延遲、不受歡迎的香味成分 即乙醛及1 —丙醇增加，因此作為實用酵母還存在問題。由此，期望能有既 不影響發(fā)酵速度和產(chǎn)品質(zhì)量又能生產(chǎn)充分量的亞硫酸鹽的酵母的育種方 法。本發(fā)明者為了解決上述課題不斷潛心研究，結(jié)果從啤酒酵母中成功地 鑒定并分離出編碼比已知蛋白質(zhì)更有效的磷酸腺苷酰硫酸還原酶的基因。 且通過將所得基因?qū)虢湍覆⑹蛊浔磉_而制備了轉(zhuǎn)化酵母，確認了亞硫酸 鹽生成量的增加，從而完成了本發(fā)明。艮口，本發(fā)明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型磷酸腺苷酰硫酸還原酶 基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、該基因的表達得到調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)化酵母、通過使 用該基因的表達得到調(diào)節(jié)的酵母來控制產(chǎn)品中的亞硫酸鹽生成量的方法 等。具體而言，本發(fā)明提供如下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、 導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化酵母、使用該轉(zhuǎn)化酵母的酒精飲料的制造方法等。(1) 多核苷酸，其是選自下述(a) (f)構(gòu)成的組中的多核苷酸(a) 多核苷酸，其含有由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸；(b) 多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的 多核苷酸；(c) 多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列經(jīng)過1個或多個 氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列組成，且具有磷酸腺苷 酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(d) 多核苷酸，其含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列60%以上同 一性的氨基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷 酸；(e) 多核苷酸，其含有與由序列號l的核苷酸序列的核苷酸互補的核 苷酸序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有磷酸腺苷酰硫酸 還原酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(f) 多核苷酸，其含有與編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì) 的多核苷酸的核苷酸序列的互補核苷酸序列所組成的多核苷酸在嚴謹條件 下雜交，且編碼具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。(2) 上述(1)所述的多核苷酸，其是選自下述(g) (i)構(gòu)成的組 中的多核苷酸(g) 多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸 序列經(jīng)過1 10個氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列組成 且具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)；(h) 多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90%以上同一 性的氨基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)；以及(i) 多核苷酸，其與序列號1的核苷酸序列或與序列號1的核苷酸序 列的互補核苷酸的核苷酸序列在高嚴謹條件下雜交，且編碼具有磷酸腺苷 酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)。(3) 上述(1)所述的多核苷酸，其含有由序列號1的核苷酸序列組 成的多核苷酸。(4) 上述(1)所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序 列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。(5) 上述(1) (4)任一項所述的多核苷酸，其是DNA。(6) 多核苷酸，其是選自下述(j) (m)構(gòu)成的組的多核苷酸， (j)多核苷酸，其編碼具有與上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的核苷酸序列的RNA;(k)多核苷酸，其編碼通過RNAi作用抑制上述(5)所述的多核苷酸 (DNA)表達的RNA;(1)多核苷酸，其編碼具有特異性切割上述(5)所述的多核苷酸(DNA) 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性的RNA;以及(m)多核苷酸，其編碼通過共抑制作用抑制上述(5)所述的多核苷 酸(DNA)表達的RNA。(7) 蛋白質(zhì)，其是由上述(1) (5)任一項所述的多核苷酸編碼的 蛋白質(zhì)。(8) 載體，其是含有上述(1) (5)任一項所述的多核苷酸的載體。 (8a)上述(8)所述的載體，其含有包含以下(x) (z)的構(gòu)成要素的表達盒(x)在酵母細胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)與該啟動子以正向或反向連接的上述(1) (5)任一項所述的 多核苷酸；以及(z)與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止以及多聚腺苷化作用有關(guān)的在酵母起作 用的信號。(9) 載體，其是含有上述(6)所述的多核苷酸的載體。(10) 酵母，其是導(dǎo)入了上述(8)或(9)所述的載體的酵母。(11) 上述(10)所述的酵母，其通過導(dǎo)入上述(8)所述的載體，增 強亞硫酸鹽生成能力。(12) 酵母，其通過導(dǎo)入上述(9)所述的載體，或通過破壞與上述(5) 所述的多核苷酸(DNA)相關(guān)的基因，抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達。(13) 上述(10)所述的酵母，其通過增加上述(7)所述的蛋白質(zhì)的 表達量，提高亞硫酸鹽生成能力。(14) 酒精飲料制造方法，其使用上述(10) (13)任一項所述的酵母。(15) 上述(14)所述的酒精飲料制造方法，其釀造的酒精飲料是麥 芽飲料。(16) 上述(14)所述的酒精飲料制造方法，其釀造的酒精飲料是葡萄酒。(17) 酒精飲料，其是用上述(14) (16)任一項所述的方法制造 的酒精飲料。(18) 評價方法，其用根據(jù)具有序列號1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰 硫酸還原酶基因的核苷酸序列設(shè)計的引物或探針，評價被測酵母的亞硫酸 鹽生成能力。(18a)通過上述(18)所述的方法來篩選亞硫酸鹽生成能力高或低的 酵母的方法。(18b)用通過上述(18a)所述的方法篩選的酵母來制造酒精飲料(例 如啤酒)的方法。(19) 評價方法，其通過培養(yǎng)被測酵母，測定具有序列號1的核苷酸 序列的磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因的表達量，來評價被測酵母的亞硫酸鹽 生成能力。