專利名稱：：包括非天然氨基酸的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：無
背景技術(shù)：
：將非遺傳編碼的氨基酸(即，"非天然氨基酸")并入蛋白質(zhì)中的能力允許引入化學官能團，其可提供天然存在官能團(諸如賴氨酸的s-NH2、半胱氨酸的巰基-SH、組氨酸的亞氨基等)的有價值替代物。已知某些化學官能團對20種常見遺傳編碼氨基酸中存在的官能團為惰性的，但與可結(jié)合于非天然氨基酸上的官能團明確且有效地反應(yīng)以形成穩(wěn)定鍵聯(lián)。如今可用方法來選擇性地引入蛋白質(zhì)中不存在的對20種常見遺傳編碼氨基酸中所存在的所有官能團呈化學惰性且可用于與包括某些官能團的試劑有效且選擇性地反應(yīng)以形成穩(wěn)定共價連接的化學官能團。
發(fā)明內(nèi)容本文中描述且以引用的方式并入用于制造、純化、檢測、表征以及使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽以及經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的方法、組合物、技術(shù)以及策略。本發(fā)明提供檢測多肽的方法，其包括檢測多肽中的非天然編碼氨基酸側(cè)鏈。在一些實施例中，多肽是由核糖體合成的。本發(fā)明也提供檢測多肽的方法，其包括檢測已經(jīng)翻譯后修飾的多肽中的非天然編碼氨基酸側(cè)鏈。也提供檢測所述多肽中非天然編碼氨基酸側(cè)鏈的方法，其包括使非天然編碼氨基酸側(cè)鏈與包括與非天然編碼氨基酸側(cè)鏈特異性相互作用的官能團的分子接觸。也提供純化多肽鏈中具有非天然編碼氨基酸的多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包括使多肽和與多肽中的非天然編碼氨基酸側(cè)鏈相互作用的物質(zhì)接觸。在其它實施例中，所述純化多肽鏈中具有非天然編碼氨基酸的多肽的方法包括使多肽沉淀，其中當與多肽鏈中無非天然編碼氨基酸的多肽的溶解性相比時，非天然編碼氨基酸改變多肽的溶解性。也提供純化核糖體制造的多肽側(cè)鏈中具有非天然編碼氨基酸的多肽的方法，其包括使多肽電泳，其中當與多肽側(cè)鏈中無非天然編碼氨基酸的多肽的電泳遷移率相比時，非天然編碼氨基酸改變多肽的電泳遷移率。在其它實施例中，純化核糖體制造的多肽側(cè)鏈中具有非天然編碼氨基酸的多肽的方法包括使多肽透析，其中當與多肽鏈中無非天然編碼氨基酸的多肽的擴散速率相比時，非天然編碼氨基酸改變多肽的擴散速率。、本發(fā)明也提供篩檢分子文庫的方法，其包括a)在允許文庫分子與包括非天然編碼氨基酸的多肽相互作用的條件下使包括非天然編碼氨基酸的多肽與文庫分子組合，和b)鑒別與包括非天然編碼氨基酸的多肽相互作用的文庫分子。在一些實施例中，篩檢包括多個具有不同氨基酸序列的多肽的核糖體制造的多肽的文庫，其中各多肽都包括非天然氨基酸。本發(fā)明也提供包括以下步驟的方法a)在具有至少一種已知生物活性的預選定多肽中的單個預選定位點處用非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸；和b)測量包括非天然編碼氨基酸的預選定多肽的生物活性；以及C)比較步驟b)的預選定多肽與已在預選定多肽鏈的不同位置處用非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸的預選定多肽或多肽鏈中無取代非天然編碼氨基酸的預選定多肽的生物活性。在一些實施例中，選擇預選定多肽的供翻譯后修飾的位置的方法包括a)在具有至少一種己知生物活性的預選定多肽中的單個預選定位點處用非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸；和b)測量包括非天然編碼氨基酸的預選定多肽的生物活性；以及C)比較步驟b)的預選定多肽與已在預選定多肽鏈的不同位置處用非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸的預選定多肽或多肽鏈中無取代非天然編碼氨基酸的預選定多肽的生物活性。應(yīng)了解，本文中所述且以引用的方式并入的方法和組合物不限于本文中所述的特定方法、方案、細胞株、構(gòu)筑體以及試劑且同樣可改變。同樣應(yīng)了解，本文中所使用的術(shù)語僅出于描述特定實施例的目的，且并非意欲限制本文中所述的方法和組合物的范疇，所述范疇應(yīng)僅由隨附權(quán)利要求書來限制。定義除非上下文另外明確指出，否則如本文中和隨附權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式"一"和"所述"包含復數(shù)提及。除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學術(shù)語具有如本文中所述的本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所了解相同的含義。盡管與本文中所述的那些類似或等效的任何方法、裝置以及材料可用于本文中所述的本發(fā)明的實施或測試中，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置以及材料。本文中提及的所有公開案和專利是為了描述和揭露(例如)公開案中所述的構(gòu)筑體和方法的目的以引用的方式全部并入本文中，其可結(jié)合本文中所述的本發(fā)明使用。僅提供本文所討論的公開案在本發(fā)明申請日期之前的揭露內(nèi)容。本文中的任何內(nèi)容不應(yīng)被解釋為承認本文所述的發(fā)明者因先前發(fā)明或任何其它原因而無權(quán)提前公開本發(fā)明。術(shù)語"垸氧基"、"烷基氨基"以及"垸硫基"(或硫代垸氧基)是以其常規(guī)意義使用，且指的是分別通過氧原子、氨基或硫原子與分子其余部分連接的那些垸基。除非另外指出，否則自身或作為另一取代基的部分的術(shù)語"烷基"意謂直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基，或其組合，其可為完全飽和、單不飽和或多不飽和的且可包含具有指定碳原子數(shù)目(即Q-do意謂1至IO個碳)的二價基團和多價基團。飽和烴基的實例包含(但不限于)以下基團，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基以及其類似基團的同系物和異構(gòu)體。不飽和垸基為具有一個或一個以上雙鍵或三鍵的垸基。不飽和烷基的實例包含(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(l,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高級的同系物和異構(gòu)體。除非另外指出，否則術(shù)語"烷基"也意謂包含下文中更詳細定義的垸基的那些衍生物，諸如"雜烷基"。限于烴基的垸基稱為"均垸基"。自身或作為另一取代基的部分的術(shù)語"亞烷基"意謂衍生自烷烴的二價基團，例如(但不限于)結(jié)構(gòu)-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-且進一步包含下文中描述為"亞雜垸基"的那些基團。烷基(或亞垸基)通常將具有1至24個碳原子，其中具有10個或10個以下碳原子的那些基團是本文中所述的方法和組合物的特定實施例。"低碳烷基"或"低碳亞烷基"是通常具有8個或8個以下碳原子的較短鏈烷基或亞烷基。術(shù)語"氨基酸"指的是天然存在和非天然氨基酸，以及以類似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然編碼氨基酸為20種常見氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸以及纈氨酸)以及焦賴氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸類似物指的是具有與天然存在氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)(即，與氫、羧基、氨基以及R基團結(jié)合的a-碳)的化合物，諸如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。所述類似物可具有經(jīng)修飾R基團(諸如，正亮氨酸)或經(jīng)修飾肽主鏈，但仍保留與天然存在氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)。氨基酸在本文中可由其通常已知的三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推薦的單字母符號稱呼。同樣地，核苷酸可由其通常接受的單字母代碼稱呼。"氨基末端修飾基團"指的是可連接至多肽的氨基末端的任何分子。類似地，"羧基末端修飾基團"指的是可連接至多肽的羧基末端的任何分子。末端修飾基團包含(但不限于)各種水溶性聚合物、肽或蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白或增加肽的血清半衰期的其它部分。除非另有說明，否則術(shù)語"芳基"意謂可為單環(huán)或稠合在一起或共價連接的多環(huán)(包含(但不限于)1至3個環(huán))的多不飽和芳族烴取代基。術(shù)語"雜芳基"指的是含有1至4個選自N、O以及S的雜原子的芳基(或環(huán))，其中氮原子和硫原子可視情況經(jīng)氧化，且氮原子可視情況經(jīng)季銨化。雜芳基可通過雜原子連接至分子的其余部分。芳基和雜芳基的非限定性實例包含苯基、l-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、l-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁哇基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡淀基、4-吡啶基、2-嘧淀基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、l-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。上述芳基和雜芳基環(huán)系統(tǒng)中的每一者的取代基是選自下文中所述的可接受的取代基的群組。為了簡便起見，當與其它術(shù)語組合使用(包含(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)時，術(shù)語"芳基"包含如上所定義的芳基環(huán)與雜芳基環(huán)。因此，術(shù)語"芳垸基"或"垸芳基"意謂包含芳基是連接至烷基的那些基團(其包含(但不限于)芐基、苯乙基、吡啶基甲基以及其類似基團)，其中所述烷基包含碳原子(包含(但不限于)亞甲基)已由(例如)氧原子代替的那些焼基(包含(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(l-萘基氧基)丙基以及其類似基團)。"雙官能聚合物"指的是包括兩個能夠與其它部分(包含(但不限于)氨基酸側(cè)基團)特異性反應(yīng)以形成共價鍵或非共價鍵的離散官能團的聚合物。具有一個與特定生物活性組分上的基團有反應(yīng)性的官能團和與第二生物組分上的基團有反應(yīng)性的另一基團的雙官能連接子可用于形成包含生物活性組分、雙官能連接子以及第二生物活性組分的接合物。已知多種用于將各種化合物與肽連接的程序和連接子分子。例如參看歐洲專利申請案第188,256號、美國專利第4,671,958號、第4,659,839號、第4,414,148號、第4,699,784號、第4,680,338號以及第4,569,789號，其是以引用的方式并入本文中。"多官能聚合物"指的是包括兩個或兩個以上能夠與其它部分(包含(但不限于)氨基酸側(cè)基團)特異性反應(yīng)以形成共價鍵或非共價鍵的離散官能團的聚合物。雙官能聚合物或多官能聚合物可具有任何所需長度或分子量，且可經(jīng)選定以在連接至多肽的一個或一個以上分子與其結(jié)合搭配物或多肽之間提供特定所需間隔或構(gòu)象。當在本文中使用時，術(shù)語"生物活性分子"、"生物活性部分"或"生物活性劑"意謂可影響與有機體(包含(但不限于)病毒、細菌、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動物以及人類)有關(guān)的生物系統(tǒng)、路徑、分子或相互作用的任何物理或生物化學性質(zhì)的任何物質(zhì)。具體來說，如本文中所使用的生物活性分子包含(但不限于)意欲用于診斷、治愈、緩解、治療或預防人類或其它動物的疾病，或以其他方式增強人類或動物的身體或精神健康的任何物質(zhì)。生物活性分子的實例包含(但不限于)肽、蛋白質(zhì)、酶、小分子藥物、硬藥(harddrug)、軟藥(softdrug)、碳水化合物、無機原子或分子、染料、脂質(zhì)、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、細胞、病毒、脂質(zhì)體、微粒以及膠團。