專利名稱：具有給予對三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有給予對三氟羧草醚(ACIFLUORFEN)的抗性的活性的原卟啉原氧化酶，尤其是藍藻的原卟啉原氧化酶及其基因以及組入了該基因的轉化體等。

背景技術：
原卟啉原氧化酶是催化血紅素和葉綠素合成的最終階段反應，即從原卟啉原IX奪得6個電子合成原卟啉IX的反應的酶。血紅素作為血紅蛋白、細胞色素等血紅素蛋白質的輔助因子，是對于呼吸、能量代謝、氧緊張的防御不可缺少的分子。血紅素合成途徑在微生物、植物、動物中共通存在，是以δ-氨基乙酰丙酸作為前體合成血紅素的途徑。而且，認為植物中的血紅素和葉綠素，是以δ-氨基乙酰丙酸作為前體直至原卟啉IX的共通的途徑來合成的，原卟啉原氧化酶擔當著這兩種合成途徑的調節(jié)作用。陸生植物中承擔葉綠素代謝系統(tǒng)的這種原卟啉原氧化酶成為了二苯醚(以下有時簡稱為DPE)系除草劑的目的酶。如果原卟啉原氧化酶的活性受到DPE系除草劑的抑制，作為該酶的底物的原卟啉原IX就漸漸積累于葉綠體中，最終原卟啉原IX漏到細胞質漿液中，于是過氧化酶對其進行氧化生成原卟啉IX。原卟啉IX如果與光和氧作用，原卟啉IX就可生成單線態(tài)氧以及其它反應性氧種類。脂質的過氧化以及必然伴隨其的膜損傷的結果是植物細胞急速死亡(Lee et al，1993，Plant Physiol.，102，881)。另一方面，已經知道在藍藻中即使在DPE系除草劑存在下，也可以生長，但是其原因和機制還完全不知道。
原卟啉原氧化酶基因已經在一些生物中獲得了分離。例如，已知的有煙草的PPX1基因(Genbank登錄號Y13465)、PPX2基因(Genbank登錄號Y13466)、擬南芥的PPOX基因(Genbank登錄號D83139)、枯草桿菌的HemY基因(Genbank登錄號M97208)、小鼠的PPX基因(Genbank登錄號D45185)、人的PPX基因(Genbank登錄號D38537)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的PPX基因(Genbank登錄號Z71381)、大腸桿菌的hemG基因(Genbank登錄號X68660)等。
作為原卟啉原氧化酶的利用方法，例如，專利文獻1公開了在植物體內使給予對DPE系除草劑的抵抗性的來源于枯草桿菌(Bacillus subtilis)的原卟啉原氧化酶表達的方法，以及表達該原卟啉原氧化酶的轉基因植物。此外，例如專利文獻2，公開了原卟啉原氧化酶基因，作為適于植物育種的卟啉生物合成系統(tǒng)的酶蛋白質的基因，其是從擬南芥(Arabidopsisthaliana)植物中獲得的具有1.7kbp長度的基因，其特征在于，其自5’端起1.3kbp的部位存在限制性內切酶EcoRI識別堿基序列5’-GAATTC-3’。而且，例如專利文獻3公開了一種用于評價大鼠或衣藻屬(Chlamydomonas)來源的原卟啉原氧化酶活性抑制能力的簡便方法，其特征在于，包括(1)在被驗化合物存在或不存在下，在基本不含補充基于原卟啉原氧化酶活性的增殖能力的缺失的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達存在于DNA片段中的原卟啉原氧化酶基因的轉化體，在各條件下測定該轉化體的增殖度的工序，所述轉化體是通過將可以在宿主細胞中起作用的啟動子以可以發(fā)揮功能的形式與原卟啉原氧化酶基因結合而構成的DNA片段導入到基于原卟啉原氧化酶活性的增殖能力發(fā)生缺失的宿主細胞中而成的；(2)基于該增殖度的差異求出由于被驗化合物的接觸而造成的前述轉化體的增殖抑制度，判斷被驗化合物對原卟啉原氧化酶活性的抑制能力的過程。
另一方面，在藍藻中，根據(jù)其基因數(shù)據(jù)庫的分析，曾推定大腸桿菌hemK類似基因為原卟啉原氧化酶，然而此后漸漸清楚藍藻的該hemK類似基因不是原卟啉原氧化酶。但是，在藍藻中還沒有發(fā)現(xiàn)藍藻的基因數(shù)據(jù)庫中與目前所鑒定的其它生物種類的原卟啉原氧化酶同源的蛋白質，還沒有分離出藍藻的原卟啉原氧化酶(例如，參照非專利文獻1)。
專利文獻1特愿平9-107833號公報
專利文獻2特開平9-140381號公報
專利文獻3特愿平11-346787號公報
非專利文獻1Dmitrii V.Vavilin，Wim F.J.Vermaas“Regulation ofthe tetrapyrrole biosynthetic pathway leading to heme and chlorophyll inplants and cyanobacteria(植物和藍藻中導向為血紅素和葉綠素的四吡咯生物合成途徑的調節(jié))”Physiologia Plantarum第115卷，第9頁，2002年

發(fā)明內容
如上所述，無法在藍藻的基因數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)與來源于其它生物種類的已知的原卟啉原氧化酶同源的蛋白質，至今為止還沒有分離出藍藻的原卟啉原氧化酶。本發(fā)明的課題在于提供具有給予三氟羧草醚抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因，以及組入了該基因的轉化體等。
本發(fā)明人，以分離藍藻來源的原卟啉原氧化酶為目的，嘗試了采用原卟啉原氧化酶缺損的大腸桿菌的互補篩選。該方法是在原卟啉原氧化酶發(fā)生缺損的大腸桿菌中導入藍藻基因組片段來尋找互補的基因，鑒定與藍藻的原卟啉原IX的氧化相關的基因的方法。使用的載體不同，使用相同的方法分離擬南芥或煙草來源的原卟啉原氧化酶基因。以下公開了前述互補篩選的概況。
首先，從藍藻(集胞藻屬(Synechocystis)PCC6803)中獲得了DNA。在制備DNA文庫時，使用λZAPII載體(STRATEGENE公司制)作為噬菌體載體。由于該藍藻的全堿基序列已經被報道(約3,500kb)，因而研究了該藍藻的基因組序列，結果認為對于包含于載體的多克隆位點的6種限制性內切酶序列而言，XbaI、SpeI、EcoRI這3種適于制備文庫。因此，以這三種限制性內切酶處理為基礎制備出噬菌體文庫。通過將制備的文庫導入到原卟啉原氧化酶缺損的大腸桿菌中，研究該轉化體的原卟啉原氧化酶活性，進行互補試驗，卻沒有發(fā)現(xiàn)顯示出明顯的互補性。根據(jù)該結果，認為可能是該藍藻的原卟啉原氧化酶不幸恰好帶有這3種限制性內切酶序列，或者該藍藻的啟動子沒有很好地發(fā)生作用等幾種可能性。
因此，通過使用限制性內切酶Tsp5091的限定分解重新制備文庫，重新進行了研究。Tsp5091是識別4堿基的限制性內切酶。前次文庫制備中使用的3種限制性內切酶(EcoRI、SpeI、XbaI)為6堿基識別，必然會產生尺寸過大的片段。而且，藍藻原卟啉原氧化酶的基因序列內存在這些限制性內切酶識別序列時，無法克隆全長的原卟啉原氧化酶基因。另一方面，如果使用4堿基識別的限制性內切酶完全切斷DNA，就會獲得大量的數(shù)百bp的細小的片段。為了解決該問題，使用通過4堿基識別的限制性內切酶不完全切斷DNA的方法(限定分解)制備了文庫。使用了該文庫，卻無法與大腸桿菌的原卟啉原氧化酶缺失能力互補。
然后，考慮如果是質粒的狀態(tài)則可能出現(xiàn)生長恢復，對Tsp5091藍藻基因組噬菌體文庫，切出了大量的質粒，制備出Tsp5091藍藻基因組質粒文庫，然后進行了研究，沒有發(fā)現(xiàn)生長顯著恢復的克隆。由此，認為可能是藍藻原卟啉原氧化酶沒有與大腸桿菌的原卟啉原氧化酶缺損互補，或者即使發(fā)生了互補也是非常輕微的。
因此，本發(fā)明人為了解決上述問題，進行了積極的研究，結果發(fā)現(xiàn)，基于藍藻對三氟羧草醚具有抗性的認識，通過采用利用轉座子的藍藻變異體篩選，首次分離出源于藍藻(集胞藻屬PCC6803)的卟啉原氧化酶，該卟啉原氧化酶具有給予三氟羧草醚抗性的活性，并且通過鑒定該基因，而完成了本發(fā)明。而且，得到了如下認識上述利用轉座子的基因篩選法，作為在其它生物種類的基因數(shù)據(jù)庫中無法發(fā)現(xiàn)藍藻來源的卟啉原氧化酶等與已知的蛋白質同源的其它生物種類來源的蛋白質時的基因分離方法是有效的，從而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明涉及(1)原卟啉原氧化酶，其特征在于，具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性并且來源于藍藻；(2)根據(jù)上述(1)記載的原卟啉原氧化酶，其特征在于，所述藍藻為屬于集胞藻屬的藍藻；(3)根據(jù)上述(1)或(2)記載的原卟啉原氧化酶，其特征在于，所述生物為植物。
而且本發(fā)明還涉及(4)下述(a)～(c)中任一所示的蛋白質(a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；(b)具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質，其特征在于，由序列號2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列構成，并且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性；(c)具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質，其特征在于，與序列號2所示的氨基酸序列的同源性為20％以上，并且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性；(5)根據(jù)上述(4)記載的蛋白質，其特征在于，來源于藍藻。
而且本發(fā)明還涉及(6)編碼上述(1)～(3)中任一項記載的原卟啉原氧化酶或上述(4)或(5)記載的蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA，(7)下述(d)或(e)所示的原卟啉原氧化酶基因DNA(d)由序列號1所示的堿基序列構成的原卟啉原氧化酶基因DNA；(e)編碼以具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性為特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA，其由序列號1所示的堿基序列中缺失、取代或添加了1個或多個堿基的堿基序列構成；(8)編碼以具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性為特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA，其在嚴謹條件下與由與序列號1所示的堿基序列互補的序列構成的DNA雜交；(9)上述(7)或(8)任一項記載的原卟啉原氧化酶基因DNA，其特征在于，具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質來源于藍藻。
而且本發(fā)明還涉及(10)組入了上述(6)～(9)中任一項記載的原卟啉原氧化酶基因DNA的重組載體。
而且本發(fā)明還涉及(11)轉化體，其特征在于，導入了上述(10)記載的重組載體；(12)上述(11)記載的轉化體，其特征在于，具有對三氟羧草醚的抗性；(13)上述(11)或(12)記載的轉化體，其特征在于，所述轉化體為微生物；(14)上述(11)或(12)記載的轉化體，其特征在于，所述轉化體為植物；(15)上述(14)記載的轉化體，其特征在于，光合成能力提高了。
而且本發(fā)明還涉及(16)使用上述(11)～(15)中任一項記載的轉化體的評價原卟啉原氧化酶抑制活性能力的方法；(17)使用上述(11)～(16)中任一項記載的轉化體的篩選原卟啉原氧化酶抑制劑的方法。