(19a)選擇亞硫酸鹽生成能力強的酵母的方法，其用上述(19)所述 的方法，評價被測酵母，選擇磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因的表達量高的酵 母。(19b)用通過上述(19a)所述的方法選擇的酵母來制造酒精飲料(例 如啤酒)的方法。(20) 酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被測酵母；對上述(7)所述的蛋 白質(zhì)進行定量或?qū)哂行蛄刑?的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因的表達量進行測定；選擇具有與目的亞硫酸鹽生成能力相應(yīng)的上述蛋白 質(zhì)的生成量或上述基因的表達量的被測酵母。(21) 上述(20)所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標準酵母和被 測酵母；對具有序列號1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因在各 酵母中的表達量進行測定；選擇與標準酵母相比該基因為高表達或低表達 的被測酵母。(22) 上述(20)所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標準酵母和被 測酵母；對各酵母中上述(7)所述的蛋白質(zhì)進行定量；選擇與標準酵母相 比該蛋白質(zhì)的量多或少的被測酵母。(23) 酒精飲料制造方法，其包括用上述(10) (13)任一項所 述的酵母或通過上述(20) (22)任一項所述的方法選擇的酵母中的任 一酵母進行以酒精飲料制造為目的的發(fā)酵，并調(diào)節(jié)亞硫酸鹽生成能力。根據(jù)使用本發(fā)明的具有可操作地連接到載體上的磷酸腺苷酰硫酸還原 酶多核苷酸的轉(zhuǎn)化酵母的酒精飲料的制造方法，能增加產(chǎn)品中具有抗氧化 作用的亞硫酸鹽含量，因而能夠制造出香味穩(wěn)定性優(yōu)異、保質(zhì)期更長的酒 精飲料。


圖1表示啤酒釀造試驗中酵母增殖量的經(jīng)時變化。橫坐標表示發(fā)酵時 間，縱坐標表示OD660值。圖2表示啤酒釀造試驗中糖消耗量的經(jīng)時變化。橫坐標表示發(fā)酵時間， 縱坐標表示浸出物表觀濃度(w/w%)。圖3表示啤酒釀造試驗中酵母中的nonScMET16基因的表達行為。橫 坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示檢測到的信號輝度。圖4表示使用底部酵母及其轉(zhuǎn)化體的釀造試驗中酵母增殖量的經(jīng)時變 化。橫坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示0D660值。圖5表示使用下面酵母及其轉(zhuǎn)化體的啤酒釀造試驗中糖消耗量的經(jīng)時 變化。橫坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示浸出物表觀濃度(w/w%)。圖6表示使用下面酵母及其轉(zhuǎn)化體的啤酒試驗釀造結(jié)束時醪液中的亞 硫酸鹽濃度。圖7表示使用上面酵母及其轉(zhuǎn)化體的釀造試驗中酵母增殖量的經(jīng)時變 化。橫坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示OD660值。圖8表示使用頂部酵母及其轉(zhuǎn)化體的啤酒釀造試驗中糖消耗量的經(jīng)時 變化。橫坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示浸出物表觀濃度(w/w%)。圖9表示使用上面酵母及其轉(zhuǎn)化體的啤酒釀造試驗結(jié)束時醪液中的亞 硫酸鹽濃度。
具體實施方式
已知的使亞硫酸鹽根離子排出泵的表達量增加的方法，由于菌體內(nèi)不 積累剩余的亞硫酸鹽，因而能保持良好的發(fā)酵速度，但菌體內(nèi)亞硫酸鹽的 生物合成反應(yīng)可能成為限速步驟。因此認為通過強化作為起始物質(zhì)的硫酸 根離子向亞硫酸鹽的還原途徑，可以更高效地生成亞硫酸鹽。本發(fā)明者基于這種構(gòu)想不斷研究，根據(jù)用日本特開2004-283169中公開 的方法解讀的啤酒酵母基因組信息，分離并鑒定出啤酒酵母特有的編碼磷 酸腺苷酰硫酸還原酶的nonScMET16基因。該核苷酸序列如序列號1所示。 另外，由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列號2所示。l.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供(a)多核苷酸，其含有由序列號1的核苷酸序列組成 的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成 的蛋白質(zhì)的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA。作為本發(fā)明對象的多核苷酸，不限于來自上述啤酒酵母的編碼磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因的多核苷酸，還包含編碼與該蛋白質(zhì)具有同等功能的 蛋白質(zhì)的其他多核苷酸。作為功能同等的蛋白質(zhì)，例如，可為(c)由序列號2 的氨基酸序列經(jīng)過1個或多個氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加后的 氨基酸序列組成，且具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)。此種蛋白質(zhì)可包括由序列號2的氨基酸序列經(jīng)過例如1 100個、l 90個、1 80個、1 70個、1 60個、1 50個、1 40個、卜39個、l 38個、卜37個、卜36個、1 35個、1 34個、1 33個、1 32個、l 31個、卜30個、卜29個、1 28個、1 27個、1 26個、1 25個、l 24個、1 23個、1 22個、1 21個、1 20個、1 19個、1 18個、l 17個、1 16個、1 15個、1 14個、1 13個、1 12個、1 11個、l 10個、1 9個、1 8個、1 "7個、1 6個(1 數(shù)個氨基酸)、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個、l個氨基酸殘基缺失、取代、插入和/或添加的 氨基酸序列組成，且具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)。上述氨基 酸殘基的缺失、取代、插入和/或添加的數(shù)量， 一般越小越好。另外，此 種蛋白質(zhì)可包括(d)具有與序列號2的氨基酸序列有約60%以上、約70%以 上、71%以上、72°/。以上、73%以上、74°/。以上、75%以上、76%以上、77% 以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、 84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、 91%以上、92°/。以上、93°/。以上、94%以上、95°/。以上、96%以上、97%以上、 98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、 99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上同一性的氨 基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)。上述同源性的數(shù) 值一般越大越好關(guān)于磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性，例如可通過Thomas等的方法(J Biol Chem. 1990Sepl5; 265(26): 15518-24.)