適用于本文中所述的方法和組合物的生物活性劑的種類包含(但不限于)藥物、前藥、放射性核素、顯像劑、聚合物、抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、消炎藥、抗腫瘤劑、心血管藥物、抗焦慮劑、激素、生長因子、類固醇藥物、微生物來源的毒素以及其類似物。如本文中所使用，"共折疊"特定地指使用至少兩種彼此相互作用的多肽且使得未折疊或不當折疊的多肽轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊坏倪m當折疊的多肽的再折疊過程、反應(yīng)或方法。如本文中所使用，"比較窗"包含提及選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成的群組的連續(xù)位置數(shù)目中的任一者的區(qū)段，其中可將序列與具有相同數(shù)目的連續(xù)位置的參考序列在將兩個序列最佳比對后進行比較。用于比較的序列的比對方法在所屬領(lǐng)域中為熟知的。可由以下方法進行用于比較的序列的最佳比對，其包含(但不限于)Smith禾卩Waterman(1970)X;^/.Ma仇2:482c的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J!Mo/.所o/.48:443的同源性比對算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Ato'/.Sc/.85:2444的相似性搜索方法；所述算法的計算機化實施(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA);或手工比對和目測檢査(例如參看Ausubel等人，Ci^/"eW/Vofocokz'"Mo/ecw^w5!'o/ogy(1995增干U))。適于測定序列一致性百分比和序列相似性的算法的一個實例為BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述于Altschul等人，(1997)Wmc.^c/A及m.25:3389-3402和Altschul等人，(1990)乂Mo/.祝o/.215:403-410中。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開獲得。BLAST算法參數(shù)W、T以及X確定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=-4以及兩條鏈的比較作為默認值。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用字長為3、期望值(E)為10和BLOSUM62計分矩陣(參看Henikoff和Henikoff(1992)Prac.M//,JcW.Sc/.t/&489:10915)比對(B)為50、期望值(E)為10、M=5、N=-4以及兩條鏈的比較作為默認值。BLAST算法通常在"低復雜性"過濾器關(guān)閉的情況下執(zhí)行。BLAST算法也執(zhí)行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計分析(例如參看Karlin和Altschul(1993)Ato/.XcadSc!'.t/&490:5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一個量度為最小和概率(P(N))，其提供兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然會發(fā)生匹配的概率的指示。舉例來說，如果在測試核酸與參考核酸的比較中，最小和概率小于約0.2，小于約O.Ol,或小于約0.001，那么就認為所述核酸與參考序列相似。術(shù)語"保守性修飾變體"適用于氨基酸與核酸序列。對于特定核酸序列來說，"保守性修飾變體"指的是編碼一致或基本上一致的氨基酸序列的核酸，或其中所述核酸不將氨基酸序列編碼成基本上一致的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定蛋白質(zhì)。舉例來說，密碼子GCA、GCC、GCG以及GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子指定的每一位置處，密碼子可改變?yōu)樗鱿鄳?yīng)密碼子中的任一者而不改變所編碼的多肽。所述核酸變異為"沉默變異"，其為保守性修飾變異中的一種。編碼多肽的本文中的每一核酸序列也描述核酸的每一可能沉默變異。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認識到，核酸中的各密碼子(除通常僅為甲硫氨酸的密碼子的AUG和通常僅為色氨酸的密碼子的TGG之外)可經(jīng)修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各沉默變異在各所述序列中為隱含的。至于氨基酸序列，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認識到，改變、添加或缺失所編碼序列中單一氨基酸或小百分比的氨基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的個別取代、缺失或添加為變異使得氨基酸經(jīng)化學上類似的氨基酸取代的"保守性修飾變體"。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知提供功能上類似的氨基酸的保守性取代列表。所述保守性修飾變體是在本文所述方法和組合物的多態(tài)變體、種間同源物以及等位基因的范圍之外且不將其排12除在外。以下八組各自含有關(guān)于彼此為保守性取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(例如參看Creighton,iVofe/"5viS^w"wesA/o/ecw/ariVopeW/e>s(WHFreeman&Co.;第2版(1993年12月))。除非另外說明，否則自身或與其它術(shù)語組合的術(shù)語"環(huán)烷基"和"雜環(huán)烷基"分別表示"烷基"和"雜垸基"的環(huán)狀形式。因此，環(huán)烷基或雜環(huán)垸基包含飽和、部分不飽和以及完全不飽和的環(huán)鍵。另外，對于雜環(huán)垸基，雜原子可占據(jù)雜環(huán)連接至分子的其余部分的位置。環(huán)烷基的實例包含(但不限于)環(huán)戊基、環(huán)己基、l-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基以及其類似基團。雜環(huán)烷基的實例包含(但不限于)l-(l,2，5,6-四氫吡啶基)、l-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、l-哌嗪基、2-哌嗪基以及其類似基團。另外，所述術(shù)語涵蓋雙環(huán)和多環(huán)結(jié)構(gòu)。類似地，自身或作為另一取代基的部分的術(shù)語"亞雜環(huán)烷基"意謂衍生自雜環(huán)垸基的二價基團，且自身或作為另一取代基的部分的術(shù)語"亞環(huán)烷基"意謂衍生自環(huán)烷基的二價基團。如本文中所使用，"變性劑"經(jīng)定義為會造成蛋白質(zhì)可逆性展開的任何化合物或物質(zhì)。變性劑的強度將由特定變性劑的性質(zhì)與濃度來決定。合適的變性劑可為離液劑、清潔劑、水可混溶有機溶劑、磷脂或兩種或兩種以上所述試劑的組合。合適的離液劑包含(但不限于)尿素、胍以及硫氰酸鈉。適用的清潔劑可包含(但不限于)強清潔劑，諸如十二垸基硫酸鈉或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清潔劑)、十二垸基肌氨酸鈉(Sarkosyl);溫和非離子型清潔劑(例如，毛地黃皂苷(digitonin));溫和陽離子型清潔劑，諸如N》2,3-(二油烯氧基)-丙基-N,N,N-三甲基銨；溫和離子型清潔劑(例如膽酸鈉或脫氧膽酸鈉)；或兩性離子型清潔劑，其包含(但不限于)磺酸甜菜堿(Zwiftergent)、3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基銨基-l-丙烷硫酸鹽(CHAPS)以及3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基銨基-2-羥基-l-丙垸磺酸鹽(CHAPSO)。水可混溶有機溶劑，諸如乙腈、低碳烷醇(尤其C2-C4垸醇，諸如乙醇或異丙醇)，或低碳烷二醇(尤其C2-Q烷二醇，諸如乙二醇)可用作變性劑。適用于本文中所述的方法和組合物中的磷脂可為天然存在的磷脂，諸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸以及磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或變體，諸如二己酰基磷脂酰膽堿或二庚?；字Ｄ憠A。如本文中所使用，術(shù)語"有效量"指的是會在一定程度上減輕一種或一種以上所治療的疾病、病狀或病癥的癥狀的所投與的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的量。可投與含有本文中所述的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的組合物用于預防性、增強性和/或治療性治療。術(shù)語"增強"意謂增加或延長所要效應(yīng)的效力或持續(xù)時間。因此，對于增強治療劑的效應(yīng)來說，術(shù)語"增強"指的是在效力或持續(xù)時間方面增加或延長其它治療劑對系統(tǒng)的效應(yīng)的能力。如本文中所使用，"增強有效量"指的是足以增強另一治療劑在所要系統(tǒng)中的效應(yīng)的量。當用于患者中時，對于此用途有效的量應(yīng)視以下因素而定疾病、病癥或病狀的嚴重性和病程、先前的治療、患者的健康狀態(tài)和對藥物的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判斷。如本文中所使用，術(shù)語"真核細胞"指的是屬于種系發(fā)生域真核生物域的有機體，諸如動物(包含(但不限于)哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包含(但不限于)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。術(shù)語"官能團"、"活性部分"、"活化基團"、"離去基團"、"反應(yīng)性位點"、"化學反應(yīng)性基團"以及"化學反應(yīng)性部分"在所屬領(lǐng)域和本文中用來指分子的獨特的可定義部分或單元。所述術(shù)語在化學領(lǐng)域中在一定程度上同義且在本文中用于指示執(zhí)行一些功能或活性且可與其它分子反應(yīng)的分子的部分。術(shù)語"鹵素"包含氟、氯、碘以及溴。除非另有說明，否則自身或與另一術(shù)語組合的術(shù)語"雜垸基"意謂穩(wěn)定的直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基，或其組合，其由規(guī)定數(shù)目的碳原子和至少一個選自由O、N、Si和S組成的群組的雜原子組成，且其中氮原子和硫原子可視情況經(jīng)氧化且氮雜原子可視情況經(jīng)季銨化。雜原子O、N和S以及Si可位于雜烷基的任何內(nèi)部位置或位于烷基連接至分子的其余部分的位置處。實例包含(但不限于)-CH2-CH2-0-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2，-S(0)-CH3、-CH2-CH2-S(0)2-CH3、-CH=CH-0-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3以及-CHNCH-N(CH3)-CH3。至多兩個雜原子可相鄰，諸如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-0-Si(CH3)3。類似地，自身或作為另一取代基的部分的術(shù)語"亞雜垸基"意謂衍生自雜烷基的二價基團，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對于亞雜烷基來說，相同或不同的雜原子也可占據(jù)鏈的一端或兩端(包含(但不限于)亞垸基氧基、亞垸基二氧基、亞垸基氨基、亞烷基二氨基、氨基氧基亞垸基以及其類似基團)。此外，對于亞垸基和亞雜烷基鍵聯(lián)基團來說，由鍵聯(lián)基團的化學式書寫的方向來暗示鍵聯(lián)基團的無方向性。舉例來說，式《(0)211'-表示-<:(0)211'-與-r'c(o)2-。術(shù)語"一致"或"一致性"百分比在兩個或兩個以上核酸或多肽序列的情況下，指的是相同的兩個或兩個以上的序列或子序列。當經(jīng)比較窗比較且比對最大符合率或使用以下序列比較算法中的一種或通過手工比對且目測檢查測量指定區(qū)域時，如果序列具有相同(即，在指定區(qū)域上具有約60%的一致性，視情況約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%的一致性)的氨基酸殘基或核苷酸百分比，那么序列為"實質(zhì)上一致"。