而且本發(fā)明還涉及(18)包括以下(f)～(j)工序的藍藻的原卟啉原氧化酶基因的分離方法(f)在藍藻中導入擬南芥的原卟啉原氧化酶基因的工序；(g)使用轉座子破壞藍藻的基因的工序；(h)選擇原卟啉原氧化酶基因被破壞的菌株；(i)確定被破壞的原卟啉原氧化酶基因的工序；(j)分離被破壞的原卟啉原氧化酶基因的工序。
而且本發(fā)明還涉及(19)上述(4)或(5)記載的蛋白質作為原卟啉原氧化酶的使用方法；(20)人為地使上述(4)或(5)記載的蛋白質與原卟啉原IX接觸轉換成原卟啉IX的方法；(21)上述(6)～(9)中任一項記載的DNA作為原卟啉原氧化酶基因的使用方法；(22)人為地使上述(6)～(9)中任一項記載的DNA表達，使其表達產物與原卟啉原IX接觸轉換成原卟啉IX的方法。
而且本發(fā)明還涉及(23)包括以下的1)～5)工序的分離特定生物中編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因的方法1)在特定生物中導入來源于特定生物以外的其它生物的編碼互補規(guī)定功能的蛋白質的基因來制備轉化體的工序；2)通過變異處理等隨機破壞轉化體的基因從而制備轉化體的變異株的工序；3)通過使用作用于互補規(guī)定功能的蛋白質而不作用于具有規(guī)定功能的蛋白質的藥劑，或者改變培養(yǎng)條件，從而選擇編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因被破壞的變異株的工序；4)確定被破壞的編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因的工序；5)分離被破壞的編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因的工序。
而且本發(fā)明還涉及(24)上述(23)記載的基因的分離方法，其特征在于，變異處理為使用轉座子的變異處理；(25)上述(23)或(24)記載的基因的分離方法，其特征在于，所述來源于特定生物以外的其它生物的互補規(guī)定功能的蛋白質為擬南芥的原卟啉原氧化酶；(26)上述(25)記載的基因的分離方法，其特征在于，所述作用于互補規(guī)定功能的蛋白質而不作用于具有規(guī)定功能的蛋白質的藥劑為三氟羧草醚；(27)上述(25)或(26)記載的基因的分離方法，其特征在于，特定生物中的具有規(guī)定功能的蛋白質為藍藻的原卟啉原氧化酶。



圖1序列號2所示的氨基酸序列和藍藻來源的功能未知的基因編碼的氨基酸序列的比對。
圖2序列號2所示的氨基酸序列和其它生物來源的功能未知的基因編碼的氨基酸序列的比對。
圖3表示破壞集胞藻屬(Synechocystis)的slr1790基因用的構建體(pslr1790SKM 6.4kb)。
圖4表示原卟啉IX的試樣(A)、slr1790基因缺損株的提取液(C)和野生株的提取液(B)中涉及的原卟啉IX的色譜圖。
圖5表示pBI121的概略。
圖6表示pBIslr1790的概略。

具體實施例方式 本發(fā)明的原卟啉原氧化酶具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性。其中，所謂“具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶”是指在適當?shù)纳镏袑朐撛策趸?，使該酶在該生物中適當表達時，該生物的對三氟羧草醚的抗性提高了的原卟啉原氧化酶。該生物對三氟羧草醚的抗性是否獲得提高，可以通過例如確認與導入該酶前相比，導入該酶后，三氟羧草醚的對該生物的48小時后的LC50值是否提高來研究。而且，尤其是生物為植物時，例如將特定量的三氟羧草醚施用于植物的栽培土壤中時，通過確認與使前述酶在植物中適當表達前的植物相比，使前述酶在植物中適當表達的植物的黃化、褐變或枯化的程度降低，或者確認與使前述酶在植物中適當表達前的植物相比，在使前述酶在植物中適當表達的植物中發(fā)生同程度的黃化、褐變或枯化所需要的三氟羧草醚的單位面積的施用量增加等，可以研究該植物對三氟羧草醚的抗性是否提高。對三氟羧草醚的抗性的提高程度沒有特別的限制，三氟羧草醚對生物的48小時后的LC50值，或者發(fā)生同程度的黃化、褐變或枯化所需要的三氟羧草醚的單位面積的施用量，與在該生物中導入該酶前相比，優(yōu)選提高到1.1倍以上，更優(yōu)選提高到1.5倍以上，更為優(yōu)選提高到2倍以上，最優(yōu)選提高到3倍以上。
而且，本發(fā)明的“具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶”中，也包括該原卟啉原氧化酶自身具有對三氟羧草醚的抗性的情況，其中，所謂“原卟啉原氧化酶自身具有對三氟羧草醚的抗性”是指，在含有1μM的三氟羧草醚的適當溶劑中的原卟啉原氧化酶的比活性為三氟羧草醚不存在時的原卟啉原氧化酶的比活性的五十分之一以上，優(yōu)選二十分之一以上，更優(yōu)選十分之一以上。其中“原卟啉原氧化酶活性”是指氧化原卟啉原IX生成原卟啉IX的酶活性。某些蛋白質的原卟啉原氧化酶比活性，可以通過在適當?shù)木彌_液或鹽溶液中使該蛋白質與原卟啉原IX接觸，研究原卟啉原IX的生成量等而容易地進行確認。而且，“具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性”中的“生物”沒有特別的限制，可以是植物也可以是微生物，但優(yōu)選植物，其中優(yōu)選擬南芥、煙草、玉米、稻、麥類(小麥、大麥等)、薯類(馬鈴薯等)。
本發(fā)明的原卟啉原氧化酶，只要具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性，可以不來源于藍藻，也可以來源于藍藻。藍藻沒有特別的限制，可以例舉，例如屬于集胞藻屬、魚腥藻(Anabaena)屬、粘桿菌(Gloeobacter)屬、原綠球藻(Prochlorococcus)屬、聚球藻(Synechococcus)屬、紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)屬的藍藻、更具體可以列舉集胞藻屬PCC6803、魚腥藻屬PCC7120、無類囊體藍藻(Gloeobacter violaceus)PCC7421、海洋原綠球藻(Prochlorococcusmarinus)SS120、海洋原綠球藻MIT9313、海洋原綠球藻MED4、聚球藻WH8102、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。這其中，優(yōu)選屬于集胞藻屬的藍藻，更優(yōu)選集胞藻屬PCC6803。
本發(fā)明中，所謂“來源于藍藻的原卟啉原氧化酶”是指除了包括實際存在于藍藻中的原卟啉原氧化酶，只要是與該原卟啉原氧化酶同一，使用轉化等手法由藍藻以外的微生物表達的原卟啉原氧化酶也包括在其中。
本發(fā)明的蛋白質為以下任一項所示的蛋白質(1)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；(2)含有在序列號2所示的氨基酸序列、序列號2的氨基酸編號1～34和48～176中記載的氨基酸序列、和序列號2的氨基酸編號1～34和48～193中記載的氨基酸序列中的任一氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白質；(3)與序列號2所示的氨基酸序列、序列號2的氨基酸編號1～34和48～176中記載的氨基酸序列、和序列號2的氨基酸編號1～34和48～193中記載的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的同源性為20％以上并且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質。以下，也將這些本發(fā)明的蛋白質總稱為“本案蛋白質”。
本發(fā)明的上述蛋白質(2)如果是序列號2所示的氨基酸序列、序列號2的氨基酸編號1～34和48～176中記載的氨基酸序列、和序列號2的氨基酸編號1～34和48～193中記載的氨基酸序列中的任一氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質，則沒有特別的限制。但可以優(yōu)選列舉在序列號2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的，并且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性，并且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質；由含有在序列號2的氨基酸編號1～34和48～176中記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且在對應于該氨基酸編號1～34的氨基酸序列的氨基酸序列和對應于該氨基酸編號48～176的氨基酸序列的氨基酸序列之間具有10～16個、優(yōu)選12～14個、更優(yōu)選13個任意的氨基酸序列的氨基酸序列構成的，而且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質；由含有在序列號2的氨基酸編號1～34和48～193中記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且在對應于該氨基酸編號1～34的氨基酸序列的氨基酸序列和對應于該氨基酸編號48～193的氨基酸序列的氨基酸序列之間具有10～16個、優(yōu)選12～14個、更優(yōu)選13個任意的氨基酸序列的氨基酸序列構成的，而且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質。其中，所謂對應于氨基酸編號m～n的氨基酸序列的氨基酸序列是指在氨基酸編號m～n的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列。
上述所謂“缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列”是指缺失、取代或添加了例如1～20個、優(yōu)選1～15個、更優(yōu)選1～10個、更優(yōu)選1～5個、最優(yōu)選1～3個任意個數(shù)的氨基酸的氨基酸序列。
本發(fā)明中，所謂“具有原卟啉原氧化酶活性”是指具有氧化原卟啉原IX生成原卟啉IX的酶活性。某些蛋白質是否具有原卟啉原氧化酶活性，可以通過在適當?shù)木彌_液或鹽溶液中使該蛋白質與原卟啉原IX接觸，研究原卟啉原IX的生成而容易地進行確認。
而且，所謂“具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白質”是指在適當?shù)纳镏袑朐摰鞍踪|，使該蛋白質在該生物中適當表達時，該生物對三氟羧草醚的抗性提高的蛋白質。該生物對三氟羧草醚的抗性是否提高可以通過例如確認與導入該蛋白質前相比，導入該蛋白質后，三氟羧草醚的對該生物的48小時后的LC50值是否提高來研究。并且，尤其是生物為植物時，例如在植物的栽培土壤中施用特定量的三氟羧草醚時，通過確認與在植物中使前述蛋白質適當表達前的植物相比，使前述蛋白質在植物中適當表達的植物黃化、褐變或枯化的程度降低，或者確認與在植物中使前述蛋白質適當表達前的植物相比，在使前述蛋白質在植物中適當表達的植物中發(fā)生同程度的黃化、褐變或枯化所需要的三氟羧草醚的單位面積的施用量增加等，可以研究該植物對三氟羧草醚的抗性是否提高。對三氟羧草醚的抗性的提高程度沒有特別的限制，三氟羧草醚對該生物的48小時后的LC50值，或者發(fā)生同程度的黃化、褐變或枯化所需要的三氟羧草醚的單位面積的施用量，優(yōu)選與在該生物中導入該蛋白質前相比，提高到1.1倍以上，更優(yōu)選提高到1.5倍以上，更為優(yōu)選提高到2倍以上，最優(yōu)選提高到3倍以上。