來測定。另外，本發(fā)明也包含(e)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，該多核苷 酸在嚴謹條件下，與序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核 苷酸雜交，且編碼具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸； 以及(f)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，該多核苷酸在嚴謹條件下，與編 碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的核苷酸序列的互補核 苷酸序列組成的雜交，且編碼具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的 多核苷酸。這里，"在嚴謹條件下雜交的多核苷酸"，指以序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸或編碼序列號2的氨基酸序列的DNA的全 部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交 法等得到的多核苷酸，例如DNA。雜交的方法可以利用例如Molecular Cloning 3rd Ed.、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997等中記載的方法。本說明書中所述的"嚴謹條件"可以是低嚴謹條件、中嚴謹條件以及高嚴 謹條件中的任一種。"低嚴謹條件"，例如為5xSSC、 5xDenhardt溶液、0.5% SDS、 50%甲酰胺、32"C的條件。"中嚴謹條件"，例如為5xSSC、 5xDenhardt 溶液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、42-C的條件。"高嚴謹條件"，例如為5xSSC、 5xDenhardt溶液、0.5% SDS、 50%甲酰胺、50。C的條件。上述條件中，溫 度越高，越能高效地獲得具有高同源性的多核苷酸，例如DNA。但是，影 響雜交嚴謹性的因素有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽 濃度等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過適當選擇這些因素來實現(xiàn)同樣的 嚴謹性。另外，在雜交中使用市售的試劑盒時，例如可使用Alkphos Direct Labelling Reagents [安瑪西亞法瑪西亞(Amersham Pharmacia)公司帝U]。此 時，根據(jù)試劑盒中附帶的操作方法，與已標記的探針一同保溫過夜后，將 膜在55"C的條件下用含有0.1%(w/v)SDS的1次洗滌緩沖液洗滌后，可檢測 出雜交后的DNA。其他可雜交的DNA，可通過例如FASTA、 BLAST等同源性檢索軟件， 使用默認參數(shù)計算時，與編碼序列號2的氨基酸序列的DNA具有約60%以 上、約70°/。以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、 76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80°/。以上、81%以上、82%以上、 83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、 卯％以上、91%以上、92°/。以上、93%以上、94°/。以上、95%以上、96%以上、 97%以上、98%以上、99°/。以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4% 以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上同一 性的多核苷酸。另外，關(guān)于氨基酸序列、核苷酸序列的同一性，可使用根據(jù)Karlin及 Altschul的BLAST算法(proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA90 : 5873， 1993)來確定。開發(fā)了基于BLAST算法的被 稱為BLASTN、 BLASTX的程序(Altschul SF， et al: J Mol Biol 215: 403, 1990)。用BLASTN分析核苷酸序列時，參數(shù)例如為score=100、 wordlength =12。用BLASTX分析氨基酸序列時，參數(shù)例如為score=50、 wordlength =3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認參數(shù)。此外，本發(fā)明的多核苷酸包含(j)多核苷酸，其編碼具有與上述(5)所 述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的核苷酸序列的RNA; (k)多核苷酸， 其編碼通過RNAi作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)表達的RNA; (l)多核苷酸，其編碼具有特異性切割上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性的RNA;以及(m)多核苷酸，其編碼通過共抑制作用抑制上 述(5)所述的多核苷酸(DNA)表達的RNA。這些多核苷酸被整合進載 體，進而可在導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化細胞中抑制上述(a) (i)的多核苷酸 (DNA)的表達。因此，在希望抑制上述DNA表達的情況下優(yōu)選利用這些 多核苷酸。本說明書中，"編碼具有與DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的核苷酸序列的RNA 的多核苷酸"，指所謂的反義DNA。反義技術(shù)作為抑制特定內(nèi)源性基因的表 達的方法而公知，各種文獻中均有記載[例如，參照平島及井上新生化學(xué) 實驗講座2核酸IV基因的復(fù)制和表達(日本生化學(xué)會編，東京化學(xué)同人) pp.319-347,1993等。日語原文「平島招上"井上新生化學(xué)実験講座2 核 酸IV遺伝子(D複製t発現(xiàn)(日本生化學(xué)會編，東京化學(xué)同人)」]。反義DNA 的序列，優(yōu)選為與內(nèi)源性基因或其一部分互補的序列，但只要能有效地抑 制基因的表達，也可以不完全互補。轉(zhuǎn)錄的RNA相對于耙基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 優(yōu)選具有90%以上、進一步優(yōu)選具有95%以上的互補性。反義DNA的長 度至少為15個堿基以上，優(yōu)選為100個堿基以上，進一步優(yōu)選為500個堿 基以上。本說明書中，"編碼通過RNAi作用抑制DNA表達的RNA的多核苷酸"，指用于通過RNA干擾(RNAi)抑制內(nèi)源性基因表達的多核苷酸。"RNAi" 指將具有與靶基因序列同一或類似序列的雙鏈RNA導(dǎo)入細胞內(nèi)，導(dǎo)入的外 源基因及內(nèi)源性靶基因的表達均受到抑制的現(xiàn)象。這里使用的RNA包括例 如21 25個核苷酸長的產(chǎn)生RNA干涉的雙鏈RNA，例如，dsRNA (雙鏈 RNA)、 siRNA(小干擾RNA)或shRNA(短發(fā)卡RNA)。此種RNA可通過脂 質(zhì)體等運載系統(tǒng)運載至所需位點局部，也可以使用生成上述雙鏈RNA的載 體使其局部表達。