這一定義也指測試序列的互補序列。一致性可存在于長度為至少約50個氨基酸或核苷酸的區(qū)域中，或長度為75-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域中，或(在未指定時)在聚核苷酸或多肽的整個序列中。對于序列比較來說，通常一個序列充當測試序列與其進行比較的參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列與參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列坐標，且指定序列算法程序參數(shù)。可使用默認程序參數(shù)，或可指定替代參數(shù)。隨后序列比較算法基于程序參數(shù)計算測試序列相對于參考序列的序列一致性百分比。當術(shù)語"經(jīng)分離"是應(yīng)用于核酸或蛋白質(zhì)時，其表示核酸或蛋白質(zhì)不含至少一些在天然狀態(tài)下與其結(jié)合的細胞組分，或核酸或蛋白質(zhì)已濃縮到大于其活體內(nèi)或活體外產(chǎn)生的濃度的含量。其可呈均質(zhì)狀態(tài)。經(jīng)分離物質(zhì)可為干燥或半干燥狀態(tài)，或為溶液(包含(但不限于)水溶液)形式。其可為包括其它醫(yī)藥學上可接受的載劑和/或賦形劑的醫(yī)藥組合物的組分。純度和均質(zhì)性通常使用分析化學技術(shù)測定，所述技術(shù)諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜。為制劑中所存在的主要物質(zhì)的蛋白質(zhì)實質(zhì)上經(jīng)純化。具體來說，經(jīng)分離基因是自側(cè)接基因且編碼蛋白質(zhì)而非所關(guān)注基因的開放閱讀框分離。術(shù)語"經(jīng)純化"表示核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中產(chǎn)生實質(zhì)上一個條帶。其尤其可意謂核酸或蛋白質(zhì)至少85%純、至少卯％純、至少95%純、至少99%或更純。術(shù)語"鍵"或"連接子"本文中用來指通常因化學反應(yīng)的結(jié)果而形成且通常為共價鍵的基團或鍵。水解穩(wěn)定鍵意謂所述鍵在水中實質(zhì)上穩(wěn)定且在適用pH值下(包含(但不限于)在生理條件下)長期、或許甚至無限期不與水反應(yīng)。水解不穩(wěn)定或可降解鍵意謂所述鍵可在水中或水溶液(包含例如血液)中降解。酶促不穩(wěn)定或可降解鍵意謂所述鍵可由一種或一種以上酶降解。如在所屬領(lǐng)域中所了解，PEG和相關(guān)聚合物可在聚合物主鏈中或在聚合物主鏈與聚合物分子的一個或一個以上末端官能團之間的連接子基團中包含可降解鍵。舉例來說，由PEG羧酸或活化PEG羧酸與生物活性劑上的醇基反應(yīng)所形成的酯鍵通常在生理條件下水解以釋放生物活性劑。其它水解可降解鍵包含(但不限于)碳酸酯鍵；由胺與醛反應(yīng)形成的亞胺鍵；由醇與磷酸酯基反應(yīng)形成的磷酸酯鍵；作為酰肼與醛的反應(yīng)產(chǎn)物的腙鍵；作為醛與醇的反應(yīng)產(chǎn)物的縮醛鍵；作為甲酸鹽與醇的反應(yīng)產(chǎn)物的原酸酯鍵；由胺基(包含(但不限于)在諸如PEG的聚合物末端處的胺基)與肽的羧基形成的肽鍵；以及由亞磷酰胺基(包含(但不限于)在聚合物末端處的亞磷酰胺基)與寡核苷酸的5'羥基形成的寡核苷酸鍵。如本文中所使用，術(shù)語"培養(yǎng)基"包含可支撐或容納任何宿主細胞的任何培養(yǎng)基、溶液、固體、半固體或剛性支撐物，所述宿主細胞包含細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、CHO細胞、原核宿主細胞、大腸桿菌(￡.co/Z)或假單胞菌(Pseudomonas)宿主細胞以及細胞內(nèi)含物。因此，這一術(shù)語涵蓋宿主細胞已生長于其中的培養(yǎng)基，例如多肽已分泌于其中的培養(yǎng)基，包含增殖步驟之前或之后的培養(yǎng)基。這一術(shù)語也可涵蓋含有宿主細胞溶解產(chǎn)物的緩沖液或試劑，諸如在細胞內(nèi)產(chǎn)生多肽且宿主細胞經(jīng)溶解或破裂以釋放多肽的情況下。本文中所揭露的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的"代謝物"是在(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽經(jīng)代謝時形成的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的衍生物。術(shù)語"活性代謝物"指的是在(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽經(jīng)代謝時形成的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的生物活性衍生物。術(shù)語"經(jīng)代謝"指的是特定物質(zhì)由有機體改變的過程的總和(包含(但不限于)水解反應(yīng)和由酶催化的反應(yīng))。關(guān)于新陳代謝的其它信息可獲自ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第9版，McGraw-Hill(1996)。本文中所揭露的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的代謝物可通過將(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽投與宿主且分析來自宿主的組織樣品來鑒別，或通過將(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽與肝細胞一起活體外培育且分析所得化合物來鑒別。如本文中所使用，術(shù)語"經(jīng)修飾"指的是存在對多肽的翻譯后修飾。形式"(經(jīng)修飾)"術(shù)語意謂所討論的多肽視情況經(jīng)修飾，即所討論的多肽可經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾。如本文中所使用，術(shù)語"經(jīng)調(diào)節(jié)的血清半衰期"意謂(經(jīng)修飾)多肽相對于其非未經(jīng)修飾形式的循環(huán)半衰期的正改變或負改變。血清半衰期是通過在投與多肽后的各個時間點取血液樣品且測定每一樣品中那種分子的濃度來測量。血清濃度與時間的相關(guān)性使16得可以計算血清半衰期。血清半衰期理想地增加至少約兩倍，但較小的增加可能適用，例如當其使得能夠得到令人滿意的給藥方案或避免毒性效應(yīng)時。在一些實施例中，增加為至少約3倍、至少約5倍或至少約10倍。如本文中所使用，術(shù)語"經(jīng)調(diào)節(jié)的治療半衰期"意謂治療有效量的(經(jīng)修飾)多肽相對于其未經(jīng)修飾形式的半衰期的正改變或負改變。治療半衰期是通過在投藥后的各個時間點測量分子的藥物動力學和/或藥效學性質(zhì)來測量。增加的治療半衰期理想地使得能夠得到尤其有益的給藥方案、尤其有益的總劑量，或避免不當效應(yīng)。在一些實施例中，治療半衰期的增加由效力增加、經(jīng)修飾分子與其標靶的結(jié)合增加或降低、酶(諸如蛋白酶)對分子的分解增加或降低或未經(jīng)修飾分子的另一參數(shù)或作用機制的增加或降低而產(chǎn)生。如本文中所使用，術(shù)語"非真核生物"指的是非真核有機體。舉例來說，非真核有機體可屬于真細菌(Eubacteria)(其包含(但不限于)大腸桿菌(&c/zm'c//aco//)、嗜熱棲熱菌(77zer附ws^zerwop/zz7w51)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(5ac/〃wi1Wearaf/zer附op/n7M)、熒光假單胞菌(尸seMf/omo^uw/7wo;-esce7S)、銅綠假單胞菌(i^se"do附owawaerwgiwojaO、惡臭假單胞菌(i^e^omo"w/7w"必)等)種系發(fā)生域，或古細菌(Archaea)(其包含(但不限于)詹氏甲烷球菌(A/e^2"wococcw51/aww<xycW/)、熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Af"/tf"o6flc/en'ww^2er附oaWWrapWcwm)、諸如沃氏嗜鹽富饒菌(//c^o/emxvoZca"")和嗜鹽桿菌(//a/okj"en'ww)物種7^CW的嗜鹽桿菌，閃爍古生球菌(v4rc/meog/oZnw/w/gzWw;0、強烈熾熱球菌(/yococc^s/wn'oras)、掘越氏熱球菌(戶,ococa^/wr/A:(w//0、敏捷氣熱菌"￡wwp_yn/w/)gr"/x)等)禾中系發(fā)生域。"非天然氨基酸"指的是不為20種常見氨基酸或焦賴氨酸或硒半胱氨酸中的一種的氨基酸；可與術(shù)語"非天然氨基酸"同義使用的其它術(shù)語為"非天然編碼氨基酸"、"非天然氨基酸"、"非天然存在氨基酸"以及其各種帶有連字符和不帶連字符的形式。術(shù)語"非天然氨基酸"包含(但不限于)通過修飾天然編碼氨基酸(包含(但不限于)20種常見氨基酸或焦賴氨酸和硒半胱氨酸)天然存在但并不通過翻譯復合物自身并入生長中的多肽鏈中的氨基酸。不為天然編碼的天然存在氨基酸的實例包含(但不限于)N-乙酰葡糖氨基-L-絲氨酸、N-乙酰葡糖氨基-L-蘇氨酸以及O-磷酰基酪氨酸。術(shù)語"核酸"指的是脫氧核苷酸、脫氧核苷、核苷或核苷酸以及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有具有與參考核酸類似的結(jié)合性質(zhì)且以類似于天然存在核苷酸的方式代謝的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非特定限制，否則所述術(shù)語也指包含PNA(肽基核酸)、反義技術(shù)中使用的DNA的類似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯以及其類似物)的寡核苷酸類似物。除非特定限制，否則特定核酸序列也暗示性涵蓋其保守性修飾變體(包含(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。具體來說，可通過產(chǎn)生一個或一個以上所選(或全部)密碼子的第三位置經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer等人，7Vwc/"c爿czWi仏19:5081(1991);Ohtsuka等人，《/所o/.CAe附.260:2605-2608(1985);以及Rossolini等人，Mo/.Ce//.iVo6es8:91-98(1994))。如本文中所使用，術(shù)語"氧化劑"在蛋白質(zhì)再折疊方面定義為能夠從被氧化的化合物中移除電子的任何化合物或物質(zhì)。合適的氧化劑包含(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫蘇糖醇、氧化型赤蘚糖醇(oxidizederythreitol)以及氧。多種氧化劑適用于本文中所述的方法和組合物中。如本文中所使用，術(shù)語"聚亞垸基二醇"指的是聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇以及其衍生物。術(shù)語"聚亞烷基二醇"涵蓋線性與分枝聚合物且平均分子量介于lkDa與100kDa之間。其它例示性實施例列出于(例如)商業(yè)供應(yīng)商目錄中，諸如ShearwaterCorporation的目錄"用于生物醫(yī)學應(yīng)用的聚乙二醇和衍生物"("PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedicalApplications")(2001)。術(shù)語"多肽"、"肽"以及"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，且指氨基酸殘基的聚合物。即，針對于多肽的描述同樣適用于對肽的描述和對蛋白質(zhì)的描述，且反之亦然。所述術(shù)語適用于天然存在氨基酸聚合物以及一個或一個以上氨基酸殘基為非天然氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術(shù)語涵蓋具有任何長度的氨基酸鏈，包含全長蛋白質(zhì)，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。術(shù)語"經(jīng)翻譯后修飾"指的是在天然或非天然氨基酸已并入多肽鏈中之后對所述氨基酸進行的任何修飾。僅舉例來說，所述術(shù)語涵蓋共翻譯活體內(nèi)修飾、共翻譯活體外修飾(諸如在無細胞翻譯系統(tǒng)中)、翻譯后活體內(nèi)修飾以及翻譯后活體外修飾。"前藥"指的是活體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槟阁w藥物的藥劑。前藥通常適用，因為在一些情形中，其比母體藥物易于投藥。