專利名稱：人平滑肌細胞的獲得方法及其用途的制作方法
人平滑肌細胞的獲得方法及其用途
本發(fā)明涉及從人肌活檢樣品或從體外分化成為骨骼肌細胞
(hSkMC)的人肌活檢樣品中體外獲得主要包括表達鈣調節(jié)蛋白和 SM-MHC的人平滑肌細胞(hSMC)的細胞群的方法。本發(fā)明還涉及作為 -陂設計成用于人的治療成分的組合物，所述組合物包括可通過所述方 法獲得的分離的平滑肌細胞。本發(fā)明還涉及分離的平滑肌細胞在制備 被設計成用于替換平滑肌細胞的治療組合物中的用途。尤其是，本發(fā) 明涉及所述分離的平滑肌細胞在治療缺血、癌癥或需要損傷組織血管 再生的任意疾病中的用途。最后，本發(fā)明涉及所述平滑肌細胞作為有 效成分的載體在制備被設計成用于需要采用所述活性成分治療的人的 治療組合物中的用途。
存在于血管、腸和膀胱中的平滑肌細胞(SMC)和骨骼肌細胞 (SkMC)為有機體實現(xiàn)機械收縮功能所采用的兩種細胞類型。SMC的 起源復雜，且取決于它們的位置。實際上，胚胎發(fā)生過程中，SMC前 體起源于三個系間質細胞、神經(jīng)褶細胞或來自心外膜的細胞。最近 觀察到在外周血循環(huán)中存在SMC前體。實際上，用于研究(i)血管新生 內膜形成、(ii)動脈移植結果或動脈粥樣硬化斑塊形成所采用的不同動 物模型使得可能表明包含在骨髓細胞中的前體參與這些過程并分化成 為SMC。
成年人中，通過衛(wèi)星細胞群進行骨骼肌細胞修復，單核肌原細胞 位于肌纖維基底層的下面。但看起來這個細胞群是異質的。另外，當 采用它們釋放煙酸己可堿染料的特性(l， 2)通過流式細胞術從骨骼肌 分離的其他多能細胞被移植到通過照射損壞骨髓的小鼠中(2)時，它們 能分化成所有的血液細胞。這個細胞群稱為"邊群"(SP)。通過表達標 志物Scal來確定。然而，它不表達CD34、 ckit和CD45。在適合的培 養(yǎng)條件下，這些細胞能分化成為結蛋白+的肌細胞(1)。其他研究描述 了骨骼肌中存在高細胞"可塑"性的前體細胞(3)。這種骨骼肌似乎包含幾種類型的具有不同多能干細胞'
療、特別是修復治療中可能采用這些容易分離的細胞。隨后可移植離 體培養(yǎng)的這些細胞，它們組成用于自體治療血管病理(缺血后血管再開 成、動脈粥樣硬化、腫瘤血管的穩(wěn)定化.......)的細胞治療產物。
采用涉及存在VEGF的情況下共培養(yǎng)SkMC與膀胱SMC的方法， Hwang JH.等人已描述了大鼠SkMS的分化(4)，這個方法使得可能獲 得表達oSMA的分化的SkMC。
WO 03/027281號公開的國際專利申請(Sakurada Kazuhiro " a/.)也 有記載，它描述了獲得起源于骨骼肌間質組織的多能干細胞群，所述 多能干細胞群能分化成為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞、心肌細胞、脂肪細 胞、血管內皮細胞、血細胞、骨細胞、軟骨細胞、胰腺細胞和肝細胞。
WO 01/94555號公開的國際專利申請(J.P. Marolleau " a/.)也有記 載，它描述了肌肉起源的特征細胞群的獲得方法及它們的用途。該文 件尤其描述了從肌肉組織活檢中獲得細胞群(其主要細胞類型表達
(特別是為了加強心力衰竭藥理治療的移植物)的方法。
因此期望有一種體外獲得主要包括平滑肌細胞(SMC)的細胞群的
方法，特別是從采用所述細胞群治療的個體或患者的肌肉組織樣品中獲得。
這正是本發(fā)明的目的。
因此，本發(fā)明第一方面涉及從人肌活檢樣品或從體外分化成為骨 骼肌細胞(hSkMC)的人肌活檢樣品中體外獲得主要包括表達鈣調節(jié)蛋 白和平滑肌肌球蛋白重鏈(以下稱為SM-MHC)的人平滑肌細胞(hSMC) 的細胞群的方法，
-所述人肌活檢細胞不表達CD31和CD14，以及如果適合，不表 達B和T 、淋巴細^<標志物，和
-所述hSkMC表達CD56、結蛋白和選自MyoD、 Myf5和肌形成 蛋白基因的肌形成基因并能產生多核肌管，
特征為包括如下步驟A) 在包含VEGF(血管內皮生長因子)、優(yōu)選人VEGF的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)所述成肌細胞的人肌活檢細胞，優(yōu)選在沒有膀胱SMC的情況下 進4亍所述培養(yǎng)；和
B) 回收步驟A獲得的hSMC。
在"主要包括人平滑肌細胞(hSMC)"的表述中所采用的術語"主要" 在本文理解為特別指對于獲得的全部細胞群含有至少50%、優(yōu)選至少 60%、 70%、 75%和80%hSMC的細胞群。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法的特征為表達CD56和結蛋白的所述hSkMC 表達MyoD、 Myf5和肌形成蛋白基因。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法的特征為所述hSkMC不表達CD34和CD14。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法的特征為所述hSkMC不表達鈣調節(jié)蛋白和 SM-MHC。優(yōu)選地，本發(fā)明方法的特征為步驟A獲得的所述hSMC 表達鈣調節(jié)蛋白和SM-MHC。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法的特征為步驟A獲得的所述hSMC不表達 MyoD基因。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法的特征為在步驟A從體外分化成為人骨骼 肌細胞(hSkMC)的人肌活檢中獲得的所述hSMC比步驟A采用的所述 hSkMC表達CD56和結蛋白的量明顯較少。