專利名稱：：具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苦酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于在洗滌劑、紙和紙漿、石油鉆井(oildrilling)、煉油(oilextraction)、酒和果汁(wineandjuice)、食品成^分(foodingredients)、動物飼#+或紡織品工業(yè)中產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。
背景技術(shù)：
：纖維素是通過(3-l,4-糖苷鍵連接的葡萄糖的聚合物。纖維素鏈形成許多分子內(nèi)和分子間氫鍵，導(dǎo)致不溶性纖維素微原纖維的形成。纖維素微生物水解成葡萄糖涉及以下三類主要的纖維素酶(i)內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2丄4),其在整個纖維素分子中隨機(jī)切割卩-l，4-糖苷鍵，也稱為內(nèi)切-(3-l,4-葡聚糖酶；(ii)纖維二糖水解酶(EC3.2丄91)，其從非還原端消化纖維素，釋放纖維二糖；和(iii)P-葡糖苷酶(EC3.2丄21),其水解纖維二糖和低分子量纖維糊精以釋放葡萄糖。卩-l,4-糖苷鍵也存在于其它天然存在的聚合物中，例如在源自植物例如大麥和燕麥的(3-葡聚糖中。在某些情況下，內(nèi)切葡聚糖酶還提供對這些非纖維素聚合物的水解。纖維素酶由許多微生物產(chǎn)生，并且通常以多種形式存在。對酶降解纖維素的經(jīng)濟(jì)意義的認(rèn)識已經(jīng)推動了對能夠在工業(yè)上使用的微生物纖維素酶的廣泛搜尋。結(jié)果，已經(jīng)多種纖維素酶的酶性質(zhì)和一級結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到了研究?；诖呋Y(jié)構(gòu)域氨基酸序列的疏水簇分析結(jié)果，這些纖維素酶被分成不同的糖基水解酶家族；已將真菌和細(xì)菌糖基水解酶分組為35個家族(Henrissat，B.:Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.280(1991),309-316。Henrissat,B.,andBairoch，A.:Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.293(1993),781-788。)。大多數(shù)纖維素酶由被接頭分開的糖結(jié)合模塊(CBM)和催化結(jié)構(gòu)域(CAD)組成，所述接頭可富含脯氨酸和羥基氨基酸殘基。已經(jīng)基于纖維素酶的CBM的相似性建立了另一種纖維素酶分類法(Gilkesetal.(1991))，該分類生成五個糖基水解酶家族(I-V)。纖維素酶由許多微生物合成，所述微生物包括真菌、放線菌、粘細(xì)菌和真細(xì)菌，但也由植物合成。特別是已經(jīng)鑒定了具有很多種特異性的內(nèi)切-(3-1,4-葡聚糖酶。已經(jīng)描述了許多細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶(Gilbert,H丄andHazlewood，G.P.(1993)丄Gen.Microbiol.139:187-194。Henrissat,B.，andBairoch,A.:Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.293(1993),781-788。)。纖維素分解酶的一個重要工業(yè)用途是用于紙漿的處理，例如用于改進(jìn)再循環(huán)紙的濾水(drainage)或用于再循環(huán)紙的脫墨。纖維素分解酶的另一個重要的工業(yè)用途是用于纖維素紡織品或織物的處理，例如作為洗滌劑組合物或織物柔軟劑組合物中的成分，用于新織物的生物拋光(衣物整理(garmentfinishing)),和用于獲得含纖維素的織物特別是斜紋粗棉布(denim)的"石洗(stone-washed)"夕卜觀，并且已經(jīng)提出用于這種處理的幾種方法，例如在GB-A-1368599、EP-A-0307564和EP陽A-0435876、WO91/17243、WO91/10732、WO91/17244、WO95/24471和WO95/26398中。日本專利申請no.13049/1999公開適合用于洗滌劑的源自芽孢桿菌屬菌種KSM-S237(作為FERM-P-16067保藏)的耐熱》咸性纖維素酶。提供可用于期望纖維素酶，優(yōu)選內(nèi)切-P-l,4-葡聚糖酶活性(內(nèi)切葡聚糖酶，EC3.2.1.4)的應(yīng)用中的新纖維素酶或酶制劑，一直是人們的需求。本發(fā)明的目的是提供多肽和多肽組合物，其在弱酸性至堿性條件下具有實(shí)質(zhì)的(substantial)|3-1，4-葡聚糖酶活性，并且在紙漿加工、紡織品處理、洗衣方法、提取方法或動物飼料中具有改進(jìn)的性能；優(yōu)選的是，這種性能優(yōu)良的新內(nèi)切葡聚糖酶可以使用重組技術(shù)高產(chǎn)率生產(chǎn)，或者是使用重組技術(shù)以高產(chǎn)率生產(chǎn)的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其具有與SEQIDNO:2的氨基酸1至759具有至少72%同一性的氛基酸序列；(b)多肽，其由在至少低嚴(yán)緊條件下與以下雜交的核苷酸序列編碼(i)SEQIDNO:1的核苦酸100至2376,或(ii)(i)的互補(bǔ)鏈；和(c)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至759。本發(fā)明還涉及編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的分離的多核苷酸，其選自下組(a)編碼多肽的多核苦酸，所述多肽具有與SEQIDNO:2的氨基酸1至759具有至少72%同一性的氨基酸序列；(b)多核苷酸，其在至少低嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的核普酸100至2376，或(ii)(i)的互補(bǔ)鏈。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)月包。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生這種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼該多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明的內(nèi)切-P-l,4-葡聚糖酶具有穩(wěn)定性和活性性質(zhì)，這使其非常適合用于與含有表面活性劑和/或氧化活性類物質(zhì)(例如化學(xué)漂白劑)的堿性水溶液相關(guān)的應(yīng)用。這些應(yīng)用條件非常普遍地存在于家用和工業(yè)洗滌劑、紡織品整理處理和纖維素紙漿的制造或再循環(huán)中。因?yàn)楸景l(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶在這些相關(guān)應(yīng)用條件下維持其活性的程度是優(yōu)異的，所以預(yù)期所述內(nèi)切葡聚糖酶將比其它已知的酶更有用，例如，當(dāng)用于洗滌劑中、用于紙/紙漿加工或用于紡織品處理時。因此本發(fā)明也涉及在洗滌劑或紡織品處理組合物、用于紙漿處理或用于生物質(zhì)降解例如用于產(chǎn)生乙醇的組合物中使用本發(fā)明的多肽的方法。此外，本發(fā)明涉及用包含所述多肽的洗滌劑來洗滌紡織品、廚房用具或硬表面的方法，用于處理纖維素紡織品或織物的方法，例如軟化、生物拋光或石洗。還包括用于改進(jìn)再循環(huán)紙的濾inking)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含編碼蛋白質(zhì)的基因的核酸構(gòu)建體，其中所述基因與編碼信號肽的第一核苷S吏序列中的一個或兩個可操作地連接，所述第一核香酸序列由SEQIDNO:1的核苷酸1至99組成。附圖筒述圖1,本發(fā)明的多肽的氨基酸序列(ACE160，SEQIDNO:2)與現(xiàn)有技術(shù)的相關(guān)多肽的比對?，F(xiàn)有技術(shù)多肽公開為名稱登錄號專利號KSM-64ADP87708,GeneseqPJP2004173598KSM-365AAR77395,GeneseqPJP07203960-1994KSM-634AAR07478,GeneseqPJP01281090KSM-S237ADP87707,GeneseqPJP2004173598MB1181ABG76403，Genes叫PWO200299091KSM-635P19424，Uniprot—圖2，顯示本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶(ACE160，SEQIDNO:2)與現(xiàn)有技術(shù)多肽序列之間關(guān)系的系統(tǒng)樹，其通過在DNAStarTM程序包中程序MegAlign版本5.05的ClustalV功能中用默認(rèn)i殳置比對來構(gòu)建。定義內(nèi)切葡聚糖酶活性術(shù)語"內(nèi)切葡聚糖酶活性，，在本文中定義為催化纖維素、地衣淀粉(lichenin)和谷物P-D-葡聚糖中的1,4-(3-D-糖苷鍵內(nèi)切水解(endohydrolysis)的水解活性，EC3.2.1.4。用于測定內(nèi)切葡聚糖酶活性的方法在下文中描述。本發(fā)明的多肽具有由SEQIDNO:2的氨基S復(fù)1至759所示氨基酸序列組成的多肽或由SEQIDNO:2的氨基酸65至347組成的催化核心結(jié)構(gòu)域的內(nèi)切葡聚糖酶活性的至少70%,更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。分離的多肽術(shù)語"分離的多肽"用于本文中指通過SDS-PAGE測定為至少20%純，優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，最優(yōu)選至少90%純，甚至最優(yōu)選至少95%純的多肽?；旧霞兊亩嚯?substantiallypurepolypeptide):術(shù)語"基本上純的多肽"在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計(jì)含有至多10%,優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%,更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%,最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然伴隨的(associated)的其它多肽材料。即，因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多肽是"實(shí)質(zhì)上(essentially)純的形式"，即，所述多肽制備物實(shí)質(zhì)上(essentially)不含與其天然伴隨的其它多肽材料。這可以通過，例如，用公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽來實(shí)現(xiàn)。在本文中，術(shù)語"基本上純的多肽，，與術(shù)語"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。同一性參數(shù)"同一性"描述兩個氨基酸序列之間的相關(guān)性(relatedness)。就本發(fā)明而言，通過使用來自EMBOSS軟件包Oi加:〃emboss.org)版本2.8.0的Needle程序來測定兩個氨基酸序列之間的比對。Needle程序執(zhí)行在Needleman,S.B.andWunsch,CD,(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中描述的總體比對算法。使用的取代矩陣是BLOSUM62，缺口開啟罰分(gap叩eningpenalty)是10，在夬口延伸罰分(gapextensionpenalty)是0.5。本發(fā)明的氨基S交序列("發(fā)明序列"；例如SEQIDNO:2的氨基酸1至759或SEQIDNO:2的氨基酸65至347的催化核心結(jié)構(gòu)域)和另一不同氨基酸序列("外源序列")之間的同一性程度如下計(jì)算用兩個序列比對中完全匹配的數(shù)目除以"發(fā)明序列"的長度或"外源序列"的長度中最短的一個。結(jié)果以百分比同一性表示。當(dāng)"發(fā)明序列"和"外源序列"在重疊的相同位置中具有同一氨基酸殘基(在下述比對實(shí)例中用T表示)，發(fā)生完全匹配。序列的長度是序列中氨基酸殘基的數(shù)目(例如SEQIDNO:2的"發(fā)明序歹'J"的長度是759個氨基酸)。在以下比對實(shí)例中，重疊是序列1的氨基酸序歹'J"HTWGER.NLG";或序列2的氨基酸序列"HGWGEDANLA"。缺口用"."表示。比對實(shí)例序歹ll1:ACMSHTWGER.NLGIIIIII:序歹'J2:HGWGEDANLAMNPS"發(fā)明序列"的重疊的長度可以是"發(fā)明序列"的長度的至少20%，更優(yōu)選"發(fā)明序列"的長度的至少30%、40%、50%、60。/o、70%、80%或至少90%。"外源序列，，的重疊的長度可以是"外源序列，，的長度的至少20%，更優(yōu)選"發(fā)明序列"的長度的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或至少90%。多肽片段術(shù)語"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:2或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的多肽；其中所述片段具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。優(yōu)選地，片段含有至少283個氨基酸殘基，例如，SEQIDNO:2的氨基酸65至347。亞序列(subsequence):術(shù)語"亞序列，，在本文中定義為從SEQIDNO:l或其同源序列的5'和/或3'端缺失一個或多個核苦酸的核苦酸序列；其中所述亞序列編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽片段。優(yōu)選地，亞序列含有至少849個核苷酸，例如，SEQIDNO:l的核酸193至1041。等位變體(allelicvariant):術(shù)語"等位變體，，在本文中表示占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可選形式中的任一種。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語"基本上純的多核芬酸"用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核芬酸制備物處于適合于在基因工程化蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計(jì)含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%,更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然伴隨的其它多核香酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3，非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苦酸是按重量計(jì)至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99。