專利名稱：：新穎的基因sms37的制作方法新穎的基因SMS37本發(fā)明涉及新鑒定出的基因，其編碼L-抗壞血酸(下文中也稱為維生素C)合成中涉及的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含該新穎基因的全長(zhǎng)多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術(shù)工具在從微生物生產(chǎn)維生素C中的用途，其中對(duì)所述多核苷酸和/或被編碼的多肽的修飾對(duì)在所述微生物中生產(chǎn)所述發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率有著直接或間接的影響。本發(fā)明還包括使用所述多核苷酸和經(jīng)修飾的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主微生物的方法/工藝。本發(fā)明還涉及經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的微生物及其用于直接生產(chǎn)維生素C的用途。維生素C是對(duì)人類來(lái)說(shuō)非常重要且必不可少的營(yíng)養(yǎng)因子。維生素C還用于動(dòng)物飼料，盡管一些畜牧動(dòng)物可自身體內(nèi)合成維生素C。在過(guò)去的70年中，已通過(guò)公知的Reichstein方法從D-葡萄糖對(duì)維生素C進(jìn)行了工業(yè)生產(chǎn)。該工藝中的所有步驟都是通過(guò)化學(xué)方式進(jìn)行的，只除了其中一個(gè)步驟(從D-山梨糖醇到L-山梨糖的轉(zhuǎn)化)，其通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行。從對(duì)維生素C的工業(yè)生產(chǎn)的最初實(shí)踐開(kāi)始，就已使用了多種化學(xué)改良和技術(shù)改良，來(lái)提高Reichstein方法的效率。近來(lái)對(duì)維生素C生產(chǎn)的發(fā)展被概括于Ullma皿，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,5thEdition,Vol.A27(1996)，pp.547ff中。維生素C生產(chǎn)的不同中間步驟已在微生物或從屮分離出的酶的協(xié)助下進(jìn)行。因此，可通過(guò)發(fā)酵工藝，通過(guò)屬于例如A^togw/ow'c/gem'ww屬或G/wco"o&cter屬的菌株從L-山梨糖或D-山梨糖醇起始來(lái)生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA，這是可通過(guò)堿性重排反應(yīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化為維生素C的中間產(chǎn)物)，或者通過(guò)屬于G/wco"Wa"er屬或?qū)俚闹亟M菌株，從D-葡萄糖起始進(jìn)行另一種發(fā)酵工藝來(lái)生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸。目前用于對(duì)維生素進(jìn)行化學(xué)生產(chǎn)的方法具有一些人們不想要的特征，例如高能耗以及要使用大量的有機(jī)及無(wú)機(jī)溶劑。因此，在過(guò)去數(shù)十年中，人們已在研究更加經(jīng)濟(jì)且環(huán)保的用微生物轉(zhuǎn)化來(lái)制造維生素C的其它方法。從大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)來(lái)直接生產(chǎn)維生素c已在多種微生物中被報(bào)道過(guò)，所述微生物例如藻類、酵母和乙酸細(xì)菌，其中使用了不同的培養(yǎng)方法。已知能直接生產(chǎn)維生素c的細(xì)菌的例子包括，例如，來(lái)自G7wco"o6acfer、G7t/ccwflceto6acfer、Jc"oZ"cte廠、A^ogw/(m'c/gew/讓、尸朋toM、尸化wi/owoW(X或E^c/^n'c/w'a屬的菌株。已知酵母或藻類的例子包括，例如Cfl"AJa、Sacc/^ramF"、能吸收D-山梨糖醇用于生長(zhǎng)的微生物通常具有能將該化合物氧化為普遍性的同化吸收底物(例如D-果糖)的酶。能在L-山梨糖上生長(zhǎng)的微生物還擁有一種酶——NAD(P)H-依賴性L-山梨糖還原酶，該酶可將該化合物還原為D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被進(jìn)一步氧化為D-果糖。被D-果糖激酶磷酸化之后，D-果糖成為很多微生物生長(zhǎng)的優(yōu)秀底物。例如，在乙酸細(xì)菌(其是專性需氧的革蘭氏陰性微生物，屬于Jceto6a"er、G7wcom6acter禾口G7wcowaceto^acter屬)的情況F，這些微生物能將D-山梨糖醇轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞質(zhì)溶膠(cytosol)，并通過(guò)胞質(zhì)溶膠中的NAD-依賴性D-山梨糖醇脫氫酶將其轉(zhuǎn)化為D-果糖。一些個(gè)體菌株，例如G/wco朋kz"eroxy^"sIFO3292和IFO3293還能將L-山梨糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞質(zhì)溶膠，并通過(guò)胞質(zhì)溶膠中的NAD(P)H-依賴性L-山梨糖還原酶將其還原為D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被進(jìn)一步氧化為D-果糖。在這些細(xì)菌中，Embden-Meyerhof-Pamas途徑以及三羧酸循環(huán)并不具有完全活性，將糖導(dǎo)向中央代謝的主要途徑是磷酸戊糖途徑。通過(guò)磷酸化反應(yīng)從D-果糖獲得的D-果糖-6-磷酸進(jìn)入磷酸戊糖途徑，其被進(jìn)一步代謝，產(chǎn)生以NAD(P)H形式存在的還原能量和生長(zhǎng)及維持所必需的三羧基化合物。乙酸細(xì)菌因其能不完全氧化不同底物(例如醇、糖、糖醇和醛)的能力而為人們公知。這些過(guò)程為人們所已知并通常被稱為氧化發(fā)酵或不完全氧化，它們己被長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用于食品和化學(xué)工業(yè)中，尤其是對(duì)醋和L-山梨糖的生產(chǎn)中。已知能用屬于G/wco"okzcter屬的菌株從D-山梨糖醇或L-山梨糖進(jìn)行不完全氧化獲得的有用產(chǎn)物是2-KGA。乙酸細(xì)菌通過(guò)位于周質(zhì)空間中、周質(zhì)膜上以及胞質(zhì)中的不同脫氫酶來(lái)完成這些不完全氧化反應(yīng)。不同的脫氫酶使用不同的輔助因子，最常見(jiàn)的是用于膜結(jié)合酶或周質(zhì)酶的PQQ和FAD，以及用于胞質(zhì)酶的NAD綠DP。雖然這些氧化反應(yīng)的所有產(chǎn)物都通過(guò)外層膜分散回到外界水環(huán)境，但是它們中的一些可被主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞，并進(jìn)一步用于與生長(zhǎng)和能量形成有關(guān)的代謝途徑。細(xì)胞中，氧化產(chǎn)物可被還原酶多次還原回它們的最初底物，然后被導(dǎo)向回到中央代謝。在D-山梨糖醇或L-山梨糖的代謝中具有活性的蛋白質(zhì)，尤其是酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter)，在本文中被稱為涉及山梨糖醇/山梨糖代謝系統(tǒng)(Sorbitol/SorboseMetabolizationSystem)。此類蛋白質(zhì)在本文中被縮寫(xiě)為SMS蛋白，其在對(duì)D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接代謝中發(fā)揮作用。D-山梨糖醇或L-山梨糖的代謝包括一方面，將這些化合物吸收進(jìn)胞質(zhì)溶膠，以及進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為可用于吸收途徑的代謝物，所述吸收途徑例如Embden-Meyerhof-Pamas途徑、磷酸戊糖途徑、Entner-Doudoroff途徑以及三羧酸循環(huán)，它們都涉及對(duì)于活的細(xì)胞的生長(zhǎng)和維持來(lái)說(shuō)必要的全部關(guān)鍵的能量形成和合成代謝反應(yīng)。另一方面，D-山梨糖醇或L-山梨糖的代謝還包括通過(guò)所謂的不完全氧化過(guò)程將這些化合物轉(zhuǎn)化為經(jīng)進(jìn)一步氧化的產(chǎn)物，例如L-山梨糖酮、2-KGA和維生素C。本發(fā)明的一個(gè)目的是提高維生素C生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)能力。令人吃驚地，我們發(fā)現(xiàn)，SMS蛋白或此類蛋白的涉及對(duì)D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮的吸收或轉(zhuǎn)化或具有針對(duì)此的活性的亞基在對(duì)維生素C和/或2-KGA的生物技術(shù)生產(chǎn)中具有重要作用。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的SMS蛋白選自氧化還原酶[ECl]，優(yōu)選選自在供體的CH-OH基團(tuán)上發(fā)揮作用的氧化還原酶[ECl.l]，更優(yōu)選選自以NAD+或NADP+作為受體的氧化還原酶[ECl丄l]以及具有其它受體的氧化還原酶[EC1丄99]，最優(yōu)選選自屬于[ECl丄l.l]、[EC1丄1.15]或[EC1.2丄-]的酶組的氧化還原酶，或者優(yōu)選選自在供體的醛或氧代基團(tuán)上發(fā)揮作用的氧化還原酶[EC1.2]，更優(yōu)選地選自以NAD+或NADP+作為受體的氧化還原酶[EC1.2.1]。此外，本發(fā)明的SMS蛋白可選自與膜結(jié)合的PQQ依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶、與膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶、與膜結(jié)合的L-山梨糖酮脫氫酶、與膜結(jié)合的FAD依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶、胞質(zhì)NAD依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶、NAD(P)依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶(也被稱為NADPH依賴性的山梨糖還原酶)、NAD依賴性的木糖醇脫氫酶、NAD依賴性的醇脫氫酶、與膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶、NAD(P)H依賴性的L-山梨糖還原酶、胞質(zhì)NADP依賴性的山梨糖酮脫氫酶、胞質(zhì)NAD(P)H依賴性的L-山梨糖酮還原酶、與膜結(jié)合的醛脫氫酶、胞質(zhì)醛脫氫酶、3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶以及SMS中涉及的其它酶(包括涉及糖和/或糖醇轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)，特別是共輸送蛋白(symporter)，優(yōu)選半乳糖-質(zhì)子共輸送蛋白，或糖或糖醇的輸出蛋白(exporter)，優(yōu)選山梨糖酮輸出蛋白)構(gòu)成的組。特別地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，具有下述核苷酸序列的多核苷酸編碼的SMS蛋白在對(duì)維生素C的生物技術(shù)生產(chǎn)中具有重要作用，該核苷酸序列能在優(yōu)選高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO:l所示的序列雜交?，F(xiàn)還已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在能直接生產(chǎn)維生素C的微生物(例如G/MC0"0^cter)中對(duì)根據(jù)本發(fā)明的核苷酸的表達(dá)水平進(jìn)行遺傳改變，可很大程度地提高所述微生物對(duì)維生素C的直接發(fā)酵。隨后，本發(fā)明涉及選自下述組的多核苷酸或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來(lái)自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物組，通過(guò)核酸擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(C)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有糖輸出蛋白(exporter)和/或糖醇輸出蛋白的活性，優(yōu)選地，具有SMS37的活性；(e)編碼糖輸出蛋白和/或糖醇輸出蛋白，優(yōu)選編碼SMS37多肽的多核苷酸，且其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸互補(bǔ)；以及(f)編碼糖輸出蛋白和/或糖醇輸出蛋白，優(yōu)選編碼SMS37多肽的多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少60%相同，例如70%、85%、90%或95%相同;構(gòu)成。我們發(fā)現(xiàn)，本文中描述的SEQIDNO:2示出的從G/"co"Macterorj^fl似DSM17078分離的SMS蛋白是特別有用的SMS蛋白，因?yàn)榭雌饋?lái)其在微生物(特別是細(xì)菌，例如乙酸細(xì)菌，例如G/MCO恥^Cter,Jceto&"er和G/wcwmcetokzcter)中的直接維生素C生產(chǎn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本發(fā)明涉及編碼根據(jù)SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸。該蛋白可由SEQIDNO:1示出的核苷酸序列編碼。本發(fā)明因此還涉及包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸。上文確定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作為"査詢序列"，以便用來(lái)自NationalCenterforBiotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)PROSW-SwissProt(完全發(fā)布版本加上增加的更新)進(jìn)行搜索。根據(jù)這些搜索結(jié)果，將根據(jù)SEQIDNO:1的SMS37多核苷酸標(biāo)注為編碼具有半乳糖-質(zhì)子共輸送蛋白活性的蛋白質(zhì)。令人驚奇的是，目前還發(fā)現(xiàn)由根據(jù)SEQIDNO:l的SMS37多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)涉及糖和/或糖醇(特別是山梨糖酮)的輸出。在這里，"輸出"表示各自化合物從細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)入周質(zhì)或細(xì)胞外環(huán)境的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。可使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物(例如根據(jù)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的核苷酸引物)，按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)核酸擴(kuò)增來(lái)獲得根據(jù)本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增出的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過(guò)DNA序列分析對(duì)其進(jìn)行表征。用于反應(yīng)的模板可以是通過(guò)對(duì)從已知包含或懷疑包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的菌株制備的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。PCR產(chǎn)物可被亞克隆和測(cè)序，以確保擴(kuò)增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通過(guò)多種已知方法，用PCR片段分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，可標(biāo)記擴(kuò)增出的片段，用其篩選噬菌體或粘粒(cosmid)cDNA文庫(kù)。或者，經(jīng)標(biāo)記的片段可用于篩選基因組文庫(kù)。因此，本發(fā)明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來(lái)自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物組，通過(guò)核酸擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)獲得。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其包含編碼本文所述的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有SMS多肽(優(yōu)選地，SMS37多肽)的活性。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其編碼SMS多肽(優(yōu)選地，SMS37多肽)，其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本文定義的多核苷酸互補(bǔ)。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其與本文定義的多核苷酸至少60%相同，并且其編碼SMS多肽；本發(fā)明還涉及是上文定義的多核苷酸的互補(bǔ)鏈的多核苷酸。本發(fā)明還涉及引物、探針和片段，其可用于擴(kuò)增或檢測(cè)本發(fā)明的DNA和鑒定也帶有這類基因的相關(guān)微生物的種或科。