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法的特征為步驟A獲得的所述hSMC表達 Myf5和肌形成蛋白。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法的特征為步驟A采用的所述培養(yǎng)基還包括 至少一種生長因子，所述至少一種生長因子選自PDGF-BB(血小板衍 生的生長因子，同型二聚體BB，也稱為同型二聚體bb)、 IGF1(1型胰 島素生長因子)、FGFb(堿性成纖維細胞生長因子)、HGF(肝細胞生長 因子)和TNFo(a腫瘤壞死因子)、TGF/3和在SMC增殖或分化中起作 用的所有其他因子，優(yōu)選為人生長因子。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法的特征為在步驟A從體外分化成為骨骼肌 細胞(hSkMC)的人肌活檢細胞中獲得所述hSMC，特征為通過包括 如下步驟的方法從人肌活檢細胞樣品中獲得所述hSkMC:
a)切碎所述肌活4企樣 品，b) 酶裂解纖維和肌細胞并通過過濾分離個體細胞，
c) 存在生長培養(yǎng)基和/或分化培養(yǎng)基的情況下在粘附細胞的培養(yǎng) 反應器中培養(yǎng)該方法獲得的肌細胞，如果適合，接著一個或幾個擴增 期，
d) 通過分析特異性的細胞標志物鑒定不同培養(yǎng)階段存在的細胞 類型，
e) 選擇所需細胞類型為細胞群主要部分的培養(yǎng)階段，
f) 在e)選擇的培養(yǎng)階段收集細胞群，
g) 如果適合，深度冷凍步驟f)收集的細胞，特別是在選擇的培養(yǎng) 階段制備細胞治療產物。
才艮據(jù)前述方法優(yōu)選的方式，如下進4亍 -在步驟b):
-洗滌培養(yǎng)基A中的切碎物，接著存在釋放酶(liberase)的情況下 酶裂解所述切碎物；
-分離通過濾網(wǎng)過濾獲得的個體細胞，接著離心；和
-洗滌在培養(yǎng)基B中的獲得的沉淀細胞， -在步驟c):
-在培養(yǎng)板上于培養(yǎng)基C中培養(yǎng)步驟b)獲得的細胞，直到獲得約 20-50%的匯合程度或直到第一個肌管出現(xiàn)，接著在PBS(磷酸鹽緩沖鹽 水)中、FCS(胎牛血清)中、隨后在培養(yǎng)基C中洗滌細胞，其中在培養(yǎng) 基C中于擴大的板單元或多層板單元上再次進行培養(yǎng)，以獲得約90% 的匯合程度或第 一個肌管出現(xiàn)；
-收集所述細胞的前一天除去培養(yǎng)基C并用培養(yǎng)基D替換；和
-在PBS然后在培養(yǎng)基A中洗滌獲得的細胞， -如果適合，在步驟f)結束時
-在補充了 0.5。/0(P/V)人白蛋白血清的培養(yǎng)基A中濃縮獲得的所 述細胞，和 —在步驟g):
-在補充了 4。/。(P/V)人白蛋白血清和7.5。/o(V/V)DMSO的培養(yǎng)基A 中進行深度冷凍步驟f)獲得的所述細胞，在37。C解凍，接著用培養(yǎng)基A洗滌后，在培養(yǎng)基中懸浮，
和以上步驟中，所述培養(yǎng)基A、 B、 C和D為2001年12月13日 公開的WO01/94555號國際專利申請(第24和25頁)所定義的，即 培養(yǎng)基A:
-改良的MCDB120培養(yǎng)基(Ham et al., 1988): D-纈氨酸取代L-纈氨酸，去除酚紅和胸苷。 培養(yǎng)基B:
-培養(yǎng)基A + 20%照射的胎牛血清+抗生素。 培養(yǎng)基C:
-培養(yǎng)基B + FGFb(lO ng/ml) + 1 jiiM地塞米松。 溶液D:磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
優(yōu)選地，采用的抗生素為慶大霉素，特別為50 /ig/ml，或青霉素 和鏈霉素的混合物(特別地，分別為100 IU/ml和100 /xg/ml)。
在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法的特征為從根據(jù) WO 01/94555號公開的國際專利申請描述的方法獲得的預先分化成為 hSkMC的人肌活檢細胞中獲得所述hSMC，在該申請描述的方法中， 通過出現(xiàn)占總群至少50%、優(yōu)選至少60%、 70%、 75%和80%的CD56+ 表型群來確定需要的hSkMC細胞類型是細胞群主要部分的培養(yǎng)階段。
優(yōu)選地，占總群至少50%、優(yōu)選至少60%、 70%、 75%和80%的 所述CD56+表型細胞群還具有選自CD10+、 CD13+、結蛋白+、 1型 HLA且不表達2型HLA的至少一個表型、優(yōu)選至少2、3和4個表型。
在一個優(yōu)選的實施方案中，在體外獲得主要包括本發(fā)明hSMC的 細胞群的方法中，/人體外分化成為骨骼肌細胞(hSkMC)的人肌活檢細 胞中獲得所述hSMC,該方法的特征為在步驟A)包含VEGF的所述 培養(yǎng)基為Ham等人(in vitro Cell Dev. Biol.， 24， 833-844， 1998)描述的并 通過D-纈氨酸取代L-纈氨酸、去除酚紅和胸苷而改良的MCDB 120 培養(yǎng)基。
在一個優(yōu)選的實施方案中，在體外獲得主要包括本發(fā)明hSMC的 細胞群的方法中，從人肌活檢細胞樣品中獲得所述hSMC，該方法的 特征為在步驟A)包含VEGF的所述培養(yǎng)基為M199培養(yǎng)基(如培養(yǎng)基199 Gibco， Grand Island, NY)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，體外獲得主要包括本發(fā)明hSMC的細 胞群的方法的特征為在步驟A)中所述培養(yǎng)基包含10ng/ml VEGF。