/。，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選的是，本文公開的多核苷酸是"實(shí)質(zhì)上(essentially)純的形式，，，即，所述多核苷酸制備物實(shí)質(zhì)上不含與其天然伴隨的其它多核苷酸材料。在本文中，術(shù)語"基本上純的多核苷酸"與術(shù)語"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。核酸構(gòu)建體術(shù)語"核酸構(gòu)建體"用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的片段。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明的編碼序列表達(dá)所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達(dá)盒"同義。調(diào)控序列(controlsequence):術(shù)語"調(diào)控序列"在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的或有利的所有成分。每種調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列而言可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以具有用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核芬S吏序列編碼區(qū)的連"t妄?？刹僮鞯剡B接術(shù)語"可操作地連接"在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。編碼序列當(dāng)用于本文時術(shù)語"編碼序列，，的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核芬酸序列。表達(dá)術(shù)語"表達(dá)"包括多肽的產(chǎn)生所涉及的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語"表達(dá)載體，，在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核普酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括任何對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等易感的(susceptible)細(xì)胞類發(fā)明詳述具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及具有下述氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至759即成熟多肽具有至少72%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,并且甚至最優(yōu)選至少97%的同一性程度，所述多肽具有內(nèi)切葡聚糖酶活性(下文中稱"同源多肽")。在優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有與SEQIDNO:2的氨基酸1至759相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸的氨基酸序列。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2的氨基S吏序列或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體組成；或由其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的片段組成。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸65至347中的催化核心結(jié)構(gòu)域，或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的片段。催化核心結(jié)構(gòu)域的多肽具有與SEQIDNO:2的氨基酸65至347具有至少86%,更優(yōu)選至少88%,甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少97%的同一性程度的氨基酸序列。在另外的優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸65至347中的催化核心結(jié)構(gòu)域，或其變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的片段。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸65至347組成。對催化核心結(jié)構(gòu)域的注解基于與糖基水解酶家族5的纖維素酶的同源性(HenrissatB.Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.280309-316(1991》HenrissatB.，BairochA.Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.293781-788(1993);HenrissatB.,BairochA.Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases.Biochem.J.316695-696(1996》DaviesG"HenrissatB.Structuresandmechanismsofglycosylhydrolases.Structure3853-859(1995);HenrissatB"ClaeyssensM.,TommeP.,LemesleL.,MornonJ.-P.Cellulasefamiliesrevealedbyhydrophobicclusteranalysis.Gene8183-95(1989);PyB.，Bortoli-GermanI.，HaiechJ"ChippauxM.,BarrasRCellulaseEGZof五rvWw/ac/zrysawf/ze附/:structuralorganizationandimportanceofHis98andGlul33residuesforcatalysis.ProteinEng.4325-333(1991))。催化核心結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域注解可以通過http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/、http:〃www.ebi.ac.uk/interpro/、在本發(fā)明的另一個方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸368至569中的糖結(jié)合模塊。在另一優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及包含糖結(jié)合模塊的多肽，所述糖結(jié)合模塊與SEQIDNO:2的氨基酸368至569具有至少67%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少卯％，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少97%的同一性程度。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸368至569中的糖結(jié)合才莫塊，或其等位變體；或具有糖結(jié)合活性的它們的片段。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸368至569組成。糖結(jié)合模塊屬于家族17/28。CBM的注解基于與已知序列特別是KSM-635的CBM(Ozaki，K.Shikata,S.Kawai,S.Ito,S.Okamoto,K.;"MolecularcloningandnucleotidesequenceofageneforalkalinecellulosefromBacillussp.KSM陽635.";J.Gen.Microbiol.136:1327-1334(1990),UniprotNo.P19424)的同源性，所述KSM-635的CBM的注解為基于與半乳糖結(jié)合樣結(jié)構(gòu)域的相關(guān)性的CBM，所述半乳糖結(jié)合樣結(jié)構(gòu)域在ItoN.,PhillipsS.E.，StevensC.,OgelZ.B.，McPhersonM丄，KeenJ.N.,YadavK.D.，KnowlesP.F.Novelthioetherbondrevealedbya1.7Acrystalstructureofgalactoseoxidase.Nature35087-90(1991);Macedo-ribeiroS.,BodeW.,HuberR.，Quinn畫AllenM.A.，KimS.W"OrtelT丄.，BourenkovG.R,BartunikH.D.,StubbsM.T"KaneW.H.，F(xiàn)uentes-priorP.Crystalstructuresofthemembrane-bindingC2domainofhumancoagulationfactorV.Nature402434-439(1999);HimanenJ.P.，RajashankarK.R.，LackmannM.，CowanC.A.,HenkemeyerM.,NikolovD.B.CrystalstructureofanEphreceptor-ephrincomplex.Nature414933-938(2001)[PUBMED:11780069][PUB00010665];和MarintchevA.,MullenM.A.，MaciejewskiM.W.,PanB.，GrykM.R.,MullenG.P.Solutionstructureofthesingle-strandbreakrepairproteinXRCClN-terminaldomain.Nat.Struct.Biol.6884-893(1999)中描述。糖結(jié)合模塊的結(jié)構(gòu)域注解可通過http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/、http:〃www.ebi.ac.uk/interpro/、http:〃www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/或http:〃www.expasy.org/prosite/獲得。在第二個方面，本發(fā)明涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苦酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選低嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選中-高嚴(yán)緊條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸100至2376，(ii)(i)的亞序列或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,M/ecw/arC7om."g,」丄a6orator少M(fèi)a履a/,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:l的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸，更優(yōu)選300、400、500、600、700、800、900個連續(xù)的核苷酸或甚至更優(yōu)選至少1000個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽片段。可以利用SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段來設(shè)計(jì)核酸探針，根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌抹鑒定和克隆編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。具體而言，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25,更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少.70個核芬酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針的長度是至少100個核苦酸。例如，所述核酸探針的長度可以是至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苦酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸?？梢允褂酶L的探針，例如，長度是至少600個核苷酸，至少700個核苷酸，更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。本發(fā)明包含這些探針。因此，可以在由這些其它生物制備的基因組DNA文庫中篩選與上述探針雜交并且編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的DNA?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)來分離來自這些其它生物的基因組DNA或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素NO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料用在Sounthem印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)緊條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:l所示的核苷酸序列、它的互補(bǔ)鏈或其亞序列?？墒褂美鏧射線膠片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸^l罙針雜交的分子。在優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸193至1041。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:l。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴(yán)緊條件定義為在42。C，在5XSSPE、0.3%SDS、200嗎/ml已剪切并且變性的鮭精DNA，和對于非常低和低嚴(yán)緊性為25%的曱酰胺，對于中和中-高嚴(yán)緊性為35%的甲酰胺，或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)緊性為50%的曱酰胺中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2。/。SDS優(yōu)選至少在M。C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在50。CC(氐嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在M。C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在60。