而且，本發(fā)明的“具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白質”中，也包括該蛋白質自身具有對三氟羧草醚的抗性的情況。其中，所謂“該蛋白質自身具有對三氟羧草醚的抗性”是指，在含有1μM的三氟羧草醚的適當溶劑中的該蛋白質的比活性(與原卟啉原氧化酶活性相關)為三氟羧草醚不存在時的比活性(與原卟啉原氧化酶活性相關)的五十分之一以上，優(yōu)選二十分之一以上，更優(yōu)選十分之一以上。其中“原卟啉原氧化酶活性”是指氧化原卟啉原IX生成原卟啉IX的酶活性。某些蛋白質的比活性(與原卟啉原氧化酶活性相關)，可以在適當?shù)木彌_液或鹽溶液中使該蛋白質與原卟啉原IX接觸，研究原卟啉IX的生成量等來容易地進行確認。而且，“具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性”中的“生物”沒有特別的限制，優(yōu)選是植物和微生物，特別優(yōu)選植物。
本發(fā)明的上述蛋白質(3)如果是與序列號2所示的氨基酸序列(slr1790)、序列號2的氨基酸編號1～34和48～176中記載的氨基酸序列、和序列號2的氨基酸編號1～34和48～193中記載的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的同源性為20％，并且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質，則沒有特別的限制，但優(yōu)選與序列號2所示的氨基酸序列、序列號2的氨基酸編號1～34和48～176記載的氨基酸序列、和序列號2的氨基酸編號1～34和48～193中記載的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的同源性為45％以上，更優(yōu)選54％以上，更為優(yōu)選65％以上，更優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選90％以上，最優(yōu)選95％以上。其中，本發(fā)明中所謂“與氨基酸編號o～p和q～r中記載的氨基酸序列的同源性在X％以上”是指與按順序依次具有氨基酸編號o～p的氨基酸序列和氨基酸編號q～r的氨基酸序列，并且氨基酸編號o～p的氨基酸序列和氨基酸編號q～r的氨基酸序列之間具有10～16個、優(yōu)選12～14個、更優(yōu)選13個任意的氨基酸序列的氨基酸序列的同源性為X％以上。上述蛋白質(3)中“具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白質”和“具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白質”和它們的優(yōu)選方式與上述蛋白質(2)中的那些蛋白質含義相同。
用BLAST檢索與本發(fā)明的序列號2所示的氨基酸序列同源性高的蛋白質，結果發(fā)現(xiàn)了幾個編碼與序列號2所示的氨基酸同源性高的氨基酸序列的功能未知的基因。其中，藍藻來源的功能未知的基因示于表1。而且，該基因編碼的氨基酸序列與本發(fā)明的序列號2所示的氨基酸序列的同源性(％)也示于表1。它們也包含于本案蛋白質中。本發(fā)明人清楚了本發(fā)明的序列號2所示的氨基酸序列，如后述的實施例中所記載的，為由來源于集胞藻屬PCC6803的slr1790基因編碼的氨基酸序列。
[表1] 而且，表1中所示的基因編碼的氨基酸序列的比對示于圖1中。
圖1的比對中，在所有7個基因共同的氨基酸下加上了星號。而且，4～6個基因共同的氨基酸下加上了點。從表1和圖1中清楚表明，集胞藻屬PCC6803以外的7種藍藻的這些氨基酸序列與集胞藻屬PCC6803的slr1790基因編碼的氨基酸同源性高，而且在特定區(qū)域很保守。因此，預測集胞藻屬PCC6803的slr1790基因之外的這些基因編碼的蛋白質，與集胞藻屬PCC6803的slr1790基因編碼的蛋白質(序列號2的氨基酸序列)同樣為具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶。而且，根據(jù)圖1的比對，本發(fā)明的原卟啉原氧化酶，序列號2所示的氨基酸序列或序列號1所示的堿基序列中，序列號2的氨基酸編號1～34和48～193中記載的氨基酸序列(序列號1的堿基編號1～102和142～582中記載的堿基序列)，尤其是序列號2的氨基酸編號1～34和48～176中記載的氨基酸序列(序列號1的堿基編號1～102和142～528中記載的堿基序列)的保守性高，預測它們的部分序列對該酶的性質起到重要的作用。
而且，作為編碼與序列號2所示的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列的基因，通過BLAST檢索顯示的基因中，藍藻以外的生物來源的基因示于以下的表2中。這些基因的表達產物也包含于本案蛋白質中。
[表2] 而且，表2中所示的基因編碼的氨基酸序列的比對示于以下的圖2中。
圖2的比對中，在所有5個基因共同的氨基酸下加上了星號。而且，3個基因共同的氨基酸下加上了點。從表2和圖2中清楚表明，集胞藻屬PCC6803以外的4種生物的這些氨基酸序列與集胞藻屬PCC6803的slr1790基因編碼的氨基酸同源性高，而且在特定區(qū)域很保守。因此，預測集胞藻屬PCC6803的slr1790基因之外的這些基因編碼的蛋白質，也與集胞藻屬PCC6803的slr1790基因編碼的蛋白質(序列號2的氨基酸序列)同樣為具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶。
本發(fā)明還涉及上述的本案蛋白質作為原卟啉原氧化酶的使用方法。其中，所謂“作為原卟啉原氧化酶的使用”是指，例如在體外或體內人為地使本案蛋白質與底物原卟啉原IX接觸而生成反應生成物原卟啉IX的反應中使用等，本案蛋白質具有原卟啉原氧化酶活性這個認識是由本發(fā)明首次了解清楚的全新的認識。而且，人為地使本發(fā)明的本案蛋白質與原卟啉原IX接觸而轉換成原卟啉IX的方法中所謂的“人為地使......接觸”是指在體外或體內人為地使之接觸，例如不包括在藍藻細胞中非人為地接觸。
本發(fā)明的原卟啉原氧化酶基因DNA為以下基因DNA中的任一種(1)編碼本發(fā)明的原卟啉原氧化酶或本案蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA；(2)由序列號1所示的堿基序列構成的原卟啉原氧化酶基因DNA；(3)編碼以具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性為特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA，其含有在序列號1的堿基序列、序列號1的堿基編號1～102和142～528中記載的堿基序列和序列號1的堿基編號1～102和142～582中記載的堿基序列中的任一堿基序列中缺失、取代或添加了一個或多個堿基的堿基序列；(4)編碼以具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性為特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA，其與由與序列號1的堿基序列、序列號1的堿基編號1～102和142～528中記載的堿基序列和序列號1的堿基編號1～102和142～582中記載的堿基序列中的任一堿基序列的互補序列構成的DNA在嚴謹條件下雜交。這些本發(fā)明的原卟啉原氧化酶基因DNA有時總稱為“本案基因DNA”。
本發(fā)明的上述DNA(2)如果是編碼以具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性為特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA，且含有序列號1所示的堿基序列、序列號1的堿基編號1～102和142～528中記載的堿基序列和序列號1的堿基編號1～102和142～582中記載的堿基序列中的任一堿基序列中缺失、取代或添加了一個或多個堿基的堿基序列，則沒有特別的限制。優(yōu)選可以列舉編碼以具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性為特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA，其由序列號1所示的堿基序列中缺失、取代或添加了一個或多個堿基的堿基序列構成；編碼以具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性為特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA，其由含有序列號1的堿基編號1～102和142～528中記載的堿基序列中缺失、取代或添加了一個或多個堿基的堿基序列，并且在對應于該堿基編號1～102的堿基序列的堿基序列和對應于該堿基編號142～528的堿基序列的堿基序列之間具有30～48(只限于3的倍數(shù))個、優(yōu)選36～42(只限于3的倍數(shù))個、更優(yōu)選39個任意的堿基序列的堿基序列構成；編碼以具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性為特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA，其由含有序列號1的堿基編號1～102和142～582中記載的堿基序列中缺失、取代或添加了一個或多個堿基的堿基序列，并且在對應于該堿基編號1～102的堿基序列的堿基序列和對應于該堿基編號142～582的堿基序列的堿基序列之間具有30～48(只限于3的倍數(shù))個、優(yōu)選36～42(只限于3的倍數(shù))個、更優(yōu)選39個任意的堿基序列的堿基序列構成。其中，所謂對應于堿基編號m～n的堿基序列的堿基序列是指在堿基編號m～n的堿基序列中缺失、取代或添加了一個或多個堿基的堿基序列。
上述所謂“缺失、取代或添加了一個或多個堿基的堿基序列”是指例如缺失、取代或添加了1～20個、優(yōu)選1～15個、更優(yōu)選1～10個、更優(yōu)選1～5個、最優(yōu)選1～3個的任意個數(shù)的堿基的堿基序列。
例如，這些缺失、取代或添加了一個或多個堿基的堿基序列構成的DNA(變異DNA)也可以通過化學合成、基因工程法、突變誘導等本領域技術人員已知的任意方法進行制備。具體的是，可以通過采用使序列號1所示的堿基序列構成的DNA與作為變異原的藥劑發(fā)生接觸作用的方法、照射紫外線的方法、基因工程法等，在這些DNA中導入變異，從而獲得變異DNA。作為基因工程法的一種的定點誘變法由于是一種可以在特定位置導入特定變異的方法，因此有用，可以按照分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約，1989(以后簡稱為分子克隆第二版)等中記載的方法進行。通過使用適當?shù)谋磉_系使該變異DNA表達，可以獲得由缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列構成的蛋白質。
上述所謂“在嚴謹條件下雜交的DNA”是指通過使用DNA或RNA等核酸作為探針，使用菌落雜交法、噬斑雜交法或者Southern雜交法等獲得的DNA，具體而言，可以列舉通過使用固定有來源于菌落或噬斑的DNA或該DNA的片段的濾膜，在0.7～1.0M的NaCl存在下，于65℃進行雜交后，使用0.1～2倍左右的SSC溶液(1倍濃度的SSC溶液的組成為150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉)，在65℃條件下清洗濾膜從而可以鑒定的DNA。雜交可以按照分子克隆第2版等中記載的方法進行。