舉例來說，其可通過經(jīng)口投藥生物利用，而母體藥物不可以。前藥也可具有優(yōu)于母體藥物的改良的于醫(yī)藥組合物中的溶解性。在預防性應(yīng)用中，將含有(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的組合物投與易患特定疾病、病癥或病狀或處于特定疾病、病癥或病狀風險中的患者。所述量定義為"預防有效量"。在這一用途中，精確量也視患者的健康狀況、體重以及其類似因素而定。認為通過常規(guī)實驗(例如，劑量遞增臨床試驗)確定所述預防有效量完全是在所屬領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。術(shù)語"經(jīng)保護"指的是存在防止化學反應(yīng)性官能團在某些反應(yīng)條件下反應(yīng)的"保護基"或部分。保護基會根據(jù)所保護的化學反應(yīng)性基團的類型而改變。舉例來說，如果化學反應(yīng)性基團為胺或酰肼，那么保護基可選自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群組。如果化學反應(yīng)性基團為硫醇，那么保護基可為鄰吡啶基二硫化物。如果化學反應(yīng)性基團為羧酸(諸如丁酸或丙酸)或羥基，那么保護基可為節(jié)基或烷基，諸如甲基、乙基或叔丁基。本文中所述的方法和組合物中也可使用所屬領(lǐng)域中已知的其它保護基，包含對光不穩(wěn)定的基團，諸如Nvoc和MeNvoc。僅舉例來說，阻斷/保護基可選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>其它保護基描述于Greene禾口Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版，JohnWiley&Sons,NewYork,NY，1999中，其是以引用的方式全部并入本文中。術(shù)語"重組宿主細胞"或"宿主細胞"指的是包含外源聚核苷酸的細胞，與插入所使用的方法無關(guān)，所述方法例如直接吸收、轉(zhuǎn)導、f配對或產(chǎn)生重組宿主細胞所屬領(lǐng)域中巳知的其它方法。外源聚核苷酸可維持為非整合型載體(例如，質(zhì)粒)或可整合入宿主基因組中。如本文中所使用，術(shù)語"還原劑"在蛋白質(zhì)再折疊方面定義為將巰基維持為還原狀態(tài)且還原分子內(nèi)或分子間雙硫鍵的任何化合物或物質(zhì)。合適的還原劑包含(但不限于)二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)以及還原型谷胱甘肽。多種還原劑適用于本文中所述的方法和組合物中。如本文中所使用的"再折疊"描述將含有二硫鍵的多肽由不當折疊或未折疊狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)于二硫鍵的天然或適當折疊構(gòu)象的任何過程、反應(yīng)或方法。如本文中所使用，短語"與……選擇性(或特異性)雜交"指的是當復雜混合物(包含(但不限于)總細胞或文庫DNA或RNA)中存在特定核苷酸序列時，在嚴格雜交條件下分子僅與所述序列結(jié)合、二聯(lián)或雜交。短語"嚴格雜交條件"指的是如所屬領(lǐng)域中已知的低離子濃度和高溫度條件。通常，在嚴格條件下，探針會與核酸的復雜混合物(包含(但不限于)總細胞或文庫DNA或RNA)中的其目標子序列雜交，但不與復雜混合物中的其它序列雜交。嚴格條件具有序列依賴性且在不同環(huán)境下會不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。對核酸雜交的詳細t旨南可見于Tijssen,Ztf6ora/o^y7fec/mz'《we515foc/e附z'^str;v"awdAfo/ecM/ar5/0/ogy-i/^6n'c/feaf/oww"/ziVwc/e/c7Vo6es，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)中。嚴格雜交條件通常經(jīng)選擇為在確定離子濃度、pH值下比特異性序列的熱解鏈點(Tm)低約5'C-10'C。Tm是與標靶互補的探針的50M與標靶序列雜交處于平衡(當標靶序列過量存在時，在Tm下，平衡時50%的探針被占據(jù))時的溫度(在確定離子強度、pH值以及核酸濃度下)。嚴格條件可為在pH值為7.0至8.3下鹽濃度小于約l.OM鈉離子、通常約0.01M至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)且溫度對于短探針(包含(但不限于)10至50個核苷酸)來說為至少約3(TC且對于長探針(包含(但不限于)大于50個核苷酸)來說為至少約6(TC的那些條件。嚴格條件也可通過添加去穩(wěn)定劑(諸如，甲酰胺)來實現(xiàn)。對選擇性或特異性雜交來說，陽性信號可為至少兩倍背景、視情況10倍背景雜交。例示性嚴格雜交條件可如下50%甲酰胺，5XSSC和1。/。SDS，在42t:下培育，或5XSSC,1%SDS，在65。C下培育，其中在65。C下以0.2XSSC和0.1。/。SDS洗滌。所述洗滌可進行5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘或更長時間。如本文中所使用，術(shù)語"個體"指的是動物，在一些實施例中，指的是哺乳動物，且在其它實施例中，指的是人類，其是治療、觀察或?qū)嶒灥膶ο蟆Ｈ绫疚闹兴褂?，術(shù)語"實質(zhì)上經(jīng)純化"指的是可實質(zhì)上或基本上不含與其天然存在環(huán)境中可見的蛋白質(zhì)通常相伴或相互作用的組分的多肽，在重組產(chǎn)生的多肽的情況下，所述環(huán)境即天然細胞或宿主細胞?？蓪嵸|(zhì)上不含細胞物質(zhì)的多肽包含具有少于約30%、少于約25%、少于約20%、少于約15%、少于約10%、少于約5%、少于約4%、少于約3%、少于約2%或少于約1%(以干重計)的污染蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)制劑。當多肽或其變體由宿主細胞重組產(chǎn)生時，蛋白質(zhì)可占細胞干重的約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%或更少。當多肽或其變休由宿主細胞重組產(chǎn)生時，蛋白質(zhì)可以細胞干重計以約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約lg/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約1mg/L或更低濃度存在于培養(yǎng)基中。因此，如由本文中所述的方法所產(chǎn)生的"實質(zhì)上經(jīng)純化"的多肽可具有如由適當方法(諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC以及毛細管電泳)所測定至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%的純度，尤其至少約75%、80%、85%的純度，且更尤其至少約90%的純度、至少約95%的純度、至少約99%或更高的純度。術(shù)語"取代基"包含(但不限于)"無干擾取代基"。"無干擾取代基"是那些產(chǎn)生穩(wěn)定化合物的基團。合適的無干擾取代基或基團包含(但不限于)鹵基、Q-Cu)垸基、C2-d。烯基、C2-d。炔基、d-do烷氧基、Cs-d2芳垸基、C3-d2環(huán)垸基、C4-d2環(huán)烯基、苯基、經(jīng)取代苯基、甲苯基、二甲苯基、聯(lián)苯基、C2-Cu烷氧基烷基、C5-Cu垸氧基芳基、Cs-d2芳氧基垸基、C7-d2氧基芳基、d-C6烷基亞磺?；?、d-do烷基磺?；?(<:112)1-0-((:1-(:1()烷基)(其中m為i至8)、芳基、經(jīng)取代芳基、經(jīng)取代垸氧基、氟烷基、雜環(huán)基、經(jīng)取代雜環(huán)基、硝基垸基、-N02、-CN、-NRC(O)-(C廣do垸基)、-C(O)-(C廣do垸基)、C2-do烷硫基烷基、-C(O)O-(d-do烷基)、-OH、-S02、=S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C廣do烷基)-CF3、-C(0)-CF3、-C(0)NR2、-(C廣do芳基)-S-(C6-do芳基)、-(:(0)隱((:6-(:10芳基)、-((:112)1-0-((:112)1-0-((:1-(:10烷基)(其中111各自為i至8)、-c(o)nr2、-C(S)NR2、-S02NR2、-NRC(0)NR2、-NRC(S)NR2、其鹽以及其類似基團。前述列表中的每一R基團獨立地選自由H、烷基或經(jīng)取代垸基、芳基或經(jīng)取代芳基，或垸芳基組成的群組。當取代基由其從左向右書寫的常規(guī)化學式指定時，其同樣涵蓋可由從右向左書寫結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的化學上相同的取代基，例如，-CH20-等于-OCH2-。垸基和雜烷基(包含通常稱作亞垸基、烯基、亞雜垸基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)垸基、環(huán)烯基以及雜環(huán)烯基的那些基團)的取代基可為選自(但不限于)以下各基團的多個基團中的一個或一個以上基團-OR、=0、=NR、=N-OR、-NR2、-SR、-鹵素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-C02R、-CONR2、-OC(0)NR2、-NRC(O)R、-NRC(0)NR2、-NR(0)2R、-NR-C(NR2)=NR、-S(O)R、-S(0)2R、-S(0)2NR2、-NRS02R、-CN以及-NO;;，其個數(shù)在0到(2m'+l)(其中m'為所述基團中的碳原子的總數(shù)目)的范圍內(nèi)。前述列表中的每一R基團獨立地選自由以下各基團組成的群組氫、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的雜烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的芳基(包含(但不限于)經(jīng)l-3個鹵素取代的芳基)、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的垸基、烷氧基或硫烷氧基或芳垸基。當兩個R基團連接至同一氮原子時，其可與氮原子組合以形成5元環(huán)、6元環(huán)或7元環(huán)。舉例來說，-NR2意謂包含(但不限于)1-吡咯烷基和4-嗎啉基。由取代基的上述討論，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，術(shù)語"烷基"意欲包含包括與不為氫的基團結(jié)合的碳原子的基團，諸如鹵烷基(包含(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和?；?包含(但不限于)-C(0)CH3,、-C(0)CF3、-C(0)CH2OCH3以及其類似基團)。類似于關(guān)于垸基所述的取代基，芳基和雜芳基的取代基可變化且選自(但不限于)隱OR、=0、=NR、=N-OR、-NR2、-SR、-卣素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-C02R、-CONR2、-OC(0)NR2、-NRC(O)R、-NRC(0)NR2、-NR(0)2R、-NR-C(NR2)=NR、-S(O)R、-S(0)2R、-S(0)2NR2、-NRS02R、-CN、-N02、-R、-N3、-CH(Ph)2、氟(d-C4)烷氧基以及氟(d-C4)垸基，數(shù)目在零到芳族環(huán)系統(tǒng)上的開放價態(tài)的總數(shù)的范圍內(nèi)；且其中前述列表中的每一R基團獨立地選自氫、烷基、雜烷基、芳基以及雜芳基。在治療性應(yīng)用中，可將含有(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的組合物以足以治愈或至少部分減輕所述疾病、病癥或病狀的癥狀的量投與已患所述疾病、病癥或病狀的患者。所述量定義為"治療有效量"且將視以下因素而定疾病、病癥或病狀的嚴重性和病程、先前的治療、患者的健康狀態(tài)和對藥物的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判斷。認為通過常規(guī)實驗(例如，劑量遞增臨床試驗)確定所述預防有效量完全在所屬領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。如本文所使用，術(shù)語"測試配位體"指的是可為化合物、分子或復合物的試劑，其正被測試與非天然氨基酸多肽結(jié)合的能力，諸如巳知呈天然形式的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復合物與活有機體(諸如脊椎動物，尤其哺乳動物且甚至更尤其人類)的疾病或病狀相關(guān)或是其病因。