C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選至少在"。C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選至少在70。C(非常高嚴(yán)緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。優(yōu)選地，使用0.2XSSC、0.2。/。SDS優(yōu)選至少在45。C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在50°C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在60。C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選至少在6S。C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選至少在70。C(非常高嚴(yán)緊性)進(jìn)行所述洗滌。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴(yán)緊條件定義為在比才艮據(jù)Bolton和McCarthy計(jì)算法(1962,PraceeWwgsAeiVfl^wa/Jcadewy。/5We"cM48:1390)計(jì)算的Tm低大約5。C至大約10。C的溫度，在0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5%NP-40、1xDenhardt5容'液、1mM焦石舞酉臾4內(nèi)(sodiumpyrophosphate)、1mM石舞酉臾三氛4內(nèi)(sodiummonobasicphosphate)、0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSCC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并使用6XSSC在比計(jì)算的TJ氐5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽，所述多肽由包含SEQIDNO:1的核苷酸193或1041作為獨(dú)特(unique)基序的多核芬酸編碼。在第四個方面，本發(fā)明涉及具有以下理化特性的分離的多肽pl為4.4,最適pH為9，最適溫度為40°C,且在pH5-10.5具有穩(wěn)定性。本發(fā)明的(3-1,4-葡聚糖酶不被Fe(II)離子顯著失活。所述多肽的酶活性對亞鐵離子的存在的敏感性可能限制多肽的可應(yīng)用性，例如在金屬容器或設(shè)備中進(jìn)行的方法。在第五個方面，本發(fā)明涉及人工變體，所述人工變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2或其成熟多肽。優(yōu)選氨基酸改變在性質(zhì)上是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端曱硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進(jìn)純化的小延伸，例如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合^或(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變具體活性(specificactivity)的氨基S吏取代是本領(lǐng)域已知的，并且由侈'B口H.NeurathandR.L.Hill，1979,/"，77ze戶rafe/"s，AcademicPress,NewYork描述。最普遍存在的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了上述20種基本氨基酸，可以用非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-7V-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-曱基絲氨酸)取代野生型多肽的氨基酸殘基。可以用有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸來取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸，，在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修15飾，并且/或者在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括2-哌啶酸(pipecolicacid)、p塞口坐》克酉臾(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氛月甫氛酉交、3-矛口4-曱基脯氨酸，和3，3-二曱基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)，使得多肽的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適pH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變法(CunninghamandWells,1989，>SWe"ce244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，向分子中的每個殘基引入單一丙氨酸突變，并且測試所得突變分子的生物活性(即，內(nèi)切葡聚糖酶活性)以鑒定對于所述分子的活性而言關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見HiltoneZa/.，1996，/C/zem.271:來測定，如通過以下這些技術(shù)如核石茲共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，結(jié)合對推定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來加以測定。參見例如deVos"a/.，1992,&/e"ce255:306-312;Smith"a/.,1992,乂Mo/.224:899-904;Wlodaver"a/.,1992,/^^S309:59-64。也可以從分析同與本發(fā)明多肽相關(guān)的多肽的同一性來推斷必需氨基酸的身份?？梢允褂靡阎恼T變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后進(jìn)行有關(guān)的篩選方;去，侈寸^t口刃卩些由Reidhaar-OlsonandSauer,1988，5We"ce241:53-57;BowieandSauer，1989，戶rac.TVa".86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公開的那些方法來實(shí)現(xiàn)和測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易4晉PCR、噬菌體展示(例如，Lowman"a/.,1991,所oc/zew.30:10832-10837;美國專利號5,223,409;WO92/06204)和區(qū)域定向誘變(Derbyshire^/,,1986,46:145;Ner"a/.，1988,D細(xì)7:127)。具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語"獲得自"的意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌林產(chǎn)生。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬C6a"7/w力多肽，例如嗜堿芽孢桿菌C6ac/〃^a汰a/op/n7w)、解淀斗分芽孑包桿菌(5ac〃/i^附少/0//《1^/^/￡似)、短芽孑包牙干菌(5ac/〃i"Zrev&)、環(huán)^!犬芽孑包4干菌(5ac/〃wsc/rcw/ara)、；疑結(jié)芽孑包才干菌coagw/a""、火山步蘭芽孑包桿菌C5(3"'〃W5/aw/w力、遲緩芽孑包桿菌(5ac〃/ws/e"^s)、地衣芽孑包桿菌(^3c/〃z^//c/zem》r/w'力、巨大芽孑包4干菌(^fi!c/〃i^附egafer/wm)、口耆熱月旨肪芽孑包才干菌(Bac/〃wsWearc^ermo////^)、枯草芽孑包桿菌(萬ac/〃wssw6W//?；蛱K云金芽孑包桿菌(5flc/〃w"/wn'"g/era/力多肽；或鏈霉菌屬(5^e;to7^c&s)多肽，例如，淺青紫鏈霉菌((S^e/to7"ces1//v/^my)或鼠灰鏈零菌(iSyr，圃ycesw,Vw力多狀；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，例如，大腸桿菌或々支單胞菌屬菌種CP"MW.)多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽是芽孢桿菌屬菌種ACE160多肽，例如SEQIDNO:2的多肽。可理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates),和其它分類學(xué)的等同物(equivalent),例如無性型(anamorph)，而與它們已知的種名無關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將輕易地識別適合的等同物的身份。對于公眾而言，這些種的菌抹可以容易地獲自許多培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)，諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物禾口纟田胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選其它微生物的基因組文庫或cDNA文庫來獲得所述多核苦酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)分離或克隆所述多核苷酸(參見,例如，Sambrook^a/.,1989，見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另外的多肽被融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一種多肽的核苦酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷S臾序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們共閱讀框，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動子和終止子的控制下。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸具有編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列。在優(yōu)選的方面，核苷酸序列是SEQIDNO:l中所示。在另一優(yōu)選的方面，核苦酸序列是SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包含編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的核苷酸序列，且由于遺傳密碼的簡并性所述核苷S吏序列不同于SEQIDNO:l。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:l的亞序列，其編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的SEQIDNO:2的片段，例如SEQIDNO:2的氨基酸65至347的催化核心結(jié)構(gòu)域或SEQIDNO:2的氨基酸368至569的片段。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2的氨基酸1至759組成的多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例^口,Innisa/,，1990,尸C7:爿Gw/c/etoMef/zo(iy^wt/AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法，例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于核苷酸序歹1]的擴(kuò)增(NASBA)?？梢詮难挎邨U菌屬的菌抹，或從其它或相關(guān)的生物克隆所述多核苷酸，因此所述多核苷酸可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種間變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列(即，核苷酸100至2376)具有至少60%,優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少97%同一性的同一性程度，所述多核苷酸編碼活性多肽。修飾編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術(shù)語與所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以某些工程改造的方式不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:l的多肽編碼區(qū)提供的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上構(gòu)建變體序列，和/或通過引入如下的核苷酸取代來構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的其它氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物的密碼子用法；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的才既述，參見，例如，F(xiàn)orda/.,1991,戶raZez'wEx/mw/o"awJ戶w〃yca"o"2:95-107。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代可以在對于分子功能至關(guān)重要的區(qū)域之外進(jìn)行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不加以取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸掃描誘變法(參見，例如，CunninghamandWells，1989,Sc/e"ce244:1081-1085)來鑒定。在后一技術(shù)中，在分子中的每個正電殘基處引入突變，測試所得突變分子的內(nèi)切葡聚糖酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點(diǎn)也可以通過分析三維結(jié)構(gòu)來確定，所述三維結(jié)構(gòu)通過如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記這樣的技術(shù)來測定(參見，例如，deVos"a/"1992,6We廳255:306-312;Smitha/.,1992，/。