例如，作為在嚴謹條件下可以雜交的DNA，可以列舉與作為探針使用的DNA的堿基序列具有一定以上的同源性的DNA，例如，可以優(yōu)選列舉與序列號1的堿基序列、序列號1的堿基編號1～102和142～528中記載的堿基序列和序列號1的堿基編號1～102和142～582中記載的堿基序列中任一堿基序列具有60％以上、優(yōu)選70％以上、更優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、特別優(yōu)選95％以上、最優(yōu)選98％以上的同源性的DNA。其中，本發(fā)明中所謂“與堿基編號s～t和u～v中記載的堿基序列的同源性為X％以上”是指與下述堿基序列的同源性為X％以上按順序依次具有堿基編號s～t的堿基序列和u～v的堿基序列，并且在堿基編號s～t的堿基序列和堿基編號u～v的堿基序列之間具有30～48(只限于3的倍數(shù))個、優(yōu)選36～42(只限于3的倍數(shù))個、更優(yōu)選39個任意的堿基序列的堿基序列。而且，作為在嚴謹條件下可以雜交的DNA，可以優(yōu)選例舉編碼如下氨基酸序列的DNA與序列號2所示的氨基酸序列、序列號2的氨基酸編號1～34和48～176中記載的氨基酸序列、和序列號2的氨基酸編號1～34和48～193中記載的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的同源性為20％以上、優(yōu)選45％以上、更優(yōu)選54％以上、更為優(yōu)選65％以上、更優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、最優(yōu)選95％以上的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及上述的本案DNA作為原卟啉原氧化酶基因的使用方法。其中，所謂“作為原卟啉原氧化酶基因的使用”是指在如下反應中使用等例如在體外或體內人為地使本案DNA表達，使其表達產物原卟啉原氧化酶與底物原卟啉原IX接觸，生成反應生成物原卟啉原IX。本案DNA的表達產物具有原卟啉原氧化酶活性這個認識是由本發(fā)明首次了解清楚的全新的認識。通過將本案DNA作為原卟啉原氧化酶基因使用，例如，可以給予對三氟羧草醚不具有抗性的生物以三氟羧草醚抗性。而且，人為地使本發(fā)明的本案DNA表達，使其表達產物與原卟啉原IX接觸，轉換成原卟啉IX的方法中所謂的“人為地使......表達”是指在體外或體內人為地使之表達，例如不包括在藍藻細胞中非人為地表達。
本案蛋白質、本案基因DNA的分離方法沒有特別的限制，但可以是由分子遺傳學的方法、酶學方法等一般已知的方法獲得的分離方法。分離編碼與已知的原卟啉原氧化酶同源性低的原卟啉原氧化酶的基因DNA時，優(yōu)選使用包括以下工序的原卟啉原氧化酶基因分離方法(f)在藍藻中導入擬南芥的原卟啉原氧化酶基因的工序；(g)用轉座子破壞藍藻的基因的工序；(h)選擇出原卟啉原氧化酶基因被破壞的菌株的工序；(i)確定出被破壞的原卟啉原氧化酶基因的工序；(j)分離被破壞的原卟啉原氧化酶基因的工序。
作為采取源的生物，可以是對三氟羧草醚不具有抗性的生物，但優(yōu)選對三氟羧草醚具有抗性的生物。以下，以對三氟羧草醚具有抗性的生物作為采取源時的方法進行描述。
即使作為采取源的生物的原卟啉原氧化酶發(fā)生缺損，為了該生物可以生長，在變異原處理前，預先在作為采取源的生物中導入來源于該生物的近源生物等的原卟啉原氧化酶基因，使來源于該近源生物等的原卟啉原氧化酶基因在作為采取源的生物中表達。來源于該近源生物的原卟啉原氧化酶，使用確認了對三氟羧草醚沒有顯示出抗性者。然后，對于作為采取源的生物進行利用轉座子的變異原處理，對獲得的變異體使用三氟羧草醚(二苯基醚系除草劑)進行篩選。作為采取源的生物對三氟羧草醚顯示出抗性，但是其它近源生物等來源的原卟啉原氧化酶沒有顯示出對三氟羧草醚的抗性(顯示出感受性)。因此，導入了來源于該近源生物等的原卟啉原氧化酶基因的采取源(原卟啉原氧化酶缺損株)顯示出對三氟羧草醚的感受性。因此，選擇出不進行三氟羧草醚處理時通常生長，在進行三氟羧草醚處理時顯示出感受性的變異株。例如，通過實施例3中記載的方法等，對于對三氟羧草醚顯示出感受性的菌株，可以通過分析轉座子的插入位置來確定基因。這樣，可以分離采取源來源的編碼對三氟羧草醚顯示出抗性的原卟啉原氧化酶的基因。
本發(fā)明中作為原卟啉原氧化酶基因的采取源使用的生物，優(yōu)選為具有與已存在的原卟啉原氧化酶顯示出低同源性的酶的生物。所謂本發(fā)明的與已存在的原卟啉原氧化酶基因顯示出低同源性的基因，具體是指例如與煙草PPX1基因(Genbank登錄號Y13465)在氨基酸水平的同源性不足20％的基因。本發(fā)明中作為原卟啉原氧化酶基因的采取源使用的生物，優(yōu)選原核生物，更優(yōu)選藍藻，從容易獲得、易于操作等考慮，最優(yōu)選集胞藻屬PCC6803的葡萄糖耐性株。這些菌株可以從例如Pasteur研究所容易地獲得。該株的培養(yǎng)條件可以按照一般已知的方法進行，但理想的是，通過在一定光存在下，于30℃在BG11培養(yǎng)基[Hihara Y.et al，Plant Physiol(1998)117pp.1205]中將TES-KOH(pH-8.2)調整成最終5mM來進行。
本案基因DNA的獲得方法、制備方法沒有特別的限定，可以基于本說明書中公開的序列號1所示的堿基序列信息或序列號2所示的氨基酸序列信息，制備適當?shù)奶结?、引物，用它們從例如集胞藻屬PCC6803、其之外的藍藻等生物的基因組DNA文庫等中分離目的基因，按照常規(guī)方法通過化學合成進行制備。而且，基因組DNA的獲得和其克隆等均可按照常規(guī)方法實施。從基因組DNA文庫篩選本案基因DNA的方法，可以列舉，例如分子克隆第2版中記載的方法等本領域技術人員常用的方法。而且，作為變異基因或相同基因，可以通過利用具有序列號1所示的堿基序列或其一部分的DNA片段，通過其它生物體等，在適當條件下篩選具有與該DNA的同源性高的堿基序列的DNA來進行分離。此外，也可以通過前述變異DNA的制備方法進行調制。
作為本發(fā)明的重組載體，如果是組入了本案基因DNA的重組載體，則沒有特別的限制，本發(fā)明的重組載體可以通過在表達載體中適當導入本案基因DNA來構建。例如，可以優(yōu)選列舉在適當?shù)膯幼酉掠芜B接了本案基因DNA的構建體。作為表達載體，優(yōu)選可以在宿主細胞中自我復制的表達載體，或可以組入到宿主細胞的染色體中的表達載體，而且，可以優(yōu)選使用含有與本發(fā)明的基因的表達相關的啟動子、終止子等控制序列或轉錄控制因子的基因的表達載體。
作為細菌用的表達載體，可以列舉例如pUC118(寶酒造社制)、pUC19[Gene，33，103(1985)]等的pUC系統(tǒng)、pGEMEX-1(Promega公司制)等pGEM系統(tǒng)、pKK223-2(Pharmacia公司制)、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII SK(-)(Stratagene公司制)等公知或市售的表達載體。
而且，作為細菌用啟動子，可以列舉例如T7噬菌體啟動子、trp啟動子(P trp)、lac啟動子(P lac)、recA啟動子、λPL啟動子、λPR啟動子、lpp啟動子、PSE啟動子、SP01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。
作為植物細胞用的表達載體，可以列舉例如pIG121-Hm[Plant CellReport，15，809-814(1995)]、pBI121[EMBO J.6，3901-3907(1987)]、pLAN411、pLAN421(Plant Cell Reports 10(1991)286-290)。而且，作為植物用啟動子，可以列舉例如花椰菜花葉病毒35S啟動子(Mol.Gen.Genet(1990)220，389-392)等。而且，可以列舉玉米來源的乙醇脫氫酶的啟動子(Maydica 35(1990)353-357)，擬南芥來源的IRE基因的啟動子(特開2000-270873號公報)等。
作為本發(fā)明的轉化體，如果是導入了上述本發(fā)明的重組載體的轉化體，則沒有特別的限制，作為宿主，可以列舉細菌等微生物、植物、動物等，優(yōu)選微生物、植物。作為細菌，具體可以例舉例如埃希氏桿菌屬細菌、假諾卡氏菌屬細菌、鏈霉菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌、鏈球菌屬細菌、葡萄球菌屬細菌等。而且，作為植物，具體可以例舉擬南芥、煙草、玉米、稻、麥類(小麥、大麥等)、薯類(馬鈴薯等)等。
作為在宿主微生物中導入上述本發(fā)明的重組載體的方法，可以通過分子克隆第2版等眾多標準實驗室手冊中記載的方法，例如電穿孔、轉導、轉化等進行。而且，作為上述在植物中導入本發(fā)明的重組載體的方法，可以列舉基因槍法、電穿孔法、農桿菌法等。
認為導入了本發(fā)明的重組載體的轉化體，優(yōu)選轉化植物具有對三氟羧草醚的抗性。其中，所謂“具有對三氟羧草醚的抗性的轉化體”是指，與導入本發(fā)明的重組載體之前相比，對三氟羧草醚的抗性提高的轉化體。該轉化體對三氟羧草醚的抗性是否提高，可以通過確認與導入該重組載體前相比，導入該重組載體后，三氟羧草醚對該轉化體的48小時后的LC50值是否提高來研究。而且，尤其是生物為植物時，例如在植物的栽培土壤中施用特定量的三氟羧草醚時，通過確認與在植物中使前述重組載體適當表達前的植物相比，使前述重組載體在植物中適當表達的植物黃化、褐變或枯化的程度降低，或者確認與在植物中使前述重組載體適當表達前的植物相比，在使前述重組載體在植物中適當表達的植物中發(fā)生同程度的黃化、褐變或枯化所需要的三氟羧草醚的單位面積的施用量增加等，可以研究該植物對三氟羧草醚的抗性是否提高。對三氟羧草醚的抗性的提高程度沒有特別的限制，三氟羧草醚對生物的48小時后的LC50值，或者發(fā)生同程度的黃化、褐變或枯化所需要的三氟羧草醚的單位面積的施用量，優(yōu)選與在該生物中導入該重組載體前相比，提高到1.1倍以上，更優(yōu)選提高到1.5倍以上，更為優(yōu)選提高到2倍以上，最優(yōu)選提高到3倍以上。
例如，通過在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的轉化體，使本案蛋白質在培養(yǎng)物中生成積累，再通過從該培養(yǎng)物中采取本案蛋白質，可以大量制造本案蛋白質。而且，轉化植物時，撒播作為農藥·除草劑的三氟羧草醚時，栽培目的的轉化植物生存，三氟羧草醚感受性的雜草死亡，可以選擇性培育栽培目的的轉化植物。
本發(fā)明的轉化植物的光合成能力可以不提高，但優(yōu)選光合成能力提高，更優(yōu)選在三氟羧草醚存在下光合成能力提高。本發(fā)明的轉化植物，由于表達許多原卟啉原氧化酶，因此可期待光合成能力提高。通過比較導入本發(fā)明的重組載體前宿主植物的光合成能力與導入后的轉化植物的光合成能力，可以確認光合成能力是否提高。其中，可以通過比較根據(jù)用光合成蒸散測定裝置獲得的測定值計算出的光合成速度，或比較一定期間同條件下培養(yǎng)后的植物體的干燥重量等來確認光合成能力是否提高。
本發(fā)明的轉化體可以在評價抑制原卟啉原氧化酶活性能力的方法中使用。該評價方法沒有特別的限定，但可以列舉，例如包括以下(1)～(3)的評價方法(1)在被檢物質存在下培養(yǎng)該轉化體的宿主，記錄生長曲線；(2)在與(1)同樣的被檢物質存在下培養(yǎng)該轉化體，記錄生長曲線；(3)比較階段(1)和階段(2)中記錄的生長曲線。
而且，本發(fā)明的轉化體也可以在原卟啉原氧化酶抑制劑的篩選方法中使用。作為該篩選方法，可以列舉例如與上述評價方法相同的方法。