此種雙鏈RNA(dsRNA、 siRNA或shRNA)的制備方法、 使用方法等已在許多文獻中公開(參照日本特表2002-516062號公報；美國 公開專利第2002/086356A號；Nature Genetics,24(2),180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April; Nature, 407:6802， 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.l6,(8),948-958，2002 Apr. 15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 99(8), 5515-5520， 2002 Apr. 16; Science, 296(5567)， 550-553， 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA， 99:9, 6047-6052， 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500， 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505， 2002 May; Nucleic Acids Res" 30:10， e46,2002 May 15等)。本說明書中，"編碼具有特異性切割DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性的RNA的多 核苷酸"一般指核酶。核酶是指具有催化活性的RNA分子，通過切割靶DNA 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，抑制該基因的功能。關(guān)于核酶的設(shè)計，可參照各種公知文獻 (例如參照FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875， 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125， 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271， 1992等)。另外，"編碼通過共抑制作用抑制DNA表達的RNA的多核苷酸"， 指通過"共抑制"抑制靶DNA的功能的核苷酸。本說明書中，"共抑制"是指通過在細胞中由轉(zhuǎn)化導(dǎo)入具有與內(nèi)源性靶基 因同一或類似序列的基因，從而使導(dǎo)入的外源基因及內(nèi)源性靶基因的表達 均受到抑制的現(xiàn)象。關(guān)于具有共抑制作用的多核苷酸的設(shè)計，可參照各種 公知文獻(例如，參照Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997， Martienssen R:Curr.Biol. 6: 810， 1996等)。 2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明還提供由上述多核苷酸(a) (f)中任一多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。 本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)，是由序列號2的氨基酸序列經(jīng)過1個或多個氨基酸 缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列組成，且具有磷酸腺苷酰硫 酸還原酶活性的蛋白質(zhì)。作為此種蛋白質(zhì)，可列舉由序列號2的氨基酸序列經(jīng)過上述數(shù)量的氨 基酸殘基的缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列組成，且具有磷 酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)。另外，此種蛋白質(zhì)包括具有與序列號2 的氨基酸序列有約60%以上、優(yōu)選約70%以上、進一步優(yōu)選約80%以上、 更優(yōu)選約90%以上、最優(yōu)選約95%以上同源性的氨基酸序列，且具有磷酸 腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)可用《分子克隆第3版》、《Current Protocols in Molecular Biology》、"Nuc. Acids. Res" 10， 6487 (1982)"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 79, 6409 (1982)"、 "Gene, 34, 315 (1985)"、 "Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)"、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)"等中記載的定點誘變法獲得。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1個以 上的氨基酸殘基，是指在同一序列中的任意1個或多個氨基酸序列的位置 上缺失、取代、插入和/或添加1個或多個氨基酸殘基，2種以上的缺失、 取代、插入及附加中也可同時發(fā)生。以下，例示可相互取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可 相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2 一氨基丁酸、蛋氨酸、鄰甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán) 己基丙氨酸；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2_氨基 己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨 酸、鳥氨酸、2， 4一二氨基丁酸、2， 3 —二氨基丙酸；E組脯氨酸、3 — 羥基脯氨酸、4一羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以用Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧 羰基法)等化學(xué)合成法來制造。另外，也可以利用Advanced ChemTech公 司、珀金埃爾默(Perkin Elmer)、法瑪西亞(Pharmacia)公司、Protein Technology Instruments公司、Synthecell畫Vega公司、PerSeptive公司、島津制作公司等制造的肽合成儀進行化學(xué)合成。3.本發(fā)明的載體及導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化酵母其次，本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體含有上述 (a) (i)中任一項所述的多核苷酸或上述(j) (m)中任一項所述的多核苷酸。 本發(fā)明的載體通常包括表達盒，該表達盒含有(x)在酵母細胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的 啟動子；(y)與該啟動子以正向或反向連接的上述(a) (i)中任一項所述的多 核苷酸；以及(z)與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷化作用有關(guān)的在酵母中 起作用的信號。本發(fā)明中，在后述的酒精飲料(例如，啤酒)釀造中，使 上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)高表達時，將這些多核苷酸針對該啟動子正向?qū)耄?以促進上述(a) (i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)的表達。