畫a/o/Mo/簡/ar腸/ogy224:899-904;WlodaverWa/"1992，F(xiàn)^^S丄e論rs309:59-64)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選低嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)緊條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴(yán)緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸100至2376,(ii)SEQIDNO:l的核苷酸193至1041，(iii)SEQIDNO:l的核苷酸1104至1707或(iv)(i)至(iii)的互補(bǔ)鏈;或它們的如本文所定義的等位變體和亞序列(Sambrook"a/.,1989,見上文)。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴(yán)緊條件下，將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸100至2376，或(ii)(i)的互補(bǔ)《連；和(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸，其編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苦酸與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識別的核香酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截?cái)嗟暮碗s合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌/ac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌OS^eptom少cescoe/Zco/or)瓊脂糖酶基因0fa^4)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因0acB)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amy丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因O,，7k0、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyi0、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(pe"P)、枯草芽孢桿菌xyM和x_y/B基因和原核(3-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff&a/"1978,/Vocee(i/"gsiV加'ow"/」c"d簡yo/6We"cej"&475:3727-3731)，以及toc啟動子(DeBoer"a/.，1983，Pracee^"^o/AeiVfl/c"a/」cacfew_yo/Sc/e"c&st/S^80:21-25)。另夕卜的啟動子在"Usefolproteinsfromrecombinantbacteria"in5We"孝cyl膨Wcaw,1980,242:74-94中；和在Sambrookda/.，1989,見上文中有所描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉G^;wgz7/M07zae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉CR/zizowMcorm/e/2e/)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(^^erg"/^w'ger)中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(g/"j)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉(A^wg/〃wm'血/a"》乙酰胺酶、鑲片鐮孢CFwan'Mwve"e"a&m)淀粉葡糖芬酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WO00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(WO00/56900)、尖鐮孢(FMsan'Mmox，poram)胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉(7Wc/z^fem^wese/)|3-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶n、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶m、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iv、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶n、里氏木霉p-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性ot-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截?cái)嗟暮碗s合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下蛋白的基因獲得釀酒酵母(&cc/zaramyc^cewWWae)烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氬酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADHl，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動子由Romanos^/.，1992,1fea^8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，即由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地連接。任何在所選宿主細(xì)胞中有功能的終止子均可以在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、黑曲霉ot-葡糖苦酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油酪-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細(xì)l包其它有用的終止子由Romanos&a/.,1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，即對于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5，-末端。在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列均可以在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氬酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺香酸化序列，即與核芬酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細(xì)胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號。在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列均可以在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列記載于GuoandSherman,1995,Mo/ecw/arCe〃w/ar15:5983-5990。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相聯(lián)，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的氨基酸序列。核苷酸序列的編碼序列5，端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。或者，編碼序列5'端可含有與所述編碼序列異源的信號肽編碼區(qū)。在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區(qū)的場合，異源信號肽編碼區(qū)可能是必需的?；蛘?，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)均可以在本發(fā)明中使用。對于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從下列蛋白的基因獲得的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草溶菌素(subtilisin)、地衣芽孢桿菌P-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(wprr、^nS、"pr局和枯草芽孢桿菌SimonenandPalva，1993，Mfcra6/o/og/ca/i^Wewy57:109-137描述了其它信號肽。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從下述蛋白的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉(//"附//0/rao/e"力纖維素酶和3危才帛卄犬腐質(zhì)霉(i/ww/coZa/awMg/"osa)月旨肪酶。在優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)是SEQIDNO:l的核苷酸1至99,其編碼SEQIDNO:2的氨基酸-33至陽l。對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區(qū)由Romanose/a/.,1992,見上文描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化成成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(";^7>釀酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。當(dāng)信號肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，前肽區(qū)緊鄰著(nextto)多肽氨基末端，而信號肽區(qū)緊鄰著前肽區(qū)的氨基末端。此外，最好添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是導(dǎo)致基因表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激，包括調(diào)節(jié)性化合物的存在，而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括/ac、toc和^p操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在曱氨蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和隨重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列可與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。上文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個或多個方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或替換編碼多肽的核苷酸序列?；蛘?，可以通過在合適的用于表達(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，致使該編碼序列與合適的表達(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí)體(entity)存在，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制的載體，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘撸d體可以是當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)粒，或使用共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)的兩個或更多個載體或質(zhì)粒，或可以-使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標(biāo)記，其允許容易地選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。條件性必需基因(conditionallyessentialgene)可以作為非抗生素選4奪性標(biāo)記發(fā)揮作用。細(xì)菌條件性必需非抗生素選擇性標(biāo)記的非限制性例子是來自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或其它芽孢桿菌0^"7//)的&/基因，這些基因僅當(dāng)在缺乏D-丙氨酸條件下培養(yǎng)細(xì)菌時是必需的。當(dāng)將細(xì)胞培養(yǎng)在存在半乳糖的條件下或培養(yǎng)在導(dǎo)致半乳糖存在的培養(yǎng)基中時，編碼UDP-半乳糖更新(turnover)中涉及的酶的基因同樣能夠發(fā)揮細(xì)胞中的條件性必需標(biāo)記的功能。這些基因的非限定性實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌編碼UTP依賴性磷酸化酶(EC2.7.7.10)、UDP-葡萄糖依賴性尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucose-dependenturidylyltransferase)(EC2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向異構(gòu)酶(EC5丄3.2)的那些基因。在以木糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中，木糖異構(gòu)酶基因例如芽孢桿菌屬的^M同樣能夠用作選^H"生標(biāo)記。在以葡糖酸為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中，利用葡糖酸所必需的基因g"W和g"^P也能夠用作選擇性標(biāo)記。其它條件性必需基因的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的。抗生素選擇性標(biāo)記賦予對抗生素如氨千青霉素、卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、新霉素、潮霉素或曱氨喋呤的抗生素抗性。對于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨曱?；D(zhuǎn)移酶)、z^r(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、/z;/z(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、m'oD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、(乳清酸核苦-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和^tC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase》以及它們的等價(jià)物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的am必和；^rG基因和吸水鏈霉菌(6^eptomyc^/^gmsccip/cw力的6ar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或允許載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組自主復(fù)制的元件。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)量的與相應(yīng)目標(biāo)序列具有高度同一性的核酸，如100至10,000個堿基對，優(yōu)選400至10,000個堿基對，并且最優(yōu)選800至10,000個堿基對，以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核苷酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator),其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語"復(fù)制起點(diǎn)"或"質(zhì)粒復(fù)制子"在本文定義為使質(zhì)?；蜉d體能夠體內(nèi)復(fù)制的核苷S臾序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMBl的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMA1和ANSI(Gemsea/.，1991,G面98:61-67;Cullen"a/.,1987，AWe/d油ie廳rc/715:9163-9175;WO00/24883)。分離AMA1基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)粒或載體可以根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成。可以將多于一個拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或包括與多核苷酸一起的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因，其中細(xì)胞含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增的拷貝，并且由此可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇多核苷酸的額外拷貝。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook"a/"1989,見上文)。宿主細(xì)力包本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，將其有利地用于多肽的重組生產(chǎn)中。將包含本發(fā)明多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞中，使得該載體作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為前述的自主復(fù)制的染色體外載體被保持。術(shù)語"宿主細(xì)胞"包含親本細(xì)胞的任何由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而異于親本細(xì)胞的子代。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因和它的來源。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或者是非單細(xì)胞微生物，例j口真一亥生物。有用的單細(xì)胞微生物是細(xì)菌細(xì)胞，例如革蘭氏陽性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌屬細(xì)胞，例如，嗜i咸芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(Ba"7/Mc/aww7)、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬細(xì)胞，例如，淺青紫鏈霉菌和鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌和假單胞菌屬菌種。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬細(xì)胞是嗜堿的芽孢桿菌?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將載體？1入到細(xì)菌宿主細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，ChangandCohen,1979,Mo/ecw/wGe麼a/Ge"W"168:111-115),4吏用感受態(tài)纟田月包(參見，例如,YoungandSpizizen，1961，J。Mwa/o/^Sacten-o/o^81:823-829或DubnauandDavidoff-Abelson,1971,Jbwrm/o/Mo/ecw/arB/o/ogy56:209—221),電穿孑L(參見，侈寸j!口，ShigekawaandDower,1988,腸tec/zw々腦6:742-75l)或接合(參見，例如，KoehlerandThome,1987，Jo畫a/q/"BacteWo/ogv169:5771-5278)。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、才直物或真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。"真菌"用在本文包括以下門子嚢菌門(Ascomycota)、4旦子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworthe/1力/"，oW/z朋(i5/A少i1Z)/"/owar_yo/77zeFwwg/,她edition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth"a/.,1995,見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfongi)(Hawksworth26"g/"1995,見上)。在更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。"酵母"用在本文包括產(chǎn)子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孑包霉目(Endomycetales))、產(chǎn)4旦子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半#、口菌類(FungiImperfecti)(芽孑包纟岡(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如Wo/ogyaw/J"/v/Z^o/1feas/(Skinner,F.A.，Passmore,S.M.,andDave叩ort，R.R.，eds，5bc.」,^acfer/o/.S，尸cw/騰Sen.esNo.9，19S0)中所述。在更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是念珠菌屬(OwAV/a)、漢遜酵母屬(//a/we歷/a)、克魯維酵母屬CS7wyvera/，ce力、畢赤酵母屬(尸/c/z/a)、酵母屬(iS"acc/zara"ca51)、裂殖酵母屬(5b/z/zasacc/2aram^ycas)或西洋蓍霉屬(J^rraw/a)細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母OSbcc/^rawycwcar/s6ergem7's)、S良酒酵母、4唐"f匕酵母0Sacc/iaramjvc&st//asfaft'cws)、道才各4立氏酵母(&cc/zaramycesc/owg7as7.0、克魯弗酵母(&cc/zarom少cesWwyver/)、諾地酵母(Sacc/aramyceswor6em7'力或卯形酵母纟田月包(iSacc/zaromycesovzybrw/s)。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母CS:/《yveramyc"/acto)細(xì)胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉(7arraw/a/^0(yrica)細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth"a/.,1995,見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細(xì)胞菌體(thallus)的出芽(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵性的。在一個甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬(ylcremom'wm)、曲審屬、4豆片更審屬(^"/^060/^"附)、步因管審屬(5/erA:aMcfer(3)、Cen)wn'o/w^、鬼傘屬(Co/n'"m力、革蓋菌屬(Con'o/us)、隱3求菌屬(Oy/tococcw力、網(wǎng)孑包菌屬(尸z7oZos7W/wm)、鐮孑包屬(Fuyan'wm)、腐質(zhì)霉屬(/wm/cok)、梨孢菌屬(M3g"apoW/ze)、毛霉屬(A/wcor)、毀絲霉屬(A^ce//o//^/7c>ra)、誶斤考3馬月旨霉屬(7Veoca〃/mos^/;c)、月永孑包菌屬(7Vewra5pon3)、擬、青霉屬(i^ec〃o附少ces)、青霉屬(尸em'".〃/臓)、平革菌屬(尸/zawmc/2aefe)、射脈菌屬CP/7/e6/a)、瘤胃壺菌屬CP/ramyce力、側(cè)耳屬(尸/ewrafw力、裂褶菌屬(5"c/2/zo//^〃mw)、3果節(jié)菌屬(7^/an9m少ce力、P耆熱子嚢菌屬(772erwooycus1)、斗炎孑包殼屬(777/e/aWa)、彎頸霉屬(7b/，oc/a(i/M附)、檢菌屬(7h3wetes)或木霉屬(7Hc/70c/er附a)纟田月包。在一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉(y^/e^/〃M/訓(xùn)/ga加)、臭曲霉(^5pe^7.〃MS》eri(i—、日本曲審(y^/erg/〃ws/"尸cra'cw力、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是一干孑包卄大鐮孑包(Fwsan'wm6acfnWo/fifes1)、禾谷鐮孑包(Fwsan'wmcerea/Z力、庫威鐮孑包(Fwsan'wmcrao^we〃e"se)、大刀鐮孑包(Fwsan'Mwcw/wo/^m)、禾本牙牛鐮孑包(Fwsar/wmgraw/"earww)、禾赤鐮孑包(Fwsan'wmgram/www)、異孑包鐮孑包(Fz^an'ww/zeferos^orw附)、合7欠木鐮孑包(Fwsan'Mmwegw"<i/)、尖鐮孑包、多4支鐮孑包(FMS(3r/Mm7-e/7'cw/(3fwm)、4分纟工鐮孑包CFi^or/Mmra化ww)、才妄骨木鐮孑包(Fwsan'w"7samZwc/wwm)、月夫色鐮孑包(Fwsan'wmsa/roc/zraww)、擬、分4支孑包鐮孑包(Fz^arz'wm^sporafWc/z/o/cie力、石克色鐮孑包(FMsan'Mmw/p/wreww)、圓鐮孑包(jFYAsanYw7tonJoraw)、4以絲孑包鐮孑包(Fwsan'wmfn'c/7c^/2ec/o/cfe力或4裏片鐮孑包(Fusan'wmve/7e"afwm)纟田月包。在另一最"f尤選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌CSyerfez"cferaa^iwto)、Cen)on'o^^、Ce—on'op^awezWwa、Ce—o":o/m/sca廠eg/ea、Ce"jw"'op^毛革蓋菌(Cor/o/w/7hw^力、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉(Mwcorm/e/ze/)、嗜熱毀絲霉(踏<^//0^/^/20^;Aemw//n7a)、^a4造月永孑包菌(A^wms^oracm^a)、產(chǎn)紫青霉(尸em'c/〃/wm/w/wrage"MW)、黃孑包平革菌(P/a"erac/zaefec"/zoAscw/or/Mm)、輻射射月永菌(尸WeW(3rac^'ata)、尸/ewrafwse;^wg〃、土生4發(fā)孑包殼(77z/e/麵'afermst〃》、絨毛檢菌(7函etov/〃osa)、雜色栓菌(『rameteyvem'co/or)、哈茨木霉(7Hc/20fife削a/zarz/朋Mm)、康亍木霉(7Hc/zo<ierm(3A:0"/"g7'/)、長斗支木審(7/c/z。cfer附"/owg/ferac/zfafw附)、里氏木審或鄉(xiāng)錄色木審(7h'c/zo(iermav/nV/e)菌^朱纟田月包?？梢詫⒄婢?xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton<a/.，1984,PraceW"gso/Atofcwa/爿cacfemyo/Sc/mcmWS^Si:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier&"/.,1989，Ge"e78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法專爭4b酵母BeckerandGuarente,Abelson，J.N.andSimon,M.I.，editors,GWcfeto1fem/G"ewWoyM/ecw/"rA/e/Zzoo^EVzywo/ogy,Volume194，pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Itoa/.,1983,ToM廠wa/o/Bacten'o/c^153:163;和Hinnenda/.，1978,尸raceW"g^Ato/cwa"ccwfe附y(tǒng)q/"Sc/e"cest75^75:1920。產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是芽孢桿菌屬的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區(qū)中具有至少一個突變的突變核苷酸序列，其中所述突變核苷S吏序列編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1-759或SEQIDNO:2的氨基酸65至347或SEQIDNO:2的氨基酸368至569的多肽，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在包含碳源和氮源和無機(jī)鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，可以從所述培養(yǎng)基中直接回收該多肽。如果多肽不分泌，則可以從細(xì)胞裂解物(lysate)回收之。