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明多核苷酸的載體，和用所述多核苷酸或所述載體遺傳工程改造過(guò)的微生物。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)微生物和由上文定義的多核苷酸編碼的多肽的工藝，所述微生物能夠表達(dá)上文定義的多核苷酸所編碼的多肽。本發(fā)明還涉及下述微生物，其中，SMS多肽(優(yōu)選地，SMS37多肽)的活性增強(qiáng)和/或提高，使得從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率增加。這可例如通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)入重組或非重組微生物來(lái)完成，所述為生物可以含有SMS37基因的內(nèi)源等同物，或者可以不含。技術(shù)人員將知道如何增強(qiáng)和/或提高SMS蛋白(優(yōu)選地，SMS37蛋白)的活性。這些可以例如增加SMS蛋白(優(yōu)選地，SMS37蛋白)的比活性，或者通過(guò)對(duì)宿主生物進(jìn)行遺傳修飾來(lái)完成，所述遺傳修飾以較之野生型生物產(chǎn)生更多或更穩(wěn)定的SMS蛋白(優(yōu)選地，SMS37蛋白)的拷貝的方式來(lái)進(jìn)行。在下述說(shuō)明書(shū)中，將對(duì)達(dá)到此目的(即，通過(guò)增加SMS37蛋白的活性，增加從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量)的方案進(jìn)行詳細(xì)描述。在進(jìn)行必要修正后，這些方案可應(yīng)用于其它SMS蛋白。為獲得產(chǎn)生更多拷貝的SMS37基因(即，過(guò)量表達(dá)該基因)和Z或蛋白的生物進(jìn)行的修飾包括使用強(qiáng)啟動(dòng)子，或者對(duì)SMS37基因(的部分)或其調(diào)控元件加以突變(例如，插入、缺失或點(diǎn)突變)。這還可包括將多個(gè)拷貝的基因插入到合適的微生物中。SMS37蛋白比活性的增加也可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)完成。此類方法可包括對(duì)SMS37基因(的部分)的突變(例如，插入、缺失或點(diǎn)突變)。如果基因的轉(zhuǎn)錄水平較之野生型基因有所增強(qiáng)，那么認(rèn)為該基因被"過(guò)量表達(dá)"。這可通過(guò)例如對(duì)mRNA的量加以定量的Northern印跡分析來(lái)測(cè)量，mRNA的量被用作為對(duì)基因表達(dá)的指示。在本文中，如果產(chǎn)生的mRNA的量較之野生型基因產(chǎn)生的mRNA的量增加至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過(guò)500%，那么基因就是過(guò)量表達(dá)的。本領(lǐng)域中還已知可以通過(guò)將SMS37蛋白與特定增強(qiáng)子相接觸或與能與SMS37蛋白發(fā)生特異性相互作用的其它物質(zhì)相接觸，來(lái)增強(qiáng)給定蛋白質(zhì)活性。為鑒定出此類特定增強(qiáng)子，可表達(dá)SMS37蛋白，并對(duì)存在懷疑能增強(qiáng)SMS37蛋白活性的化合物時(shí)的活性加以測(cè)試。還可通過(guò)對(duì)編碼SMS37的信使RNA進(jìn)行穩(wěn)定化來(lái)增加SMS37蛋白的活性。此類方法也是本領(lǐng)域己知的，見(jiàn)，例如Sambrooketal.,1989，MolecularConing,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.禾口Ausubeletal.(eds.),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)。本發(fā)明可以在攜帶有SMS37基因或其等同物或同源體的任何微生物中Z使用所述微生物進(jìn)行。合適的微生物可選自酵母、藻類和細(xì)菌構(gòu)成的組，它們可以是野生型菌株或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的誘變方法和選擇方法獲得的突變體菌株以及重組菌株。此類酵母的例子可以是，例如，Ozm//^、Xacc/wramyces、Zygwacc力flr蘭ycey、Sc/n'zc^accAwomj;ce5或A7w，eromj;c^。此類藻類的例子可以是，例如，CA/o"〃a。此類細(xì)菌的例子可以是，{列々卩，G7wco"oZacfer、Jc"o6acter、G7wcowacetoZ"cte廠、禾口￡^c/e/-/c/n'a(例如Esc/ehc/n'"co//)。優(yōu)選的是G7wco"o/^cter或Jce勵(lì)acterace"，例如，(7.ox3^/flws、G.cm>2i、G.yh3te訓(xùn)7、Aace"swZ)平xy/Zw畫(huà)或ylacef/w/取or/e朋ws，優(yōu)選地，G.ax_y<ia/MDSM17078。己按照《布達(dá)佩斯條約》，于2005年1月26日將G/wcom^acferox—"sDSM17078(以前稱作G7wc畫(huà)kzcter謹(jǐn)N44-l)保藏至DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ),MascheroderWegIB,D-38124Braunschweig,Germany?？捎糜诒景l(fā)明的微生物可被公眾從不同來(lái)源獲得，例如，DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ)，MascheroderWegIB,D-38124Braunschweig,Germany、AmericanTypeCultureCollection(ATCC),P.O.Box1549,Manassas,VA20108USA或CultureCollectionDivision,NITEBiologicalResourceCenter,2-5-8,Kazusakamatari，Kisarazu-shi,Chiba，292-0818,Japan(以前是InstitueforFermentation,Osaka(IFO),17-85,Juso-honmachi2-chome，Yodogawa-ku，Osaka532-8686,Japan)。保存到IFO的優(yōu)選的細(xì)菌的例子例如是G/Mco"ok^eroxj^zm(以前被稱為G.me/朋ogewws)IF03293、G7wcowoZactero砂(iara(以前被稱為G.me/朋ogeww51)IF03292、G7wco"o^cte廠oxj^/fl"s(以前被禾爾為(7.n^/g/naMs)IF03244、G/wccwo6flcteryh^e駅7(以前被禾爾為G.zWm欲/ms)IFO3260、G7wcowoZac/ercer/wwsIF03266、G7wcowoZaCerIFO3287和爿ceto^z"erace"犯&;.or/ea"wIFO3259，上述這些都于1954年4月5日被保藏；1975年10月22日保藏的Jcetokcterace"x_y//m/mIFO13693禾卩1977年12月8日保藏的爿c"0k7cterace"5"fe;.xj;/〖"wwIFO13773。菌株爿ceto^cter取ATCC15164也是優(yōu)選細(xì)菌的例子，其被保藏于ATCC。菌t朱G7MCowc^acferax3^/aw(以前l(fā)皮禾爾為G.附e/awogem")N44-l是優(yōu)選細(xì)菌的另一個(gè)例子，其是菌株IFO3293的衍生物，在Sugisawaetal.，Agric，Biol.Chem.54:1201-1209，1990中對(duì)其有所描述。本發(fā)明的微生物可在DNA水平或蛋白質(zhì)水平上攜帶其它修飾(見(jiàn)上文所述)，只要此類修飾對(duì)從底物(例如D-山梨糖醇或L-山梨糖)直接生產(chǎn)維生素C的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率具有直接影響即可。此類其它修飾可以例如影響編碼上文所述的SMS蛋白的其它基因，特別是，編碼與膜結(jié)合的L-山梨糖酮脫氫酶(例如，L-山梨糖酮脫氫酶SNDHai)或與膜結(jié)合的PQQ結(jié)合D-山梨糖醇脫氫酶的基因。進(jìn)行此類修飾的方法是本領(lǐng)域已知的，一些例子在本文中有進(jìn)一步描述。關(guān)于用于對(duì)維生素C進(jìn)行直接生產(chǎn)的SNDHai及其核苷酸和氨基酸序列，參見(jiàn)WO2005/017159，其通過(guò)引用并入本文。另外，這類修飾可以例如影響涉及D-山梨醇和/或L-山梨糖代謝的基因，例如SEQIDNO:9所示基因或其同源物(其作為SMS37基因的抑制子作用)，特別是導(dǎo)致所述抑制子(例如根據(jù)SEQIDNO:9的)的活性降低或消除的修飾。技術(shù)人員將知道如何降低或消除所述抑制子(優(yōu)選地根據(jù)SEQIDNO:10的蛋白質(zhì))的活性。這些可以例如降低或消除所述抑制子(優(yōu)選地根據(jù)SEQIDNO:10的蛋白質(zhì))的比活性，或者通過(guò)對(duì)宿主生物進(jìn)行遺傳修飾來(lái)完成，所述遺傳修飾以較之野生型生物產(chǎn)生更少或?yàn)榱愕乃鲆种谱?優(yōu)選地根據(jù)SEQIDNO:10的蛋白質(zhì))拷貝的方式來(lái)進(jìn)行。為了使生物產(chǎn)生更少或零拷貝的抑制子基因(優(yōu)選地根據(jù)SEQIDNO:9的基因)和/或根據(jù)SEQIDNO:10的蛋白質(zhì)進(jìn)行的修飾包括使用弱啟動(dòng)子，或者對(duì)根據(jù)SEQIDNO:9的基因(的部分)或其調(diào)控元件加以突變(例如，插入、缺失或點(diǎn)突變)。根據(jù)SEQIDNO:IO的蛋白比活性的降低或消除也可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)完成。此類方法可包括對(duì)根據(jù)SEQIDN0:9的基因(的部分)的突變(例如，插入、缺失或點(diǎn)突變)。這可例如影響與DNA的相互作用(其通過(guò)根據(jù)SEQIDNO:IO的蛋白質(zhì)的N端區(qū)介導(dǎo))或與其它效應(yīng)子分子的相互作用。本領(lǐng)域中還已知可以通過(guò)將根據(jù)SEQIDNO:IO的蛋白質(zhì)與特定抑制子相接觸或與能與所述蛋白質(zhì)發(fā)生特異性相互作用的其它物質(zhì)相接觸，來(lái)降低或消除給定蛋白質(zhì)活性。為鑒定出此類特定抑制子，可表達(dá)所述蛋白質(zhì)，并對(duì)存在懷疑能抑制所述蛋白質(zhì)活性的化合物時(shí)的活性加以測(cè)試。可能的抑制化合物可以是例如針對(duì)所述蛋白質(zhì)的單克隆或多克隆抗體。這類抗體可以通過(guò)適當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的常規(guī)免疫方案獲得。根據(jù)本發(fā)明的另一目的，提供了本文定義的多核苷酸或者已用此類多核苷酸進(jìn)行過(guò)遺傳工程改造的微生物在生產(chǎn)維生素C中的用途。本發(fā)明還涉及在微生物中表達(dá)內(nèi)源基因的工藝，涉及在微生物中生產(chǎn)上文定義的多肽的工藝，以及生產(chǎn)能產(chǎn)生維生素C的微生物的工藝。所有這些工藝都可包含改變微生物的步驟，其中，本文中使用的"改變"包括下述工藝，該工藝以使得發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)能力較之野生型生物有所提高的方式來(lái)進(jìn)行"遺傳改變"或"改變細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或改變用于培養(yǎng)的方法"。本文中使用的"維生素C的提高的產(chǎn)率"表示較之野生型微生物(即，沒(méi)有被遺傳改變的微生物)而言增加至少5%、10%、25%、30%、40%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過(guò)500%。術(shù)語(yǔ)"遺傳工程改造"或"遺傳改變"表示對(duì)活的生物體中遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的科學(xué)改變。這包括生產(chǎn)和使用重組DNA。更特別地，這用于描述來(lái)自天然存在的生物而經(jīng)遺傳工程改造或修飾的生物。遺傳工程改造可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)進(jìn)行，例如，基因替換，基因擴(kuò)增，基因打斷，使用質(zhì)粒、病毒或其它載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染。經(jīng)遺傳修飾的生物，例如，經(jīng)遺傳修飾的微生物通常還被稱作重組生物，例如重組微生物。因此，本發(fā)明可包括(l)除其天然基因(例如編碼SMS37的基因)外還帶有多拷貝所述基因的重組微生物，所述基因由本領(lǐng)域已知的和例如木文所列的技術(shù)通過(guò)遺傳操作所述微生物而被引入，或(2)如上所述被遺傳改造過(guò)的重組微生物，但是其天然不帶有這類基因，如例如編碼SMS37的基因。優(yōu)選地，如本發(fā)明的重組微生物被修飾使得其與野生型微生物相比帶有更多拷貝的編碼SMS37的DNA，特別是通過(guò)用帶有一個(gè)或多個(gè)拷貝編碼SMS37的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，或者將這類編碼SMS37的DNA整合進(jìn)其基因組中來(lái)達(dá)成。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于通過(guò)直接發(fā)酵生產(chǎn)維生素C的工藝。特別地，本發(fā)明提供了用于直接生產(chǎn)維生素C的工藝，所述工藝包括將底物轉(zhuǎn)化為維生素C。若干種底物可在本發(fā)明的工藝(即，用于將給定的底物直接轉(zhuǎn)化為維生素C的工藝，例如上文提到的)中用作為碳源。特別適用的碳源是可以容易地從D-葡萄糖或D-山梨糖醇代謝途徑獲得的那些，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、2-酮基-L-古洛糖酸鹽/酯、D-葡萄糖酸鹽/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯，或2，5-二酮基-葡萄糖酸鹽/酯。優(yōu)選地，底物選自，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮，更優(yōu)選地，選自D-葡萄糖、D-山梨糖醇或L-山梨糖，以及最優(yōu)選地，選自D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮。在涉及使用微生物進(jìn)行上述工藝時(shí)，術(shù)語(yǔ)"底物"和"生產(chǎn)底物"在本文中可互換使用。在本文中用于使用微生物進(jìn)行的上述工藝的培養(yǎng)基可以是用于生產(chǎn)維生素C的任何合適的培養(yǎng)基。典型地，該培養(yǎng)基是包含例如鹽和(多種)底物，并具有一定pH的水性培養(yǎng)基。其中底物被轉(zhuǎn)化為維生素C的培養(yǎng)基也被稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基。本文中使用的"發(fā)酵"或"生產(chǎn)"或"發(fā)酵工藝"可以是利用技術(shù)人員己知的培養(yǎng)基、條件和方案，使用生長(zhǎng)中的細(xì)胞或非生長(zhǎng)中的所謂靜止細(xì)胞，這在適合于將合適的底物轉(zhuǎn)化為想要的產(chǎn)物(例如維生素C)的條件下，使用技術(shù)人員已知的培養(yǎng)基、條件和方案對(duì)所述靜止細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)之后迸行。優(yōu)選地，用靜止細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)維生素C。術(shù)語(yǔ)"直接發(fā)酵"、"直接生產(chǎn)"、"直接轉(zhuǎn)化"等意指微生物能通過(guò)一個(gè)或多個(gè)生物轉(zhuǎn)化步驟將某底物轉(zhuǎn)化為特定的產(chǎn)物，而無(wú)需任何額外的化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。例如，術(shù)語(yǔ)"將D-山梨糖醇直接轉(zhuǎn)化為維生素C"意在描述下述過(guò)程，其中，微生物生產(chǎn)維生素C，并且，其中，D-山梨糖醇作為碳源提供，而無(wú)需中間產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。能直接發(fā)酵維生素C的單種微生物是優(yōu)選的。在允許本文定義的從底物開(kāi)始的此類轉(zhuǎn)化進(jìn)行的條件下培養(yǎng)所述微生物。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，應(yīng)當(dāng)理解，上述微生物還包括此類菌株的具有同樣生理屬性的異名(synonym)或基原異名(basonym)，其如InternationalCodeofNomenclatureofProkaryotes所定義。本文中使用的對(duì)微生物的命名是InternationalCommitteeonSystematicsofProkaryotesandtheBacteriologyandAppliedMicrobiologyDivisionoftheInternationalUnionofMicrobiologicalSocieties官方接受的(在優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的提交日期時(shí))，并被其官方出版物InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology(IJSEM)所公開(kāi)。具體的參考文獻(xiàn)是Urbanceetal.,IJSEM(2001)vol51:1059-1070，以及IJSEM(2001)vol51:1231-1233上的修訂通矢口，其中描述了對(duì)作為Xetogw/簡(jiǎn)'c/ge"/謹(jǐn)vw/gare的G*.axy(ifl朋DSM4025的分類學(xué)上的重新歸類。本文中使用的靜止細(xì)胞指下述微生物的細(xì)胞，所述微生物例如是存活但不能活躍生長(zhǎng)的，或者是以低的比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)的，例如，低于0.02h—1的生長(zhǎng)速率，優(yōu)選地，低于0.01h—1。