而且，三氟羧草醚是二苯基醚系除草劑的1種。本案蛋白質由于具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性，因此認為也具有給予生物對作用機制類似的其它二苯基醚系除草劑的抗性的活性。對于本案的原卟啉原氧化酶及本發(fā)明的轉化體也適用同樣的考慮。
接著，對本發(fā)明的特定生物(例如，藍藻)中編碼具有規(guī)定功能的蛋白質(例如，原卟啉原氧化酶)的基因的分離方法進行說明。該基因的分離方法包括以下1)～5)的工序，其作為在其它生物種類的基因數(shù)據(jù)庫中無法發(fā)現(xiàn)與已知蛋白質(例如，來源于擬南芥的原卟啉原氧化酶)同源的其它生物種類來源的蛋白質(例如，藍藻來源的原卟啉原氧化酶)時的基因分離方法，特別有效 1)在特定生物中導入來自特定生物之外的其它生物的編碼互補規(guī)定功能的蛋白質的基因來制備轉化體的工序； 2)隨機破壞轉化體的基因來制備轉化體的變異株的工序； 3)通過使用作用于互補規(guī)定功能的蛋白質而不作用于具有規(guī)定功能的蛋白質的藥劑，或者改變培養(yǎng)條件，從而選擇編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因被破壞的變異株的工序； 4)確定被破壞的編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因的工序； 5)分離被破壞的編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因的工序。
作為上述變異處理，還可以列舉使用甲磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、2，6-二氨基嘌呤(DAP)等藥劑處理細胞的變異處理、使用紫外線處理細胞的變異處理，可優(yōu)選列舉使用可以導入基因水平的變異的轉座體(Transposome)的變異處理。轉座體是轉座子和轉座酶(Transposase)的復合體，可以容易地在許多微生物中導入基因水平的變異(Hoffman，L.M.，Jendrisak，J.J.，Meis，R.J.，Coryshin，I.Y.andRezhikof，S.W.Genetica，108，19-24(2000))。例如，作為使用轉座體的方法，已知有使用EZ::TNTM<KAN-2>Tnp轉座體(EPICENTRE公司制)等的方法。
使用轉座子的突變誘導法，作為基因分析的強大的工具是本領域公知的?；蚱茐闹昕梢酝ㄟ^例如用轉座子導入的對特定抗生素的抗性標記等進行篩選。
通過對這樣獲得的基因破壞株進一步使用作用于互補規(guī)定功能的蛋白質而不作用于具有規(guī)定功能的蛋白質的藥劑，或者改變培養(yǎng)條件，來進行篩選，從而可以選擇編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因由于轉座子的導入而被破壞的變異株。鄰接該轉座子的核苷酸序列，可以通過例如鏈終止法(Sanger F.S.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，755463-5467(1977))進行測定。這樣，通過進行轉座子標記的插入位置分析，可以確定出被破壞的編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因。
作為上述“作用于互補規(guī)定功能的蛋白質而不作用于具有規(guī)定功能的蛋白質的藥劑”，可以優(yōu)選列舉作用于來源于擬南芥的原卟啉原氧化酶，而不作用于藍藻來源的原卟啉原氧化酶的三氟羧草醚(二苯基醚系)、吡草醚(pyraflufen-ethyl)(苯基吡唑系)、丙炔氟草胺(Flumioxazin)(二羧酰亞胺系)。
可是，血紅素和葉綠素由共同的前體δ-氨基乙酰丙酸(ALA)合成。植物、大腸桿菌等中ALA由三個階段的反應“C5型”合成，所述三個階段的反應“C5型”包括1)谷氨?；?tRNA合成酶作用于谷氨酸，生成谷氨?；?tRNA的步驟；2)谷氨酰基-tRNA還原酶作用于生成的谷氨?；?tRNA生成谷氨酸1-半醛的步驟；3)谷氨酸1-半醛氨基變位酶作用于生成的谷氨酸1-半醛。但ALA在動物、農桿菌屬細菌中經ALA合成酶作用于琥珀酰CoA和甘氨酸生成ALA的1階段反應“C4型”來合成。如上所述，農桿菌屬細菌以“C4型”合成ALA，該酶ALA合成酶的存在本身是已知的，但其基因沒被鑒定時，編碼植物來源的谷氨?；?tRNA合成酶、谷氨?；?tRNA還原酶和谷氨酸1-半醛氨基變位酶的基因共轉染農桿菌屬細菌，通過轉座子等隨機破壞轉化農桿菌屬細菌的基因而制備變異株，從該變異株中，選擇在不存在作為谷氨酸1-半醛氨基變位酶抑制劑的gabaculine下生長、在gabaculine存在下死亡的變異株，通過進行該選擇的變異株的轉座子標記的插入位置的分析，可以鑒定來源于農桿菌屬細菌的ALA合成酶基因。因此，作為前述“作用于互補規(guī)定功能的蛋白質而不作用于具有規(guī)定功能的蛋白質的藥劑”，可以列舉作用于來源于植物、大腸桿菌的谷氨酸1-半醛氨基變位酶而不作用于來源于動物、農桿菌屬細菌的δ-氨基乙酰丙酸(ALA)合成酶的gabaculine。
而且，作為通過改變培養(yǎng)條件，從而選擇編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因被破壞的變異株的方法，可以列舉例如根據(jù)溫度條件進行選擇時，通過在常規(guī)培養(yǎng)溫度和高溫(或低溫)下培養(yǎng)基因破壞株，選擇出現(xiàn)生長差別的變異株的方法；例如根據(jù)光條件進行選擇時，通過在通常的光條件和強光下(或弱光下)培養(yǎng)基因破壞株，選擇出現(xiàn)生長差別的變異株的方法；例如根據(jù)pH條件進行選擇時，在常規(guī)pH條件和高pH(或低pH)條件下培養(yǎng)基因破壞株，選擇出現(xiàn)生長差別的變異株的方法等。
以下，通過實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明的技術范圍不受這些實施例的限制。
實施例1 (向藍藻導入擬南芥來源的原卟啉原氧化酶基因) 用RNeasy RNA提取試劑盒(Qiagen公司制)從擬南芥的蓮座葉中提取總RNA。按照常規(guī)方法從獲得的總RNA中純化Poly(A)+mRNA。以獲得的Poly(A)+mRNA作為模板，使用ReverTra-Plus-試劑盒(TOYOBO公司制)，合成cDNA。以合成的cDNA作為模板，使用具有限制性內切酶AseI位點的引物ATHPPOX.Ase1f(序列號3)和引物ATHPPOX.r(序列號4)和TaKaRaLA Taq聚合酶(Takara公司制)，通過PCR擴增擬南芥的原卟啉原氧化酶基因(1.6kbp)后，用AseI切斷該PCR產物。PCR進行28個變性(94℃、30秒)、退火(52℃、45秒)、延伸(72℃、120秒)的循環(huán)。
載體使用了可以用于對藍藻的轉化、帶有卡那霉素抗性的pFS10[Jansson et al，Methods Enzymol(1998)297::pp166]。用限制性內切酶NdeI和HincII切斷該pFS10載體，與前述原卟啉原氧化酶基因的PGR產物連接，制備出重組載體。用熱激法將該重組載體轉化到大腸桿菌(JM109)，用含有卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行選擇。在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)出現(xiàn)的菌落，從其培養(yǎng)物中純化質粒。在后面的工序，即，使用轉座子的變異原處理中，利用卡那霉素抗性作為選擇標記。因此必須除去卡那霉素抗性基因，重新導入其它的抗生素抗性基因(氯霉素抗性基因)。
以pFS10載體作為模板，使用具有XbaI位點的引物Chloram.r(序列號5)和引物SPE2Xbal.r(序列號6)和Pyrobest Taq聚合酶(Takara公司制)，進行第一次PCR。PCR進行25個變性(98℃、10秒)、退火(55℃、45秒)、延伸(72℃、30秒)的循環(huán)。通過該PCR，獲得了約500bp的PCR產物。然后，以氯霉素抗性基因作為模板，使用先前獲得的PCR產物和引物Chloram.Xba1.f(序列號7)和Pyrobest Taq聚合酶(Takara公司制)進行第二次PCR。PCR進行25個變性(98℃、10秒)、退火(50℃、45秒)、延伸(72℃、90秒)的循環(huán)。用限制性內切酶XbaI切斷由該PCR獲得的含有氯霉素抗性基因的PCR產物。
另一方面，用限制性內切酶XbaI切斷連結了擬南芥的原卟啉原氧化酶基因和pFS10載體的前述重組載體，除去卡那霉素抗性基因后，與前述用XbaI切斷的氯霉素抗性基因片段連接，重新獲得重組載體。用與前述相同的方法將該重組載體轉化到大腸桿菌(JM109)，用含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行選擇。在含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)出現(xiàn)的菌落，從其培養(yǎng)物中純化質粒。用該質粒轉化集胞藻屬PCC6803，制備使擬南芥來源的原卟啉原氧化酶表達的集胞藻屬(以下有時稱為“AT株”)。集胞藻屬PCC6803的轉化方法，按照文獻[Williams JG.MethodsEnzymol(1998)167pp766]的方法進行。
實施例2 (利用轉座子制備藍藻變異體) 用Tsp5091限定分解從集胞藻屬PCC6803中提取的基因組，用λZAP載體試劑盒(Stratagene公司制)，制備基因組質粒文庫。用EZ::TNTM<KAN-2>Insertion試劑盒(Epicentre公司制)在體外對基因組質粒文庫插入轉座子。轉座子的插入方法按照Epicentre公司公開的手冊進行。使用插入了該轉座子標記的集胞藻屬基因組質粒文庫，通過同源重組對AT株進行轉化，制備使擬南芥來源的原卟啉原氧化酶表達之后的集胞藻屬變異株。
實施例3 (藍藻原卟啉原氧化酶缺損株的篩選) 使用對三氟羧草醚的感受性作為選擇標記，從實施例2制備的集胞藻屬變異株中進行藍藻原卟啉原氧化酶缺損株的篩選。具體而言，按照以下步驟進行。
在含有終濃度為500μM的三氟羧草醚的BG11瓊脂培養(yǎng)基中，接種實施例2制備的集胞藻屬變異株，用白色熒光燈連續(xù)光照射(光強度30μmol s-1m-2)下，30℃下進行兩周的靜置培養(yǎng)。而且，用不含三氟羧草醚的BG11瓊脂培養(yǎng)基進行同樣的培養(yǎng)。以這些培養(yǎng)的結果為基礎，選擇9株在不存在三氟羧草醚下生長但在三氟羧草醚存在下死亡的變異株。這9株中，將三氟羧草醚存在下生長抑制程度最高的菌株命名為3216株，如下述說明，分析轉座子標記的插入位置，結果發(fā)現(xiàn)轉座子標記插入于推定為蛋白質slr1790的轉錄調節(jié)區(qū)域的位置。
(藍藻變異體的基因分析) 設想兩種方式作為確認轉座子標記插入位置的方法。
(1)由于使用的轉座子導入了作為標記的卡那霉素抗性基因，因此利用該抗生素抗性進行選擇。
具體而言，從變異株中獲得DNA，利用卡那霉素抗性基因中不含的限制性內切酶序列將DNA片段化。用切斷DNA的同樣的限制性內切酶切斷不具有卡那霉素抗性基因的載體。將它們連接然后轉化到大腸桿菌，對在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長的菌落純化質粒，分析序列。
(2)用反向PCR法。與(1)相同，從變異株中獲得DNA，利用轉座子標記中不含有的限制性內切酶序列進行片段化。使其自我連結(環(huán)狀化)，設計朝向轉座子標記的外側的引物，進行PCR反應，分析擴增PCR產物的序列。
首先，用(1)中所示的利用抗生素抗性的方法進行研究。
(1)利用卡那霉素抗性的研究 <藍藻變異體DNA的提取> 在BG11液體培養(yǎng)基中于30℃在明亮的地方培養(yǎng)藍藻變異體(3216株)12天。培養(yǎng)終止后，收集菌體，用SDS法進行提取，結果獲得了約800μg的藍藻變異體DNA。