可以使用本領(lǐng)域已知的對于所述多肽具有特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶測定(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常身見方法，包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀等，從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，石克酸銨沉淀)、SDS-PAGE或4是耳又(參見，例^口，尸ra/e/"J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。本發(fā)明還涉及具有內(nèi)切-(3-l,4-葡聚糖酶活性，并且通過上述方法之一生產(chǎn)，優(yōu)選通過重組產(chǎn)生技術(shù)生產(chǎn)的分離的酶。分離的酶優(yōu)選不含同源雜質(zhì)。這些雜質(zhì)可由內(nèi)源內(nèi)切-(3-l，4-葡聚糖酶基因生產(chǎn)，因此如果生產(chǎn)是在不表達(dá)具有內(nèi)切-P-1,4-葡聚糖酶活性的內(nèi)源多肽的宿主細(xì)胞中進(jìn)行的，酶將不含同源雜質(zhì)。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語"富含，，表示所述組合物的內(nèi)切葡聚糖酶活性已經(jīng)得以增加，例如，以至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增加。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物?；蛘?，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氬酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、(x-半乳糖苷酶、)3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、卣素過氧化酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutamiriase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉04verg/〃wacM/ea&力、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、好b色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以將包括于所述組合物中的多肽依照本領(lǐng)域內(nèi)已以下提供的實(shí)施例是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選的用途。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法決定。用途紡織品應(yīng)用在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶在紡織品整理方法例如生物拋光中的用途。生物拋光是對紗線(yarn)表面的特殊處理，其在手感和外觀方面改善織物的質(zhì)量，而不損失織物可濕性。生物拋光最重要的效果特征可在于起毛(fuzz)和起球(pilling)減少、光彩(gloss)/光澤(luster)增加、織物手感改善、持久柔軟性增加及吸水性(waterabsorbency)改變。生物拋光通常在制造針織(knitted)和編織(woven)織物期間的濕加工中進(jìn)行。濕加工包括例如脫漿、沖刷(scouring)、漂白、洗滌、染色/印染和整理等步驟。在這些步驟期間，織物或多或少地經(jīng)受機(jī)械作用。通常而言，在針織或編織紡織品之后，接著對織物進(jìn)行任選的脫漿階段，其后是沖刷階段等。脫漿是從紡織品去除漿料(size)的作用。在機(jī)械織機(jī)上紡織之前，通常用由淀粉或淀粉衍生物組成的漿泮牛包4li至紗(warpyarn)，/人而增加它們的4立伸強(qiáng)度(tensilestrength)。紡織之后，必須在進(jìn)一步加工織物之前將漿料包覆去除以保證均勻和防洗效果。在沖刷過程中，將雜質(zhì)從織物去除。本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶能夠有利地用于纖維素和棉紡織品以及韌皮纖維的沖刷，并且可改進(jìn)雜質(zhì)去除的效率。對纖維素紡織品賦予耐久免燙性(durablepress)的一種最普遍使用的方法是通過纖維素交聯(lián)化學(xué)整理。交聯(lián)使纖維素在分子水平固定，并且顯著減少纖維素衣物收縮和褶鈹。用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶處理經(jīng)耐久免燙處理的纖維素紡織品，可使受應(yīng)力區(qū)域得到選擇性的松弛，從而使邊緣磨損最小化。此外，可以利用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶高效地去除印染方法中使用的紡織品和設(shè)備中多余的羧曱基纖維素基印花色漿(printpaste)。已知為了實(shí)現(xiàn)生物拋光的效果，需要纖維素分解作用和機(jī)械作用的結(jié)合。還已知將纖維素酶處理與柔軟劑的常規(guī)處理相結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)"超柔軟"。預(yù)期本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶和該酶與其它酶的組合用于纖維素物品(cellulosics)(天然的和制造的纖維素物品、織物、衣物、紗線和纖維)生物拋光的用途是有利的，例如能夠?qū)崿F(xiàn)更徹底的拋光。相信可以通過應(yīng)用例如WO93/20278中描述的方法來獲得生物拋光。進(jìn)一步預(yù)期本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶能夠應(yīng)用于同時或順序的紡織品濕加工，包括脫漿、沖刷、漂白、生物拋光、染色和整理的不同組合。石洗已知染色織物，特別是斜紋粗棉布織物或細(xì)斜紋布(jeans)中的"石洗"外觀(局部性的顏色磨損)可以如下提供在浮石存在下洗滌由這種織物制造的斜紋粗棉布或細(xì)斜紋布以提供期望的織物顏色局部性淺化，或通過酶處理所述織物，具體而言用纖維素分解酶處理所述織物。本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶(單獨(dú)或與其它酶組合)的處理可以如US4,832,864中7>開的那樣單獨(dú)進(jìn)行，與用量少于傳統(tǒng)方法所需量的浮石一起進(jìn)行，或者如WO95/09225中公開的那樣與珍珠巖(perlite)—起進(jìn)行。用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶處理斜紋粗棉布織物與常規(guī)方法相比可以減少回染(backstaining)。生物質(zhì)降解可將4艮據(jù)本發(fā)明的酶或酶組合物有利地應(yīng)用，例如如下匿用于去皮(debarking)，即在機(jī)械筒(mechanicaldrum)中去皮之前，用可部分降解富含果膠的形成層的水解酶預(yù)處理，從而導(dǎo)致有利的能源節(jié)約。-用于脫纖維(勻漿(refming)或打漿(beating》，即在勻漿或打漿之前，用水解酶處理含有纖維素纖維的材料，由于酶在纖維表面的水解效果，致使能量消耗降低。-用于纖維改性，即改進(jìn)纖維性質(zhì)(例如為了使粗纖維更柔韌)，其中需要跨越纖維壁的部分水解，所述水解需要較深滲透性的酶。-用于濾水用水解酶處理紙漿可以改善造紙紙漿的濾水能力。使用本發(fā)明的酶或酶組合物可以更有效，例如導(dǎo)致細(xì)粒部分(finesfraction)中的強(qiáng)力水合微原纖維束得到更高程度的松弛，所述強(qiáng)力水合的微原纖維束阻斷纖維之間和造紙機(jī)絲網(wǎng)(wiremesh)中的中空間隙，從而限制濾水速率。木質(zhì)纖維素紙漿的處理可以例如WO93/08275、WO91/02839和WO92/03608中所述進(jìn)行。洗衣本發(fā)明的酶或酶組合物在用于紡織品和衣物的家用或工業(yè)洗滌的洗滌劑組合物中可能是有用的，并且在織物的機(jī)洗處理方法中可能是有用的，所述方法包括在機(jī)洗方法的一個或多個洗滌循環(huán)期間用含有本發(fā)明的酶或酶制劑的洗滌溶液處理織物。用于洗滌過程中的洗滌劑組合物通常包含常規(guī)成分例如表面活性劑(陰離子、非離子、兩性離子、兩性)、增效劑(builder)、漂白劑(過硼酸鹽、過碳酸鹽或過氧化氫)和其它成分，例如WO97/01629中所述，將其通過提述全部并入本文。洗滌劑應(yīng)用可以將本發(fā)明的酶添加至洗滌劑組合物，并且因此成為洗滌劑組合物的成分。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以例如配制為手洗或機(jī)洗的洗滌劑組合物，包括適于預(yù)處理沾污織物的洗衣添加劑組合物和添加了漂洗劑的織物柔軟劑組合物，或?qū)⑵渑渲茷橛糜诔Ｒ?guī)家庭硬表面清理操作的洗滌劑組合物，或配制用于手洗或機(jī)洗的洗碟(dishwashing)操作，特別用于自動洗碟(ADW)。本發(fā)明的內(nèi)切-(3-l,4-葡聚糖酶提供例如改進(jìn)去污和減少污垢再沉積等優(yōu)點(diǎn)。特定的沾污，例如特定的食品沾污含有(3-葡聚糖，其使得完全去除所述沾污難以實(shí)現(xiàn)。同樣，織物的纖維素纖維可能含有由這種酶降解的(3-葡聚糖聚合物，尤其在"非結(jié)晶，，和表面區(qū)。在洗滌過程中，沾污中或織物上的這些卩-葡聚糖的水解使污垢對織物的結(jié)合減少。家庭洗衣過程在一定范圍的條件下進(jìn)行。通常而言，洗滌時間是5-60分鐘，而洗滌溫度是15-60。C,最通常是20-40。C。洗滌溶液通常是中性或堿性，最通常具有pH7-10.5。通常使用漂白劑，尤其用于白色織物的洗滌。這些漂白劑通常是過氧化物漂白劑，例如過硼酸鈉、過碳酸鈉或過氧化氫。在具體的方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的酶的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可包含一種或多種其它的酶例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶和/或過氧化物酶。通常選擇的酶的性質(zhì)應(yīng)該與選擇的洗滌劑相容(即，最適pH，與其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶應(yīng)以有效量存在。蛋白酶:合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些。微生物來源是優(yōu)選的。包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。所述蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草桿菌蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬的那些，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶"7和枯草桿菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例是胰蛋白酶(例如，豬或牛來源)和在WO89/06270和WO94/25583中描述的鐮孢屬蛋白酶。有用的蛋白酶的實(shí)例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的變體，特別是在以下位置中的一個或多個具有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的蛋白酶包括Relase、Alcalase、Savinase、Primase、Everiase、Esperase、Ovozyme、Coronase、Polarzyme和Kannase(NovozymesA/S)，Maxatase、Maxacal、MaxapemTM、Properase、Purafect、PurafectOxPTM、FN2TM、FN3TM、FN4TM和PurafectPrimeTM(GenencorInternational,Inc.),BLAPX和BLAPS(Henkel)。脂肪酶:合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的脂肪酶的實(shí)例包括來自以下的脂肪酶腐質(zhì)霉屬(同物異名嗜熱霉屬(77zermomyce力)，例如，來自疏棉狀腐質(zhì)霉(細(xì)毛嗜熱霉(r/"w《/"oy^))，如EP258068和EP305216中所述，或來自特異腐質(zhì)霉，如WO96/13580中所述，假單胞菌屬脂肪酶，例如，來自產(chǎn)石威假單胞菌CR"/^//^"")或類產(chǎn)堿假單胞菌(/(EP218272)、洋蔥假單胞菌CRcepa"'a)(EP331376)、施氏假單胞菌OR潔zen〕(GB1,372,034)、熒光假單胞菌CRy7womce似)、假單胞菌屬菌種(i^ewcfowoww^.)菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康星假單胞菌CPw'"om/"m^)(WO96/12012)、芽孢桿菌屬脂肪酶，例如，來自枯草芽孢桿菌(Dartoisetal.(1993),BiochemicaetBiophysicaActa,1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌C8./m加7m)(WO91/16422)的脂肪酶。其它實(shí)例是例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的那些脂肪酶變體。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的脂肪酶包括Lipolase和LipolaseUltra(NovozymesA/S)。淀粉酶:合適的淀粉酶(a和/或(3)包括細(xì)菌和真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。淀粉酶包括例如從芽孢桿菌屬獲得的a-淀粉酶，例如，地衣芽孢桿菌的一個特殊菌抹，在GB1,296,839中對其有更詳細(xì)的描述。有用的淀粉酶的實(shí)例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，特別在一個或多個以下位置具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業(yè)上使用的淀粉酶是Duramyl、Termamyf、Stainzyme、Fungamyl和BAN(NovozymesA/S),Rapidase頂、Purastar和PurastarOxAmTM(來自GenencorInternationalInc.)。纖維素酶:其它合適的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如，產(chǎn)生自特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢的真菌纖維素酶，其公開于US4,435,307、US5,648,263、US5，691,178、US5,776,757和WO89/09259。特別合適的纖維素酶是堿性或中性纖維素酶，其具有保護(hù)顏色的益處(colourcarebenefits)。這些纖維素酶的實(shí)例是在EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其它實(shí)例是纖維素酶變體，例如在WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和WO99/01544中描述的那些。