顯示出上述生長(zhǎng)速率的細(xì)胞被稱為"靜止細(xì)胞模式"。如上所述使用微生物來(lái)進(jìn)行的本發(fā)明的工藝可以以不同的步驟或階段來(lái)進(jìn)行優(yōu)選地，在第一個(gè)步驟(也被稱為步驟(a)或生長(zhǎng)階段)中，于能夠生長(zhǎng)的條件下對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)改變條件來(lái)終止該階段，其中，所述條件改變使得微生物的生長(zhǎng)速率降低，導(dǎo)致靜止細(xì)胞產(chǎn)生，這也被稱為步驟(b)，接著是用(b)的靜止細(xì)胞從底物來(lái)生產(chǎn)維生素C，這也被稱為生產(chǎn)階段。使用微生物的上述工藝中進(jìn)行的生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段可在同樣的容器中進(jìn)行，即，僅有一種容器，或在兩種或更多的不同容器中進(jìn)行，在兩個(gè)階段之間具有可選的分離步驟。可通過(guò)任何合適的手段從細(xì)胞中回收得到產(chǎn)生的維生素C。"回收"指，例如，可將維生素C從生產(chǎn)培養(yǎng)基中分離出來(lái)?？蛇x地，可對(duì)由此產(chǎn)生的維生素C進(jìn)行進(jìn)一步加工。就關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的本發(fā)明的目的而言，術(shù)語(yǔ)"生長(zhǎng)階段"、"生長(zhǎng)步驟"和"生長(zhǎng)時(shí)期"在本文中可互換使用。這同樣適用于"生產(chǎn)階段"、"生產(chǎn)步驟"、"生產(chǎn)時(shí)期"。進(jìn)行本發(fā)明的使用微生物的上述工藝的一種途徑可以是下述工藝，其中微生物生長(zhǎng)于第一容器(所謂的生長(zhǎng)容器)中，它們作為靜止細(xì)胞的來(lái)源，細(xì)胞中的至少一部分被轉(zhuǎn)移到第二容器(所謂的生產(chǎn)容器)中。生產(chǎn)容器中的條件可以是使得從生長(zhǎng)容器中轉(zhuǎn)移出的細(xì)胞變?yōu)樯衔亩x的靜止細(xì)胞的條件。維生素C在第二容器中產(chǎn)生，并從其中被回收。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，在一個(gè)方面，生長(zhǎng)步驟可在水性培養(yǎng)基中進(jìn)行，即，補(bǔ)充有用于在需氧條件下生長(zhǎng)的合適營(yíng)養(yǎng)物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)可以以，例如，分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)時(shí)間可以例如隨所用的宿主、pH、溫度和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基而變化，其可以為例如以分批或補(bǔ)料分批模式進(jìn)行時(shí)，大約IO小時(shí)至大約IO天之間，優(yōu)選為大約l天至大約IO天之間，更優(yōu)選地，大約1至大約5天，這取決于所述微生物。如果細(xì)胞以連續(xù)模式被培養(yǎng)，駐留時(shí)間可以例如為大約2至大約100小時(shí)，優(yōu)選地，大約2至大約50小時(shí)，這取決于所述微生物。如果微生物選自細(xì)菌，培養(yǎng)可進(jìn)行于大約3.0至大約9.0的pH下，優(yōu)選為大約4.0至大約9.0，更優(yōu)選地，大約4.0至大約8.0，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約5.0至大約8.0。如果使用了藻類或酵母，培養(yǎng)可進(jìn)行于低于大約7.0的pH下，優(yōu)選低于大約6.0，更優(yōu)選低于大約5.5，最優(yōu)選地，低于大約5.0。用于使用細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)的合適的溫度范圍可以為，例如，大約13°C至大約40°C，優(yōu)選地，大約18°C至大約37°C，更優(yōu)選地，大約13°C至大約36°C，最優(yōu)選地，大約18°C至大約33°C。如果使用藻類或酵母，用于進(jìn)行培養(yǎng)的合適的溫度范圍可以例如為，大約15°C至大約40°C，優(yōu)選地，大約20°C至大約45°C，更優(yōu)選地，大約25°C至大約40。C，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約25°C至大約38°C，最優(yōu)選地，大約30°C至大約38°C。用于進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基通?？梢院邢率鰻I(yíng)養(yǎng)物作為可被吸收的碳源，例如，甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖和乙醇，優(yōu)選地，L-山梨糖、D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、甘油和乙醇；以及含有可消化的氮源，例如，有機(jī)物質(zhì)，例如，蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。所述培養(yǎng)基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或面包酵母。多種無(wú)機(jī)物質(zhì)也可被用作為氮源，例如，硝酸鹽和銨鹽。此外，生長(zhǎng)培養(yǎng)基通常含有無(wú)機(jī)鹽，例如，硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和碳酸鈣。然后可在與上文所述大致相同的模式、溫度和pH條件下，存在例如D-山梨糖醇、L-山梨糖或D-葡萄糖等底物時(shí)，進(jìn)一步溫育使用上述方案獲得的細(xì)胞，以使得所述細(xì)胞將底物直接轉(zhuǎn)化為維生素C。溫育可在富含氮的培養(yǎng)基中進(jìn)行，培養(yǎng)基中含有，例如，有機(jī)氮源，例如，蛋tl胨、酵母提取物、面包酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液，或無(wú)機(jī)氮源，例如硝酸鹽和銨鹽，這種情況下，細(xì)胞將能夠在產(chǎn)生維生素C的同時(shí)進(jìn)一步生長(zhǎng)?；蛘撸瑴赜稍诘毞Φ呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行，在這種情況下，細(xì)胞將基本不生長(zhǎng)，其將處于靜止細(xì)胞模式，或生物轉(zhuǎn)化模式。在所有情況下，溫育培養(yǎng)基還可含有無(wú)機(jī)鹽，例如硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和氯化鈣。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，在生長(zhǎng)階段中，比生長(zhǎng)速率例如為至少0.02h—1。對(duì)于以分批、補(bǔ)料分批或半連續(xù)模式生長(zhǎng)的細(xì)胞而言，生長(zhǎng)速率取決于，例如，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成、pH、溫度等。通常，生長(zhǎng)速率可以例如在大約0.05至大約0.2h"的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，在大約0.06至大約0.15h"的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地，在大約0.07至大約0.13h—1的范圍內(nèi)。在使用微生物進(jìn)行的上述方法的另一個(gè)方面，可通過(guò)在瓊脂平板(作為生長(zhǎng)容器)上對(duì)個(gè)別微生物進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)提供靜止細(xì)胞，其中使用了基木上相同的條件，例如，如上所述的培養(yǎng)時(shí)間、pH、溫度、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并添加有瓊脂。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，如果生長(zhǎng)和生產(chǎn)階段進(jìn)行于兩種不同的容器中，那么來(lái)自生長(zhǎng)階段的細(xì)胞可被收獲或濃縮，并轉(zhuǎn)移至第二容器(所謂的生產(chǎn)容器)中。該容器可以含有補(bǔ)充有任何適用的生產(chǎn)底物(可通過(guò)細(xì)胞被轉(zhuǎn)化為維生素C)的水性培養(yǎng)基。可通過(guò)任何合適的操作來(lái)收獲或濃縮來(lái)自生長(zhǎng)容器的細(xì)胞，所述操作例如，離心、膜橫流(membranecrossflow)超濾或微濾、過(guò)濾、傾析、絮凝。由此獲得的細(xì)胞還可以以原始培養(yǎng)液的形式從生長(zhǎng)容器轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器中，而不用被收獲、濃縮或洗滌，§卩，以細(xì)胞懸浮液的形式被轉(zhuǎn)移。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞以細(xì)胞懸浮液的形式從生長(zhǎng)容器被轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器，在它們之間沒(méi)有任何洗滌或分離步驟。因此，在使用微生物進(jìn)行的上述工藝的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，上文所述的本發(fā)明方法的步驟(a)和(c)不被任何洗滌和/或分離步驟分開(kāi)。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，如果生長(zhǎng)和生產(chǎn)階段進(jìn)行于同樣的容器中，細(xì)胞可以生長(zhǎng)于適當(dāng)?shù)臈l件下，以達(dá)到理想的細(xì)胞密度，接著用含有生產(chǎn)底物的生產(chǎn)培養(yǎng)基來(lái)替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。此類替換可以例如是，在從容器中收回或收獲上清液的同時(shí)，并以與之相同的速度，將生產(chǎn)培養(yǎng)基補(bǔ)入到容器中。為將靜止細(xì)胞保留于容器中，可以使用用于細(xì)胞回收或駐留的操作，例如，細(xì)胞回收步驟。此類回收步驟，例如包括但不限于如下的方法使用離心機(jī)、過(guò)濾器、超濾步驟的膜橫流微濾、膜反應(yīng)器、絮凝或在合適的多孔、非多孔或聚合物基質(zhì)上的細(xì)胞固定。在轉(zhuǎn)移階段之后，對(duì)容器應(yīng)用下述工藝條件在此條件下，細(xì)胞以如上文定義的靜止細(xì)胞模式存在，并且，生產(chǎn)底物能有效地轉(zhuǎn)化為維生素c。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，用于生產(chǎn)步驟中的生產(chǎn)容器中的水性培養(yǎng)基在下文中被稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基，其可以僅含有將被轉(zhuǎn)化為維生素C的生產(chǎn)底物，或可以含有額外的無(wú)機(jī)鹽，例如，氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀、磷酸鈣和碳酸鈣。生產(chǎn)培養(yǎng)基還可以含有可消化的氮源，例如有機(jī)物質(zhì)，例如，蛋白胨、酵母提取物、尿素、氨基酸和玉米浸出液；以及無(wú)機(jī)物質(zhì)，例如，氨、硫酸銨和硝酸鈉，其濃度為使得細(xì)胞被保持為上文定義的靜止細(xì)胞模式的濃度。培養(yǎng)基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。生產(chǎn)步驟可以，例如，以分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式進(jìn)行。在補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式下，來(lái)自生長(zhǎng)容器和生產(chǎn)培養(yǎng)基的兩種細(xì)胞都可以以合適的補(bǔ)料速率被連續(xù)或間歇地補(bǔ)入到生產(chǎn)容器中?；蛘撸瑑H生產(chǎn)培養(yǎng)基可被連續(xù)或間歇補(bǔ)入到生產(chǎn)容器中，而來(lái)自生長(zhǎng)容器的細(xì)胞被同時(shí)轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器。來(lái)自生長(zhǎng)容器的細(xì)胞可在生產(chǎn)容器中用作為細(xì)胞懸浮液，或者可被用作為例如，在任何固相(例如，多孔或聚合物基質(zhì))上絮凝或固定的細(xì)胞。生長(zhǎng)時(shí)期被定義為從底物進(jìn)入到生產(chǎn)容器中開(kāi)始，到收獲含有維生素C的上清液(即所謂的收獲流)之間的時(shí)期，該時(shí)期可根據(jù)，例如，使用的細(xì)胞的濃度和種類、pH、溫度和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基而變動(dòng)，其優(yōu)選在大約2至大約100小時(shí)之間。pH和溫度可與生長(zhǎng)步驟中的pH和溫度不同，但應(yīng)與生長(zhǎng)步驟中的基本上相同。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，生產(chǎn)步驟可以以連續(xù)模式進(jìn)行，這意味著，含有來(lái)自生長(zhǎng)容器的細(xì)胞的第一種補(bǔ)料流和含有底物的第二種補(bǔ)料流被連續(xù)或間歇補(bǔ)入到生產(chǎn)容器中。第一種流可以僅含有從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離/分開(kāi)的細(xì)胞，或可以含有直接來(lái)自生長(zhǎng)歩驟的細(xì)胞懸浮液，即，懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞，而沒(méi)有任何中間的細(xì)胞分離、洗滌和/或分離步驟。在本文中定義的第二種補(bǔ)料流可以包括生產(chǎn)步驟的操作所需要的所有其它補(bǔ)料流，例如，以一種或多種不同的流的形式存在的包含底物的生產(chǎn)培養(yǎng)基、用于稀釋的水以及用于控制pH的堿。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，當(dāng)兩種流都連續(xù)補(bǔ)料時(shí)，第一種流的補(bǔ)料速率與第二種流的補(bǔ)料速率之比可在大約0.01至大約10之間變動(dòng)，優(yōu)選地，在大約0.01至大約5之間變動(dòng)，最優(yōu)選地，在大約0.02至大約2之間變動(dòng)。該比例取決于第一種和第二種流中各自的細(xì)胞和底物的濃度。進(jìn)行本發(fā)明的使用微生物的上述工藝的另一種途徑可以是在生長(zhǎng)容器中使用一定細(xì)胞密度的靜止細(xì)胞的工藝。通過(guò)技術(shù)人員已知的方法，于600nm處，細(xì)胞密度作為吸收單位(光學(xué)密度)被測(cè)得。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，生產(chǎn)步驟中的細(xì)胞密度為至少大約10，更優(yōu)選地，大約10至大約200之間，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約15至大約200之間，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約15至大約120之間，最優(yōu)選地，大約20至大約120之間。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，為在生產(chǎn)階段期間(例如，20以連續(xù)或半連續(xù)模式進(jìn)行的)，以想要的細(xì)胞密度將細(xì)胞保持于生產(chǎn)容器中，本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何手段都可以使用，例如，通過(guò)離心、過(guò)濾、微濾的膜橫流超濾、傾析、絮凝進(jìn)行的細(xì)胞再利用，通過(guò)膜設(shè)備進(jìn)行的細(xì)胞駐留，或細(xì)胞固定。此外，在生產(chǎn)步驟以連續(xù)或半連續(xù)模式進(jìn)行的情況下，從生長(zhǎng)容器中連續(xù)或間歇補(bǔ)入細(xì)胞，生產(chǎn)容器中的細(xì)胞密度可被保持于恒定的水平，這例如，通過(guò)從生產(chǎn)容器中收獲一定量的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，所述的量對(duì)應(yīng)于從生長(zhǎng)容器中補(bǔ)入的細(xì)胞的量。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，從生產(chǎn)容器中回收/收獲在所謂的收獲流中含有的產(chǎn)生出的維生素C。收獲流可以包括，例如，來(lái)自生產(chǎn)容器的不含細(xì)胞的水溶液或含有細(xì)胞的水溶液，其中含有通過(guò)生產(chǎn)容器中的靜止細(xì)胞從生產(chǎn)底物轉(zhuǎn)化得到的維生素c?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何操作，將仍處于收獲流中的細(xì)胞與維生素C分開(kāi)，例如，過(guò)濾、離心、傾析、膜橫流超濾或微濾、切線流超濾或微濾或死端(deadend)過(guò)濾。在該細(xì)胞分離操作之后，收獲流中基本不含細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的工藝可組合有將產(chǎn)生的維生素C與收獲流中含有的其它組分分離和/或純化的額外步驟，即，所謂的下游加工步驟。這些步驟可包括技術(shù)人員已知的任何手段，例如，濃縮、結(jié)晶、沉淀、吸附、離子交換、電滲析、兩極膜電滲析和/或反滲透。維生素C可作為游離酸形式或其已知的任何鹽的形式被進(jìn)一步純化，這是通過(guò)下述操作手段來(lái)進(jìn)行的，例如，用活性炭進(jìn)行處理、離子交換、吸附和洗脫、濃縮、結(jié)晶、過(guò)濾和干燥。