因為配位體與其非天然氨基酸多肽的結(jié)合須當配位體對非天然氨基酸多肽產(chǎn)生直接效應(yīng)時才發(fā)生，所以通過本發(fā)明檢定方法指示的結(jié)合是如本文中所述鑒別的配位體的治療潛能的強有力指示?？赏ㄟ^本發(fā)明方法評估的測試配位體可為幾乎任何試劑，包含(但不限于)金屬、多肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、聚核苷酸以及有機小分子。展示結(jié)合非天然氨基酸多肽的測試配位體被稱為配位體?？蓽y試包含超過一種測試配位體的物質(zhì)的復雜混合物(包含(但不限于)天然產(chǎn)物提取物)且如果存在陽性反應(yīng)(即，如果存在與非天然氨基酸多肽的結(jié)合)，那么可從所述混合物中純化結(jié)合非天然氨基酸多肽的配位體，之后進一步評估其治療潛能。術(shù)語"治療"用于指預防性和/或治療性治療。如本文中所使用，術(shù)語"水溶性聚合物"指的是可溶于水性溶劑中的任何聚合物。水溶性聚合物與多肽的鍵聯(lián)可產(chǎn)生改變，其包含(但不限于)相對于未經(jīng)修飾形式，血清半衰期增加或得到調(diào)節(jié)、治療半衰期增加或得到調(diào)節(jié)、免疫原性得到調(diào)節(jié)、物理締合22特征(諸如聚集和多聚體形成)得到調(diào)節(jié)、受體結(jié)合改變、與一種或一種以上結(jié)合搭配物的結(jié)合改變以及受體二聚化或多聚化作用改變。水溶性聚合物可具有或可不具有其自身的生物活性且可用作使多肽與其它物質(zhì)(包含(但不限于)一種或一種以上多肽或一種或一種以上生物活性分子)連接的連接子。合適的聚合物包含(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單Q-Cu)烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美國專利第5,252,714號中，其是以引用的方式并入本文中)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚馬來酸酐、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包含硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纖維素和纖維素衍生物(包含(但不限于)甲基纖維素和羧甲基纖維素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚垸二醇和其衍生物、聚垸二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚，和a-e-聚[(2-羥乙基)-DL-天冬酰胺以及其類似物或其混合物。所述水溶性聚合物的實例包含(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。除非另外指示，否則使用所屬領(lǐng)域內(nèi)的質(zhì)譜、NMR、HPLC、蛋白質(zhì)化學、生物化學、重組DNA技術(shù)以及藥理學的常規(guī)方法。本文中提出的化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽以及用于制備任一種前述化合物的試劑)包含經(jīng)同位素標記的化合物，其與本文中提出的各種式和結(jié)構(gòu)中敘述的那些化合物相同，但一個或一個以上原子由具有與自然界中通常存在的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子代替?？刹⑷氡景l(fā)明的化合物中的同位素的實例包含氫、碳、氮、氧、氟以及氯的同位素，分別諸如2！^、3H、13C、14C、15N、180、170、35S、15F、36C1。本文中所述的某些經(jīng)同位素標記的化合物(例如并有諸如311和14C的放射性同位素的那些化合物)適用于藥物和/或底物組織分布檢定。此外，用諸如氘(即210的同位素取代可提供某些由較高代謝穩(wěn)定性產(chǎn)生的治療優(yōu)點，例如活體內(nèi)半衰期增加或劑量需求降低。本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽以及用于制備任一種前述化合物的試劑)具有不對稱碳原子且可因此以對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體形式存在?；谄湮锢砘瘜W差異，由已知方法(例如，色譜和/或分級結(jié)晶)可將非對映異構(gòu)混合物分離為其個別非對映異構(gòu)體?？赏ㄟ^由與適當光學活性化合物(例如，醇)的反應(yīng)將對映異構(gòu)混合物轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍τ钞悩?gòu)混合物，分離非對映異構(gòu)體且將個別非對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)變(例如，水解)為相應(yīng)純對映異構(gòu)體而將對映異構(gòu)體分離。包含非對映異構(gòu)體、對映異構(gòu)體以及其混合物的所有所述異構(gòu)體均被視作本文中所述的組合物的部分。在另外或其它實施例中，本文中所述的化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽以及用于制備任一種前述化合物的試劑)是以前藥的形式使用。在另外或其它實施例中，本文中所述的化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽以及用于制備任一種前述化合物的試劑)在投與需要產(chǎn)生代謝物的有機體之后代謝，所述代謝物隨后用于產(chǎn)生所需效應(yīng)，包含所需治療效應(yīng)。在其它或另外實施例中為非天然氨基酸和(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的活性代謝物。本文中所述的方法和調(diào)配物包含使用非天然氨基酸和(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的N-氧化物、結(jié)晶形式(也稱作多晶型物)或醫(yī)藥學上可接受的鹽。在某些情形中，非天然氨基酸和(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽可以互變異構(gòu)體形式存在。所有互變異構(gòu)體均包含于本文中提出的非天然氨基酸和(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的范疇內(nèi)。另外，本文中所述的非天然氨基酸和(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽可以非溶劑化形式形式以及與醫(yī)藥學上可接受的溶劑(諸如水、乙醇以及其類似物)形成的溶劑化形式存在。本文中提供的非天然氨基酸和(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的溶劑化形式也視為揭露于本文中。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認識到本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽以及用于制備任一種前述化合物的試劑)可以若千互變異構(gòu)形式存在。所有所述互變異構(gòu)形式均被視作本文中所述的組合物的部分。同樣，例如本文中的任何化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽以及用于制備任一種前述化合物的試劑)的所有烯醇-酮形式均被視作本文中所述的組合物的部分。本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽以及用于制備任一種前述化合物的試劑)具有酸性且可與醫(yī)藥學上可接受的陽離子形成鹽。本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽以及用于制備任一種前述化合物的試劑)可具有堿性且因此可與醫(yī)藥學上可接受的陰離子形成鹽。包含二鹽的所有所述鹽在本文中所述的組合物的范疇內(nèi)且其可通過常規(guī)方法來制備。舉例來說，鹽可通過在水性、非水性或部分水性介質(zhì)中使酸性實體與堿性實體接觸來制備。通過使用以下技術(shù)中的至少一種來回收鹽過濾；以非溶劑沉淀，接著過濾；蒸發(fā)溶劑；或(在水溶液的情況下)凍干。鹽(例如)包含(1)與無機酸或有機酸形成的酸加成鹽，其中所述無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸以及其類似酸；所述有機酸諸如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲垸磺酸、乙烷磺酸、1，2-乙烷二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基雙環(huán)-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4,4'-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羥基萘酸、水楊酸、硬脂酸、粘糠酸以及其類似酸；(2)當母體化合物中存在的酸性質(zhì)子由金屬離子(例如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子)代替；或與有機堿配位時形成的鹽?？山邮艿挠袡C堿包含乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、緩血酸胺、N-甲基葡糖胺以及其類似物。可接受的無機堿包含氫氧化鋁、氫氧化鈣、氫氧化鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉以及其類似物。應(yīng)了解，對鹽的提及包含其溶劑加成形式或晶體形式，尤其溶劑合物或多晶型物。溶劑合物含有化學計量或非化學計量之量的溶劑，且通常在結(jié)晶過程中形成。當溶劑為水時形成水合物，或當溶劑為醇時形成醇化物。多晶型物包含化合物的相同元素組成的不同晶體組合排列。多晶型物通常具有不同X射線衍射圖案、紅外光譜、熔點、密度、硬度、晶體形狀、光學性質(zhì)和電學性質(zhì)、穩(wěn)定性以及溶解性。諸如再結(jié)晶溶劑、結(jié)晶速率以及儲存溫度的各種因素可使得單一晶體形式占優(yōu)勢。以引用的方式并入本說明書中所提及的所有公開案、專利以及專利申請案是出于所有目的以引用的方式全部并入本文中，引用的程度就如同已特定地且個別地將各個別公開案、專利或?qū)＠暾埌赋鲇谒心康囊砸玫姆绞讲⑷氲谋疚闹?。本發(fā)明的新穎特征詳細陳述于隨附權(quán)利要求書中。通過參考下列陳述利用本發(fā)明的原理的說明性實施例的詳細描述和以下隨附圖式將獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更充分理解。圖l呈示本文所述的方法、組合物、策略以及技術(shù)的某些方面的關(guān)系的示意圖。圖la呈示多種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。圖2呈示使經(jīng)翻譯并入(或以其他方式并入)多肽中的氨基酸官能團(A)與反應(yīng)物(B)反應(yīng)以得到修飾多肽的反應(yīng)的說明性非限定性實例。圖3呈示通過使含羰基非天然氨基酸組分與含羥胺試劑反應(yīng)形成含肟非天然氨基酸組分的說明性非限定性實例。圖4呈示通過使含羥胺非天然氨基酸組分與含羰基試劑反應(yīng)形成含肟非天然氨基酸組分的說明性非限定性實例。圖5呈示通過使含肟非天然氨基酸組分與含羰基試劑反應(yīng)形成含JB非天然氨基酸組分的說明性非限定性實例。圖6呈示通過使含二羰基非天然氨基酸組分與含羥胺試劑反應(yīng)形成含肟非天然氨基酸組分的說明性非限定性實例。圖7呈示通過使含羥胺非天然氨基酸組分與含二羰基試劑反應(yīng)形成含肟非天然氨基酸組分的說明性非限定性實例。圖8呈示通過使含肟非天然氨基酸組分與含羰基或二羰基試劑發(fā)生肟交換反應(yīng)形成含肟非天然氨基酸組分的說明性非限定性實例。圖9呈示通過在并入多肽中的非天然氨基酸的羰基與分子的羥胺之間形成肟來位點特異性地連接至蛋白質(zhì)的分子的非限定性實例。圖io展示利用與非天然氨基酸反應(yīng)的樹脂的非天然氨基酸多肽的純化方法的實例。圖11展示以"一鍋法"進行非天然氨基酸多肽的純化和多肽的接合的方法的實例。圖12展示樹脂選擇和官能化的實例。圖13展示使用羥胺樹脂親和力純化非天然氨基酸多肽的實例。圖14展示使用醛樹脂純化非天然氨基酸多肽的實例。圖15展示從裂解后轉(zhuǎn)化為酪胺酸的非天然氨基酸前驅(qū)體純化天然蛋白質(zhì)的實例。圖16展示非天然氨基酸的非限定性實例。圖17展示hGH-單鏈DNA接合物的SDS-PAGE分析1)接合反應(yīng)的反應(yīng)混合物；2)通過HIC管柱純化的hGH-ssDNA接合物。圖18展示蛋白質(zhì)-ssDNA接合物雜交。