<用限制性內切酶進行切斷> 分別使用EcoR1、Sac1作為限制性內切酶，切斷藍藻變異體DNA和載體(pUC118)。限制性內切酶處理結束后，用旋轉柱純化片段化的藍藻變異體DNA。為了防止載體的自我連結，進行堿性磷酸酶處理。
<連結> 從數(shù)據(jù)庫中可知如果用上述3種限制性內切酶切斷，則用EcoR1切斷可獲得的平均片段長度為6kb，用Sac1切斷可獲得的平均長度為10kb。參考平均片段長，將插入物/載體的摩爾比調整成3/1和9/1，于12℃連結16小時。
<向大腸桿菌的轉化> 用連結液的一部分，通過熱激法轉化到大腸桿菌(JM109)，用含有卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行選擇。其結果是，在含有卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中沒有發(fā)現(xiàn)菌落。
而且，即使將連結時的插入物/載體的混合比率設為插入物過量，也是相同的結果。利用抗生素抗性的選擇方法在理論上是可行的，但這次的情況，考慮是例如插入物/載體比的條件不匹配等問題所致。存在對條件進行研究的余地，用(2)中所示的反向PCR法進行了研究。
(2)利用反向PCR法進行的研究 對表現(xiàn)型強的3216株進行了研究。以與上述同樣的方法進行了DNA的獲得，使用EcoR1、Kpn1作為限制性內切酶。限制性內切酶處理結束后，用旋轉柱純化DNA片段。
<自我連結> 使用經旋轉柱純化的DNA片段，于12℃進行16小時自我連結。
<第1次和第2次PCR> 反向PCR法時，由于擔心非特異性的條帶的擴增，因此PCR反應分成兩個階段進行。
設計兩組朝向轉座子標記的外側的引物。
第2次PCR的引物使用試劑盒附帶的測序引物。
(第1次PCR用引物) KAN-2-fr(序列號17) KAN-2-rev(序列號18) (第2次PCR用引物) KAN-2FP1(序列號19) KAN-2RP1(序列號20) 將自我連結的基因組片段作為模板進行第1次PCR。第1次PCR條件為30個98℃10秒(變性)、55℃30秒(退火)、72℃7分(延伸)的循環(huán)，使用EX taq聚合酶(Takara公司制)，引物濃度為最終各0.5μM。
在上述連結液50倍稀釋、250倍稀釋、1250倍稀釋這三個階段研究模板的終濃度。取5μl PCR產物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行確認。電泳結果，只在使用由EcoR1切斷的模板時在7kb附近發(fā)現(xiàn)了特異的條帶擴增。為了除去引物，用旋轉柱純化第1次PCR產物，作為第2次PCR的模板。
第2次PCR條件為3個98℃10秒(變性)、60℃30秒(退火)、72℃5分鐘(延伸)的循環(huán)后，20個98℃10秒(變性)、58℃30秒(退火)、72℃5分鐘(延伸)的循環(huán)，使用EX taq聚合酶(Takara公司制)，引物濃度為最終各0.5μM來進行。
取5μl PCR產物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行確認。
其結果，通過引物的設計，在比第1次PCR產物低數(shù)百個bp的位置發(fā)現(xiàn)了條帶的擴增，同時還發(fā)現(xiàn)了非特異性的條帶的擴增。
<TA克隆和質粒的純化> 進行了第2次PCR的條件的研究，但無法抑制非特異性條帶的擴增，因此對于第1次PCR中特異性擴增的7kb附近的條帶進行了凝膠回收。將其作為插入物，進行TA克隆(使用pGEM-T Easy載體，Promega公司制)，通過熱激法轉化到大腸桿菌(JM109)，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中進行選擇。選擇4個在培養(yǎng)板上出現(xiàn)的菌落，在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用Miniprep法進行質粒的純化。由于用EcoR1處理pGEM-T Easy載體，可以切出插入物，因此對純化的質粒進行EcoR1處理，通過瓊脂糖凝膠電泳進行了確認。
電泳的結果，質粒1和2在5kb、3kb(載體)、1.8kb附近發(fā)現(xiàn)了條帶。插入物來源的條帶的合計大小為7kb左右，判斷為目的克隆。對于質粒1和2，經EcoR1處理發(fā)現(xiàn)了包括載體來源在內的3個被切斷的條帶，這考慮可能是在最初的連結階段未形成環(huán)狀，而形成連環(huán)體。由于序列分析中沒有問題，因此對質粒1進行測序反應。
<測序> 對質粒1，通過雙脫氧法以循環(huán)測序分析堿基序列。
使用第2次PCR中使用的KAN-2FP1和KAN-2RP1作為測序引物。使用的測序引物由于與轉座子標記的DNA區(qū)域退火，因此獲得的序列數(shù)據(jù)的開始部分為轉座子標記的DNA區(qū)域。反向重復序列為轉座子插入克隆的靶DNA和轉座子標記的接點處發(fā)現(xiàn)的19bp轉座子嵌合末端轉座酶(Transposon Mosaic End Transposase)識別序列，該序列可以明顯地識別靶和轉座子標記。
而且，由轉座酶催化的轉座子插入，生成9-bp的靶位點重復序列以保護插入的轉座子的側面。
如果參考這些內容來分析獲得的序列，可以確認轉座子標記插入于藍藻基因組第256677位的T至第256685位的G之間(確認嵌合末端序列和9-bp重復序列)。該位置不包含于ORF區(qū)域中，但認為其為存在于下游的推定蛋白質slr1790(256698～257279，193aa)的轉錄調節(jié)區(qū)域。
在不存在三氟羧草醚下生長但在存在三氟羧草醚下死亡的9株變異株中，對于3216株之外的8株，也進行了同樣的分析，這些株都在與3216株同樣的基因(slr1790)中插入了轉座子標記。
實施例4 (推定蛋白質slr1790的基因破壞株的制備) 為了確認slr1790基因(集胞藻屬基因組256698-257279的600bp)是否編碼原卟啉原氧化酶，使用在slr1790的編碼區(qū)插入了卡那霉素抗性基因的重組載體，對集胞藻屬PCC6803的slr1790基因進行基因破壞。由于藍藻的轉化是通過同源重組進行的，以slr1790基因上游的700bp和下游600bp的序列(集胞藻屬基因組255999-257920的1.9kbp)為基礎設計引物。以從集胞藻屬PCC6803中提取的DNA作為模板，通過使用引物Slr1790km EcoR1 f(序列號8)和引物Slr1790km Hind3r(序列號9)和TaKaRa EX Taq聚合酶(Takara公司制)的PCR，擴增含有slr1790基因上游的700bp和下游600bp的序列的序列，獲得了PCR產物。PCR，進行28個變性(98℃、10秒)、退火(55℃、30秒)、延伸(72℃、120秒)的循環(huán)。將獲得的PCR產物連結到pGEM-T Easy載體(Promega公司制)中。
通過熱激法將連結了含有slr1790基因的序列的載體轉化到大腸桿菌(JM109)，用含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行選擇。在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出現(xiàn)的菌落，從其培養(yǎng)物中純化質粒(pslr1790S)。然后，以包含于轉座子標記中的卡那霉素抗性基因(1.3kbp)為模板，通過使用具有Nhe1位點的引物Km Nhe1 f(序列號10)和引物Km Nhe1r(序列號11)以及TaKaRa EX Taq聚合酶(Takara公司制)的PCR，擴增含有卡那霉素抗性基因的PCR產物。PCR，進行28個變性(98℃、10秒)、退火(58℃、30秒)、延伸(72℃、80秒)的循環(huán)。用Nhe1切斷獲得的PCR產物，將其連結于載體中的slr1790基因中游的Nhe1位點。將其通過熱激法轉化到大腸桿菌(JM109)，用含有卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行選擇。在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出現(xiàn)的菌落，從其培養(yǎng)物中純化質粒(pslr1790SKM)。slr1790基因破壞用的這種構建體示于圖3。用該pslr1790SKM轉化集胞藻屬PCC6803，在含有卡那霉素的BG11瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)該轉化體，選擇slr1790基因破壞株。集胞藻屬PCC6803的轉化方法按照文獻[Williams JG.MethodsEnzymol(1998)167pp766]的方法進行。
實施例5 (推定蛋白質slr1790的基因破壞株的分析) 原卟啉原氧化酶被破壞時，預測作為底物的原卟啉原IX積累，但由于原卟啉原IX非常不穩(wěn)定，因此在提取過程中與空氣中的氧反應而容易氧化成原卟啉IX，因而通過測定在空氣中進行提取操作后的原卟啉IX量，可以判定原卟啉原氧化酶是否被破壞。對于slr1790基因破壞株的原卟啉IX量的測定按照下述方法進行。
用試管，在白色熒光燈的連續(xù)光照射(光強度30μmol s-1m-2)下，在50ml通氣的BG11液體培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)實施例4中獲得的slr1790基因破壞株1周，獲得培養(yǎng)液。用90％丙酮從獲得的培養(yǎng)液中提取含有原卟啉IX的色素，獲得色素提取液。將該色素提取液置于HPLC，在1.2ml/分的流速、柱加熱器40℃的條件下，使用辛基硅柱(Waters Symmetry C8(150×4.6mm))和甲醇(洗脫劑)進行HPLC分析(泵LC-10ATVP和自動采樣器SIL-10ADVP由(株)島津制作所社制)。在激發(fā)波長405nm，熒光波長633nm下進行原卟啉IX的監(jiān)控(熒光檢測器RF-10AXL由(株)島津制作所社制)。其結果示于圖4的C)中。而且，使用不進行slr1790基因破壞的集胞藻屬PCC6803代替該基因的破壞株，進行同樣的分析，結果示于圖4的B)中。而且，原卟啉IX的試樣的色譜圖示于圖4的A)中。
根據(jù)圖4的結果，與沒進行該基因破壞的株相比，在slr1790基因破壞株中發(fā)現(xiàn)了20倍以上的原卟啉IX的積累。如果將這種情況與藍藻的原卟啉原IX或原卟啉IX的代謝相關的酶中，沒有鑒定的酶只是原卟啉原氧化酶的情況綜合考慮，那么就清楚了slr1790編碼原卟啉原氧化酶。slr1790與已知的原卟啉原氧化酶的同源性極低。已知的原卟啉原氧化酶與slr1790的氨基酸水平的同源性示于下表3。
表3 實施例6 (藍藻原卟啉原氧化酶slr1790向集胞藻屬的導入) 使用pBI121作為植物用表達載體。pBI121的概略圖示于圖5中。植物的原卟啉原氧化酶是存在于葉綠體和線粒體中的酶，這次為了使slr1790在葉綠體中表達，將擬南芥來源的葉綠素a加氧酶(CAO，Genbank登錄號BT002075)的葉綠體移行信號連結到slr1790基因，進行導入。利用TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進行移行信號的預測。具體用以下步驟進行。
對pBI121載體(14.8kbp)使用限制性內切酶BamH1和Sac1除去GUS基因(1.9kbp)，通過用凝膠回收殘留的載體部分(12.9kbp)進行純化。而且，以實施例1獲得的擬南芥cDNA作為模板，使用分別具有限制性內切酶BamH1、Sac1識別位點的引物BamSma CAO fr.(序列號12)和Sac CAO rev.(序列號13)和KOD-Plus-聚合酶(TOYOBO公司制)以PCR擴增了CAO來源的葉綠體移行信號(0.2kbp)。PCR，進行30個變性(94℃、15秒)、退火(55℃、30秒)、延伸(68℃、15秒)的循環(huán)。