特別地，將維生素C與收獲流中其它組分的第一次分離可通過(guò)例如下述方法的任何合適的組合或重復(fù)來(lái)進(jìn)行，所述方法例如兩區(qū)室或三區(qū)室電滲析、兩極膜電滲析、反滲透或吸附(其進(jìn)行于，例如，離子交換樹(shù)脂上或非離子樹(shù)脂上)。如果獲得的維生素C的形式為L(zhǎng)-抗壞血酸的鹽，將該鹽形式轉(zhuǎn)化為游離酸形式可通過(guò)例如，兩極膜電滲析、離子交換、模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)等來(lái)進(jìn)行。上述步驟的組合也可使用，例如，將電滲析和兩極膜電滲析組合為一個(gè)步驟，以及使用模擬移動(dòng)床色譜方法的多個(gè)離子交換步驟的組合。上述任何方案單獨(dú)或組合就構(gòu)成了用于分離和純化產(chǎn)物(即維生素C)的方便的手段。由此獲得的產(chǎn)物還可被進(jìn)一步分離(例如，通過(guò)濃縮、結(jié)晶、沉淀、對(duì)晶體的洗滌和干燥的方式來(lái)進(jìn)行)和/或進(jìn)一步純化(用活性炭處理、離子交換和/或重結(jié)晶)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)一系列上述下游加工歩驟來(lái)從收獲流中純化維生素C，而不必在該加工中的任何時(shí)刻將其轉(zhuǎn)移到非水性溶液中，即，所有步驟都在水性環(huán)境中進(jìn)行。此類優(yōu)選的下游加工方案可以包括，例如，通過(guò)兩區(qū)室或三區(qū)室電滲析對(duì)來(lái)自生產(chǎn)容器的收獲流進(jìn)行濃縮，通過(guò)兩極膜電滲析和/或離子交換將濃縮溶液中以其鹽的形式存在的維生素C轉(zhuǎn)化為其酸的形式，通過(guò)例如用活性炭、離子交換或非離子樹(shù)脂進(jìn)行處理等方法來(lái)進(jìn)行純化，接著進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮步驟和結(jié)晶。這些晶體可被分離、洗滌和干燥。如果必要的話，晶體還可被重新溶解于水中，用活性炭和/或離子交換樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行處理，并重結(jié)晶。然后可對(duì)上述晶體進(jìn)行分離、洗滌和干燥。本發(fā)明的有利的實(shí)施方式通過(guò)從屬權(quán)利要求而顯而易見(jiàn)。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明的上述和其它方面以及上述和其它實(shí)施方式。通過(guò)對(duì)從G/wcw2oki"erox;^awDSM17078獲得的基因組克隆進(jìn)行測(cè)序，來(lái)測(cè)定包含編碼SMS37蛋白的SEQIDNO:1的核苷酸序列的基因的序列。本發(fā)明還涉及編碼SEQIDNO:2所示的SMS37多肽的至少一個(gè)生物活性片段或衍生物的多核苷酸。本文中使用的"生物活性片段或衍生物"表示保留有與SEQIDNO:2所示的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信號(hào)傳遞活性或抗體反應(yīng)活性。術(shù)語(yǔ)"相同的生物功能"或"功能等同物"在本文中使用時(shí)表示蛋白質(zhì)與SEQIDNO:2所示的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活性、信號(hào)傳遞活性或者抗體反應(yīng)活性。本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以經(jīng)分離的形式提供，優(yōu)選地，被純化至均質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)分離的"表示物質(zhì)被移出其原來(lái)的環(huán)境(例如，如果其天然存在的話，就是天然環(huán)境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是經(jīng)分離的，但與天然系統(tǒng)中的一些或全部共存物質(zhì)分開(kāi)的同樣的多核苷酸或多肽就是經(jīng)分離的。此類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但仍然是經(jīng)分離的，因?yàn)榇祟愝d體或組合物并非其天然環(huán)境的一部分。本文中使用的經(jīng)分離的多核苷酸或核酸可以是這樣的DNA或RNA，它們與從中獲得該多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因組中緊密相鄰的兩條編碼序列(5'末端一條，3'末端一條)并非緊密相鄰。因此，在一種實(shí)施方式中，核酸包括與編碼序列緊密相鄰的5'非編碼(例如，啟動(dòng)子)序列的一些或全部。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)分離的多核苷酸"因此包括，例如，加入到載體中、加入到自主復(fù)制質(zhì)?；虿《局?，或者加入到原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或者作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)分子(例如，通過(guò)PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括是雜合體基因的一部分的重組DNA，所述基因編碼基本不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基(當(dāng)通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí))或化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)(當(dāng)通過(guò)化學(xué)方式合成時(shí))的額外多肽。此外，"經(jīng)分離的核酸片段"是這樣的核酸片段其天然并不作為片段存在，并且將不會(huì)在天然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"基因"和"重組基因"指可與染色體DNA分離開(kāi)的、包括編碼蛋白質(zhì)(例如，G.oxWa/MDSM17078STS蛋白)的開(kāi)放讀碼框的核酸分子。多核苷酸可包括，例如，SEQIDNO:1所示的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或下游的區(qū)域，所述區(qū)域可包括，例如，對(duì)于由其獲得的多肽的適當(dāng)表達(dá)和穩(wěn)定來(lái)說(shuō)重要的啟動(dòng)子區(qū)域、調(diào)控子區(qū)域和終止子區(qū)域?；蚩砂ň幋a序列、非編碼序列(例如，位于基因編碼區(qū)域3'末端和5，末端的非翻譯序列)和調(diào)控序列。此外，基因指本文定義的經(jīng)分離的核酸分子。技術(shù)人員還將理解，導(dǎo)致SMS蛋白氨基酸序列的變化的DNA序列多態(tài)性可存在于禾中群(population)中，例如，G/wco"o6acterox;^ms種群中。SMS37基因中的此類遺傳多態(tài)性可由于天然變異存在于種群的個(gè)體間，或者存在于不同種群的細(xì)胞中。典型地，此類天然變異可導(dǎo)致SMS37基因核苷酸序列中1-5%的變化度。作為天然變異結(jié)果的、并且不會(huì)改變SMS蛋白的功能活性的SMS37中的任何以及全部此類核苷酸變異和由此得到的氨基酸多態(tài)性也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"或"核酸分子"意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA?？墒褂霉押塑账犷愃莆锘蜓苌?例如，肌苷或磷硫酰核苷酸)來(lái)合成核酸。此類寡核苷酸可用于例如，制備具有改變的堿基配對(duì)能力或增加的對(duì)核酸酶的抗性的核酸。本文中提供的序列信息不應(yīng)被狹義理解為需要包括進(jìn)被錯(cuò)誤鑒定的堿基。本文公開(kāi)的特定序列可以很容易地用于從能將給定碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C的重組或非重組微生物(特別是G/"co"okcteroxj^/a朋，優(yōu)選地，G/Mco"oZ>acteroxjY/fl"sDSM17078)中分離出完整基因，隨后可容易地對(duì)該基因進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析，由此鑒定出測(cè)序錯(cuò)誤。除非特別指明，本文中通過(guò)對(duì)DNA分子進(jìn)行測(cè)序來(lái)確定的所有核苷酸序列都是用自動(dòng)DNA測(cè)序儀(測(cè)定的，并且，本文測(cè)定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都是通過(guò)對(duì)按照上文所述測(cè)定的DNA序列進(jìn)行翻譯來(lái)推測(cè)的。因此，如本領(lǐng)域所已知的，對(duì)由該自動(dòng)方法所測(cè)定的任何DNA序列而言，本文所測(cè)定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯(cuò)誤。典型地，通過(guò)自動(dòng)方法測(cè)出的核苷酸序列與被測(cè)序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列至少大約90%同源，更典型地，至少大約95%至至少大約99.9%相同。通過(guò)其它方法，包括本領(lǐng)域內(nèi)公知的人工DNA測(cè)序方法，可對(duì)實(shí)際序列進(jìn)行更為精確的測(cè)定。也如本領(lǐng)域所已知的，測(cè)得的核苷酸序列中較之實(shí)際序列的單個(gè)插入或缺失將會(huì)導(dǎo)致核苷酸序列翻譯中的讀碼框位移，使得從此類插入或缺失的點(diǎn)開(kāi)始，測(cè)得的核苷酸序列編碼的預(yù)計(jì)氨基酸序列完全不同于被測(cè)序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能鑒定出此類被錯(cuò)誤鑒定的堿基，并且知道如何改正此類錯(cuò)誤。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以僅包含本發(fā)明提供的核酸序列(例如，SEQIDNO:1示出的序列)的一部分或片段，例如，可用作為探針或引物的片段(例如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4)或編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的一部分的片段。從對(duì)SMS37基因的克隆測(cè)定的核苷酸序列允許產(chǎn)生被設(shè)計(jì)來(lái)鑒定和/或克隆SMS37家族其它成員以及來(lái)自其它物種的SMS37同源體的探針和引物。典型地，該探針/引物包含基本純化的寡核苷酸，其典型地包含與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大約12或15個(gè)、優(yōu)選大約18或20個(gè)、更優(yōu)選大約22或25個(gè)、進(jìn)一步更優(yōu)選大約30、35、40、45、50、55、60、65或75個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸雜交(優(yōu)選地，在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交)的核苷酸序列區(qū)域。還可通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用基于本文含有的序列信息設(shè)計(jì)的合成寡核苷酸引物，分離出包含SEQIDNO:1的核苷酸序列的全部或一部分的核酸分子?？砂凑諛?biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，來(lái)擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過(guò)DNA序列分析加以表征。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段還可包含不編碼功能多肽的多核苷酸。此類多核苷酸可作為探針或引物用于PCR反應(yīng)。不管其編碼功能或非功能多肽，根據(jù)本發(fā)明的核酸都可用作為雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有SMS37活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途包括(1)從cDNA文庫(kù)(例如來(lái)自除G/wo"oZ^"eroxj^few外的其它生物)分離編碼本發(fā)明蛋白的基因或其等位變體，以及(2)用于探測(cè)特定細(xì)胞中所述蛋白的mRNA的表達(dá)的Northern印跡分析，或(3)用于增強(qiáng)和/或提高同源SMS37基因在所述其它生物中的功能或活性?；诒疚奶峁┑暮塑账嵝蛄械奶结樋捎糜跈z測(cè)編碼同樣或同源蛋白(例如，其它生物中的)的轉(zhuǎn)錄本或基因組序列?？苫谄渑c本文公開(kāi)的G.xqy^msSMS37核酸的同源性，使用G.DNA或其一部分作為雜交探針，按照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，分離出對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的G.xo_y^"sSMS37DNA的天然變體或非G.qy^朋同源體的核酸分子，它們也包括在本發(fā)明內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，探針還包含與其附著的標(biāo)記基團(tuán)，例如，標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶的輔助因子。例如，可使用基于本文教導(dǎo)的核苷酸序列設(shè)計(jì)的兩套簡(jiǎn)并寡核苷酸引物庫(kù)，進(jìn)行PCR來(lái)分離同源基因序列。用于反應(yīng)的模板可以是通過(guò)對(duì)從已知能表達(dá)或懷疑能表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的菌株制備的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。PCR產(chǎn)物可被亞克隆及測(cè)序，以確保擴(kuò)增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通過(guò)多種已知方法，用PCR片段分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，可標(biāo)記擴(kuò)增出的片段，用其篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫(kù)。或者，經(jīng)標(biāo)記的片段可用于篩選基因組文庫(kù)。PCR技術(shù)還可用于從其它生物分離全長(zhǎng)cDNA。例如，可按照標(biāo)準(zhǔn)方案，從合適的細(xì)胞或組織來(lái)源分離RNA。可在RNA上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中使用與擴(kuò)增片段的5'最末端具有特異性的寡核苷酸引物，以引導(dǎo)第一鏈合成。然后可使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，對(duì)得到的RNA/DNA雜交體"加尾"(例如，用鳥(niǎo)嘌呤)，可用RNaseH消化雜交體，然后可(例如，用poly-C引物)引導(dǎo)第二鏈合成。由此，可容易地分離擴(kuò)增的片段上游的cDNA序列。關(guān)于有用的克隆策略的綜述，參見(jiàn)，例如上文所述的Sambrooketal.禾口上文所述的A畫(huà)beletal.。此外，編碼SMS37家族其它成員、具有與根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，編碼來(lái)自其它物種的SMS37蛋白、具有與SEQIDNO:1示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的多核苷酸，其可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下(優(yōu)選地，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下)與本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQIDNO:1所示的多核苷酸)雜交。有利地，此類多核苷酸可從能將給定的碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C的今敫生物(牛寺另U是G/wco"oZ)acteroxj^fa"5，優(yōu)選地，G/wco"c^acterDSM17078)中獲得。本文中用到的術(shù)語(yǔ)"雜交"被用來(lái)描述雜交和洗滌，在所述雜交和洗滌條件下，典型地，互相之間同源性為至少約50%、至少約60%、至少約70%、更優(yōu)選為至少約80%、進(jìn)一步優(yōu)選為至少約85%到90%、最優(yōu)選為至少95%的核苷酸序列保持相互雜交的狀態(tài)。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸與SEQIDNO:1所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源。此類嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制的例子是在6x氯化鈉/擰檬酸鈉(SSC)中，大約45。C下雜交，隨后在lxSSC、0.1。/。SDS中，50°C下進(jìn)行一次或多次洗滌，洗滌優(yōu)選在55。C下，更優(yōu)選在60。C下，進(jìn)一歩優(yōu)選在65。C下進(jìn)行。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括使用經(jīng)標(biāo)記的DNA探針(例如，用地高辛(DIG)標(biāo)記的DNA探針)在42。