圖19展示hGH-ssDNA接合物雜交的天然14%甘氨酸凝膠分析；hGH-ssDNA接合物(5nL)具有1)0nl、2)2^、3)4nl、4)6pl、5)8pl、6)10nl的1,FTam28d3;和7)2pl、8)4nl、9)8nl的10FTam28-d3。圖20展示5pil與1)0pl、2)1pl、3)4pl的100nMFTam28d3混合的hGH-ssDNA和與4)1pl、5)0pl的100pMFTam28-d3混合的hGH的天然凝膠分析。圖21展示使用DNA作為模板的一維hGH結(jié)構(gòu)的裝配。具體實施方式I.引言近年來，已報導一種誓將克服多種與蛋白質(zhì)的位點特異性修飾相關(guān)的限制的全新蛋白質(zhì)科學技術(shù)。具體來說，已將新的組分添加到原核生物大腸桿菌(例如，L.Wang等人，(2001),Science292:498-500)和真核細胞釀酒酵母(Sacchromycescerevisiae;S.cerevisiae)(例如，J.Chin等人，Science301:964-7(2003))的蛋白質(zhì)生物合成機構(gòu)中，此使得能夠在活體內(nèi)將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。使用此方法，具有新穎化學、物理或生物性質(zhì)的許多新氨基酸(包含光親和性標記和可光異構(gòu)化氨基酸、酮基氨基酸以及糖基化氨基酸)已回應(yīng)琥珀密碼子TAG有效且高保真性地并入大腸桿菌和酵母中的蛋白質(zhì)中。例如參看J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027(以引用的方式全部并入)；J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem3ni、:1135-1137C以引用的方式全部并入)；J.W.Chin，等人，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024C以引用的方式全部并入)；以及L.Wang和P.G.Schultz，(2002),Chem.Comm.,l:l陽ll(以引用的方式全部并入)。所述研究己證實有可能選擇性且常規(guī)地引入蛋白質(zhì)中不存在的化學官能團，其對20種常見遺傳編碼氨基酸中存在的所有官能團呈化學惰性，且可用于有效且選擇性地反應(yīng)以形成穩(wěn)定共價鍵。II.概述圖I是對本文中所述的組合物、方法以及技術(shù)的概述。在某種程度上，從美國專利申請案第60/638，418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號中以引用的方式全部并入用于產(chǎn)生和使用包括至少一個非天然氨基酸或經(jīng)修飾非天然氨基酸的多肽的手段(方法、組合物、技術(shù))。所述非天然氨基酸多肽可含有其它官能團，包含(但不限于)標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯(lián)劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應(yīng)性化合物；樹脂；第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反義聚核苷酸；糖、水溶性樹枝狀聚合物、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團；含金屬部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠蔽部分；可光化輻射激發(fā)的部分；可光異構(gòu)化部分；生物素；生物素衍生物；生物素類似物；結(jié)合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長的側(cè)鏈；碳鍵聯(lián)糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經(jīng)同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發(fā)色團；能量轉(zhuǎn)移劑；生物活性劑；可檢測標記；小分子；量子點；納米傳遞素；以及上述各者的任何組合。如圖1中所示，一方面為使用美國專利申請案第60/638,418號、第60/638，527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/6%，302號以及第60/696,068號(其是以引用的方式全部并入本文中)中進一步描述的方法、組合物以及技術(shù)來選擇和設(shè)計欲修飾的多肽的方法。新穎多肽可從頭設(shè)計，其包含(僅舉例來說)作為高通量篩檢方法(在此情況下，可設(shè)計、合成、表征和/或測試眾多多肽)的部分或根據(jù)研究者的興趣設(shè)計。新穎多肽也可根據(jù)已知或部分表征的多肽的結(jié)構(gòu)進行設(shè)計。僅舉例來說，生長激素基因超家族(GrowthHormoneGeneSuperfamily)(見下文)巳成為科學團體廣泛研究的主題；新穎多肽可根據(jù)這一基因超家族的成員的結(jié)構(gòu)進行設(shè)計。選擇哪個氨基酸來取代和/或修飾的原則單獨描述于本文中。使用哪種修飾的選擇也描述于本文中，且可用于滿足實驗人員或最終使用者的需求。修飾包含(僅舉例來說)操縱多肽的治療功效；改良多肽的安全性概況；調(diào)節(jié)多肽的藥物動力學；向多肽提供其它官能團；向多肽中并入標簽、標記或可檢測信號；易化多肽的分離性質(zhì)以及前述修飾的任何組合。因此，美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號(其是以引用的方式全部并入本文中)中進一步提供和描述包括至少一個非天然氨基酸或經(jīng)修飾非天然氨基酸的多肽。多種非天然編碼氨基酸適用于本發(fā)明?？稍诙嚯闹幸肴魏螖?shù)目的非天然編碼氨基酸。所引入的非天然編碼氨基酸通常對20種常見遺傳編碼氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸以及纈氨酸)實質(zhì)上呈化學惰性。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含與20種常見氨基酸中不存在的官能團(包含(但不限于)疊氮基、酮基、醛基以及氨基氧基(aminooxy))有效且選擇性地反應(yīng)以形成穩(wěn)定接合物的側(cè)鏈官能團。因為本發(fā)明的非天然編碼氨基酸通常僅在側(cè)鏈結(jié)構(gòu)方面與天然氨基酸不同，所以非天然編碼氨基酸以與天然存在多肽中形成酰胺鍵相同的方式與其它氨基酸(包含(但不限于)天然或非天然編碼氨基酸)形成酰胺鍵。然而，非天然編碼氨基酸具有使其區(qū)別于天然氨基酸的側(cè)鏈基團。舉例來說，側(cè)鏈(R基團)視情況包括烷基-、芳基-、?；?、酮基-、疊氮基-、羥基-、肼、氰基-、鹵基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺?；?、硼酸酯基(borate)、,酸酯基(boronate)、磷?；㈧Ⅴ；㈧?、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、氨基或其類似基團或其任何組合。可適于在本發(fā)明中使用的所關(guān)注的其它非天然存在的氨基酸包含(但不限于)包括可光活化交聯(lián)劑的氨基酸、經(jīng)自旋標記的氨基酸、熒光氨基酸、金屬結(jié)合氨基酸、含金屬氨基酸、放射性氨基酸、具有新穎官能團的氨基酸、與其它分子共價或非共價相互作用的氨基酸、光籠蔽和/或可光異構(gòu)化氨基酸、包括生物素或生物素類似物的氨基酸、糖基化氨基酸(諸如糖取代絲氨酸)、經(jīng)其它碳水化合物修飾的氨基酸、含酮基氨基酸、包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸、經(jīng)重原子取代氨基酸、可化學裂解和/或可光裂解氨基酸、與天然氨基酸相比具有延長的側(cè)鏈的氨基酸(包含(但不限于)聚醚或長鏈烴，包含(但不限于)超過約5個碳或超過約IO個碳)、碳鍵聯(lián)含糖氨基酸、氧化還原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及含有一個或一個以上毒性部分的氨基酸。多種用于并入多肽中的非天然氨基酸可見于標題為"Invivoincorporationofunnaturalaminoacids"的WO2002/085923中，其是以引用的方式全部并入本文中?；铙w內(nèi)合并非天然編碼氨基酸的方法和組合物描述于美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)中，其是以引用的方式全部并入本文中。選擇在有機體的活體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中使用的正交tRNA-tRNA合成酶對的方法也描述于美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931)中，其是以引用的方式全部并入本文中。以引用的方式全部并入本文中的標題為"SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins"的PCT公開案第WO04/035743號描述用于合并酮基氨基酸的正交RS和tRNA對。以引用的方式全部并入本文中的標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號描述用于在真核宿主細胞中并入非天然編碼氨基酸的正交RS和tRNA對。非天然編碼氨基酸具有使其區(qū)別于天然氨基酸的側(cè)鏈基團。所述側(cè)鏈可包括垸基-、芳基-、?；?、酮基-、疊氮基-、羥基-、肼、氰基-、鹵基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺?；?、硼酸酯基、,酸酯基、磷酰基、膦?；?、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、氨基或其類似基團或其任何組合。在某些實施例中，具有至少一個非天然氨基酸或經(jīng)修飾非天然氨基酸基團的多肽在多肽上的一些位置上包含至少一次翻譯后修飾。在一些實施例中，翻譯后修飾是通過細胞機構(gòu)(例如，糖基化、乙酰化、?；?、脂質(zhì)修飾、棕櫚?；?、棕櫚酸鹽加成、磷酸化、糖脂鍵修飾以及其類似機構(gòu))發(fā)生，在許多情況下，所述基于細胞機構(gòu)的翻譯后修飾發(fā)生在多肽上的天然存在氨基酸位點上，然而，在某些實施例中，基于細胞機構(gòu)的翻譯后修飾發(fā)生在多肽上的非天然氨基酸位點上。在其它實施例中，翻譯后修飾不利用細胞機構(gòu)，而是通過利用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員巳知的適于特定反應(yīng)性基團的化學方法使包括第二反應(yīng)性基團的分子(包含(但不限于)標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯(lián)劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應(yīng)性化合物；樹脂；第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反義聚核苷酸；糖、水溶性樹枝狀聚合物、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團、含金屬部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠蔽部分；可光化輻射激發(fā)的部分；可光異構(gòu)化部分；生物素；生物素衍生物；生物素類似物；結(jié)合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長的側(cè)鏈；碳鍵聯(lián)糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經(jīng)同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發(fā)色團；能量轉(zhuǎn)移劑；生物活性劑；可檢測標記；小分子、量子點；納米傳遞素以及上述各者的任何組合)連接至至少一種包括第一反應(yīng)性基團(包含(但不限于)含有酮、醛、縮醛、半縮醛、肟或羥胺官能團的非天然氨基酸)的非天然氨基酸來提供。在某些實施例中，翻譯后修飾是在真核細胞或非真核細胞中活體內(nèi)進行。在某些實施例中，翻譯后修飾是在活體外進行。這一方面同樣包含用于制備、純化、表征以及使用含有至少一個所述經(jīng)翻譯后修飾的非天然氨基酸的所述多肽的方法。美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號(其是以引用的方式全部并入本文中)中進一步描述的方法、組合物、策略以及技術(shù)的范疇內(nèi)也包含能夠與作為多肽的部分的非天然氨基酸反應(yīng)以產(chǎn)生任何前述翻譯后修飾的試劑。