將這樣獲得PCR產物連結到具有氨芐青霉素抗性的pTA2載體(TOYOBO公司制，KOD-Plus-用TA克隆載體，2.9kbp)后，通過熱激法轉化到大腸桿菌(JM109)，用含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行選擇。在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出現(xiàn)的菌落，純化質粒(pTACAO)。用限制性內切酶BamH1和Sac1切斷質粒pTACAO，切出CAO來源的葉綠體移行信號，通過凝膠回收進行純化。以這種純化的CAO來源的葉綠體移行信號作為插入物，與預先除去GUS基因的pBI121載體連結。用熱激法將其轉化到大腸桿菌(JM109)后，用含有卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行選擇。在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出現(xiàn)的菌落，純化質粒(pBICAO，13.1kbp)。用限制性內切酶Sac1切斷pBICAO，為了防止自我連結，進行CIP處理后，通過凝膠回收純化載體片段。
然后，以從集胞藻屬中提取的基因組作為模板，使用具有限制性內切酶Sac1識別位點的引物Sac slr1790 fr.(序列號14)和Sac slr1790rev.(序列號15)和KOD-Plus-聚合酶(TOYOBO公司制)以PCR擴增了slr1790基因(0.6kbp)。PCR，進行30個變性(94℃、15秒)、退火(55℃、30秒)、延伸(68℃、35秒)的循環(huán)。將這樣獲得的PCR產物連結到具有氨芐青霉素抗性的pTA2載體后，通過熱激法轉化到大腸桿菌(JM109)，用含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行選擇。在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出現(xiàn)的菌落，純化質粒(pTAslr1790Sac)。用限制性內切酶Sac1切斷質粒pTAslr1790Sac，切出slr1790基因，通過凝膠回收進行純化。以這種純化的slr1790基因作為插入物，與預先通過限制性內切酶Sac1切斷的pBICAO連結。用熱激法將其轉化到大腸桿菌(JM109)后，用含有卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行選擇。在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出現(xiàn)的菌落，純化質粒(pBIslr1790，13.6kbp)。pBIslr1790的概略圖示于圖6。
接著，通過冷凍法，使用導入了pBIslr1790的根瘤農桿菌C58株，通過in planta法轉化擬南芥。
首先，將其懸浮于300ml轉化緩沖液(5％蔗糖，0.02％SilwetL-77)中，使得帶有pBIslr1790的根瘤農桿菌C58株的菌體濃度為OD600＝0.8～1.0附近。然后，將帶有芽的罐植的擬南芥的地上部分浸漬于前述懸浮液中30秒，然后，用乙烯袋覆蓋各罐2天。取下覆蓋物后，再繼續(xù)培養(yǎng)，獲得種子。在玻璃房(24h光照，溫度22℃，光強度70μmols-1m-2)中進行栽培。對獲得的種子進行殺菌，播種于含有35ppm的卡那霉素、0.6％的瓊脂的1/2濃度的Murashige-Skoog的培養(yǎng)基[T.Murashige andF.Skoog Physiol.Plant(1962)15pp473]中，獲得轉化體(slr系)。將該轉化體移植到土中，在玻璃房中栽培，獲得第二代的種子。
實施例7 (轉化體的對三氟羧草醚的抗性效果) 對三氟羧草醚的抗性效果是在轉化體第二代中，對可以確認基因導入者研究對三氟羧草醚的抗性。
通過以下方法確認基因導入的有無。
從玻璃房內生長到草的高度為1～2cm左右的轉化擬南芥slr系，直徑2mm左右的各個轉化體中回收葉，提取基因組DNA。將該基因組DNA作為模板，使用與導入的基因的N末端和C末端退火的引物AtCAO-tra-up(序列號16)和Sac slr1790rev.(序列號15)和Taq DNA聚合酶(SIGMA公司制)通過PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳確認條帶的有無。PCR，進行40個變性(95℃、30秒)、退火(55℃、45秒)、延伸(72℃、60秒)的循環(huán)。
對于可以確認基因導入的轉化體，研究了其對三氟羧草醚的抗性效果。三氟羧草醚通過混合并溶解二甲基甲酰胺和聚氧乙烯山梨糖醇酐系表面活性劑，制成有效成分為4％的乳劑。將其用水稀釋成三氟羧草醚的終濃度為10μM，用微量移液管向玻璃房內生長到草的高度為1～2cm左右的擬南芥野生株和確認了基因導入的轉化擬南芥slr系的葉面分別滴下5μl。
持續(xù)研究直至藥液處理7天后，通過目測評價壞死的程度(0～5六個等級評價，0表示沒影響)。處理7天后的結果示于表4。其結果是，與擬南芥野生株相比，可以確認導入slr1790的擬南芥對三氟羧草醚的抗性。
[表4] 表4導入slr1790的擬南芥對三氟羧草醚的抗性效果(處理7天后)
通過目測以5表示完全枯死、0表示沒有影響的0-5的6個等級進行評價。
實施例8 (原卟啉原氧化酶抑制劑的抑制能力試驗) 使用實施例1獲得的AT株和通過實施例4的方法破壞了AT株的slr1790基因的ATΔslr1790株。培養(yǎng)基使用前述的BG11液體培養(yǎng)基，為了抑制基因缺失和回復突變，由于在AT株中導入原卟啉原氧化酶的同時也導入氯霉素抗性基因，因此添加氯霉素至終濃度為25μg/ml，由于ATΔslr1790株在其基因破壞時導入卡那霉素抗性基因，因此添加卡那霉素至終濃度為25μg/ml。收集在BG11液體培養(yǎng)基中進行振蕩前培養(yǎng)的增殖期的AT株、ATΔslr1790株，懸浮于添加了抗生素的新的BG11液體培養(yǎng)基中，使A730達到0.1，然后用于研究。
被驗化合物的原藥溶解于DMSO中，添加到各孔中，使最終藥劑處理濃度為1.0×10-4M-1.0×10-9.5M(最終DMSO濃度為0.5％)。試驗以96孔板每孔中100μl的規(guī)模實施，培養(yǎng)溫度30℃，光強度1000lux的條件下振蕩培養(yǎng)。試驗開始6天后，測定濁度，與溶劑處理區(qū)進行比較，計算pI50值。
pI50值＝-log(50％活性抑制處理濃度(M)) (除草處理活性) 在200cm2的罐中填充土壤，在表層播下莧的種子，輕輕鋪上土后，使之在溫室中生長至草長為5～10cm。用小型噴霧器在莧的莖葉部位以1000升/ha撒播量撒播各被驗化合物的水稀釋液直至規(guī)定的藥量。使之在室溫下生長，處理兩周后按照下述研究標準研究莧的除草效果，以殺草指數(shù)來表示。結果示于下表。
[表5] 研究標準 ※1，3，5，7，9的數(shù)值分別表示0與2，2與4，4與6，6與8，8與10的中間值。
[表6]
[表7] 被驗化合物 ATΔslr1790株對作為二苯基醚系型原卟啉原氧化酶抑制劑的三氟羧草醚之外的試劑也顯示出感受性，原卟啉原氧化酶抑制劑全部顯示出抑制活性。而且，各被驗化合物對ATΔslr1790株的pI50值的傾向分別反映各個莖葉處理活性，可以認為對抑制原卟啉原氧化酶活性能力的評價有效。
實施例9 (對原卟啉原氧化酶抑制劑特異的化合物篩選法) 根據(jù)上述實施例，原卟啉原氧化酶抑制劑對AT株沒有顯示出感受性，對ATΔslr1790株顯示出感受性。另一方面，對非原卟啉原抑制劑用AT株和ATΔslr1790株兩者都顯示出同等程度的抑制活性。這樣一來，通過比較AT株和ATΔslr1790株對化合物的抑制能力，判斷各被驗化合物的原卟啉原氧化酶抑制能力。
工業(yè)上利用的可能性 由于本發(fā)明的原卟啉原氧化酶具有與已知的該酶差異很大的結構，因此可期待在新的原卟啉原氧化酶抑制除草劑的選擇中的應用。而且，可預期本發(fā)明的原卟啉原氧化酶應用于對原卟啉原氧化酶抑制除草劑具有抗性的光合成植物的育種或對惡劣條件具有抵抗性的植物的育種中。而且，如果按照本發(fā)明的基因的分離方法，可以提供即使在其它生物種類的基因數(shù)據(jù)庫中無法發(fā)現(xiàn)與已知的蛋白質同源的其它生物種類來源的蛋白質時，也可以分離其它生物種類的基因的有效方法。
序列表
<110>日本曹達株式會社
國立大學法人北海道大學
<120>具有給予對三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因
<130>00F00753
<150>JP2005-278942
<151>2005-09-26
<160>20
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>582
<212>DNA
<213>集胞藻屬PCC6803
<400>1
atggcctact actggtttaa agccttccac ttgattggca ttgttgtttg gtttgctgga 60
ttattttatt tagtgcgtct ttttgtctat cacgccgagg cagaccagga gccggaacca 120
gctaaaacta tcctcaaaaa acagtatgag ttgatggaaa agcggcttta caacatcatc 180
actacccccg gcatggtagt tacggtggct atggcgatcg gtctcatttt cacagaaccc 240
gaaattctca aatccggctg gctccacatc aaactcacct ttgtggcgtt actgttgctt 300
taccatttct attgtggtcg ggtgatgaaa aagctagccc agggggaatc ccaatggagt 360
gggcaacagt tccgggcttt aaatgaggca ccgactattt tgctcgtggt gattgtccta 420
ctggcggtgt ttaagaataa tttgcccctg gatgcgacca cttggttaat tgtagctttg 480
gttattgcca tggctgcttc gattcaactc tacgctaaaa aacgtcgccg ggaccaagca 540
ctattaacgg aacagcaaaa agcggcttct gctcagaatt ag 582
<210>2
<211>193
<212>PRT
<213>集胞藻屬PCC6803
<400>2
Met Ala Tyr Tyr Trp Phe Lys Ala Phe His Leu Ile Gly Ile Val Val
1 5 10 15
Trp Phe Ala Gly Leu Phe Tyr Leu Val Arg Leu Phe Val Tyr His Ala
20 25 30
Glu Ala Asp Gln Glu Pro Glu Pro Ala Lys Thr Ile Leu Lys Lys Gln
35 40 45
Tyr Glu Leu Met Glu Lys Arg Leu Tyr Asn Ile Ile Thr Thr Pro Gly
50 55 60
Met Val Val Thr Val Ala Met Ala Ile Gly Leu Ile Phe Thr Glu Pro
65 70 75 80
Glu Ile Leu Lys Ser Gly Trp Leu His Ile Lys Leu Thr Phe Val Ala
85 90 95