在一個同樣優(yōu)選的實施方案中，體外獲得主要包括本發(fā)明hSMC 的細胞群的方法的特征為直接獲得所述hSMC或預先分化成為 hSkMC的人肌活檢樣品是從獲得樣品的任意肌肉區(qū)域、優(yōu)選從兒童或 成年個體腿部肌肉獲得的活檢樣品。
另一方面，本發(fā)明包括可通過本發(fā)明方法獲得的分離的人平滑肌 細胞，所述分離的人平滑肌細胞的特征為它們表達鈣調節(jié)蛋白和 SM-MHC。
另一方面，本發(fā)明涉及用作藥物的組合物，所述組合物包括從人 肌活檢細胞樣品或從體外分化成為骨骼肌細胞的人肌活檢細胞中易于 獲得或直接獲得的分離的人平滑肌細胞。
本發(fā)明還包括通過本發(fā)明方法從人肌活檢樣品或從體外分化成為 骨骼肌細胞的人肌活檢樣品中易于獲得或直接獲得的分離的人平滑肌 細胞的用途，或本發(fā)明作為藥物的組合物在制備用于人、特別是用于 所述方法步驟A)中培養(yǎng)的肌活檢細胞所取自的個體的治療組合物中 的用途。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述治療組合物被設計成用于替換或 移植人SMC,優(yōu)選自體替換或移植。
優(yōu)選地，所述治療組合物祐/沒計成用于預防或治療癌癥，優(yōu)選抗 癌化療或放療治療前給藥或同時給藥。
這是因為與正常血管相反，腫瘤血管結構和功能上不同。鑒定腫 瘤血管的特定標志物使得可能靶向這些血管而不損害正常脈管系統(tǒng) (抗生成血管療法)(5)。許多研究已表明腫瘤血管內皮細胞(EC)的功能 變化。最近的結果表明血管周圍的細胞(周細胞或SMC)在腫瘤的微環(huán) 境中經(jīng)歷表型和功能的改變(異常形態(tài)、表達新標志物、低結合EC、 細胞質延伸深度滲透到腫瘤薄壁組織中)(6-8)，因此成為抗生成血管療 法的新靶。實體腫瘤的這些病理生理學特征折衷了常規(guī)細胞毒療法和 靶向療法的遞送和效力。新治療方法在損害肺瘤脈管系統(tǒng)前使其正常
12以促進藥物遞送(參見(9)綜述)。實際上，最近的結果表明在穩(wěn)定和正 ?；[瘤脈管系統(tǒng)后采用組合療法的胂瘤消退的效力(IO)。通過注射 SMC到腫瘤部位或其周圍進行穩(wěn)定腫瘤血管。
這種治療方法(注射通過本發(fā)明方法易于獲得或直接獲得的分離 的人SMC,目的在于正常化腫瘤血管)應該僅優(yōu)選地與化療或放療的 組合進行。為此，定義"治療窗"為注射SMC獲得抗癌癥治療最大效果 的時段。
血管"正?；?，，確保了更具功能性的網(wǎng)絡，由此增強藥物的局部擴 散、更均一遞送和特定藥物起作用所必需的肺瘤氧化。這使得藥物在 肺瘤中更快速和更廣泛地起作用，因此降低了給藥劑量，減少副作用 的先驗嚴重性和頻率。最后，起作用的速度和組合快速限制增殖，因 此常觀察到腫瘤耐藥性現(xiàn)象。
此處提到的細胞療法不組成被設計成用于替換當前療法的新型療 法，但會用作當前提供的化療或放療的補充和/或可能的協(xié)同療法。
優(yōu)選地，所述治療組合物還被設計成用于預防或治療缺血、尤其 是心肌缺血或下肢缺血。
在小鼠治療方案和某些人治療方案中進行的許多研究中注射骨髓 細胞或體外分化的細胞后顯著提高了缺血后的血管再形成(心肌缺血 或下肢缺血)。盡管目前有效整合這些細胞到新生血管中似乎存在一些 問題，但觀察到的基礎效果是有效的。另外，在這些方法中SMC的作 用可能非常重要。最近的結果顯示新血管形成部位處，注射到小鼠 的骨髓細胞僅分化成為內皮周圍細胞，而不分化成為內皮細胞(ll)。
因此，更具體地，本發(fā)明一個目的為通過本發(fā)明方法從人肌活枱r
直接獲得的分離的人平滑肌細胞用于被設計成用于"正?；?腫瘤脈管 系統(tǒng)或缺血后血管再形成的組合物中的用途。
然而，這些細胞也可用作被設計成用于治療動脈硬化癥、慢性靜 脈病癥、血管畸形(如血管瘤)的藥物。
出于這個原因，本發(fā)明目的還為通過本發(fā)明方法從人肌活檢細胞 樣品或從體外分化成為骨骼肌細胞的人肌活檢細胞中易于獲得或直接獲得的分離的人平滑肌細胞在制備被設計成用于預防或治療動脈硬化 癥、動脈炎、慢性靜脈病癥或靜脈畸形、尤其是血管瘤的治療組合物 中的用途。
最后，由于這些細胞向新生血管發(fā)生部位遷移的特性，它們可用 作遞送諸如藥物或抗血管形成因子或促血管形成因子的治療活性成分 的梭子或載體。
因此，在另一個特定方面，本發(fā)明的另一個目的為通過本發(fā)明方 法從人肌活4企細胞樣品或從體外分化成為骨骼肌細胞的人肌活檢細胞 中易于獲得或直接獲得的分離的人平滑肌細胞作為治療活性成分或化
合物給藥的藥物、特別是作為載體的用途，特征為
-轉化所述分離的人平滑肌細胞使得能表達所述活性成分或治療 化合物；或
-修飾所述分離的人平滑肌細胞使得包含需要給藥的所述活性成 分或治療化合物。
本發(fā)明還包括能表達活性成分或治療化合物或包含活性成分或治 療化合物的、通過本發(fā)明方法從人肌活4企細胞樣品或從體外分化成為 骨骼肌細胞的人肌活檢細胞中易于獲得或直接獲得的分離的人平滑肌
物治療的疾病的治療組合物中的用途。
優(yōu)選地，通過本發(fā)明方法從人肌活檢細胞或從體外分化成為骨骼 肌細胞的人肌活檢細胞中易于獲得或直接獲得的分離的人平滑肌細胞 在制備治療組合物中的用途的特征為所述組合物通過靜脈內途徑或 移植給藥。
下文附圖和實施例的說明旨在解釋本發(fā)明，而不是以任意方式限 制其范圍。