C溫育數(shù)天(例如2-4天)，接著在2xSSC禾B0.1%SDS中于室溫下洗一次或多次，以及在65-68°C，于0.5xSSC和0.1%SDS或0.1xSSC和0.1%SDS中洗一次或多次。特別地，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括，例如，在溶液中，例如含或不含100Mg/ml的鮭魚(yú)精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnosticsGmbH)中，或包含50%甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM擰檬酸三鈉)、0.02%十二烷基磺酸鈉、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封閉試劑(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，使用地高辛(DIG)標(biāo)記的DNA探針(例如通過(guò)用RocheDiagnosticsGmbH,68298Mannheim,Germany的DIG標(biāo)記系統(tǒng)來(lái)制備的)在42。C溫育2小時(shí)至4天，接著在2xSSC和0.1%SDS中，于室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然后在65-68。C，于0.5xSSC和0.1。/。SDS或0.1xSSC和0.1%SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。優(yōu)選地，與本發(fā)明的核苷酸序列雜交(優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交)的本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。本文中使用的"天然存在的"核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，編碼天然蛋白質(zhì))。在一種實(shí)施方式中，核酸編碼天然的G.歸SMS37蛋白。技術(shù)人員知道何種條件適合用于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件及高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。本領(lǐng)域中易于獲得關(guān)于此類條件的其它指導(dǎo)，例如，在Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;禾口Ausubeletal.(eds.)，1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。當(dāng)然，僅與poly(A)序列(例如mRNA的3'末端poly(A)區(qū))或僅與T(或U)殘基的互補(bǔ)性延伸區(qū)段(stretch)雜交的多核苷酸將不會(huì)被包括在用于與本發(fā)明核酸的一部分特異性雜交的本發(fā)明多核苷酸中，因?yàn)榇祟惗嗪塑账釋⑴c任何含有poly(A)延伸區(qū)段的核酸分子或其互補(bǔ)序列(例如，實(shí)際上是任何雙鏈的cDNA克隆)雜交。采用典型手段，可以對(duì)從其它生物，例如能將給定碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C的微生物(特別是其它G/Mco"0^cter物種)構(gòu)建的DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。例如，可以通過(guò)Southern和/或Northern印跡分析來(lái)對(duì)G/wco"o6acter的菌株進(jìn)行篩選。在探測(cè)到與本發(fā)明多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄本之后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，由分離自合適菌株的RNA來(lái)構(gòu)建cDNA文庫(kù)?；蛘?，可以使用能與本發(fā)明多核苷酸雜交的探針來(lái)對(duì)全基因組DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)以及本文提供的序列信息，來(lái)分離本發(fā)明的核酸序列，例如SEQIDNO:1所示的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如，Sambrook,J.,Fritsh,E.F.，和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989所述)，使用SEQIDNO:1所示的核酸分子的全部或一部分作為雜交探針，分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。此外，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)(例如，使用自動(dòng)DNA合成儀)來(lái)制備對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的核苷酸序列的寡核苷酸或可與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)"同源性"或"相同性百分比"在本文中可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，在此定義為確定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的相同性百分比，本著最優(yōu)比較的目的(例如，可以在第一條氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以與第二條氨基酸序列或核苷酸序列達(dá)到最佳的比對(duì))，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。然后對(duì)相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。如果第一條序列上某位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二條序列上相應(yīng)位置的相同，那么這些分子在此位置就是相同的。兩條序列間的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，%相同性=相同位置的數(shù)量/位置(即重疊位置)總數(shù)X100)。優(yōu)選地，這兩條序列長(zhǎng)度相同。技術(shù)人員會(huì)知道有若干計(jì)算機(jī)程序可被用于確定兩條序列間的同源性。例如，可以使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成對(duì)序列的比對(duì)和對(duì)兩條序列間相同性百分比的確定。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法來(lái)確定兩條氨基酸序列間的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG軟件包(可從http:〃www.accelrys.com獲得)的GAP程序中，其中使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，缺口權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4，長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到上述的所有不同參數(shù)將導(dǎo)致有細(xì)微區(qū)別的結(jié)果，但是使用不同算法時(shí)兩條序列的總體％相同性不會(huì)有顯著改變。在又一種實(shí)施方式中，使用GCG軟件包(可從h加:〃www.accdrvs.com獲得)的GAP程序來(lái)確定兩條核苷酸序列間的相同性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩陣，缺口權(quán)重為40、50、60、70或80，長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在另一種實(shí)施方式中，使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4:11-17(1989))的算法來(lái)確定兩條氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2.0版)(可從http:〃vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi獲f尋)中，其中使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長(zhǎng)度懲罰(penalty)為12，缺口懲罰為4。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步地被用作"査詢序列"來(lái)進(jìn)行針對(duì)公眾數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，例如，去鑒定相關(guān)序列或家族中其它成員?？梢允褂肁ltschul，etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)來(lái)進(jìn)行此類搜索?？梢杂肂LASTN程序，以分?jǐn)?shù)=100，字長(zhǎng)(wordlength)=12來(lái)進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肂LASTX程序，以分?jǐn)?shù)=50，字長(zhǎng)=3來(lái)進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。本著比較的目的，為獲得有缺口的比對(duì)，可以利用Altschuletal.，(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中描述的GappedBLAST。當(dāng)利用BLAST禾卩GappedBLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如BLASTX禾口BLASTN)的缺省參數(shù)。見(jiàn)http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含是本發(fā)明的核苷酸序列(例如，SEQIDNO:1所示的序列)的互補(bǔ)序列的核酸分子。與本文公開(kāi)的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是這樣的序列其與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列足夠互補(bǔ)，從而其可與所述核苷酸序列雜交，由此形成穩(wěn)定的雙鏈體(duplex)。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，SEQIDNO:1所示的本發(fā)明的核酸或其互補(bǔ)序列含有至少一處突變，所述突變導(dǎo)致基因產(chǎn)物具有經(jīng)修飾的功能/活性。所述至少一處突變可通過(guò)本文所述的方法引入。在一個(gè)方面，所述至少一處突變導(dǎo)致產(chǎn)生這樣的SMS37蛋白其功能和/或活性較之野生型副本而言有所增強(qiáng)或提高。用于引入此類突變的方法是本領(lǐng)域公知的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)一一活性的"增加"包括增加生產(chǎn)生物中一種或多種多肽的活性，所述多肽是本文所述的相應(yīng)的多核苷酸編碼的。本領(lǐng)域中可獲得用于增加給定蛋白(在本文的情況下是SMS37蛋白)活性的多種方法。通常，可增加蛋白質(zhì)的比活性或者可以增加蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)。術(shù)語(yǔ)"增加活性"或者等同的表達(dá)方式還包括下述情形其中，SMS37蛋白活性被引入以前不含該活性的細(xì)胞，這例如通過(guò)將編碼SMS37的基因引入以前不含該基因等同物的細(xì)胞或以前不能表達(dá)相應(yīng)蛋白的活性形式的細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。為協(xié)助這種增加，對(duì)應(yīng)于本文所述多核苷酸的基因的拷貝數(shù)可被增加。或者，可使用強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)多核苷酸的表達(dá)。在另一種實(shí)施方式中，基因的啟動(dòng)子、調(diào)控區(qū)域和/或核糖體結(jié)合位點(diǎn)可被改變，以增加表達(dá)。還可以通過(guò)增加信使RNA的相對(duì)半壽期來(lái)增強(qiáng)或強(qiáng)加表達(dá)。在另一種實(shí)施方式中，還可以通過(guò)在多肽氨基酸序列中利用能增加活性的一處或多處突變來(lái)增加多肽自身的活性。例如，改變多肽與其相應(yīng)底物的親和性可導(dǎo)致活性提高。類似地，可增加肽的相對(duì)半壽期。在基因表達(dá)增強(qiáng)或者比活性增加的情況下，可通過(guò)改變細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或用于培養(yǎng)的方法來(lái)達(dá)成這種提高。本文中使用的"增強(qiáng)的表達(dá)"或"提高的活性"表示較之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被增強(qiáng)和/或提高之前存在的蛋白的活性和/或濃度而言，至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過(guò)500%的增加。還可通過(guò)將蛋白與其活性的特異性或一般性增強(qiáng)劑相接觸來(lái)增加SMS37蛋白的活性。本發(fā)明的另一方面涉及載體，所述載體含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸或其功能等同物或一部分。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)"載體"指能運(yùn)送連接到其上的另一個(gè)核酸分子的核酸分子。一種載體類型是"質(zhì)粒"，"質(zhì)粒"指環(huán)狀的雙鏈DNA環(huán)，另外的DNA片斷可以連接到所述的環(huán)上。另一種載體的類型是病毒載體，其中，另外的DNA片斷可以連接到病毒基因組中。某些載體能在其被引入的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體)。其它載體在被引入宿主細(xì)胞之后就被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，因此它們與宿主基因組一同復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)可操作地連接到其上的基因的表達(dá)。此類載體在本文中被稱為"表達(dá)載體"。一般而言，在重組DNA技術(shù)中用到的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本文中術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"和"載體"可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用到的載體形式。然而，本發(fā)明也將包括其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們能提供等同的功能。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸，所述核酸存在的形式適合于該核酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，這意味著該重組表達(dá)載體包括一段或多段調(diào)控序列，所述調(diào)控序列是基于將用于表達(dá)的宿主細(xì)胞來(lái)選擇的，其被可操作地連接到將要表達(dá)的核酸序列上。在重組表達(dá)載體中，"可操作地連接"被用來(lái)表示人們感興趣的核苷酸序列被連接到調(diào)控序列上，所述的連接以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中表達(dá)，或者當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，在該宿主細(xì)胞中的表達(dá))的方式進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控序列"將包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如，弱化子)。例如，在Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中對(duì)此類調(diào)控序列進(jìn)行了描述。調(diào)控序列包括在很多種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的調(diào)控序列，也包括僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的調(diào)控序列(例如，組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，對(duì)表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可能取決于以下因素例如對(duì)將被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，期望獲得的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被引入宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，其包括但不限于本文所述的核酸編碼的突變體蛋白、其片段、其變體或功能等同物以及融合蛋白，例如，SMS37蛋白、SMS37蛋白的突變體形式、融合蛋白為了在合適的微生物中表達(dá)SMS37蛋白，可對(duì)本發(fā)明的重組表達(dá)載體加以設(shè)計(jì)。