Leu Leu Leu Leu Tyr His Phe Tyr Cys Gly Arg Val Met Lys Lys Leu
100 105 110
Ala Gln Gly Glu Ser Gln Trp Ser Gly Gln Gln Phe Arg Ala Leu Asn
115 120 125
Glu Ala Pro Thr Ile Leu Leu Val Val Ile Val Leu Leu Ala Val Phe
130 135 140
Lys Asn Asn Leu Pro Leu Asp Ala Thr Thr Trp Leu Ile Val Ala Leu
145 150 155 160
Val Ile Ala Met Ala Ala Ser Ile Gln Leu Tyr Ala Lys Lys Arg Arg
165 170 175
Arg Asp Gln Ala Leu Leu Thr Glu Gln Gln Lys Ala Ala Ser Ala Gln
180 185 190
Asn
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ATHPPOX.Aself
<400>3
ggggattaat ggagttatct cttctccgt 29
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ATHPPOX.r
<400>4
ttacttgtaa gcgtaccgtg 20
<210>5
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Chloram.r
<400>5
gctaaccgtt tttatcacct ggggggcacc ttatttt37
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物SPE2Xbal.r
<400>6
tgtttctaga taatcctggt c 21
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Chloram.Xbal.f
<400>7
ggtctagatg atgtccggcg gtgctttt 28
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Slr1790km EcoR1 f
<400>8
ggggaattct gcttgcatca atatggtggc 30
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Slr1790km Hind3r
<400>9
gggaagctta ccctggagat ccactggtt 29
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Km Nhel f
<400>10
ggggctagcg cgaagaactc cagcatgaga 30
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Km Nhel r
<400>11
ggggctagca gcttcacgct gccgcaagca ct 32
<210>12
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物BamSma CAO fr.
<400>12
gaggatcccc gggtggtcag tcccttatga acgccgccgt gtttagtc 48
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Sac CAO rev.
<400>13
ttacttgtaa gcgtaccgtg 20
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Sac slr1790fr.
<400>14
ccgagctcgc ctactactgg tttaaagcct tc32
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Sac slr1790rev
<400>15
ccgagctcct aattctgagc agaagccgc29
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物AtCAO-tra-up
<400>16
aacgccgccg tgtttagtcc 20
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KAN-2fr
<400>17
ggcctgttga acaagtctgg aa 22
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KAN-2-rev
<400>18
ggcgtttccc gttgaatatg gctc 24
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KAN-2F P1
<400>19
acctacaaca aagctctcat caacc25
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KAN-2R P1
<400>20
gcaatgtaac atcagagatt ttgag2權利要求
1. 原卟啉原氧化酶，其特征在于，具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性并且來源于藍藻。
2. 根據(jù)權利要求1記載的原卟啉原氧化酶，其特征在于，所述藍藻為屬于集胞藻屬的藍藻。
3. 根據(jù)權利要求1或2記載的原卟啉原氧化酶，其特征在于，所述生物為植物。
4. 下述(a)～(c)任一項所示的蛋白質
(a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；
(b)具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質，其特征在于，由序列號2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列構成，并且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性；
(c)具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質，其特征在于，與序列號2所示的氨基酸序列的同源性為20％以上，并且具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性。
5. 根據(jù)權利要求4記載的蛋白質，其特征在于，來源于藍藻。
6. 編碼權利要求1～3中任一項記載的原卟啉原氧化酶或權利要求4或5記載的蛋白質的原卟啉原氧化酶基因DNA。
7. 下述(d)或(e)所示的原卟啉原氧化酶基因DNA
(d)由序列號1所示的堿基序列構成的原卟啉原氧化酶基因DNA；
(e)原卟啉原氧化酶基因DNA，由序列號1所示的堿基序列中缺失、取代或添加了1個或多個堿基的堿基序列構成，并且編碼具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質。
8. 原卟啉原氧化酶基因DNA，在嚴謹條件下與由與序列號1所示的堿基序列互補的序列構成的DNA雜交，并且編碼具有給予生物對三氟羧草醚的抗性的活性且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質。
9. 根據(jù)權利要求7或8任一項記載的原卟啉原氧化酶基因DNA，其特征在于，具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質來源于藍藻。
10. 組入了權利要求6～9中任一項記載的原卟啉原氧化酶基因DNA的重組載體。
11. 轉化體，其特征在于，導入了權利要求10記載的重組載體。
12. 根據(jù)權利要求11記載的轉化體，其特征在于，具有對三氟羧草醚的抗性。
13. 根據(jù)權利要求11或12記載的轉化體，其特征在于，所述轉化體為微生物。
14. 根據(jù)權利要求11或12記載的轉化體，其特征在于，所述轉化體為植物。
15. 根據(jù)權利要求14記載的轉化體，其特征在于，光合成能力提高了。
16. 評價原卟啉原氧化酶抑制活性能力的方法，其特征在于，使用權利要求11～15中任一項記載的轉化體。
17. 篩選原卟啉原氧化酶抑制劑的方法，其特征在于，使用權利要求11～16中任一項記載的轉化體。
18. 包括以下(f)～(j)工序的藍藻的原卟啉原氧化酶基因的分離方法(f)在藍藻中導入擬南芥的原卟啉原氧化酶基因的工序；
(g)使用轉座子破壞藍藻的基因的工序；
(h)選擇原卟啉原氧化酶基因被破壞的菌株的工序；
(i)確定被破壞的原卟啉原氧化酶基因的工序；
(j)分離被破壞的原卟啉原氧化酶基因的工序。
19. 權利要求4或5記載的蛋白質作為原卟啉原氧化酶的使用方法。
20. 人為地使權利要求4或5記載的蛋白質與原卟啉原IX接觸轉換成原卟啉IX的方法。
21. 權利要求6～9中任一項記載的DNA作為原卟啉原氧化酶基因的使用方法。
22. 人為地使權利要求6～9中任一項記載的DNA表達，使其表達產物與原卟啉原IX接觸轉換成原卟啉IX的方法。
23. 包括以下的1)～5)工序的分離特定生物中編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因的方法
1)在特定生物中導入來源于特定生物以外的其它生物的編碼互補規(guī)定功能的蛋白質的基因來制備轉化體的工序；
2)隨機破壞轉化體的基因來制備轉化體的變異株的工序；
3)通過使用作用于互補規(guī)定功能的蛋白質而不作用于具有規(guī)定功能的蛋白質的藥劑，或者改變培養(yǎng)條件，從而選擇編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因被破壞的變異株的工序；
4)確定被破壞的編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因的工序；
5)分離被破壞的編碼具有規(guī)定功能的蛋白質的基因的工序。
24. 根據(jù)權利要求23記載的基因的分離方法，其特征在于，變異處理為使用轉座子的變異處理。
25. 根據(jù)權利要求23或24記載的基因的分離方法，其特征在于，所述來源于特定生物以外的其它生物的互補規(guī)定功能的蛋白質為擬南芥的原卟啉原氧化酶。
26. 根據(jù)權利要求25記載的基因的分離方法，其特征在于，所述作用于互補規(guī)定功能的蛋白質而不作用于具有規(guī)定功能的蛋白質的藥劑為三氟羧草醚。
27. 根據(jù)權利要求25或26記載的基因的分離方法，其特征在于，特定生物中的具有規(guī)定功能的蛋白質為藍藻的原卟啉原氧化酶。
全文摘要
提供了具有給予三氟羧草醚抗性的活性的原卟啉原氧化酶，及其基因等。通過在藍藻中導入擬南芥的原卟啉原氧化酶基因，用轉座子破壞藍藻的基因，選擇出原卟啉原氧化酶基因被破壞的菌株，確定被破壞的原卟啉原氧化酶基因，分離被破壞的原卟啉原氧化酶基因，從而鑒定藍藻的原卟啉原氧化酶基因。該方法，作為在其它生物種類的基因數(shù)據(jù)庫中無法發(fā)現(xiàn)藍藻來源的原卟啉原氧化酶等與已知蛋白質同源的來源于其它生物種類的蛋白質時的基因的分離方法是有效的。
文檔編號C12N1/15GK101278049SQ20068003556
公開日2008年10月1日 申請日期2006年9月25日 優(yōu)先權日2005年9月26日
發(fā)明者田中步, 田中亮一, 加登一成, 深川尊子 申請人:日本曹達株式會社, 國立大學法人北海道大學