圖1A-lC。在包含F(xiàn)GFb的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的骨骼肌細胞的特性。(圖 1A)流式細胞術分析顯示這些細胞表達CD56、結蛋白和CD90,但不 表達CD31、 CD14和CD45。在每個柱狀圖中，黑線對應于采用陰性對照抗體標記的細胞。每個柱狀圖中顯示的虛線對應于采用各柱狀圖
所標明的標志物的特異性抗體標記的細胞。這些柱狀圖代表了 6個樣 品。(圖1B)RT-PCR分析。(圖1C)通過免疫細胞化學分析測定的培養(yǎng) 的骨骼肌細胞的特性。采用抗-IgG對照抗體、抗-oSMA抗體或抗 -SM-MHC標記細胞，接著采用偶聯(lián)了過氧化物酶的二級抗體標記細 胞。
圖2A-2C。(圖2A)在含有FGFb或VEGF的培養(yǎng)基中的骨骼肌細 胞(SkMC)形態(tài)學。(圖2B)在含有FGFb或VEGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 SkMC中特定骨骼肌細胞基因和平滑肌細胞基因表達的RT-PCR分析。 在指定的不同時間收集培養(yǎng)物來制備FRNA。進行RT-PCR，在含有溴 乙錠的瓊脂糖凝膠上分析PCR產物。(圖2C)通過在采用VEGF培養(yǎng)一 個月的SkMC中免疫標記來檢測SM-MHC的表達。采用抗-IgG對照 抗體或抗-SM-MHC抗體標記細胞，接著采用偶聯(lián)了過氧化物酶的二 級抗體標記細胞。
圖3A-3C。采用相差顯微鏡拍攝的照片。將內皮細胞(EC)和肌細 胞一起接種在膠原凝膠表面。24-48小時后，EC與起源于臍帶血前體 分化的SMC(圖3A)、或者與骨骼肌細胞培養(yǎng)后獲得的SMC(圖3C)相 互作用形成網(wǎng)狀物。相反，在這些條件下SkMC不形成網(wǎng)狀物(圖3B)。
圖4A-4C?；|膠部分，HES標記。共注射EC和從骨骼肌細胞 獲得的SMC使得在植入物中形成血管紋理(圖4B)，出現(xiàn)紅細胞(箭頭 水平處的所有點，圖4C更加放大)。相反，在這些同樣的條件下，SkMC 不形成功能性血管網(wǎng)狀物(圖4A)。
圖5A-5F。采用相差顯微鏡拍攝的在含有20。/。胎牛血清(FCS)(圖 5A、 5C和5E)或2。/。FCS(圖5B、 5D和5F)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的SkMC(圖 5A-5D)和SMC(圖5E和5F)的照片。為了誘導細胞形成肌管，將細胞 達到80-90%匯合的培養(yǎng)基更換為補充了 2%FCS的培養(yǎng)基。肌管形成 的消失與添加VEGF到培養(yǎng)基中有關(圖5C-5F)。在具有VEGF情況 下培養(yǎng)的SkMC不能聚結成為多核肌管(圖5D)。
圖6。 SMC分化的程度與VEGFR2表達的降低以及SRF(血清反 應因子)表達的增加有關。在具有FGFb或VEGF的情況下培養(yǎng)的SkMC的三種不同樣品(l、 2和3)的RT-PCR分析。如(16)所述獲得的內皮祖 細胞(EPC)用作VEGF受體(VEGFR)表達的陽性對照和SRF的陰性對 照。無論培養(yǎng)條件如何，SkMC和SMC不表達VEGFR1。在SkMC中， VEGF降低VEGFR2的表達，但刺激SRF mRNA的表達。
實施例 方法
細胞培養(yǎng)
如上述(16)所述獲得從包含在臍帶血的前體離體分化的SMC。在 37°C、含有5%0)2的氛圍于M199培養(yǎng)基(Gibco)中的I型大鼠尾膠原 (60 pg/ml, SIGMA)上培養(yǎng)它們，所述培養(yǎng)基補充了 20%胎牛血清 (FCS)、 25 mM Hepes緩沖液(Gibco)和抗生素與抗真菌溶液(Gibco)以 及10 ng/ml重組的hVEGF(R&D Systems)。每周兩次更換培養(yǎng)基。如 先前描述(12)培養(yǎng)SkMC。為了誘導細胞分化成為肌管，將細胞達到 80-90%匯合的培養(yǎng)基更換為補充了 2%FCS、 25 mM Hepes和抗生素與 抗真菌溶液(Gibco)的培養(yǎng)基。
免疫細胞化學
細胞在載玻片("細胞培養(yǎng)玻片"Lab-Techn, Poly Labo， Strasburg, France)上培養(yǎng)混和并用冷的90%丙酮溶液固定。采用初級抗體。鼠抗 -人oSMA單克隆抗體(1A4， DAKO)和鼠抗-人平滑肌肌球蛋白重鏈單 克隆抗體(SMMS-A, DAKO)。采用(DAKO) En Vision 系統(tǒng)過氧化物 酶(DAB)試劑盒顯示oSMA和SM-MHC。最后用蘇木精對細胞進行復 染。
流式細胞術
用直接針對CD31(5.6E, Coulter)、 CD45/CD14(2D1， M$P9， Becton Dickinson)、 CD56和CD90的抗體直接標記細胞的等分部份。在用透 化試劑IntraprepTM(Coulter)的透化步驟之后采用抗-結蛋白抗體(D33,DAKO)標記細胞。標記后，用1%多聚甲醛固定細胞，并通過流式細 月包術(FACStar流式細月包計，Becton Dickinson)分才斤。
RT-PCR(逆轉錄-聚合酶鏈式反應)