例如，根據(jù)本發(fā)明的蛋白可在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，例如，在屬發(fā)明中有用的表達(dá)載體包括源自染色體、游離體和病毒的載體，例如源自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體的載體和源自上述物質(zhì)的組合的載體，例如源自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。DNA插入應(yīng)當(dāng)被可操作地連接到合適的啟動(dòng)子上，啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。技術(shù)人員知道如何選擇合適的啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體可以含有用于轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點(diǎn)，還可在轉(zhuǎn)錄區(qū)域含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以用于翻譯。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分可優(yōu)選包括處于起點(diǎn)的起始密碼子，以及恰當(dāng)?shù)囟ㄎ挥诖g的多肽末尾的終止密碼子。可通過(guò)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入合適的宿主細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"、"轉(zhuǎn)橋聯(lián)(transconjugation)"和"轉(zhuǎn)染"意指本領(lǐng)域內(nèi)已知的、用于將外源核酸(例如DNA)引入到宿主細(xì)胞中的多種技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的合適方法可在Sambrook,etal.(上文所述的)，Davisetal..BasicMethodsinMolecularBiology(1986)及其它實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中找到。為對(duì)已將外源DNA整合進(jìn)它們基因組的細(xì)胞進(jìn)行鑒定和選擇，通常，將編碼選擇標(biāo)記(例如，對(duì)抗生素的抗性)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括賦予對(duì)藥物(例如卡納霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素和鏈霉素)抗性的那些。編碼選擇標(biāo)記的核酸優(yōu)選在與編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的載體相同的載體上引入宿主細(xì)胞，或者其可在單獨(dú)的載體上引入，該載體例如是自殺性載體，其不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制?？赏ㄟ^(guò)藥物選擇鑒定出經(jīng)過(guò)引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，已合并有選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞會(huì)死亡)。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的多肽，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或可通過(guò)在合適的宿主中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列)獲得的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的多肽可僅含對(duì)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代，或?qū)Ψ顷P(guān)鍵氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非關(guān)鍵氨基酸是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中可被改變、且不會(huì)對(duì)生物功能造成實(shí)質(zhì)性影響的殘基。例如，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間保守的氨基酸殘基被預(yù)計(jì)為對(duì)改變特別不敏感。此外，在根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)和其它SMS37蛋白之間保守的氨基酸也對(duì)改變不太敏感。術(shù)語(yǔ)"保守取代"用于表示下述取代，其中，氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基所取代。這些家族是本領(lǐng)域已知的，其包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氮酸)、帶beta支鏈側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。如上所述，本發(fā)明的多核苷酸可用于對(duì)合適的宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造，使其在發(fā)酵中更好且更有效，例如，在對(duì)維生素c的直接發(fā)酵工藝中更好且更有效。根據(jù)本發(fā)明，提供了經(jīng)遺傳工程改造/重組產(chǎn)生的宿主細(xì)胞(也被稱為重組細(xì)胞或經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞)，其攜帶有此類經(jīng)修飾的多核苷酸，其中，相連的蛋白的功能較之野生型細(xì)胞而言被顯著修飾，使得對(duì)一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物(例如維生素c)的生產(chǎn)的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率被提高。宿主細(xì)胞可選自能從給定的碳源直接生產(chǎn)一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物(例如維生素C)的微生物，特另U是G7wcowoZ^c^oxj^ms1，優(yōu)選地，G.，(ia似DSM17078。"經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞"或"重組細(xì)胞"是已通過(guò)重組DNA技術(shù)向其(或其祖先細(xì)胞)中引入了根據(jù)本發(fā)明的核酸的細(xì)胞，或者是其中SMS37蛋白的活性已被增加和/或增強(qiáng)的細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括能生產(chǎn)給定發(fā)酵產(chǎn)物(例如，能將給定碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C)的微生物的細(xì)胞。特別地，其包括來(lái)自、尸朋toea、^&c/ze".c/n'a、Co/^"e6"cten'wm、尺efc^w/om'c/gem'wm屬的菌株，以及乙酸纟田菌，例如G7wco"o^cter、JC6foZ)aC6^或G/Mcowacgfo^aCg^，^尤選i也，Jcgfo^aCgrs;.、JceZoZ)ac,6rAa〃aw(i/ci、G7wcowc^c!C/^o"(ia/M，更優(yōu)選地，G.oxj^似，最優(yōu)選地，G.ax;_yAwwDSM17078。還可通過(guò)修飾SMS37基因獲得提高的基因表達(dá)，例如，通過(guò)將一處或多處突變引入SMS37基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中，所述突變導(dǎo)致較之野生型蛋白而言功能顯著提高的SMS37蛋白。因此，在另一種實(shí)施方式中，從SEQIDNO:l所示的多核苷酸或其等同物獲得攜帶至少一處突變的多核苷酸。本文中使用的突變可以是導(dǎo)致功能更強(qiáng)或更穩(wěn)定的多肽(例如，功能更強(qiáng)或更穩(wěn)定的SMS37基因產(chǎn)物)的任何突變。這可包括，例如，在微生物基因組中的下述改變其提高了SMS37的合成，或者導(dǎo)致SMS37蛋白以改變的氨基酸序列表達(dá)，該改變使得該蛋白的功能較之具有未被改變的氨基酸序列的野生型副本而言被提高和/或增強(qiáng)。提高可在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平或翻譯后水平上發(fā)生。微生物基因組中的改變可例如通過(guò)單交叉重組或雙交叉重組用含有改變的DNA序列替換野生型DNA序列來(lái)進(jìn)行。為了能方便地選擇出基因組被改變的微生物轉(zhuǎn)化子，該改變可以例如是編碼抗生素抗性基因的DNA序列，或者編碼補(bǔ)足微生物可能的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的基因的DNA序列。突變可包括但不限于缺失-插入突變。還可通過(guò)下述方法獲得微生物基因組中導(dǎo)致功能更強(qiáng)的多肽的改變使用例如化學(xué)誘變劑、輻射或轉(zhuǎn)座子對(duì)微生物基因組進(jìn)行隨機(jī)誘變，以及選擇或篩選出是一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物的更好的或更有效的生產(chǎn)菌株的突變體。用于篩選和選擇的標(biāo)準(zhǔn)方法是技術(shù)人員已知的。在一種特定實(shí)施方式中，人們需要敲除或遏制本發(fā)明SMS37基因的抑制子，即，其中，當(dāng)引入合適的宿主細(xì)胞時(shí)，其抑制子基因的表達(dá)被人工遏制，以提高對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供攜帶此類被遏制基因的微生物的方法是本領(lǐng)域公知的?？赏ㄟ^(guò)缺失掉抑制子基因或其調(diào)控區(qū)域的至少一部分，來(lái)誘導(dǎo)對(duì)抑制子基因的遏制。本文中使用的"對(duì)基因表達(dá)的遏制"包括完全和部分遏制，以及在特定條件下的遏制，還包括對(duì)兩個(gè)等位基因中任何一個(gè)的表達(dá)的遏制。用于SMS37蛋白的上述誘變策略可導(dǎo)致想要的化合物(特別是維生素C)的產(chǎn)率增加。這些策略的列出并不意味著限制；對(duì)這些誘變策略的變化對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的?？赏ㄟ^(guò)這些機(jī)制，用本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生出微生物，例如表達(dá)經(jīng)突變SMS37核酸和蛋白分子的G/Mco"okzcteroxy&M或細(xì)菌的相關(guān)菌株，使得對(duì)想要的化合物(例如維生素C)的生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或產(chǎn)量被提高。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的一個(gè)方面，本發(fā)明的工藝導(dǎo)致維生素C的產(chǎn)率通常為至少約高于5.7g/1，例如，10g/1、20g/1、50g/1、100g/l、200g/l、300g/l、400g/l或者超過(guò)600g/l。在一種實(shí)施方式中，通過(guò)本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率在大約高于5.7g/l至大約600g/1的范圍內(nèi)。維生素C的產(chǎn)率指直接來(lái)自生產(chǎn)容器的收獲流(即包含維生素C的不含細(xì)胞上清液)中維生素C的濃度。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了能從合適的碳源(例如D-山梨糖醇和/或L-山梨糖)直接生產(chǎn)維生素C的微生物(特別是G/wco"Wflcter、G/wco"flc"o^cfer禾B爿cetoZ^cter屬的)。當(dāng)例如以靜止細(xì)胞方法在20小時(shí)的溫育期之后測(cè)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些生物能以分別高至280mg/l和670mg/1的水平從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)維生素C。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了下述微生物，當(dāng)從D-山梨糖醇起始時(shí)，其能以300mg/l或更多的量直接生產(chǎn)維生素C，或者當(dāng)從L-山梨糖起始時(shí)，其能以800mg/1或更多的量直接生產(chǎn)維生素C，所述的量是例如以靜止細(xì)胞方法在20小時(shí)的溫育期之后測(cè)量的。這可以通過(guò)增加STS多肽(優(yōu)選地，SMS37多肽)的活性來(lái)獲得。從D-山梨糖醇產(chǎn)生的維生素C的產(chǎn)率甚至可以高達(dá)400、600、1000mg/1，或者甚至超過(guò)1.5、2、4、10、20、50g/1。從L-山梨糖產(chǎn)生的維生素C的產(chǎn)率甚至可以高達(dá)1000mg/1，或者甚至超過(guò)1.5、2、4、10、20、50g/1。優(yōu)選地，維生素C的這些量可以是例如以靜止細(xì)胞方法在20小時(shí)的溫育期之后測(cè)量獲得的。本文中使用的以"靜止細(xì)胞方法"進(jìn)行的測(cè)量包括(i)通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法培養(yǎng)細(xì)胞，(ii)從生長(zhǎng)培養(yǎng)基收獲細(xì)胞，以及(iii)在含有將被轉(zhuǎn)化為想要的產(chǎn)物(例如維生素C)的培養(yǎng)基中，于其中細(xì)胞不再生長(zhǎng)的條件下，溫育收獲的細(xì)胞(即，在該所謂的轉(zhuǎn)化步驟期間，生物質(zhì)沒(méi)有量上的增加)。攜帶有例如經(jīng)修飾的SMS37基因并且能以顯著更高的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或效率生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的重組微生物可在上文所述的需氧條件下被培養(yǎng)于補(bǔ)充有合適營(yíng)養(yǎng)物的水性培養(yǎng)基中。本文所述的核酸分子、多肽、載體、引物和重組微生物可用于下述方法中的一種或多種鑒定G/wco"okz"eroxj^ww以及相關(guān)的生物；繪制與G/wco"Wacferoj^^""s相關(guān)的生物的基因組圖譜；對(duì)感興趣的G/MCW20Z>acterOJ9^flM序列進(jìn)行鑒定和定位；進(jìn)化研究；測(cè)定功能所需的SMS37蛋白區(qū)域；調(diào)節(jié)SMS37蛋白活性或功能；調(diào)節(jié)RCS途徑的活性；以及調(diào)節(jié)對(duì)想要的化合物(例如，維生素C)的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)。本發(fā)明提供了篩選能調(diào)節(jié)SMS37蛋白活性的分子的方法，這種調(diào)節(jié)或者通過(guò)與蛋白本身或底物或SMS37蛋白的結(jié)合伴侶的相互作用或者通過(guò)調(diào)節(jié)本發(fā)明的SMS37核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯來(lái)實(shí)現(xiàn)。在此類方法中，將表達(dá)一種或多種本發(fā)明的SMS37蛋白的微生物與一種或多種測(cè)試化合物接觸，并評(píng)估每種測(cè)試化合物對(duì)于SMS37蛋白表達(dá)水平或活性的影響?？赏ㄟ^(guò)技術(shù)人員公知的方法來(lái)測(cè)定SMS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如在存在其底物、電子受體或供體(包括吩嗪硫酸甲酯(PMS)、二氯苯酚』引哚苯酚(DCIP)、NAD、NADH、NADP、NADPH，可通過(guò)光度、色度或熒光方法對(duì)其消耗進(jìn)行直接或間接測(cè)量)以及其它可能與活性的發(fā)展相關(guān)的無(wú)機(jī)組分的情況下，溫育含有SMS蛋白的膜級(jí)分(membranefraction)。因此，例如，可在下述試驗(yàn)中測(cè)量與膜結(jié)合的D-山梨糖醇脫氫酶的活性，所述試驗(yàn)中，在存在pH6的磷酸鹽緩沖液、D-山梨糖醇和人工電子受體DCIP和PMS的情況下，溫育含有該酶的膜級(jí)分。可在600nm處測(cè)量DCIP的消耗速率，其與膜級(jí)分中存在的D-山梨糖醇脫氫酶活性直接成正比。在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如輸入蛋白、共輸送蛋白或輸出蛋白)的情況下，這類SMS蛋白質(zhì)的活性可以通過(guò)技術(shù)人員公知的方法測(cè)量，例如通過(guò)將含SMS蛋白的膜級(jí)分與放射性標(biāo)記的糖或糖醇(其能夠被SMS蛋白主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn))一起孵育。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性與(l)摻入細(xì)胞群中的放射性量(如果SMS蛋白涉及糖或糖醇進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn))，或(2)在細(xì)胞質(zhì)外進(jìn)入周質(zhì)/細(xì)胞外環(huán)境所累積的放射性的量(如果SMS蛋白涉及糖或糖醇如山梨糖酮向細(xì)胞質(zhì)外的輸出)直接成比例。因此，例如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性可以在下述實(shí)驗(yàn)中測(cè)量，所述實(shí)驗(yàn)在存在pH為6的磷酸鹽緩沖液和放射性標(biāo)記的碳源(例如葡萄糖、半乳糖或山梨糖酮)時(shí)孵育含有特異轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的完整細(xì)胞。如果測(cè)量從外界進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞對(duì)放射性碳源(如葡萄糖、半乳糖或山梨糖酮)的同化率可以通過(guò)技術(shù)人員已知的方法測(cè)量，并與存在于膜級(jí)分中的SMS蛋白活性直接成比例話。