35商業(yè)上能夠獲得的纖維素酶包括CelluzymeTM、Renozyme⑧和Carezyme(NovozymesA/S)，Qazinase*PuradaxHATM(GenencorInternationalInc.),和KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。過氧化物酶/氧化酶:合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的過氧化物酶的實(shí)例包括來自鬼傘屬的過氧化物酶，例如來自灰蓋鬼傘的及其變體，如在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中描述的那些。商業(yè)上能夠獲得的過氧化物酶包括Guardzyme(NovozymesA/S)。半纖維素酶:合適的半纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。合適的半纖維素酶包括甘露聚糖酶、地衣聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶(glucorunidase)、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶和阿拉伯呋喃糖苷酶，如WO95/35362中描述。合適的甘露聚糖酶在WO99/64619中描述。通過添加含有一種或多種酶的單獨(dú)的添加劑，或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑，可將洗滌劑酶包括在洗滌劑組合物中?？蓪⒈景l(fā)明的洗滌劑添加劑(即單獨(dú)的添加劑或組合的添加劑)配制成例如，顆粒、液體、漿等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑劑型是顆粒，具體為非粉化性(non-dusting)顆粒，液體，具體為穩(wěn)定的液體，或漿。例如，可以如美國專利號4,106,991和4,661,452中所公開的產(chǎn)生非粉化顆粒，并且可以任選地通過本領(lǐng)域已知的方法包覆。蠟質(zhì)包覆材料(waxycoatingmaterial)的實(shí)例是具有1000至20000的平均摩爾量的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG);具有從16至50個的環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有從12至20個碳原子，并且其中存在15至80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單g吏甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。適合于流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包覆材料的實(shí)例提供于GB1483591。例如，可根據(jù)已經(jīng)建立的方法通過添加多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩(wěn)定化液體酶制劑?？梢愿鶕?jù)公開于EP238,216中的方法來制備保護(hù)酶。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條、片、粉末、顆粒、糊或液體。液體洗滌劑可以是含水的，通常含有多至70%的水和0-30%的有才幾溶劑，或非7jC性的(non-aqueous)。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，表面活性劑可以是非離子型的，包括半極性型的和/或陰離子型的和/或陽離子型的和/或兩性離子型的。所述表面活性劑通常以"接重量計(jì)0.1%至60%的水平存在。當(dāng)包括于其中時，所述洗滌劑將通常含有大約1%至大約40%的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸鹽、a-烯烴磺酸酯(olefinsulfonate)、烷基硫酸鹽(月旨肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽(alcoholethoxysulfate)、次級鏈烷-黃酸鹽(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸曱酯、烷基-或烯基琥珀酸或肥急(soap)。當(dāng)包括在其中時，洗滌劑將通常含有大約0.2%至大約40%的非離子型表面活性劑，例如脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二曱基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物("葡糖酰胺(glucamide)，，)。洗滌劑可以含有0-65%的洗滌劑增效劑或絡(luò)合劑例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽(phosphonate)、碳酸鹽(carbonate)、檸檬酸鹽、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸鹽或分層硅酸鹽(layeredsilicates)(例如來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實(shí)例是羧曱基纖維素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咬-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯(polycarboxylates)例如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、馬來SH/丙烯S吏共聚物和曱基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可以含有漂白體系，其可以包含H202源例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，H202源可以與形成過酸的漂白激活劑例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯石黃酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合?；蛘?，漂白體系可以包含過氧酸，例如酰胺、二酰亞胺(imide)或砜類型的過氧酸。本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶可以使用常規(guī)穩(wěn)定劑來穩(wěn)定化，例如，多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸(phenylboronicacid)衍生物例如4-曱酰苯基硼酸(4-formylphenylboronicacid),并且可以依照例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制所述組合物。洗滌劑還可以含有其它常規(guī)洗滌劑成分，例如，織物整理劑(fabricconditioner)包括粘土、泡沫促進(jìn)劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、防污漬再沉積劑、染泮十、殺菌劑、光亮劑(opticalbrightener)、水溶助劑(hydrotrope)、晦暗#卩制劑(tarnishinhibitors)或香泮牛。在洗滌劑組合物中的任何酶，特別是本發(fā)明的酶，可以按相當(dāng)于每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別是每升洗滌液0.1-1mg酶蛋白的量添加。還可以將本發(fā)明的酶4參入/>開于WO97/07202的洗滌劑配制物，WO97/07202在本文中作為參考文獻(xiàn)并入。信號肽和前肽本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼蛋白質(zhì)的基因，該基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號肽的核苦酸序列是外源的。本發(fā)明還涉及包含這些核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在適合于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)這種重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)?？梢詫⒌谝缓偷诙塑账嵝蛄袉为?dú)地與其它調(diào)控序列或組合地與其它調(diào)控序列一起可操作地連接至外源基因。這些其它調(diào)控序列如上所述。如前文所述，當(dāng)信號肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的氨基末端時，前肽區(qū)緊鄰著蛋白質(zhì)的氨基末端，并且將信號肽區(qū)緊鄰著前肽區(qū)的氨基末端。蛋白質(zhì)對于宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語"蛋白質(zhì)"在本文的并不意在指稱具體長度的編碼產(chǎn)物，因此涵蓋了肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語"蛋白質(zhì)，，還包含兩種或多種多肽結(jié)合形成的編碼產(chǎn)物。蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，其包含從至少兩種不同的蛋白質(zhì)獲得的部分或完整多肽序列的組合，所述至少兩種不同的蛋白質(zhì)中的一種或多種對于宿主細(xì)胞可以是異源的或天然的。蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白質(zhì)的天然存在的等位變異和工程化變異°優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是激素或其變體，酶，受體或其部分，抗體或其部分，或報(bào)道蛋白(reporter)。在更優(yōu)選的方面，蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構(gòu)酶或連接酶。在甚至更優(yōu)選的方面，蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖香酶、卩-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變位酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶?；蚩梢詮娜魏卧恕⒄婧嘶蚱渌鼇碓传@得。通過以下實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例'用作緩沖劑和底物的化學(xué)品是至少試劑等級的商業(yè)產(chǎn)品。內(nèi)切葡聚糖酶活性測試材料Berol537,由AkzoNobel供應(yīng)的非離子表面活性劑，或類似物(similar)。CellazymeC片劑，由MegazymeInternational,Ireland供應(yīng)。玻璃微纖維濾器，GF/C，9cm直徑，由Whatman供應(yīng)。pH9,5緩沖溶液將21,0gNaHC03和14，6gNaCl溶解在大約900ml去離子水中。添加10mlBerol537(由AkzoNobel供應(yīng)的非離子表面活性劑)。通過添加4NNaOH來調(diào)節(jié)pH至9,5。其后調(diào)節(jié)總體積至1000ml。方法在試管中，混合lmlpH9,5緩沖液和5ml去離子水。添加100微升酶樣品(或具有已知重量:重量稀釋因子的酶樣品稀釋液)。向每個試管中添加1個CellazymeC片劑，蓋上管蓋并且在渦旋混合器上混合10秒。將試管置于恒溫水浴，溫度40。C。在15、30和45分鐘之后，通過顛倒試管來混合試管中的內(nèi)容物，再置于水浴中。60分鐘之后，通過倒置混合試管中的內(nèi)容物，其后通過GF/C濾器過濾。將濾液收集至干凈的試管中。用分光光度計(jì)在590nm測量吸光度(A^(A酵))。通過添加100^1水代替100微升酶稀釋液來測量空白值A(chǔ)water(A水)。計(jì)算Adelta=Aenz-AwaterA她a必須0.5。如果獲得了較高的結(jié)果，以不同的酶稀釋因子進(jìn)行重復(fù)。求出DFO.l，其中DF0.1是得到Adelta=0.1所需的稀釋因子。單位定義1個內(nèi)切-(3-葡聚糖酶活性單位(1EBG)是在上文規(guī)定的測試條件下得出A她a二0.10的酶量。因此，例如，如果給定的酶樣品在以稀釋因子IOO稀釋之后得出Adelta=0.10,則所述酶樣品具有100EBG/g的活性。在pH固定時以不同的溫度范圍運(yùn)行活性測試，或者與之相反，在溫度固定時以不同的pH范圍運(yùn)行活性測試，來測定內(nèi)切葡聚糖酶的最適溫度和pH。實(shí)施例1篩選新的內(nèi)切葡聚糖酶通過將細(xì)菌培養(yǎng)在添加0.1%AZCL-P-葡聚糖(大麥，Megazyme)的TY瓊脂上來篩選多種芽孢桿菌屬菌抹的堿性內(nèi)切葡聚糖酶的產(chǎn)生。菌林ACE160在這種基質(zhì)上產(chǎn)生藍(lán)色暈圈(halo),通過測定部分16SrDNA來鑒定所述細(xì)菌，并且將所述序列插入系統(tǒng)樹后顯示ACE160是芽孢桿菌組05^///附group)的一個新種。實(shí)施例2全長枯草蛋白酶(subtilase)的生產(chǎn)基因組文庫構(gòu)建通過使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Ausubleetal.1995"Currentprotocolsinmolecularbiology"Publ:JohnWileyandsons)制備來自^C￡MC>的染色體DNA。用Sau3A部分切割制備的DNA并且在瓊脂糖凝膠上分離。洗脫3-8kb的片,殳，沉淀，再重懸在合適的緩沖液中。使用StratageneZAPExpressTM預(yù)消化載體試劑盒和StratageneZAPExpressTM預(yù)消化Gigapacl^克隆試劑盒(BamHI預(yù)消化的)(StratageneInc.,USA)遵循銷售商的說明書/建議來制備基因組文庫。所得lambdaZAP文庫包含38000個pfo(蝕斑形成單位)，收集其中10000個進(jìn)行總體切離(massexcision)。匯集(pool)所得的70000個大腸桿菌菌落。將大腸桿菌克隆匯集物(clonepool)通過以100(il的匯集物(pool)與100mlLB培養(yǎng)基混合進(jìn)4亍稀釋后，以每個瓊脂平板100涂布在補(bǔ)充了0.1%AZCL-P-葡聚糖(大麥，Megazyme)和50pg/ml卡那霉素的LB上，并溫育2-3天。50個瓊脂平板上每個平板有1600-1800個菌落，從中獲得了具有藍(lán)色暈圈的三個菌落。從這三個菌落回收了質(zhì)粒DNA并且用載體引物加以測序。通過后續(xù)的引物步移法表征了內(nèi)切-1,4-(3-葡聚糖酶開讀框(ORF)的完整核苷酸序列。三個菌落含有相同的ORF，如SEQIDNO:l所示。全長內(nèi)切葡聚糖酶的產(chǎn)生為了產(chǎn)生內(nèi)切-l，4-P-葡聚糖酶，從野生型芽孢桿菌屬菌種ACE160菌抹的染色體DNA擴(kuò)增基因。使用固有(indigenous)的跨膜信號肽來表達(dá)所述酶。引物ACE160-Bglu-Mlul-4:將內(nèi)切-1,4-(3-葡聚糖酶基因擴(kuò)增為大約2500nt的PCR產(chǎn)物。