一般來說，所得經(jīng)翻譯后修飾的非天然氨基酸應(yīng)含有至少一個可經(jīng)受后續(xù)修飾反應(yīng)的非天然氨基酸。這一方面也包含用于制備、純化、表征以及使用能夠進行所述非天然氨基酸的任何所述翻譯后修飾的所述試劑的方法。在某些實施例中，蛋白質(zhì)包含至少一種由一種宿主細胞在活體內(nèi)產(chǎn)生的翻譯后修飾，其中翻譯后修飾通常不由另一種宿主細胞類型產(chǎn)生。在某些實施例中，蛋白質(zhì)包含至少一種由真核細胞在活體內(nèi)產(chǎn)生的翻譯后修飾，其中翻譯后修飾通常不由非真核細胞產(chǎn)生。所述翻譯后修飾的實例包含(但不限于)糖基化、乙?；?、?；⒅|(zhì)修飾、棕櫚酰化、棕櫚酸鹽加成、磷酸化、糖脂鍵修飾以及其類似修飾。在一實施例中，翻譯后修飾包括通過GlcNAc-天冬酰胺鍵將寡糖連接至天冬酰胺(包含(但不限于)，其中寡糖包括(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc和其類似物)。在另一實施例中，翻譯后修飾包括通過GalNAc-絲氨酸、GalNAc-蘇氨酸、GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸鍵將寡糖(包含(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)連接至絲氨酸或蘇氨酸。在某些實施例中，蛋白質(zhì)或多肽可包括分泌或定位序列、抗原決定基標簽、FLAG標簽、聚組氨酸標簽、GST融合體和/或其類似物。分泌信號序列的實例包含(但不限于)原核分泌信號序列、真核分泌信號序列、5'經(jīng)優(yōu)化以供細菌表達的真核分泌信號序列、新穎分泌信號序列、果膠裂解酶分泌信號序列、OmpA分泌信號序列以及噬菌體分泌信號序列。30分泌信號序列的實例包含(但不限于)STII(原核)、FdGUI和M13(噬菌體)、Bgl2(酵母)以及來源于轉(zhuǎn)座子的信號序列bla。這一方面也包括產(chǎn)生、純化、表征以及使用所述含有至少一個所述翻譯后修飾的多肽的方法。所關(guān)注的蛋白質(zhì)和多肽可含有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或10個或10個以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如，在包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同非天然氨基酸的蛋白質(zhì)中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同位點。在某些實施例中，以蛋白質(zhì)的天然存在形式存在的特定氨基酸中的至少一個(但少于全部)經(jīng)非天然氨基酸取代。本文中提供和所描述的方法和組合物包含包括至少一個非天然氨基酸的多肽。將至少一個非天然氨基酸引入多肽中可允許應(yīng)用包括特定化學反應(yīng)(包含(但不限于)與一種或一種以上非天然氨基酸反應(yīng)，而不與通常存在的20種氨基酸反應(yīng))的接合化學。一旦并入，則所述氨基酸側(cè)鏈可利用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知適于天然編碼氨基酸中存在的特定官能團或取代基的化學方法來修飾。本文中所述的非天然氨基酸方法和組合物提供具有多種官能團、取代基或部分的物質(zhì)與其它物質(zhì)的接合物，所述其它物質(zhì)包含(但不限于)標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯(lián)劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應(yīng)性化合物；樹脂；第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反義聚核苷酸；糖、水溶性樹枝狀聚合物、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團；含金屬部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠蔽部分；可光化輻射激發(fā)的部分；配位體；可光異構(gòu)化部分；生物素；生物素衍生物；生物素類似物；結(jié)合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長的側(cè)鏈；碳鍵聯(lián)糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經(jīng)同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發(fā)色團；能量轉(zhuǎn)移劑；生物活性劑；可檢測標記；小分子；量子點；納米傳遞素以及上述各者的任何組合。非天然氨基酸多肽與分子(包含(但不限于)生物素)的接合可使得能夠純化接合物。美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號(其是以引用的方式全部并入本文中)中進一步描述的組合物、方法、技術(shù)以及策略的另一方面為研究或使用前述(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽中的任一者的方法。在這一方面中包含(僅舉例來說)會受益于包括(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽或蛋白質(zhì)的多肽的治療、診斷、基于檢定、工業(yè)、化妝品、植物生物學、環(huán)境、能量產(chǎn)生和/或軍事用途。本發(fā)明提供檢測前述(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽或其片段的方法。所述非天然氨基酸多肽或其片段可通過在適于允許特異性相互作用的條件下使非天然氨基酸多肽或其片段與分子文庫組合來獲得。本發(fā)明也提供檢測前述(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽或其片段的方法，其中非天然氨基酸多肽或其片段通過在適于允許特異性相互作用的條件下使非天然氨基酸多肽或其片段與蛋白質(zhì)文庫或其蛋白質(zhì)組合獲得。所述相互作用包含(但不限于)乙?；?、羧化、酰化、磷酸化、脫磷酸化、泛素化、糖基化、脂質(zhì)修飾、ADP核糖基化、生物可用性以及半衰期。所述文庫包含ct-l抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫輔基蛋白、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-IO、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血鈣素、c-kit配位體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-lci、單核細胞炎性蛋白-ie、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配位體、c-kit配位體、膠原蛋白、集落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子、上皮中性粒細胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細胞活化肽、紅細胞生成素(EPO)、表皮剝脫毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-l、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、grf、刺猬蛋白、血色素、肝細胞生長因子(hGF)、水蛭素、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素(IFN)、IFN-a、IFN-0、IFN-Y、白細胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12、角質(zhì)細胞生長因子(KGF)、乳鐵傳遞蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經(jīng)素、中性粒細胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因產(chǎn)物、旁降鈣素(pamcitonin)、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素(pleiotropin)、蛋白A、蛋白G、pth、致熱外毒素A、致熱外毒素B、致熱外毒素C、pyy、松弛素、腎素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調(diào)節(jié)素、生長激素抑制素、生長激素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素a1、組織型纖溶酶原活化因子、腫瘤生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子a、腫瘤壞死因子e、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、尾加壓素-II、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、尿激酶、mos、ms、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受體、孕酮受體、睪丸激素受體、醛固酮受體、LDL受體以及皮質(zhì)酮。IH.非天然氨基酸在多肽中的位置本文中所揭露的非天然氨基酸多肽或其片段包含將一個或一個以上非天然氨基酸并入多肽中。一個或一個以上非天然氨基酸可在不破壞多肽活性的特定位置處并入。此舉可通過進行"保守性"取代(包含(但不限于)用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸，大體積氨基酸取代大體積氨基酸，親水性氨基酸取代親水性氨基酸)和/或?qū)⒎翘烊话被岵迦氩粸榛钚运璧奈恢弥衼韺崿F(xiàn)。可使用多種生物化學和結(jié)構(gòu)方法來選擇用于在多肽內(nèi)經(jīng)非天然氨基酸取代的所需位點。多肽鏈的任何位置都適于選擇以并入非天然氨基酸，且選擇可基于合理設(shè)計或出于任何或無特定所需目的通過隨機選擇進行。所需位點的選擇可用于產(chǎn)生具有任何所需性質(zhì)或活性的非天然氨基酸多肽(其可經(jīng)進一步修飾或保持未修飾，包含(但不限于)激動劑、超激動劑、反向激動劑、拮抗劑、受體結(jié)合調(diào)節(jié)劑、受體活性調(diào)節(jié)劑、與一個或一個以上結(jié)合搭配物的結(jié)合的調(diào)節(jié)劑、結(jié)合搭配物活性調(diào)節(jié)劑、結(jié)合搭配物構(gòu)象調(diào)節(jié)劑)、二聚體或多聚體形成、與天然分子相比活性或性質(zhì)無改變或操縱多肽的任何物理或化學性質(zhì)，諸如溶解性、聚集或穩(wěn)定性。舉例來說，可使用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的點突變分析、丙氨酸掃描或同源物掃描方法來鑒別多肽的生物活性所需的多肽中的位置。類似于Cunningham,B.和Wells,J.,Sc/e"ce，244:1081-1085(1989)和Cunningham,B.等人，Scfe"ce243:1330-1336(1989)中所述的方法的方法可用于鑒別對生物活性關(guān)鍵的殘基和/或可用于鑒別抗體和受體抗原決定基。美國專利第5,580,723號、第5,834,250號、第6,013,478號、第6,428,954號以及第6,451,561號(其是以引用的方式并入本文中)中描述通過用標靶物質(zhì)鑒別影響多肽活性的活性域來系統(tǒng)分析多肽的結(jié)構(gòu)和功能的方法。視所尋求的多肽的所需活性而定，不為由丙氨酸或同源物掃描突變誘發(fā)鑒別為對生物活性關(guān)鍵的那些殘基的殘基可為用非天然氨基酸取代的良好候選者?；蛘撸匀灰曀鶎で蟮亩嚯牡乃杌钚远?，經(jīng)鑒別對生物活性關(guān)鍵的位點也可為用非天然氨基酸取代的良好候選者。另一替代方法為在多肽鏈上的各位置中用非天然氨基酸簡單進行連續(xù)取代且觀察對多肽活性的影響。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員易于了解，用于選擇用于經(jīng)非天然氨基酸取代入任何多肽中的位置的任何方式、技術(shù)或方法適用于本發(fā)明中。也可研究含有缺失的多肽的天然存在突變體的結(jié)構(gòu)和活性以確定可能容許經(jīng)非天然氨基酸取代的蛋白質(zhì)區(qū)域。一旦消除可能不容許經(jīng)非天然氨基酸取代的殘基，就可從相關(guān)多肽和任何締合配位體或結(jié)合蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)來研究在每一剩余位置上的提議取代的影響。