另外，在后 述的酒精飲料(例如，啤酒)釀造中，抑制上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達時， 將這些多核苷酸針對該啟動子反向?qū)?，以抑制上?a) (i)中任一項所述 的多核苷酸(DNA)的表達。抑制上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達時，也可在載 體中可表達地導(dǎo)入上述(j) (m)中任一項所述的多核苷酸。且在本發(fā)明中， 通過破壞上述耙基因(DNA)，可抑制上述DNA的表達或上述蛋白質(zhì)的表 達?；虻钠茐?，可通過向參與耙基因的基因產(chǎn)物表達的區(qū)域，例如編碼 區(qū)域、啟動子區(qū)域的內(nèi)部附加或缺失一個或多個堿基，或使這些區(qū)域整體 缺失來進行。這種基因破壞的手法，可參照公知的文獻(例如，參照Proc. Natl.Acad.Sci.USA,76,4951(1979)、 Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、 日本特開平6-253826號公報等)。作為導(dǎo)入酵母時使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp 型)、染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，作為YEp型載體，已知 有YEp24 (J. R. Broach et al" Experimental Manipulation of Gene Expression,Academic Press, New York, 83, 1983)，作為YCp型載體，已知有YCp50(M. D. Rose et al., gene, 60， 237, 1987)，作為Yip型載體，已知有YIp5(K.Struhl et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USP，76,1035,1979)，并可容易地獲得。用于調(diào)節(jié)酵母中基因表達的啟動子/終止子，如能在釀造用酵母中起 作用，同時又不影響醪液中的氨基酸、糖、高級醇或酯的濃度，則可以是 任意的組合。例如，可利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、 3 —磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動子等。這些基因己被克隆，例如 在M. R Tuite et al., EMBO J.， 1，603(1982)中有詳細記載，通過已知的方法即 可容易地獲得。作為轉(zhuǎn)化時使用的選擇標記，由于釀造用酵母不能利用營養(yǎng)缺陷型標 記，所以可利用遺傳霉素抗性基因(G418r)、銅抗性基因(CUP1) (Marin etal.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 81,337 1984)、淺藍菌素抗性基因(fas2m, PDR4)(分別為豬腰淳嗣等，生化學(xué)，64, 660, 1992; Hussain et al., gene， 101， 149, 1991)等。如上所述構(gòu)建的載體被導(dǎo)入宿主酵母。作為宿主酵母，可列舉能用于 釀造的任意酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體可列 舉酵母屬(&^c^zramyc^)等的酵母，但在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母， 例如巴斯德酵母(5^cc/2"ra附j(luò)vcas / oston'awR ) W34/70等，5^cc/2ara附少ces car/s6ergms/s NCYC453 、 NCYC456 等，或 tSacc/zara附y(tǒng)ces cereWw'ae NBRC1951、 NBRC1952、 NBRC1953、或NBRC1954等。此外，還可以使 用威士忌酵母，例如釀酒酵母NCYC90等；葡萄酒酵母，例如日本釀造協(xié) 會的1號、3號和4號等葡萄酒酵母；清酒酵母，例如日本釀造協(xié)會的用7 號和9號等清酒酵母，但不限于此。本發(fā)明優(yōu)選使用啤酒酵母，例如巴斯 德酵母(Sacc/zara，ces / oston'"聰s )。作為酵母的轉(zhuǎn)化方法，可利用常用的公知方法。例如，可使用電穿孔 法"Meth. Enzym.， 194, pl82(1990)"、原生質(zhì)球法"Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 75pl929(1978)"、醋酸鋰法"J.Bacteriology， 153， pl63(1983)"、Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 p1929(1978)、 Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A ColdSpring Harbor Laboratory Course Manual等中記載的方法，但不限于此。更具體而言，將宿主酵母在標準酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基(例如YEPD培養(yǎng)基 "Genetic Engineering. Vo 1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)，，等)中培養(yǎng) 至OD600nm的值為1 6。將此培養(yǎng)酵母離心分離并收集、洗滌，用濃度 約為1 2M的堿金屬離子優(yōu)選鋰離子進行預(yù)處理。將此細胞在約3(TC下靜 置約60分鐘后，與將導(dǎo)入的DNA (約1 20嗎) 一同在約3(TC下靜置約 60分鐘。加入聚乙二醇，優(yōu)選加入約4,000道爾頓的聚乙二醇，使最終濃 度為約20% 50%。在約3(TC下，靜置約30分鐘后，將此細胞在約42°C 下加熱處理約5分鐘。優(yōu)選將此細胞懸浮液用標準酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基洗滌， 置于規(guī)定量的新鮮標準酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在約3(TC下靜置約60分鐘。之 后，將其移植到含有作為選擇標記使用的抗生素等的標準瓊脂培養(yǎng)基上， 獲得轉(zhuǎn)化體。此外，關(guān)于通常的克隆技術(shù)，可參照《分子克隆第3版》、"Methods in Yeast Genitics、 A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 、 Cold Spring Harbor, NY)"等。4.本發(fā)明的酒精飲料的制造方法及由該制造方法制得的酒精飲料將上述本發(fā)明的載體導(dǎo)入適合釀造所需酒精飲料的酵母中，通過使用 該酵母，可制造所需的且亞硫酸鹽含量增加、香味增加了的酒精飲料。另 外，也可使用通過下述本發(fā)明的酵母評價方法選擇的酵母。作為制造對象 的酒精飲料包括例如啤酒、發(fā)泡酒等的啤酒味飲料、葡萄酒、威士忌、清 酒等，并不限于此。制造這些酒精飲料時，除了使用本發(fā)明中得到的釀造酵母代替親株外， 可利用公知的手法。因此，原料、制造設(shè)備、制造管理等可與以往方法完 全相同，不會因制造亞硫酸鹽含量增加的酒精飲料而增加成本。g卩，本發(fā) 明可在使用已有設(shè)施、不增加成本的情況下，制造出香味穩(wěn)定性等優(yōu)異的 酒精飲料。另外，使用該基因為高表達的酵母時，培養(yǎng)基中的硫酸根離子被高效 攝入，所以，即使使用硫源缺乏的原料，例如制造啤酒時使用麥芽比率低的麥芽汁時，也可以實現(xiàn)良好的酵母增殖和酒精發(fā)酵。