使用的引物是ACE160-Bglu-Sacl和ACE160-Bglu-Mlul-4。模板DNA是芽孢桿菌屬菌種ACE160的染色體DNA。使用Qiaquicktm離心柱(spincolumn)按照推薦(Qiagen，Germany)回收PCR產(chǎn)物。通過瓊脂糖凝膠電泳來評估分離的模板的質(zhì)量。按照以下方案進(jìn)行PCR:94。C,2分鐘；40個循環(huán)的[94。C30秒，52。C30秒'68。C1分鐘];68。C10分鐘后完成。在TAE緩沖液中在用溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物，確認(rèn)大小正確的單一條帶。用限制酶Sacl和Mlul消化PCR產(chǎn)物并利用GFXPCR及凝膠條帶純化試劑盒(AmerhamBiosciences)力口以纟屯4匕。將消化并且純化的PCR片段連接至SacI和MluI消化的質(zhì)粒pDG268NeoMCS-PramyQ/Prcryin/cryinAstab/Sav(美國專利5,955,310)。使用連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10F，(InvitrogenBV，TheNetherlands)中'并選擇幾個菌落用于小量制備(01八口化？@spin,QIAGENGmbH,Germany)。檢查純化質(zhì)粒的插入序列，然后將純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌菌林TH1中(TH1是一種枯草芽孢桿菌菌抹(amy-鄰o-,apr-,叩r-)，系從菌株DN3(Nooneetal.2000,JBacteriol182(6)1592-1599)通過轉(zhuǎn)化和紅霉素(Erytromycin)選擇，插入構(gòu)建體修飾而來。改變的基因型是ykdA::pDN3(PykdA-lacZPspac-ykdA)Ermr。TH1含有下列特征全長ykdA啟動子與LacZ報(bào)道基因融合。此外將ykdA基因置于IPTG誘導(dǎo)的Pspac啟動子的調(diào)控下，使得ykdA基因不再具有其天然的調(diào)節(jié)?？梢詫⒃摼钟米鞅磉_(dá)克隆和文庫的宿主，而表達(dá)并分泌蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體可以在含有X-gal和IPTG的平板上加以選4f。TH1能夠維持(maintain)在LB瓊脂+6jig/mL紅霉素上)。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在補(bǔ)充了1%脫脂乳、100pg/LX-gal、lmMIPTG、6嗎/ml氯霉素和12lig/ml紅霉素的LB-PG瓊脂平板上。將涂布的細(xì)胞在37。C溫育過夜，挑取具有藍(lán)色并且無透明區(qū)(clearingzone)的菌落，通過PCR和核苷酸測序來確^人正確的插入序列。實(shí)施例3純化來自芽孢桿菌屬菌種ACE160的內(nèi)切葡聚糖酶從670ml發(fā)酵液純化內(nèi)切葡聚糖酶，通過對發(fā)酵液進(jìn)行離心和過濾的組合從所述發(fā)酵液中去除細(xì)胞。用去離子水將體積調(diào)節(jié)至2升并且將pH滴定為8.5。將該材料上樣至用25mMTris緩沖液pH8.5平衡的Q-sepharose柱。施加相同緩沖液中的NaCl梯度來洗脫酶，并匯集含有內(nèi)切葡聚糖酶的級分。將該匯集物的一部分在以100mM乙酸鈉pH6作為液相的S-200凝膠過濾柱上分級。匯集含有內(nèi)切葡聚糖酶的級分，并在Amicon超濾單元上濃縮大約三倍(threetimes)。通過SDSPAGE分析濃縮物，獲得了大約80kD的蛋白質(zhì)帶。實(shí)施例4來自芽孢桿菌屬菌種ACE160的內(nèi)切葡聚糖酶的洗滌性能使用這種方法來測定"酶去垢性效益"。通過將沾污的棉織物樣品和清潔棉織物樣品二者一起在小規(guī)模洗滌測試設(shè)備中洗滌來進(jìn)行洗滌測試。洗滌之后，通過光反射來評估棉織物上的污垢。對原先為沾污的棉織物和原先為清潔的棉織物樣品兩者進(jìn)行評估。棉織物#2003白色紡織100%棉織物，由Tanigashira，4-11-15KomatsuYodogawa-ku，Osaka,533-0004,Japan供應(yīng)。在用于洗滌測試之前，將新的棉織物預(yù)洗滌三次。使用歐洲家用前載式洗衣^Kfront-loaderwashingmachine)進(jìn)行所述預(yù)洗滌，并且使用標(biāo)準(zhǔn)40。C洗滌流程。以0.5g/L的濃度向洗滌水中添加LAS(SurfacSDBS80烷基苯石黃酸鈉，80%)，并且通過加入石友酸鈉將洗滌溶液的pH調(diào)節(jié)至10。在預(yù)洗滌之后，將織物在轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)(tumblerdrier)中干燥。切割出大小5x5cm的經(jīng)預(yù)洗滌的棉織物樣片，大約每個重0.3g，并且將這些樣片用于洗滌測試。沾污的棉樣片從上述的5x5cm樣片制備沾污的棉樣片。使用P-葡聚糖(中等粘度，來源于大麥，由MegazymesInternational,Ireland供應(yīng))和碳黑("用于去垢性測試的碳，，，由SentakuKagakuKyokai,Tokyo,Japan供應(yīng))來制備沾污的樣片。通過攪拌和加溫至〉50。C將大約0.67g(3-葡聚糖溶解在100ml自來水(tapwater)中。添加0.33g碳黑。用UltraTurraxT25混合器進(jìn)行混合，以4000rpm速度進(jìn)行2分鐘。向每個樣片的中央施加250孩￡升(3-葡聚糖/碳。在室溫使其干燥過夜。洗滌測試將三個沾污的樣片和三個清潔的樣片在Mini-Terg-O-Tometer機(jī)器中洗滌。Mini-Terg-O-Tometer是JayC.Harris,"DetergencyEvaluationandTesting",IntersciencePublishersLtd.(1954)pp.60-61中4苗述的Terg-O-Tometer測試洗滌機(jī)的小規(guī)模型號。使用以下條件燒杯大小250ml洗滌;容'液體積100ml洗滌溫度40°C洗滌時間30分鐘攪拌150rpm在開始測試之前將洗滌劑溶液預(yù)熱至40。C。在30分鐘洗滌期開始時添加織物和酶。在洗滌之后，將織物樣片在流動的自來水下漂洗5分鐘，然后展平并且使其在室溫過夜風(fēng)千。儀器評估使用MacbethColorEye7000反射分光光度計(jì)來進(jìn)行織物樣片的光反射評估。測量在500mn進(jìn)行。不包括UV濾光器。在每個樣片的正面和反面上進(jìn)行測量。沾污樣片在沾污區(qū)域的中央進(jìn)行測量。然后由對每種類型的六次測量計(jì)算沾污樣片和清潔樣片的反射的平均結(jié)果(R,500nm)。洗滌劑溶液如下制備洗滌劑溶液對于l升溶液的制備，將0.5g碳酸鈉和l.Og碳酸氫鈉溶解在去離子水中，并且添加2ml含有117.8g/1CaCl2.2H20和54.3g/1MgCl2.6H20的溶液。這種鈣/鎂的添加提供了12。dH的水硬度。添加0.2g非離子表面活性劑(Berof537，AkzoNobel)和0.5gLAS(811遷30@808880烷基苯磺酸鈉，80%)，并且調(diào)節(jié)終體積至1升。調(diào)節(jié)pH至pH9.5士0.1(通過添加碳酸鈉或10%檸檬酸溶液)。酶添加將待測試的酶以已知濃度預(yù)溶解在水中，并且在洗滌流程開始時將所需量的酶添加至洗滌劑溶液。計(jì)算酶的去垢性效益酶的去垢性效益是對在洗滌測試中納入酶之后，樣片(原為沾污和原為清潔的)變得清潔了多少的量度。如下計(jì)算酶的去垢性效<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>在洗滌測試之后，沾污樣品的平均R,500nm值是R，沾污。在洗滌測試之后，清潔樣品的平均R，500nm值是R，清潔。對于使用酶的洗滌測試，酶去垢性效益是有酶時的R，沾污+R,清潔之和減去無酶時的R,沾污+R,清潔之和。以這種方法測定的酶的去垢性效益值是對污垢從織物的去除和污垢在織物上的再沉積的組合量度。因此酶的去垢性效益值可具有負(fù)值或正值?？蓪⒚傅娜ス感孕б嬷涤糜诒容^不同的酶的性能。最高的正去垢性效益值是優(yōu)選的結(jié)果。為了比較，將源自芽孢桿菌屬菌種ACE160的內(nèi)切葡聚糖酶的洗滌性能與現(xiàn)有技術(shù)WO2002/099091中公開的芽孢桿菌屬內(nèi)切葡聚糖酶MB1181-7的洗滌性能進(jìn)行比較。結(jié)果洗滌溶液中的酶活性ACE160,6EBG/LACE160,12EBG/LMB1181-7，6EBG/LMB1181-7,12EBG/L酶的去垢性效益28,129,915，222，2結(jié)果顯示，源自芽孢桿菌屬菌種ACE160的內(nèi)切葡聚糖酶與已知的內(nèi)切葡聚糖酶相比給出較高的酶去垢性效益。因?yàn)檫@些方面旨在說明本發(fā)明的幾個方面。任何等同的方面意欲在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。當(dāng)然，根據(jù)前文的描述，在本文顯示和描述的內(nèi)容之外對本發(fā)明的各種修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。這些修飾也意欲落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。如有沖突，以包括定義在內(nèi)的本^^開為準(zhǔn)。4權(quán)利要求1.具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組a)多肽，其具有與SEQIDNO2的氨基酸1至759具有至少72％同一性的氨基酸序列；b)多肽，其具有與SEQIDNO2的氨基酸65至347具有至少86％同一性的氨基酸序列；c)多肽，其由在至少低嚴(yán)緊條件下與以下雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO1的核苷酸100至2376，(ii)SEQIDNO1的核苷酸193至1041，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；d)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO2的氨基酸1至759；e)多肽，其由包含SEQIDNO1的核苷酸100至2376或SEQIDNO1的核苷酸193至1041的核苷酸序列編碼。2.權(quán)利要求l的多肽，其中包含SEQIDNO:2的氨基酸368至569的片段具有糖結(jié)合模塊活性。3.權(quán)利要求1或2的多肽，所述多肽具有以下性質(zhì)中的至少一種a)pi為4.4,b)最適pH為9，c)最適溫度為40°C和d)在pH5-10.5的穩(wěn)定性。4.分離的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽的核苦酸序列。5.權(quán)利要求4的分離的多核苷酸，其在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變體核苦酸序列編碼由SEQIDNO:2的氨基酸1至759組成的多肽。6.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求4或5的多核苷酸，所述多核苷酸與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列指導(dǎo)多肽在表達(dá)宿主中的產(chǎn)生。7.重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建體。8.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求7的核酸構(gòu)建體。9.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。10.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，其中所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。11.分離的多核苷酸，其在至少低嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:l的核苷酸100至2376,(ii)SEQIDNO:l的核苷酸193至1041，(iii)SEQIDNO:l的核苦酸1104至1707，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈。12.酶組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-3的多肽。13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其還包含選自下組的一種或多種酶蛋白酶、纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、(3-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂肪酶、過氧化物酶、漆酶、a-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角質(zhì)酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質(zhì)酶、支鏈淀粉酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙酰酯酶、多聚半乳糖酪酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、果膠裂合酶、甘露聚糖酶、果膠曱基酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；或它們的混合物。14.用于降解含纖維素的生物質(zhì)的方法，其中用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽或根據(jù)權(quán)利要求12或13的酶組合物來處理所述生物質(zhì)。15.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽或根據(jù)權(quán)利要求12或13的酶組合物用于降解含纖維素的生物質(zhì)的用途。16.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽或根據(jù)權(quán)利要求12或13的酶組合物在洗滌劑組合物中的用途。17.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽或根據(jù)權(quán)利要求12或13的酶組合物在紡織品整理方法中的用途。18.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽或根據(jù)權(quán)利要求12或13的酶組合物用于在染色的織物中獲得顏色的局部磨損的用途。19.洗滌劑組合物，其包含權(quán)利要求1-3中的多肽或根據(jù)權(quán)利要求12或13的酶組合物。20.紡織品處理組合物，其包含權(quán)利要求1-3中的多肽或根據(jù)權(quán)利要求12或13的酶組合物。全文摘要本發(fā)明涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。文檔編號C12P19/00GK101310017SQ200680043004公開日2008年11月19日申請日期2006年11月15日優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日發(fā)明者凱特杰·S·約翰森,基思·吉布森,普雷本·尼爾森,赫勒·烏特拉普申請人:諾維信公司