根據(jù)供應商說明采用RNAXELR(EUROBIO, Les Ulis， France)提取 全部RNA。采用"用于RT-PCR(AMV)的第 一條鏈cDNA合成試劑盒" 進行cDNA合成。因此，通過PCR能擴增感興趣的cDNA片斷。PCR 混合物包含lx反應緩沖劑、1.5 mM MgCl2、 0.2 mM脫氧核苷酸混合 物、0.5單位Taq聚合酶和0.2 pM有義引物和反義引物。下述引物用 于RT國PCR: GAPDH正義引物(SEQ ID NO:l): 5， -CCATGG AGA AGG CTGGGG-3，、 GAPDH反義引物(SEQ ID NO:2): 5，-CAAAGTTGT CAT GGA TGA CC- 3，；釣調節(jié)蛋白正義引物(SEQ ID NO:3): 5， 誦AGA-AGT-ATG-ACC-ACC-AGC- 3，、 4丐調節(jié)蛋白反義引物(SEQ ID NO:4): 5，國TAG-AGC畫CCA-ATG國ATG國TTC誦CG畫3，； SM22a正義引物 (SEQIDNO:5): 5 ， -GCA-GTC國CAA-AAT陽TGA-GAA-GA-3 ， 、 SM22a 反義引物(SEQ ID NO:6): 5， —CTG-TTG-CTG-CCC國ATT曙TGA-AG誦3，； 肌形成蛋白正義引物 (SEQ ID NO:7) : 5， -AGC-GCC-CCC-TCG-TGT-ATG- 3，、肌形成蛋白反義引物(SEQ ID NO:8): 5， —TGT-CCC畫CGG畫CAA-CTT國CAG-C- 3，； MyoD正義引物(SEQ IDNO:9): 5， —CGG-CGG-CGG陽AAC-TGC-TAC-GAA-3，、 MyoD反義 引物(SEQIDNO:10): 5， —GGG誦GCG-GGG-GCG-GAA-ACT國T誦3; Myf5 正義引物(SEQ ID NO:ll): 5， —ACC國ATG-GAT-CGG國CGG畫AAG-G國3，、 Myf5 反 義 引 物 (SEQ ID NO: 12) : 5， —AAT-CGG-TGC國TGC-CAA-CTG-GAG- 3，； VEGF-R1正義引物(SEQ ID NO: 13): 5， —CGA CCT TGG TTG TGG CTG ACT-3，、 VEGF-R1反 義引物(SEQ ID NO: 14): 5， -CCC TTC TGG TTG GTG GCT TTG國3，； VEGF-R2正義引物(SEQ ID NO:15): 5， —AAC AAA GTC GGG AGA GGA- 3，、反義引物(SEQ ID NO:16): 5， —TGA CAA GAA GTA GCC AGA AGA國3， ； SRF 正義引物(SEQ ID NO:17) : 5， —AGT-GTG畫TGG-GGG隱AGA畫TTC畫TG- 3，和SRF反義引物(SEQ IDNO: 18): 5， —TCT國CCC-TAG-CAA-CAG-CCC陽TA- 3'。
實施例1:使得可能從祖細胞或分化的骨骼肌細胞獲得大量人SMC的 培養(yǎng)條件
A) 初始細力包群
本發(fā)明方法涉及用于獲得其中一種主要細胞類型為平滑肌細胞類 型的細胞群的方法。該方法可直接應用于肌活檢細胞，或在活檢細胞 分化成為SkMC及這些細胞增殖的初期之后應用于肌活檢細力包。WO 01/94555號公開的國際專利申請(J.P. Marolleau et coll.)確定了從這些 活檢樣品中獲得肌活檢細胞和SkMC的條件及其它們的表型特性。此 外，活檢細胞不表達CD31和CD14。
從幾克肌活檢樣品開始可能獲得幾億個SkMC。這些細胞表達 CD56、結蛋白和諸如Myf5和肌形成蛋白的肌生成基因。然而，它們 不表達CD34、 CD14和諸如鈣調節(jié)蛋白和SM-MHC的SMC的特異性 標志物。這些細胞能聚結并產生多核肌管。
B) 骨骼肌細胞分化成為平滑肌細胞
在單獨存在VEGF或VEGF與其他生長因子(PDGF-BB、 IGFl、 FGFb、 HGF或TNFa)—起存在的情況下，將來自活檢樣品或分化成為 SkMC之后的細胞接種在MCDB或M199培養(yǎng)基中。 釆用的溶液和培養(yǎng)基 培養(yǎng)基A:
-改良的MCDB120培養(yǎng)基(Ham et al., 1988): D-纈氨酸取代L-纈氨酸，去除酚紅和胸苷。 培養(yǎng)基B:
-培養(yǎng)基A + 20。/。照射的胎牛血清+抗生素(50 /xg/ml慶大霉素、 100 IU/ml青霉素或100 /xg/ml鏈霉素)。 培養(yǎng)基C:
-培養(yǎng)基B + FGFb(lO ng/ml) + 1 jiiM地塞米木>。溶液D:磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
(參見WO01/94555號公開的國際專利申請第24和25頁) 培養(yǎng)基E: M199
培養(yǎng)基F: Ml99+除去補體的胎牛血清+ Hepes(25 mM) +抗生素(青 霉素、鏈霉素)和，如果需要，抗霉菌素(如25 pg/ml兩性霉素B，或 如上所顯示的)。培養(yǎng)基G:培養(yǎng)基F + (M199 + FCV + Hepes +抗生素) + VEGF(10ng/ml)。
培養(yǎng)基H:培養(yǎng)基B + (MCDB + FCV +抗生素+地塞米松)+ VEGF(IO ng/ml)。
含有如上所述不同生長因子的培養(yǎng)基。
通過逆轉錄后的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、流式細胞術和免疫細 胞化學分析與培養(yǎng)過程中分化成為SkMC或SMC相關的基因表達。 因此，在含有VEGF的培養(yǎng)基M199或MCDB120中培養(yǎng)一個月之后， 這些細胞表達信使RNA和SMC的特異性蛋白。因此它們表達鈣調節(jié) 蛋白和SM-MHC。并行地，它們較少表達結蛋白和CD56,且根本不 再表達MyoD。然而，持續(xù)表達轉錄因子Myf5和肌形成蛋白。
發(fā)明人還顯示了這些表型修飾導致不同的功能特性。
實施例2:骨骼肌細胞分化為平滑肌細胞