另外，使用含硫氨基酸合成體系的合成功能過強的酵母時，有時會大 量生成、積累以該途徑的中間代謝物硫化氫為代表的、酒精飲料中不受歡 迎的具有異味的含硫化合物類。對于這種酵母，通過抑制或破壞該基因的功能，抑制硫酸鹽作為起始原料的攝入，可以制造出減少了異味的酒精飲料。5.本發(fā)明的酵母的評價方法本發(fā)明涉及用根據(jù)具有序列號1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸還原 酶基因的核苷酸序列設(shè)計的引物或探針來評價被測酵母的亞硫酸鹽生成能 力的方法。這種評價方法的一般方法已公知，例如，在WOOl/040514號 公報、日本特開平8—205900號公報等中有記載。下面，對該評價方法進 行簡單說明。首先，制備被測酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀 法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl30 (1990)]。以得到的基因組為對象，使用根據(jù)磷酸腺苷 酰硫酸還原酶基因的核苷酸序列(優(yōu)選ORF序列)設(shè)計的引物或探針，檢 測被測酵母的基因組中是否存在該基因或該基因的特異性序列。引物或探 針的設(shè)計可用公知的方法來進行?；蚧蛱禺愋孕蛄械臋z測可使用公知的方法來進行。例如，將含有特 異性序列的一部分或全部的多核苷酸或含有該核苷酸序列的互補核苷酸序 列的多核苷酸作為一個引物使用，另一引物使用含有此序列的上游或下游 序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其核苷酸序列的互補核苷酸序列的 多核苷酸，通過PCR法擴增酵母的核酸，測定擴增物的有無、擴增物的分 子量大小等。用于引物的多核苷酸的核苷酸數(shù)通常為10bp以上，優(yōu)選為15 25bp。且夾在兩引物間部分的堿基數(shù)通常以300 2000bp為宜。PCR法的反應(yīng)條件不受特別限定，例如，可使用變性溫度90 95°C， 退火溫度40 60°C，延伸溫度60 75°C，循環(huán)數(shù)10次以上等條件。 所得反應(yīng)生成物通過使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等進行分離，可測定擴增21產(chǎn)物的分子量。通過該方法，根據(jù)擴增產(chǎn)物的分子量是否是含有特異部分的DNA分子的大小，來預(yù)測并評價該酵母的亞硫酸鹽生成能力。且通過分 析擴增物的核苷酸序列，可進一步更加準確地預(yù)測和/或評價上述能力。本發(fā)明也可以通過培養(yǎng)被測酵母，測定具有序列號1的核苷酸序列的 磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因的表達量，評價被測酵母的亞硫酸鹽生成能力。 此時，通過培養(yǎng)被測酵母，對磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因的產(chǎn)物mRNA或 蛋白質(zhì)進行定量即可。mRNA或蛋白質(zhì)的定量可用公知的手法來進行。例 如，mRNA的定量，例如可通過Northern雜交法、定量RT-PCR進行，蛋 白質(zhì)的定量，例如可通過Western印跡法進行(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。而且，通過培養(yǎng)被測酵母，測定具有序列號1的核苷酸序列的磷酸腺 苷酰硫酸還原酶基因的表達量，選擇與目的亞硫酸鹽生成能力相應(yīng)的上述 基因表達量的酵母，可選擇出適于釀造所需酒精飲料的酵母。另外，也可 以培養(yǎng)標準酵母及被測酵母，測定各酵母中上述基因的表達量，比較標準 酵母和被測酵母的上述基因的表達量，從而選擇出所需的酵母。具體而言， 例如可通過培養(yǎng)標準酵母及被測酵母，測定具有序列號1的核苷酸序列的 磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因在各酵母中的表達量，選擇與標準酵母相比該 基因為高表達的菌株，從而選擇出適于酒精飲料釀造的酵母。或者，可以通過培養(yǎng)被測酵母，選擇亞硫酸鹽生成能力強的酵母，從 而選擇出適于釀造所需酒精飲料的被測酵母。上述情況下，作為被測酵母或標準酵母，例如可使用導(dǎo)入了上述本發(fā) 明的載體的酵母、實施了人工突變處理的酵母、發(fā)生了自發(fā)突變的酵母等。 突變處理，例如可使用紫外線照射、放射線照射等物理方法，EMS (甲磺 酸乙酯)、N-甲基-N-亞硝基胍等試劑處理的化學(xué)方法等任何方法(例如， 參照大嶋泰治編著、生物化學(xué)實驗法39酵母分子遺傳學(xué)實驗法、p67-75、 學(xué)會出版中心等。日語原文「大嶋泰治編著、生物化學(xué)実験法39、酵母分 子遺伝學(xué)実験法、p67-75、學(xué)會出版iry夕一」)。另外，關(guān)于可作為標準酵母、被測酵母使用的酵母包括可用于釀造的任意酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體可為酵母屬(Saccharomyces ) 等酵母(例如 <S. pos^on'awws 、 S.cerev/w'ae 禾口 S.cw/^wgera&)。在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(iS"cc/zara附;;cas) W34/70等，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、 NCYC456等，Sacc/wramyces ce^vWaeNBRC1951、 NBRC1952、 NBRC1953、或NBRC1954等。此外，也可以使用威士忌酵母，例如釀酒 酵母NCYC90等；葡萄酒酵母，例如日本釀造協(xié)會的1號、3號和4號等 葡萄酒酵母；清酒酵母，例如日本釀造協(xié)會的7號和9號等清酒酵母，但 不限于此。本發(fā)明優(yōu)選使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母。標準酵母、被測 酵母可從上述酵母組中以任意組合選擇。實施例下面，通過實施例詳細說明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明不限于以下的實 施例。 [實施例1]磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因(noiiScMET16)的克隆用日本特開2004-283169中記載的比較數(shù)據(jù)庫檢索后，發(fā)現(xiàn)了啤酒酵母 特有的新型磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因nonScMET16 (序列號1)。根據(jù)得 到的核苷酸序列信息，分別設(shè)計了用于擴增全長基因的引物 nonScMET16—for (序列號3) /nonScMET16—rv (序列號4)，以基因組解讀 株Sacc/^ra附戸s Weihenstephan 34/70株的染色體DNA為模板進行PCR，獲得含有nonScMET16全長基因的DNA片段(約0.8kb)。將按上述操作得到的nonScMET16基因片段，通過TA克隆插入 pCR2.1-TOPO載體[英杰(Invitrogen)公司制造]。用Sanger法(F. Sanger, Science, 214， 1215， 1981)分析nonScMET16基因的核苷酸序列，并證實 了核苷酸序列。 [實施例2]啤酒試釀中的nonScMET16基因表達分析i酵母巴斯德酵母W34/70株進行啤酒試釀，將從發(fā)酵中的啤酒酵 母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列進行檢測。 