在輸出蛋白的情況下，也可產(chǎn)生反轉(zhuǎn)的膜，例如膜內(nèi)側(cè)外翻(inside-out)的小囊泡，并如上所述測(cè)量放射性的吸收。測(cè)量輸出蛋白(如SMS37)活性的另一方法可以是通過(guò)測(cè)定細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生、但是需要由所述輸出蛋白輸出到周質(zhì)或細(xì)胞外環(huán)境中的化合物(例如山梨糖酮)的細(xì)胞外水平，并將該水平與不存在排出系統(tǒng)的狀況(例如敲除突變體，其中編碼所述輸出蛋白的基因不再有活性，從而細(xì)胞外水平可下降)進(jìn)行比較。相反，這類編碼所述輸出蛋白的基因的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致化合物(如山梨糖酮)的細(xì)胞外水平提高。從上述描述中可顯而易見(jiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法的發(fā)酵產(chǎn)物可不僅限于維生素c。本文中使用的"想要的化合物"或"發(fā)酵產(chǎn)物"可以是G/wco"o^cter的任何天然產(chǎn)物，其包括生物合成途徑的終產(chǎn)物和中間產(chǎn)物，例如，L-山梨糖、L-山梨糖酮、D-葡萄糖酸鹽/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯、5-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯、2，5-二酮基-葡萄糖酸鹽/酯禾口2-酮基-L-古洛糖酸鹽/酯(2-KGA)，特別是對(duì)維生素C的生物合成生產(chǎn)。因此，本發(fā)明涉及本文所述的多核苷酸、多肽、載體、引物和重組微生物在生產(chǎn)維生素C(即將碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C)中的用途。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文所述的經(jīng)修飾的多核苷酸、多肽、載體和重組微生物用于提高對(duì)維生素C生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或效率。術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)量"或"生產(chǎn)能力"是本領(lǐng)域已知的，其包括給定的時(shí)間和給定的發(fā)酵體積中形成的發(fā)酵產(chǎn)物(例如維生素C)的濃度(例如，每升每小時(shí)的kg產(chǎn)物)。術(shù)語(yǔ)"生產(chǎn)效率"包括獲得的特定水平的生產(chǎn)所需要的時(shí)間(例如，細(xì)胞達(dá)到發(fā)酵產(chǎn)物的特定速率輸出所需時(shí)間有多長(zhǎng))。術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)率"是本領(lǐng)域已知的，其包括碳源向產(chǎn)物(例如，維生素C)轉(zhuǎn)化的效率。這通常寫(xiě)作，例如，kg產(chǎn)物/kg碳源。"增加"化合物的"產(chǎn)率禾口/或產(chǎn)量和/或生產(chǎn)能力"表示，給定的時(shí)間中給定量的培養(yǎng)物中回收的該化合物分子或回收的該化合物有用分子的量增加。術(shù)語(yǔ)"生物合成"或"生物合成途徑"是本領(lǐng)域己知的，其包括通過(guò)細(xì)胞，以可能是多步驟且被高度調(diào)控的過(guò)程，從中間產(chǎn)物化合物對(duì)化合物(優(yōu)選地，有機(jī)化合物)的合成。措辭"代謝"是本領(lǐng)域已知的，其包括對(duì)生物中發(fā)生的生化反應(yīng)的總稱。然后，特定化合物的代謝(例如，氨基酸(例如甘氨酸)的代謝)包含細(xì)胞中與該化合物相關(guān)的總的生物合成、修飾和降解途徑。措辭"轉(zhuǎn)運(yùn)"或"輸入"是本領(lǐng)域已知的，其包括一種或多種分子在協(xié)助下移動(dòng)經(jīng)過(guò)該分子本來(lái)不能經(jīng)過(guò)或不能高效經(jīng)過(guò)的細(xì)胞膜。本文中使用的維生素C可以是水溶液中發(fā)現(xiàn)的L-抗壞血酸的任何化學(xué)形式，例如未離解的、以其游離酸形式存在的或離解為陰離子的。L-抗壞血酸的溶解的鹽形式的特征為在通常發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵上清液中的任何種類的陽(yáng)離子(例如，鉀、鈉、銨或鈣)存在時(shí)的陰離子。還包括在內(nèi)的可以有L-抗壞血酸的游離酸形式的經(jīng)過(guò)分離的晶體。另一方面，用其相應(yīng)的鹽的名稱來(lái)命名L-抗壞血酸的鹽形式的經(jīng)過(guò)分離的晶體，即抗壞血酸鈉、抗壞血酸鉀、抗壞血酸鈣等。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)維生素C的方法，其中，將根據(jù)本發(fā)明的核苷酸或上文所述的經(jīng)修飾多核苷酸序列引入合適的微生物，在允許以高生產(chǎn)能力、產(chǎn)率和/或效率生產(chǎn)維生素C的條件下培養(yǎng)重組微生物，從培養(yǎng)基中分離產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物，以及可選地，進(jìn)一步純化。合適的宿主微生物可選自例如G.oxj^朋sDSM17078、G.o砂Jfl似IFO3293、G.oxj^g似IFO3292、G.oxj^/araATCC6之1H、G.ox:j^a^IFO12528、G.oxj^a/wT-100(7.ojgY/<myIFO3291、G.oxj^a似IFO3255、G.0砂&^ATCC9937、G.oxj^a似ATCC9937、G.oxj^a朋IFO3244、G.IFO3266、G./ratewn7IFO3260、G.o:tyt/a^IFO3287、G./^a/to/^/cus1NBRC100600或G7wco朋ace勵(lì)acter/—咖c/e似ATCC14835.將通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)被理解為起限制作用。本文提到的所有參考文獻(xiàn)、專利申請(qǐng)、專利和公開(kāi)的專利申請(qǐng)的內(nèi)容都通過(guò)引用并入本文。實(shí)施例實(shí)施例1制備染色體DNA以及通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA片段39在由25g/1甘露糖醇、5g/1酵母提取物(DifC0)和3g/1細(xì)菌蛋白胨(Difco)構(gòu)成的液體甘露糖醇培養(yǎng)基(MB)中，于30°C對(duì)G/wco朋6ac/erox_yt/"/wDSM17078的細(xì)胞進(jìn)行一天的培養(yǎng)，通過(guò)Sambrooketal(1989)"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述的方法，從培養(yǎng)的細(xì)胞制備G/wco"okzcferox_y^"sDSM17078的染色體DNA。使用按照上文所述制備的染色體DNA以及一組引物一一Pf(SEQIDNO:3)禾卩Pr(SEQIDNO:4)，通過(guò)PCR來(lái)制備DNA片段。按照廠商說(shuō)明書(shū)，用ExpandHighFidelityPCR試劑盒(RocheDiagnostics)和10ng染色體DNA以100/xl的總體積來(lái)進(jìn)行反應(yīng)，獲得了含有SMS37DNA序列(SEQIDNO:1)的PCR產(chǎn)物。從反應(yīng)體系中回收PCR產(chǎn)物，并驗(yàn)證了其正確序列。實(shí)施例2在G.ojcv^zwDSM17078中過(guò)量表達(dá)SMS37基因?yàn)閷?duì)SMS37基因的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)，使用采用質(zhì)粒構(gòu)建體的過(guò)量表達(dá)系統(tǒng)。本文中，SMS37基因被融合到強(qiáng)組成型啟動(dòng)子上，然后將構(gòu)建體引入G.ox;;Ja朋DSM17078。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定SMS37基因的過(guò)量表達(dá)，所述方法例如使用Northern印跡雜交、RT-PCR或其它技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，使用Western印跡雜交、二維凝膠電泳來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)測(cè)定，使用特異性酶試驗(yàn)或者通過(guò)直接測(cè)量產(chǎn)物形成或底物轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行酶活性測(cè)定。啟動(dòng)子可以是在G/wco"okzcter0x3^/flM中展示出強(qiáng)組成型活性的任何啟動(dòng)子，例如，來(lái)自￡"5cAen'c/n'aco//的似/B啟動(dòng)子、來(lái)自G/wco"oZ)flcterox_y^ms"的Zm/S啟動(dòng)子、來(lái)白G/wcowoZwicteroxj^rn的s綠啟云力子、或者來(lái)自G7wco"c^acteroxyc/a"s的s"dA啟動(dòng)子。用于基于質(zhì)粒的過(guò)量表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)?？梢允窃趂oc&n'c/n'flco/z'和G/Mco"Wacterox>y/a^中均能復(fù)制并且可在這兩個(gè)物種間轉(zhuǎn)移的任何質(zhì)粒。該質(zhì)?？煞奖愕睾羞x擇性標(biāo)記，使得該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移可被監(jiān)測(cè)，選擇性標(biāo)記例如抗生素抗性標(biāo)記、針對(duì)原營(yíng)養(yǎng)型的補(bǔ)足標(biāo)記。此類質(zhì)?？砂ǖ幌抻趐VK100、pGEl、pBBRlMCS-2、RSF1010以及它們的衍生物(具有目錄號(hào)或信息來(lái)源的載體，pVK100=ATCC37156，pGEl=J.FermentBioeng.79,95,1995，pBBRlMCS-2=NCCB3434，RSF1010=NCCB3110)。使用引物對(duì)PsndhSMS37+1(SEQIDNO:5)(其5'端含有互補(bǔ)的Psndh啟動(dòng)子懸突序列)禾QSMS37HindIII-l(SEQIDNO:4，在5'末端含有GAGAAAGCTT)，通過(guò)PCR擴(kuò)增出整條SMS37基因。使用引物對(duì)PsndhXhoI+1(SEQIDNO:7)和SMS37Psndh-l(SEQIDNO:8)(其5'端含有互補(bǔ)的SMS37DNA懸突序列)通過(guò)PCR擴(kuò)增P^h啟動(dòng)子(SEQIDNO:6)。用G/wcom^acte廠ox;^a^DSM17078基因組DNA作為模板，反應(yīng)條件由35個(gè)循環(huán)的94°C變性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸1分鐘組成。在兩種情況下均使用GC-richPCR試劑盒(RocheMolecularBiochemicals)。因?yàn)閮蓚€(gè)片段具有互補(bǔ)的懸突，因此將各PCR片段混合并使用引物對(duì)PsndhXhoI+1/SMS37HindIII-l來(lái)再擴(kuò)增，以擴(kuò)增全長(zhǎng)產(chǎn)物，藉此將選擇的啟動(dòng)子插入SMS37基因上游。第二輪反應(yīng)的PCR反應(yīng)條件由94°C、2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的[94°〇30秒，63°C30秒，68°C6分鐘]，之后20個(gè)循環(huán)的[94"30秒，63°C30秒，68°C6分鐘和每個(gè)循環(huán)額外的20秒]和68°C10分鐘的最終延伸組成。對(duì)PCR產(chǎn)物加以純化，用lol和Mwdn進(jìn)行雙消化，克隆進(jìn)用屈oI-歷w^in消化過(guò)的pVKlOO載體。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliTOP10細(xì)胞，在含有終濃度為10ml—1的四環(huán)素的Luria-Bertani瓊脂上對(duì)轉(zhuǎn)化子加以選擇。使用引物對(duì)PsndhXhoI+1/SMS37HindIII-l通過(guò)菌落PCR篩選可能的轉(zhuǎn)化子。撿出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，制備小份的質(zhì)粒(plasmidminipreps)，驗(yàn)證插入片段的DNA序列。將展示出正確序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)G.ox_yt/araDSM17078細(xì)胞，在含有終濃度為10Mgml—1的四環(huán)素的甘露糖醇培養(yǎng)基型瓊脂培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化子加以選擇。觀察到若干個(gè)可能的轉(zhuǎn)化子，再使用引物對(duì)PsndhXhoI+1/SMS37HindIII-l通過(guò)PCR對(duì)其中四個(gè)進(jìn)行分析，以驗(yàn)證質(zhì)粒的存在。發(fā)現(xiàn)所有菌株都含有SMS37過(guò)量表達(dá)質(zhì)粒，它們被命名為G.ox;^msDSM17078-SMS37upl、G.DSM17078-SMS37up2、G.ox;^(msDSM17078-SMS37up3和G.oxj^a似DSM17078-SMS37up4。實(shí)施例3使用靜止細(xì)胞從D-甘露糖醇生產(chǎn)維生素C在含有70g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、7.5g/1酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/L的CaC03禾卩18g/1瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27。C對(duì)G.oxj^/wwDSM17078、G.0x7cforaDSM17078-SMS37upl、G,ojcjy/朋sDSM17078-SMS37up2、G.ox_ytforaDSM17078-SMS37up3和G.0x3^fl朋DSM17078-SMS37up4的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸熘水中，用于在30°C，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。用處于反應(yīng)混合物(還含有0.3%NaCl和1%CaC03)中的2%D-山梨糖醇來(lái)進(jìn)行一系列反應(yīng)(0.5ml反應(yīng)混合物，處于5ml反應(yīng)試管中)，用終濃度為OD6。Q=10的細(xì)胞進(jìn)行溫育。20小時(shí)的溫育后，用具有與Aminex-HPX-78H(300x7.8mm)柱(Biorad，Reinach,Switzerland)相連的LiChrospher-100-RP18"25x4.6mm)柱(Merck,Darmstadt,Germany)的Agilent1100HPLC系統(tǒng)(AgilentTechnologies,Wilmington,USA)，通過(guò)高效液相色譜(HPLC)來(lái)對(duì)反應(yīng)混合物樣品進(jìn)行分析。移動(dòng)相為0.004M硫酸，流速為0.6ml/分鐘。用UV探測(cè)器(波長(zhǎng)254nm)組合折射率探測(cè)器，記錄下兩個(gè)信號(hào)。此外，用具有UV探測(cè)的氨基柱(YMC-PackPolyamine-II,YMC,Inc.,Kyoto,Japan)在254nm處來(lái)進(jìn)行對(duì)L-抗壞血酸的鑒定。移動(dòng)相為50mMNH4H2P04和乙腈(40:60)。用AgilentSeries1100HPLC-質(zhì)譜(MS)系統(tǒng)來(lái)鑒定L-抗壞血酸。用電噴霧界面在正離子模式下來(lái)操作MS。用LUNA-C8(2)柱(100x4.6mm)(Phenomenex，Torrance,USA)來(lái)進(jìn)行分離。移動(dòng)相為0.1%蟻酸和甲醇(96:4)的混合物。L-抗壞血酸以3.1分鐘的駐留時(shí)間被洗脫出來(lái)。通過(guò)駐留時(shí)間和該化合物的分子量來(lái)確認(rèn)L-抗壞血酸的身份。用突變體菌株G.oxj^/fl似DSM17078-SMS37upl、G,0x3^a"sDSM17078-SMS37up2、G.oxj;c^似DSM17078-SMS37up3和G.oxj^a似DSM17078-SMS37up4的細(xì)胞溫育的反應(yīng)混合物的上清液平均含有2.8g/1的維生素C，相比之下，用G.ox;;^似DSM17078細(xì)胞為1.0g/l。實(shí)施例4SMS37基因和等同物在其它生物中的存在可通過(guò)簡(jiǎn)單的DNA雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定其它生物(而非本文前面公開(kāi)的那些，例如表l中提到的生物)中SEQIDNO:l和/或等同物的存在。在含有5g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/1葡萄糖、5g/1甘露糖醇、1g/1MgS04'7H20、5ml/1乙醇和15g/1瓊脂的No.350土咅養(yǎng)基上，于27°C，7寸菌禾朱Jceto6acterswfcp.x_y//wMmIFO13693和IFO13773進(jìn)行3天的培養(yǎng)。在含有25g/1甘露糖醇、5g/1酵母提取物(Difco)、3g/1細(xì)菌蛋白胨(Difco)禾B18g/1瓊脂(Difco)的甘露糖醇培養(yǎng)基(MB)型瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C，對(duì)所有其它JcetoMcter、G/MCW2acetokz"er菌f朱禾口所有G7wcowokif"er菌株進(jìn)4亍3天白勺培養(yǎng)。