如上所述(12),首先將肌活檢細胞放于含有FGFb的培養(yǎng)基中擴大 培養(yǎng)。為了表征這些細胞的表型，采用流式細胞術(FACS)、逆轉錄聚 合酶鏈式反應(RT-PCR)和免疫細胞化學進行分析。FACS分析表明大 多數(shù)這些細胞對CD56(80.30+19.50%)、結蛋白(92.30+8.48%)和 CD90(91.32+10.19。/o)呈陽性，對內皮標志物CD31、單核細胞標志物 CD14和白細胞標志物CD45呈陰性(圖1A)。 RT-PCR分析表明所述細 胞表達與諸如Myf5、MyoD和肌形成蛋白的肌原細胞有關的標志物(圖 1B)。所述細胞還表達特異性的平滑肌細胞標志物SM22a(圖1B)和 oSMA(圖1C)。但在培養(yǎng)或再生骨骼肌細胞中檢測到平滑肌細胞的某 些亞型(14、 15)。這些細胞不表達諸如釣調節(jié)蛋白(圖1B)和 SM-MHC(圖1 C)的分化的平滑肌細胞的標志物。接著將細胞放于含有VEGF(10ng/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。七天后觀 察到細胞形態(tài)變化(圖2A)。采用RT-PCR技術比較骨骼肌細胞和平滑 肌細胞培養(yǎng)過程中基因表達的變化。對于從培養(yǎng)之后第0、 6、 11或 12和30天的細胞中獲得的RNA中進行所述分析，結果顯示在圖2B 中。觀察到，無論培養(yǎng)條件如何，在整個培養(yǎng)過程中以相似水平表達 編碼SM22a、肌形成蛋白和Myf5的基因。使用FGFb培養(yǎng)的骨骼肌 細胞(SkMC)顯示沒有鈣調節(jié)蛋白表達。但使用VEGF培養(yǎng)一個月之 后，這些細胞表達鉤調節(jié)蛋白mFRNA，并且同時不再表達MyoD(圖 2B)。 SM-MHC的表達證實了這些細胞采用了平滑肌細胞的表型(圖 2C)。由于平滑肌細胞(SMC)中結構基因表達的可變性，普遍接受的見 解為為了使細胞被表征為分化的SMC,需要證實與平滑肌相關的結 構基因的幾種亞型的表達。因此，在SkMC中表達SM22a、鉀調節(jié)蛋 白和SM-MHC強烈表明了培養(yǎng)中的某些細胞采用了分化的SMC特 性。為了確定最佳培養(yǎng)條件，測定了已知的誘導SMC分化或增殖的其 他生長因子。因此，測定了將PDGF BB和/或FGFb和/或HGF和/或 TGFj8和/或IGF1加入到VEGF的培養(yǎng)條件。但沒有觀察到對于SkMC 分化成為SMC或對于它們的增殖的顯著作用。
Frid M.G,等人(13)已證實成年牛內皮含有在體外能通過轉分化過 程獲得SMC表型的細胞。本文通過FACS分析證實培養(yǎng)中的細胞沒有 被內皮細胞(EC)污染。它們不表達諸如CD31的與內皮細胞有關的標 志物(圖1A)。另外，可假定的假設為觀察到的現(xiàn)象不是由外源SMC 造成的簡單污染。這是因為顯示表達與骨骼肌肌形成蛋白、MyoD、 Myf5和結蛋白相關的基因的所有檢測的活檢樣品經(jīng)歷分化成為平滑 肌。
實施例3:功能性測定
獲得平滑肌細胞標志物并不一定意味著這些細胞能分化成為成熟 SMC。
A) I型膠原凝膠中的培養(yǎng)(3D培養(yǎng))方案
根據(jù)供應商的介紹進行I型膠原凝膠中的培養(yǎng)(3D培養(yǎng))(BD Biosciences, Bedford, MA)，即將0.5 ml的1 mg/ml I型大鼠尾膠原 (Becton Dickinson)倒入35 mm直4圣的培養(yǎng)皿(Nunc， Fisher Scientific, Elancourt， France)中，使其在37°C聚合1小時。接著將總數(shù)400 000 個細胞(當內皮細胞與肌細胞混和時，各型細胞為200 000個)接種在凝 膠表面，并在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時。隨后采用相差顯微鏡和"電 荷耦合的，，攝影機Kappa CF1 IDSP觀察到血管網(wǎng)狀物的形成。
結果(參見圖3A-3C):
接著分析細胞在3D膠原結構中組織自身的能力。顯示內皮細胞 (EC)和SMC彼此相互作用在3D培養(yǎng)基中體外形成毛細血管類型的網(wǎng) 狀物。比較了使用FGFb培養(yǎng)的SkMC和與使用VEGF培養(yǎng)的SkMC 結合EC及體外形成毛細血管類型網(wǎng)狀物的能力。觀察到使用VEGF 培養(yǎng)的SkMC能與EC相互作用而形成緊密的管狀網(wǎng)狀物(圖3C),而 使用FGFb培養(yǎng)的SkMC在同樣條件下不能與EC相互作用，不形成 血管網(wǎng)狀物(參見圖3B)。
B)基質膠模型
在NOD-SCID免疫抑制小鼠的基質膠植入物模型中測定了使用 FGFb培養(yǎng)的SkMC或使用VEGF培養(yǎng)的SkMC中各細胞類型形成管 狀脈管結構的能力。方案
DO:將0.2 ml基質膠(BD Biosciences)(含有0.5 mg/ml FGFb)皮下 注射到NOD-SCID免疫抑制小鼠的背部。
Dl:上午亞致死照射(325 rad)小鼠。下午經(jīng)尾靜脈靜脈內注射500 000個細胞。
D10:處死動物，重新獲得植入物并包埋在石蠟中。進行HES染 色(hemalin、曙紅、番紅)并測定(放大4倍、40倍)。結果(參見圖4A-4C):
獲得及再現(xiàn)來自3個不同患者或5個不同患者活檢樣品的SkMC 的這些結果。
在基質膠植入物中，給予使用VEGF培養(yǎng)的EC和SMC或EC和 SkMC使得形成許多管狀類型結構，在光條件下顯示具有紅細胞，證 明了功能型脈管結構的存在(圖4B和4C)。相反，給予與使用FGFb 培養(yǎng)的EC和SkMC不引起任何管狀類型結構的形成，并引起形成紊 亂的細胞聚集(圖4A)。
O在存在VEGF的情況下培養(yǎng)的SkMC在多核肌管中不再聚結 (參見圖5A-5F)