麥芽汁浸出物濃度 12.69% 麥芽汁體積 70L 麥芽汁中溶解氧濃度 8.6ppm 發(fā)酵溫度 15°C 酵母添加量 12.8xl06cells/mL對發(fā)酵液進行經(jīng)時采樣，觀察酵母增殖量(圖1)、浸出物表觀濃度(圖 2)的經(jīng)時變化。與此同時，對酵母菌體進行采樣，將制備好的mRNA用生 物素標記，在啤酒酵母DNA微陣列上雜交。用基因芯片操作系統(tǒng)(GCOS; GeneChip Operating Software 1.0，昂飛(Affymetrix)公司制造)進行信號 檢測。nonScMET16基因的表達模式如圖3所示。結(jié)果證實nonScMET16 基因在一般的啤酒發(fā)酵中表達。 [實施例3]nonScMET16基因高表達株的制作從實施例1中所述的質(zhì)粒nonScMET16/pCR2.1-TOPO，通過限制酶SacI 及Notl處理，制備含有nonScMET16基因的約0.8kb的DNA片段。將其與 經(jīng)限制酶Sacl及Notl處理的pUP3GLP2連接，構(gòu)建nonScMET16組成型表 達載體pUP- nonScMET16。酵母表達載體pUP3GLP2是在同源重組位點含 有乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶基因URA3的YIp型(染色體整合型)載體， 導(dǎo)入的基因在甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因TDH3的啟動子和終止子的控制下 組成型表達。作為酵母中的選擇標記，在半乳糖激酶基因GAL1的啟動子 和終止子的控制下整合抗藥性基因YAP1，從而在含有半乳糖的培養(yǎng)基中被 誘導(dǎo)表達。另外，還包含作為大腸桿菌中的選擇標記的氨芐青霉素抗性基 因Ampr。使用通過上述方法制作的組成型表達載體，用日本特開平07-303475 中記載的方法，轉(zhuǎn)化S"cc/2ara，ces/ a加n'朋ws Weihenstephan 34/70株。首先，若生成的亞硫酸鹽在菌體內(nèi)積累，則酵母自身受到亞硫酸鹽引起的損害，無法正確評價nonScMET16基因的效果，因此用日本特開2004-283169 中記載的方法獲得編碼亞硫酸鹽排出泵的nonScSSUl基因高表達株。然后， 將其作為親株進行轉(zhuǎn)化，以得到nonScMET16基因高表達株，在含有淺藍 菌素1.0mg/L的YPGal平板培養(yǎng)基(1%酵母膏、2%多聚蛋白胨、2%半乳 糖、2%瓊脂)上選擇淺藍菌素抗性株。對頂層酵母TF一ALE株也按同樣的 順序進行操作，得到nonScSSUl高表達株，將其作為親株構(gòu)建nonScMET16 高表達株。通過RT-PCR確認組成型表達。用RNeasy Mini Kit (Qiagen公司制)， 按照試劑盒中附帶的操作手冊提取總RNA。 nonScMET16特異性引物采用 nonScMET16—F (序列號5) MonScMET16—rv (序列號4)，內(nèi)部標準采用丙 酮酸脫氫酶基因PDA1的特異性引物即PDA1—for51(序列號6)/PDAl_730rv(序列號7)。將PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖電泳后，用溴化乙錠溶液染色， 將nonScMET16基因的信號值用PDA1基因的信號值標準化。篩選該值與 親株相比顯示出2倍以上表達量的2株作為nonScMET16高表達株。 [實施例4]啤酒試驗釀造中的亞硫酸鹽生成量分析在下述條件下，用親株和實施例3中獲得的nonScMET16高表達株(2 株)進行發(fā)酵試驗。麥芽汁浸出物濃度 13%麥芽汁體積 1L麥芽汁中溶解氧濃度 約8ppm在34/70株實驗區(qū)，發(fā)酵溫度為15°C，酵母添加量為6g/L。在TF—ALE 株實驗區(qū)，發(fā)酵溫度為25。C，酵母添加量為3.75g/L。對發(fā)酵醪液進行經(jīng)時采樣，分析酵母增殖量(OD660)、糖消耗量的 經(jīng)時變化。關(guān)于發(fā)酵結(jié)束時的亞硫酸鹽濃度的定量，通過在酸性條件下利 用蒸餾將亞硫酸鹽收集到過氧化氫水中，然后用堿滴定來進行[(財)日本 釀造協(xié)會改訂BCOJ啤酒分析法]，算出2株高表達株的平均值。34/70 株實驗區(qū)的結(jié)果如圖4、圖5及圖6所示，TF ALE實驗區(qū)的結(jié)果如圖7、圖8及圖9所示。由圖6可知，發(fā)酵結(jié)束時的亞硫酸鹽生成量，親株為25ppm，而 nonScMET16高表達株為30ppm。另外，對于頂層酵母，親株為4ppm，而 高表達株為5ppm (圖9)。上述結(jié)果表明，無論是頂層酵母還是底層酵母， 由于nonScMET16高表達，亞硫酸鹽生成量均增大約20%。而且此時，親 株與組成型表達株之間在增殖速度及浸出物消耗速度上無差異。由上述結(jié)果可知，本發(fā)明中公開的通過使啤酒酵母特有的磷酸腺苷酰 硫酸還原酶基因組成型表達而使亞硫酸鹽的生成能力強化的酵母，能在不 改變發(fā)酵工序、發(fā)酵時間的情況下特異性增加作為啤酒抗氧劑起作用的亞 硫酸鹽的生成量。從而可以制造出香味穩(wěn)定性優(yōu)異、保質(zhì)期更長的酒精飲 料。[實施例5]使用低硫源麥芽汁的啤酒釀造試驗用實施例3中制作的高表達載體轉(zhuǎn)化5^cc/^ra附y(tǒng)cas / oston'am^ W34/70株，分別獲得Sc和non-ScMET16 (單獨)高表達株。然后，調(diào)制 麥芽比率為24%的麥芽汁作為低硫源麥芽汁，在下述條件下，用親株和得 到的高表達株進行啤酒釀造試驗。麥芽汁浸出物濃度 13%麥芽汁體積 2L麥芽汁中溶解氧濃度 約8ppm發(fā)酵溫度 15'C恒定酵母添加量 10.5g濕酵母菌體/2L麥芽汁對發(fā)酵醪液進行經(jīng)時采樣，分析酵母增殖量(OD660)、糖消耗量的 經(jīng)時變化。 [實施例6] MET16基因的破壞按照文獻(Goldstein etal.， yeast. 15 1541 (1999))的方法，以含有抗藥 性標記的質(zhì)粒(pFA6a (G418')或pAG25 (natl))為模板進行PCR，制作MET16基因破壞用片段。用制作的基因破壞用片段轉(zhuǎn)化W34/70株或孢子克隆W34/70-2株。轉(zhuǎn) 化采用日本特開平07-303475中記載的方法進行，選擇試劑的濃度分別為遺 傳霉素300mg/L，諾爾絲菌素(50 mg/L)。 [實施例7]啤酒釀造試驗中的含硫化合物生成量的分析在下述條件下，用親株及實施例6中獲得的破壞株進行啤酒釀造試驗。麥芽汁浸出物濃度 13%麥芽汁體積 2L麥芽汁中溶解氧濃度 約8ppm發(fā)酵溫度 15'C恒定酵母添加量 10.5g濕酵母菌體/2L麥芽汁對發(fā)酵醪液進行經(jīng)時采樣，分析酵母增殖量(OD660)、糖消耗量的 經(jīng)時變化。用頂空氣相色譜法進行醪液中的含硫化合物類的分析。工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明的酒精飲料制造方法，由于產(chǎn)品中具有抗氧化作用的亞硫 酸鹽的含量增加，從而可以制造香味穩(wěn)定性優(yōu)異、保質(zhì)期更長的酒精飲料。 另外，本發(fā)明的酵母可以高效地還原作為硫源的硫酸根離子，生物合成增 殖所需的含硫化合物，因此即使使用含硫氨基酸含量低的原料、例如發(fā)泡 酒麥芽汁的情況下也可以進行良好的酒精發(fā)酵。此外，即使對于具有異味 的含硫化合物類的生成量高的酵母，也可以通過抑制該基因的表達來制造 香味良好的酒精飲料。本申請主張日本專利申請第2005-231192號(2005年8月9日申請) 的優(yōu)先權(quán)的利益，通過引用將該申請所記載的全部內(nèi)容包括在本申請內(nèi)。 