在LuriaBroth瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)五.co//K-12。在廠商推薦的培養(yǎng)基上或者按照本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)其它菌株。按照例如Sambrooketal,1989,"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述，從合適的生物(例如表l提到的)提取基因組DNA。用限制性酶(例如EcoRI或歷"dl1)消化基因組DNA制備物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖)分離出1的DNA片段。用0.25NHC1對(duì)凝膠進(jìn)行15分鐘的處理，接著再用0.5NNaOH處理30分鐘，然后按照廠商說(shuō)明書(shū)，用VacuumBlotterModel785(BIO-RADLaboratoriesAG,Switzerland)將凝膠印到硝酸纖維素或尼龍膜上。然后用得到的印跡與含有探針(例如具有SEQIDNO:1序列的DNA片段，或含有SEQIDNO:1序列的部分或全部的DNA片段)的溶液接觸或雜交，以從測(cè)試生物中探測(cè)陽(yáng)性DNA片段?？砂凑諏?shí)施例1，用PCR-DIG標(biāo)記試劑盒(RocheDiagnostics)和引物組SEQIDNO:3和SEQIDNO:4來(lái)制備DIG標(biāo)記的探針，例如SEQIDNO:1。此印跡雜交結(jié)果示于表1中。雜交可在嚴(yán)謹(jǐn)條件或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。此類條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制性的例子是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，大約45。C下雜交，隨后在1xSSC、0.1%SDS中，50°C下進(jìn)行一次或多次洗滌，洗漆優(yōu)選在55T下，更優(yōu)選在60。C下，進(jìn)一步優(yōu)選在65。C下進(jìn)行。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括，例如，在溶液中，例如在含或不含100Atg/ml的鮭魚(yú)精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，或包含50%甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、0.02%十二烷基磺酸鈉、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封閉試劑(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，于42。C溫育2小時(shí)至4天，接著在2xSSC和0.1%SDS中，f室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然后在65-68°C，于0.5xSSC和0.1%SDS或0.1xSSC和0.1%SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。為檢測(cè)出與探針DNA具有較低相同性的DNA片段，最后的洗滌步驟可在較低溫度(例如50-65。C)進(jìn)行較短的洗滌時(shí)間(例如1-15分鐘)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的PCR方法，對(duì)表1所示各生物中陽(yáng)性信號(hào)對(duì)應(yīng)的基因加以克隆，這使用此生物的基因組DNA與合適的引物組(例如，SEQIDNO:3禾BSEQIDNO:4)在實(shí)施例1所述條件下進(jìn)行，或者按照這樣進(jìn)行每個(gè)反應(yīng)使用5至100ng基因組DNA(總體積50?？捎肊xpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(RocheDiagnostics)，采用下述反應(yīng)條件94。C2分鐘；30個(gè)循環(huán)的(i)94°C15秒的變性步驟，(ii)60°C30秒的退火步驟，(iii)72°C0.5至5分鐘(取決于目標(biāo)DNA長(zhǎng)度，1分鐘/1kb)的合成步驟；72°C延伸7分鐘?；蛘撸梢杂煤?jiǎn)并引物來(lái)進(jìn)行PCR，對(duì)簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)可基于SEQIDNO:2或基于作為共有序列的氨基酸序列(通過(guò)對(duì)由序列搜索程序(例如BLASTP，或當(dāng)核苷酸序列被用作"查詢序列"時(shí)，BLASTX)獲得的若干氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)選出的)，以找到與SEQIDNO:2的蛋白相似的蛋白。對(duì)使用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行的PCR而言，第二個(gè)退火步驟的溫度(見(jiàn)上文)可被降低至55°C，或者甚至50-45。C。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表l所示。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離PCR反應(yīng)的樣品，在用例如溴化乙啶染色后，用透照器(transilluminator)來(lái)觀察條帶，從凝膠對(duì)條帶進(jìn)行分離，驗(yàn)證正確的序列。上文提到的共有序列可以是屬于若干蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域/家族數(shù)據(jù)庫(kù)的某些類的氨基酸序列，所述數(shù)據(jù)庫(kù)例如PROSITE(蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫(kù))、COGs(直向同源體組的簇)、CDD(保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù))、pfam(多重序列比對(duì)和隱Markov模型的大集合，覆蓋很多常見(jiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和家族)。一旦可從含有此類數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)構(gòu)域或家族的蛋白中選出與本發(fā)明的蛋白具有相同/相近功能的某些蛋白，即可使用蛋白序列或其核苷酸序列(當(dāng)可從公眾數(shù)據(jù)庫(kù)獲得時(shí))通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增編碼該蛋白的對(duì)應(yīng)DNA。以下生物可進(jìn)一步提供可用作本發(fā)明備選基因的基因I/ge//"_/7eA7ien,2a菌f朱301、5"a/mowe〃a(yp/n'mMn.w/wLT2、sm/^/7/s168、々ro6a"er/wm似附咖c/ewsC58、5ra辦r/n'zoZ/w附7'，0WcwmUSDA110、5V朋r/n'zc^/wmme/〃ori1021或Mi&soWn'zo^謂/o"MAFF303099。實(shí)施例5來(lái)自其它生物的SMS37基因和等同物的過(guò)量表達(dá)，用于生產(chǎn)維生素C為在合適的微生物(能從給定碳源直接生產(chǎn)維生素C)中提高維生素C的生產(chǎn)，可在實(shí)施例2的過(guò)量表達(dá)系統(tǒng)中使用SMS37基因和等同物(例如，實(shí)施例4中獲得的PCR產(chǎn)物，其在本文中被稱為基因X)，或者可將上述SMS37基因和等同物克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO(Irwitrogen,CarlsbadCA，USA)，并用于轉(zhuǎn)化Eco//TG1，以獲得攜帶pCR2.1-TOPO-基因X的Apr轉(zhuǎn)化子，即攜帶有實(shí)施例4中獲得的PCR產(chǎn)物的Apr轉(zhuǎn)化子。用引物組——PWdeI[SEQIDNO:3，在5'末端具有CCCAT]和PrHindIII[SEQIDNO:4，在5'末端具有CCAAGCTT]通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增該插入物。用MM和消化得到的PCR產(chǎn)物，將片段與用lol和MM消化過(guò)的PcrtE-SD(Shine-Dalgarno)片段(WO02/099095)—起插入進(jìn)pVKlOO(ATCC37156)的lol禾卩///"dl1位點(diǎn)之間。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Eco"TGI，以獲得攜帶有質(zhì)粒pVK-PcrtE-SD-基因X的1V轉(zhuǎn)化子，然后再通過(guò)電穿孔用其轉(zhuǎn)化合適的宿主(例如G.DSM17078)，獲得，例如，TcrG.oxyctowDSM17078/pVK-PcrtE-SD-基因X。按照實(shí)施例3，使用重組細(xì)胞(例如G.ox;^a朋菌株DSM17078的重組細(xì)胞)和對(duì)應(yīng)的野生型菌株進(jìn)行對(duì)維生素C的生產(chǎn)。在用1%L-山梨糖酮作為底物的靜止細(xì)胞反應(yīng)中，重組細(xì)胞生產(chǎn)的維生素C可比野生型菌株多至少20%。表l:其它生物中SMS37基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>信號(hào)1:在使用不同菌株的基因組DNA，用SEQIDNO:1作為經(jīng)標(biāo)記探針進(jìn)行的印跡雜交試驗(yàn)上對(duì)DNA的探測(cè)。信號(hào)2:使用引物對(duì)SEQIDNO:3禾BSEQIDNO:4在PCR反應(yīng)中對(duì)不同菌株DNA的探測(cè)。信號(hào)3:使用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)中對(duì)不同菌株DNA的探測(cè)。更多解釋參見(jiàn)文本。權(quán)利要求1.選自下述組的多核苷酸或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQIDNO1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來(lái)自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQIDNO3和SEQIDNO4的引物組，通過(guò)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核酸擴(kuò)增獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有糖輸出蛋白和/或糖醇輸出蛋白的活性；(e)編碼糖輸出蛋白和/或糖醇輸出蛋白的多核苷酸，且其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸互補(bǔ)；以及(f)編碼糖輸出蛋白和/或糖醇輸出蛋白的多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少60％相同，例如70％、85％、90％或95％相同；構(gòu)成。2.含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸的載體。3.如權(quán)利要求2所述的載體，其中，所述多核苷酸與允許在原核生物宿主細(xì)胞或真核生物宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地相連。4.用權(quán)利要求1所述的多核苷酸或用權(quán)利要求2或3所述的載體遺傳工程改造過(guò)的微生物。5.如權(quán)利要求4所述的微生物，其能以300mg/l或更多的量從D-山梨糖醇直接生產(chǎn)維生素C，所述的量是在20小時(shí)溫育之后以靜止細(xì)胞方法測(cè)量的。6.如權(quán)利要求5所述的微生物，其能以800mg/l或更多的量從L-山梨糖直接生產(chǎn)維生素C。7.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸編碼的多肽。8.用于生產(chǎn)能表達(dá)權(quán)利要求7所述的多肽的細(xì)胞的工藝，其包括下述步驟用權(quán)利要求2或3所述的載體或用權(quán)利要求1所述的多核苷酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造。9.權(quán)利要求1所述的多核苷酸或用權(quán)利要求2或3所述的載體用于生產(chǎn)維生素c的用途。10.如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述多核苷酸與表達(dá)控制序列可操作地連接，并被引入微生物。11.如權(quán)利要求IO所述的用途，其中，所述表達(dá)控制序列包含調(diào)控序列和/或啟動(dòng)子序列和/或終止子序列，并且，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得所述微生物對(duì)維生素C的生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或效率提高的方式進(jìn)行。12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中，所述表達(dá)控制序列包含調(diào)控序列和/或啟動(dòng)子序列和/或終止子序列，并且，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得糖輸出蛋白和/或糖醇輸出蛋白的活性增加和/或提高的方式進(jìn)行。13.如權(quán)利要求4所述的微生物或含有包含權(quán)利要求1所述的多核苷酸的內(nèi)源基因的微生物，所述微生物經(jīng)過(guò)遺傳改變，所述改變以使得所述微生物對(duì)維生素C的生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或效率提高的方式進(jìn)行。14.如權(quán)利要求13所述的微生物，其生產(chǎn)出具有增加的和/或提高的糖輸出蛋白和/或糖醇輸出蛋白活性的、權(quán)利要求7所述的多肽。15.如權(quán)利要求4-6、13或14中任意一項(xiàng)所述的微生物，其中，根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸被過(guò)量表達(dá)。16.如權(quán)利要求4-6、13-15中任意一項(xiàng)所述的微生物，其選自尸swctomowfiw、尸awtoea、Esc/en'c/n'a、A^togw/om'c/gem'w附以及乙酸纟田菌-，例如G7wcowo6acter、JcetoZa"er或G7wcowaceto6acter，優(yōu)選地，c6rz'WM5、G7wcowo6ac,g廠//zaf/awfi^cws、G7wcowoZacf6廠oxjFc/a"st勾成白勺會(huì)且，"[尤選地，G7wco朋6a"ercuqy^ww，更優(yōu)選地，G7wccwo6(2cteroxj^ms"DSM17078。17.在微生物中生產(chǎn)增強(qiáng)的糖輸出蛋白和/或糖醇輸出蛋白內(nèi)源基因的工藝，所述微生物包含權(quán)利要求1所述的多核苷酸，所述工藝包括如下歩驟以使得所述微生物對(duì)維生素C的生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或效率提高的方式來(lái)改變所述多核苷酸。18.用于生產(chǎn)能產(chǎn)生維生素C的微生物的工藝，所述工藝包括如下歩驟改變所述微生物，使得所述微生物生產(chǎn)出具有增加的和/或提高的糖輸出蛋白和/或糖醇輸出蛋白活性的多肽，導(dǎo)致所述微生物對(duì)維生素C的生產(chǎn)產(chǎn)率和/或效率提高。19.用于生產(chǎn)含有下述內(nèi)源基因的微生物的工藝，所述內(nèi)源基因包含權(quán)利要求1的多核苷酸，所述工藝包括如下步驟改變所述微生物，使得所述內(nèi)源基因被過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致所述微生物對(duì)維生素C的生產(chǎn)產(chǎn)率和/或效率提高。20.如權(quán)利要求18或19所述的工藝，其用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求13至16中任意一項(xiàng)所述的微生物。21.用根據(jù)權(quán)利要求13至16或權(quán)利要求4至6中任意一項(xiàng)所述的微生物生產(chǎn)維生素C的工藝，其中，在水性培養(yǎng)基中，在允許從D-山梨糖醇或L-山梨糖對(duì)維生素C進(jìn)行直接生產(chǎn)的條件下孵育所述微生物，以及，可選地，維生素C作為發(fā)酵產(chǎn)物被分離出來(lái)。全文摘要本發(fā)明涉及新鑒定出的基因，其編碼L-抗壞血酸(下文中也稱為維生素C)合成中涉及的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含該新穎基因的全長(zhǎng)多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術(shù)工具在從微生物生產(chǎn)維生素C中的用途，其中對(duì)所述多核苷酸和/或被編碼的多肽的修飾對(duì)所述微生物中生產(chǎn)所述發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率有著直接或間接的影響。本發(fā)明還包括使用多核苷酸和經(jīng)修飾的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主微生物的方法/工藝。本發(fā)明還涉及經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的微生物及其用于直接生產(chǎn)維生素C的用途。文檔編號(hào)C12P17/04GK101316929SQ200680033175公開(kāi)日2008年12月3日申請(qǐng)日期2006年9月7日優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日發(fā)明者克里納·豪克,奈杰爾·芒希亞,安德烈亞·沐菲勒,巴斯坦·切弗勒克斯,新城雅子申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司