單個成肌細胞聚結成為多核肌管組成了 SkMC的終末分化。通過 將SkMC使用相同初始密度的FGFb或VEGF培養(yǎng)并隨后將培養(yǎng)條件 改變?yōu)榫哂?%胎牛血清的培養(yǎng)基來測定肌管的形成。在這些條件下， 在培養(yǎng)后第IO天出現(xiàn)肌管。和使用FGFb培養(yǎng)的SkMC(圖5B)相反， 使用VEGF培養(yǎng)的SkMC(圖5D)如同SMC(圖5F)不能聚結成為多核肌 管。因此，這些細胞喪失了形成多核肌管的能力。
D) VEGF涉及通過增加表達血清反應因子SRF而誘導SkMC表型轉變 為SMC表型
VEGF是軀體發(fā)育過程和成人中血管形成的主要調節(jié)劑。為了探 測可能的VEGF信號傳導通路，在SkMC和SMC中分析了 VEGFR1 和VEGFR2受體的表達。RT-PCR分析表明SkMC表達大量VEGFR2。 但當在含有VEGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細胞時，觀察到VEGFR2表達 的降低(圖6)。而且，無論培養(yǎng)條件如何，我們沒有檢測到VEGFR1 的表達。因此，這些結果暗示了 VEGFR2在調節(jié)由VEGF刺激的SkMC 轉分化為SMC中的作用。SRF為已知的涉及細胞生長和分化的許多 細胞早期反應基因的關鍵調節(jié)劑。 一些結果暗示受限于SkMC或SMC 系的 一種或幾種SRF輔因子可與SRF —起作用而活化系特異性基因的 轉錄。為了解SRF參與SkMC分化為SMC的機制，比較了在加入VEGF之前和之后的細胞中SRF的表達。觀察到當在包含VEGF的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)SkMC時，SRF mRNA的表達增加(圖6)。
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權利要求
1.從人肌活檢細胞樣品或從體外分化成為骨骼肌細胞(hSkMC)的人肌活檢細胞中體外獲得主要包括表達鈣調節(jié)蛋白和SM-MHC的人平滑肌細胞(hSMC)的細胞群的方法，-所述人肌活檢細胞不表達CD31和CD14，以及如果適合，不表達B和T淋巴細胞標志物，和-所述hSkMC表達CD56、結蛋白和選自MyoD、Myf5和肌形成蛋白基因的肌形成基因，并能產生多核肌管，其特征在于，包括如下步驟A)在包含VEGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述成肌細胞的人肌活檢細胞，在沒有膀胱SMC的情況下進行所述培養(yǎng)；和B)回收步驟A獲得的hSMC。
2. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，表達CD56和結蛋白 的所述hSkMC表達MyoD、 Myf5和肌形成蛋白基因。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述hSkMC不 表達CD34和CD14。
4. 如權利要求1-3中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所 述hSkMC不表達釣調節(jié)蛋白和SM-MHC。
5. 如權利要求1-4中任一權利要求所述的方法，其特征在于，步 驟A獲得的所述hSMC表達鈣調節(jié)蛋白和SM-MHC。
6. 如權利要求1-5中任一權利要求所述的方法，其特征在于，步 驟A獲得的所述hSMC不表達MyoD基因。
7. 如權利要求1-6中任一權利要求所述的方法，其特征在于，在步驟A從體外分化成為人骨骼肌細胞(hSkMC)的人肌活檢細胞中獲得 的所述hSMC比步驟A采用的所述hSkMC表達CD56和結蛋白的量 明顯較少。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟A獲得的所述 hSMC表達Myf5和肌形成蛋白。
9. 如權利要求1-8中任一權利要求所述的方法，其特征在于，步 驟A釆用的所述培養(yǎng)基還包括至少一種生長因子，所述至少一種生長 因子選自PDGF-BB、 IGF1、 FGFb、 HGF和TNFa、 TGFj8和在SMC 增殖或分化中起作用的所有其他因子。
10. 如權利要求1-9中任一權利要求所述的方法，其中從體外分 化成為人骨骼肌細胞(hSkMC)的人肌活檢細胞樣品中獲得所述hSMC， 其特征在于，通過包括如下步驟的方法從人肌活檢細胞樣品中獲得所 述hSkMC:a) 切碎所述肌活檢樣品，b) 酶裂解纖維和肌細胞并通過過濾分離個體細胞，c) 在存在生長培養(yǎng)基和/或分化培養(yǎng)基的情況下在粘附細胞的培 養(yǎng)反應器中培養(yǎng)該方法獲得的肌細胞，如果適合，接著一個或幾個擴 增期，d) 通過分析特異性的細胞標志物鑒定在培養(yǎng)不同階段存在的細 胞類型，e) 選擇所需細胞類型為細胞群主要部分的培養(yǎng)階段，f) 在e)選擇的培養(yǎng)階段收集細胞群，g) 如果適合，深度冷凍步驟f)收集的細胞。