另外，其他所有引用文獻的全部內(nèi)容也包括在本申請內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 多核苷酸，其是選自下述(a)～(f)構(gòu)成的組中的多核苷酸(a)多核苷酸，其含有由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(c)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列經(jīng)過1個或多個氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列組成，且具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(d)多核苷酸，其含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(e)多核苷酸，其含有與由序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有與編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列所組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其是選自下述(g) (i)構(gòu)成的 組中的多核苷酸，(g) 多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸 序列經(jīng)過1 10個氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列組成 且具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)；(h) 多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90%以上同一 性的氨基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)；以及(i) 多核苷酸，其與序列號1的核苷酸序列或與序列號1的核苷酸序 列的互補核苷酸序列所組成的多核苷酸在高嚴謹條件下雜交，且編碼具有 磷酸腺苷酰硫酸還原酶活性的蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其含有由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序 列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項所述的多核苷酸，其是DNA。
6. 多核苷酸，其是選自下述(j) (m)構(gòu)成的組中的多核苷酸，(j)多核苷酸，其編碼具有與權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的核苷酸序列的RNA;(k)多核苷酸，其編碼通過RNAi作用抑制權(quán)利要求5所述的多核苷 酸(DNA)表達的RNA;(1)多核苷酸，其編碼具有特異性切割權(quán)利要求5所述的多核苷酸 (DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性的RNA;以及(m)多核苷酸，其編碼通過共抑制作用抑制權(quán)利要求5所述的多核苷 酸(DNA)表達的RNA。
7. 蛋白質(zhì)，其是由權(quán)利要求1 5任一項所述的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)。
8. 載體，其是含有權(quán)利要求1 5任一項所述的多核苷酸的載體。
9. 載體，其是含有權(quán)利要求6所述的多核苷酸的載體。
10. 酵母，其含有權(quán)利要求8或9所述的載體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的酵母，其通過導(dǎo)入權(quán)利要求8所述的載體增 強亞硫酸鹽生成能力。
12. 酵母，其通過導(dǎo)入權(quán)利要求9所述的載體，或通過破壞與權(quán)利要求 5所述的多核苷酸(DNA)相關(guān)的基因，抑制權(quán)利要求5所述多核苷酸(DNA)的表達。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的酵母，其通過增加權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì) 的表達量，提高亞硫酸鹽生成能力。
14. 酒精飲料的制造方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求10 13任一項所述的酵母。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的酒精飲料的制造方法，其釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的酒精飲料的制造方法，其釀造的酒精飲料是 葡萄酒。
17. 酒精飲料，其是用權(quán)利要求14 16任一項所述的方法制造的酒精飲料。
18. 評價方法，其包括使用根據(jù)具有序列號1的核苷酸序列的磷酸腺苷 酰硫酸還原酶基因的核苷酸序列設(shè)計的引物或探針，評價被測酵母的亞硫 酸鹽生成能力。
19. 評價方法，其包括培養(yǎng)被測酵母，以及測定具有序列號1的核苷 酸序列的磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因的表達量，來評價被測酵母的亞硫酸 鹽生成能力。
20. 酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被測酵母，對權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)進行定量或測定具有序列號1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸還原酶 基因的表達量，以及選擇具有與目的亞硫酸鹽生成能力相應(yīng)的上述蛋白質(zhì) 的生成量或上述基因的表達量的被測酵母。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標準酵母和被 測酵母；測定具有序列號1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因在 各酵母中的表達量；以及選擇與標準酵母相比該基因為高表達或低表達的 被測酵母。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標準酵母和被 測酵母；對各酵母中權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)進行定量；以及選擇與標準 酵母相比該蛋白質(zhì)的量增多或減少的被測酵母。
23. 酒精飲料的制造方法，其包括用權(quán)利要求10 13任一項所述的酵 母或通過權(quán)利要求20 22任一項所述的方法選擇的酵母中的任一酵母進行 以酒精飲料制造為目的的發(fā)酵，并調(diào)節(jié)亞硫酸鹽的生成量。
全文摘要
本發(fā)明涉及磷酸腺苷酰硫酸還原酶基因及其用途，特別是涉及制造香味穩(wěn)定性優(yōu)異的酒精飲料的釀造酵母、用該酵母制造的酒精飲料、以及所述飲料的制造方法等。更具體而言，本發(fā)明涉及通過控制釀造酵母的磷酸腺苷酰硫酸還原酶Met16p的編碼基因MET16、特別是啤酒酵母的特征性non-ScMET16基因的表達量來控制有助于產(chǎn)品香味穩(wěn)定化的亞硫酸鹽的生成能力的酵母，以及使用該酵母的酒精飲料制造方法等。
文檔編號C12C11/00GK101248175SQ200680029178
公開日2008年8月20日 申請日期2006年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月9日
發(fā)明者下永朋子, 中尾嘉宏, 兒玉由紀子 申請人:三得利株式會社