11. 如權利要求IO所述的方法，其特征在于， -在步驟b),進行如下步驟-洗滌培養(yǎng)基A中的切碎物，接著在存在釋放酶的情況下酶裂解所述+刀碎物；-分離通過濾網(wǎng)過濾獲得的個體細胞，接著離心；和-洗滌培養(yǎng)基B中獲得的沉淀細胞； -在步驟c),進行如下步驟-在培養(yǎng)板上于培養(yǎng)基C中培養(yǎng)步驟b)獲得的細胞，直到它們 20-50%匯合或直到第一個肌管出現(xiàn)，接著在PBS中、在FCS中、隨 后在培養(yǎng)基C中洗滌細胞，接著在大培養(yǎng)板上或培養(yǎng)瓶中于培養(yǎng)基C 中再次培養(yǎng)，獲得約90%匯合程度或第一個肌管出現(xiàn)，-收集所述細胞的前一天除去培養(yǎng)基C并用培養(yǎng)基D替換，-在PBS中接著在培養(yǎng)基A中洗滌獲得的所述細胞；和，-如果需要，在補充了 0.5。/()(P/V)人白蛋白血清的培養(yǎng)基A中濃 縮步驟f)結束時獲得的所述細胞；-在步驟g)，在補充了 4。/。(P/V)人白蛋白血清和7.5%(V/V)DMSO 的培養(yǎng)基A中進行深度冷凍步驟f)獲得的所述細胞，在37°C解凍， 接著用培養(yǎng)基A洗滌后，在所述培養(yǎng)基中懸浮，在以上步驟中，所述 培養(yǎng)基A、 B、 C和E如下 培養(yǎng)基A:-改良的MCDB120培養(yǎng)基(Ham " fl/., 1988): D-纈氨酸取代L-纈氨酸，去除酚紅和胸苷； 培養(yǎng)基B:-培養(yǎng)基A + 20。/。照射的胎牛血清+抗生素； 培養(yǎng)基C:-培養(yǎng)基B + FGFb(lO ng/ml) + 1 jiiM地塞米松； 溶液或培養(yǎng)基D:磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
12. 如權利要求IO所述的方法，其特征在于，通過出現(xiàn)具有占總 群至少50%的CD56+表型群來確定需要的hSkMC細胞類型是細胞群 主要部分的培養(yǎng)階段。
13. 如權利要求12所述的方法，其中具有占總群至少50%的所述CD56+表型細胞群還具有選自CD10+、 CD13+、結蛋白+ 、 1型HLA 的至少一個表型、優(yōu)選至少2、 3和4個表型。
14. 如權利要求1-13中任一權利要求所述的方法，其中從體外分 化成為人骨骼肌細胞(hSkMC)的人肌活檢樣品中獲得所述hSMC，其 特征在于，步驟A)中包含VEGF的所述培養(yǎng)基為通過D-纈氨酸取代 L-纈氨酸、去除酚紅和胸苷而改良的MCDB 120培養(yǎng)基。
15. 如權利要求1-9中任一權利要求所述的方法，其中從人肌活 檢樣品中獲得所述hSMC，其特征在于，步驟A)中包含VEGF的所述 培養(yǎng)基為M199培養(yǎng)基。
16. 如權利要求1-15中任一權利要求所述的方法，其中步驟A) 中所述培養(yǎng)基包含10 ng/ml VEGF。
17. 如權利要求1-16中任一權利要求所述的方法，其特征在于， 直接獲得所述hSMC或預先分化成為hSkMC的人肌活檢樣品為從獲 得所述樣品的個體的任意肌肉區(qū)域獲得的活檢樣品。
18. 如權利要求1-17中任一權利要求所述的方法，其特征在于， 直接獲得所述hSMC或預先分化成為hSkMC的人肌活檢樣品為從獲 得所述樣品的個體的腿部肌肉區(qū)域獲得的活檢樣品。
19. 如權利要求1-18中任一權利要求所述的方法，其特征在于， 直接獲得所述hSMC或預先分化成為hSkMC的人肌活檢樣品為從兒 童或成人個體的肌肉區(qū)域獲得的活檢樣品。
20. 能夠通過權利要求1-19中任一權利要求所述的方法獲得的分 離的人平滑肌細胞，其特征在于，它們表達鈣調節(jié)蛋白和SM-MHC。
21. 作為藥物的組合物，所述組合物包括權利要求20所述的或通 過權利要求1-19中任一權利要求所述的方法獲得的分離的人平滑肌細 胞。
22. 如權利要求21所述的組合物在制備用于人的治療組合物中的 用途。
23. 如權利要求21或22所述的組合物在制備用于獲得所述活檢 樣品的所述個體的治療組合物中的用途。
24. 如權利要求22或23所述的組合物在制備被設計成用于SMC 替換的治療組合物中的用途。
25. 如權利要求22-24中任一權利要求所述的用途，其為在用于 制備^皮設計成用于預防或治療動脈硬化癥、動脈炎、'隄性靜脈病癥、 靜脈畸形、尤其是血管瘤的治療組合物中的用途。
26. 如權利要求22-24中任一權利要求所述的用途，其為在用于 制備被設計成用于預防或治療癌癥的治療組合物中的用途，所述治療 組合物在化療或;^文療的抗癌治療前給藥或同時給藥。
27. 如權利要求22-24中任一權利要求所述的用途，其為在用于 制備被設計成用于預防或治療缺血、尤其是心肌缺血或下肢缺血的治 療組合物中的用途。
28. 如權利要求22-24中任一權利要求所述的用途，其為在用于 制備被設計成用于預防或治療需要用活性成分治療的疾病的治療組合 物中的用途，特征為所述SMC包含所述活性成分。29如權利要求22-28中任一權利要求所述的用途，其為在用于制 備被設計成用于靜脈內給藥或移植給藥的治療組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及從人肌活檢樣品或從體外分化成為骨骼肌細胞的人肌活檢樣品中體外獲得主要包括表達鈣調節(jié)蛋白和SM-MHC的人平滑肌細胞的細胞群的方法。本發(fā)明還涉及作為被設計成用于人的治療成分的組合物，所述組合物包括可通過所述方法獲得的分離的平滑肌細胞。本發(fā)明還涉及分離的平滑肌細胞在制備被設計成用于替換平滑肌細胞的治療組合物中的用途。尤其是，本發(fā)明涉及所述的分離的平滑肌細胞在治療缺血、癌癥或需要損傷組織血管再生的任意疾病中的用途。最后，本發(fā)明涉及所述平滑肌細胞作為活性成分的載體在制備被設計成用于需要采用所述活性成分治療的人的治療組合物中的用途。
文檔編號C12N5/077GK101310013SQ200680042887
公開日2008年11月19日 申請日期2006年9月19日 優(yōu)先權日2005年9月19日
發(fā)明者瑪麗-諾樂·拉卡薩尼, 索菲·勒里庫瑟, 讓-皮埃爾·馬若里奧 申請人:巴黎國立醫(yī)院;血管與血液研究所