許多多肽的X射線結(jié)晶學和NMR結(jié)構(gòu)也可獲自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank)(PDB,www.rcsb.org),其為含有大分子蛋白質(zhì)和核酸的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的集中數(shù)據(jù)庫。因此，所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可容易地鑒別可經(jīng)非天然氨基酸取代的氨基酸位置。并入非天然氨基酸的例示性位點包含(但不限于)排除在潛在受體結(jié)合區(qū)(與一個或一個以上結(jié)合搭配物結(jié)合的區(qū)域)之外的那些位點，其可完全或部分暴露在溶劑中，與附近殘基具有最小或無氫鍵相互作用，可最小程度地暴露于附近反應(yīng)性殘基中，可為多肽的一個或一個以上暴露面，可在如由與其締合受體、配位體或結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合或未結(jié)合或與另一多肽或其它生物活性分子偶合或未偶合的多肽的三維、二級、三級或四級結(jié)構(gòu)所預測的高度柔性或結(jié)構(gòu)剛性的區(qū)域中，或可通過按需要改變完整結(jié)構(gòu)的柔性或剛性調(diào)節(jié)多肽自身或包括一個或一個以上多肽的二聚體或多聚體的構(gòu)象。多種非天然氨基酸可經(jīng)取代或并入多肽中的給定位置中。一般來說，可基于對多肽與其締合配位體、受體和/或結(jié)合蛋白質(zhì)的三維晶體結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)或四級結(jié)構(gòu)的研究來選擇用于并入的特定非天然氨基酸，優(yōu)選保守性取代(即，基于芳基的非天然氨基酸，諸如對酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸取代Phe、Tyr或Trp)以及希望引入多肽蛋白質(zhì)中的特定接合化學。所述方法進一步包含向蛋白質(zhì)中并入非天然氨基酸，其中非天然氨基酸包括第一反應(yīng)性基團；以及使蛋白質(zhì)與包括第二反應(yīng)性基團的分子(包含(但不限于)標記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交聯(lián)劑、細胞毒性化合物、藥物、親和性標記、光親和性標記、反應(yīng)性化合物、樹脂、第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、糖、水溶性樹枝狀聚合物、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、納米粒子、自旋標記、熒光團、含金屬部分、放射性部分、新穎官能團、與其它分子共價或非共價相互作用的基團、光籠蔽部分、光化學輻射可激發(fā)部分、可光異構(gòu)化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、合并有重原子的部分、可化學裂解的基團、可光裂解的基團、延長的側(cè)鏈、碳鍵聯(lián)糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、毒性部分、經(jīng)同位素標記的部分、生物物理探針、磷光基團、化學發(fā)光基團、電子致密基團、磁性基團、插入基團、發(fā)色團、能量轉(zhuǎn)移劑、生物活性劑、可檢測標記、小分子、量子點、納米傳遞素以及上述各者的任何組合)接觸。在一些情況下，非天然氨基酸取代或并入將與多肽內(nèi)的其它添加、取代或缺失組合以影響其它生物特性。在一些情況下，其它添加、取代或缺失可增加多肽的穩(wěn)定性(包含(但不限于)對蛋白質(zhì)水解降解具抗性)或增加多肽對其適當受體、配位體和/或結(jié)合蛋白質(zhì)的親和性。在一些情況下，其它添加、取代或缺失可增加多肽的溶解性(包含(但不限于)在表達于大腸桿菌或其它宿主細胞中時)。在一些情況下，為在大腸桿菌重組宿主細胞中表達后使多肽溶解性增加，除用于并入非天然氨基酸的另一位點之外，還選擇用于經(jīng)天然編碼或非天然氨基酸取代的位點。在一些情況下，多肽包括另一添加、取代或缺失，其調(diào)節(jié)對締合配位體、結(jié)合蛋白質(zhì)和/或受體的親和性、調(diào)節(jié)(包含(但不限于)增加或降低)受體二聚化、使受體二聚體穩(wěn)定、調(diào)節(jié)循環(huán)半衰期、調(diào)節(jié)釋放或生物可用性、利于純化或改良或改變特定投藥途徑。類似地，多肽可包括改良多肽的檢測(包含(但不限于)GFP)、純化、通過組織或細胞膜轉(zhuǎn)運、前藥釋放或活化、大小減小或其它特性的化學或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反應(yīng)性基團、抗體結(jié)合域(包含(但不限于)FLAG或poly-His)或其它以親和性為基礎(chǔ)的序列(包含(但不限于)FLAG、poly-ffis、GST等)或鍵聯(lián)分子(包含(但不限于)生物素)。iv.例示性生長激素超基因家族本文中所述的方法、組合物、策略以及技術(shù)不限于多肽或蛋白質(zhì)的特定類型、種類或家族。僅舉例來說，多肽可與選自由以下各物組成的群組的治療性蛋白質(zhì)同源a-l抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、抗體片段、載脂蛋白、脫輔基蛋白、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-IO、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血鈣素、c-kit配位體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-la、單核細胞炎性蛋白-ie、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配位體、c-kit配位體、膠原蛋白、集落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體l、細胞因子、上皮中性粒細胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細胞活化肽、紅細胞生成素(epo)、表皮剝脫毒素、因子ix、因子vn、因子vm、因子x、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-l、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、grf、刺猬蛋白、血色素、肝細胞生長因子(hGF)、水蛭素、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、ICAM-l、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素(IFN)、IFN-a、IFN-P、IFN-Y、白細胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12、角質(zhì)細胞生長因子(KGF)、乳鐵傳遞蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經(jīng)素、中性粒細胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因產(chǎn)物、旁降鈣素、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致熱外毒素A、致熱外毒素B、致熱外毒素C、pyy、松弛素、腎素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調(diào)節(jié)素、生長激素抑制素、生長激素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素a1、組織型纖溶酶原活化劑、腫瘤生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子a、腫瘤壞死因子P、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受體、孕酮受體、睪丸激素受體、醛固酮受體、LDL受體以及皮質(zhì)酮。本文中抗體片段包含為存在于全長抗體內(nèi)的較小組分的抗體和已經(jīng)工程化的抗體?？贵w片段包含(但不限于)Fv、Fc、Fab，以及(Fab')2、單鏈Fv(scFv)、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、雙功能雜交抗體、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的組合、可變區(qū)、構(gòu)架區(qū)、恒定區(qū)以及其類似物(Maynard和Georgiou,2000,Annu.Rev.Biomed.Eng.2:339-76;Hudson,1998，Curr.Opin.Biotechnol.9:395-402)。另一功能亞結(jié)構(gòu)為單鏈Fv(scFv)，其包括由肽連接子共價連接的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)(S-zHu等人，1996,CancerResearch,56,3055-3061)。所述小(Mr25,000)蛋白質(zhì)通常保持對單一多肽中的抗原的特異性和親和性且可為較大的抗原特異性分子提供方便的構(gòu)建組分。多肽也包含抗體重鏈、輕鏈、可變區(qū)、替代骨架非抗體分子以及雙特異性抗體以及其它抗原結(jié)合多肽或其片段。因此，僅出于說明性目的且僅以舉例的方式且并不作為對本文中所述的方法、組合物、策略以及技術(shù)的范疇的限制提供對于生長激素超基因家族的以下描述。此外，在本申請案中提及GH多肽意欲使用一般術(shù)語作為GH超基因家族的任何成員的實例。因此，應(yīng)了解在本文中提及GH多肽或蛋白質(zhì)時所述的修飾和化學可同樣適用于GH超基因家族的任何成員(包含在本文中特定列出或以引用的方式并入的那些成員)。以下蛋白質(zhì)包含由生長激素(GH)超基因家族的基因編碼的那些蛋白質(zhì)(Bazan,F.,/w附imo/ogy7bi/a少11:350-354(1990);Bazan,J.F.257:410-413(1992);Mott,H.R.禾口Campbell,I.D.，CWr虛Qpfm'on5^wc加ra/5:114-121(1995);Silvennoinen,O.和Ihle,J.N.,SIGNALLINGBYTHEHEMATOPOIETICCytokineReceptors(1996)):生長激素、泌乳激素、胎盤催乳素、促紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白細胞介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12(p35亞單位)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、a干擾素、e干擾素、y干擾素、"干擾素、t干擾素、粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和心臟營養(yǎng)素-l(CT-1)("GH超基因家族")。預期在未來會通過基因克隆和測序來鑒別出這一基因家族的其它成員。GH超基因家族的成員具有類似的二級和三級結(jié)構(gòu)，但其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共有的結(jié)構(gòu)特征使得基因家族的新成員易于鑒別且在本文中所描述且以引用的方式并入的非天然氨基酸方法和組合物類似地適用。包含G-CSF(Zink等人，F(xiàn)EBSLett.314:435(1992);Zink等人，Biochemistry33:8453(1994);Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5167(1993))、GM-CSF(Diederichs,K.等人，S"e"ce154:1779-1782(1991);Walter等人，乂Mo/.編,224:1075-1085(1992))、IL-2(Bazan，J.F.和McKay,D.B.Scfewce257:410-413(1992))、IL-4(Redfield等人,5/oc/謹勿30:11029-11035(1991);Powers等人，Sc/e"ce256:1673-1677(1992))以及IL-5(Milbum等人，A^/""363:172-176(1993))的眾多細胞因子的結(jié)構(gòu)已由X射線衍射和NMR研究測定且展示具有GH結(jié)構(gòu)的驚人保守性，但缺乏顯著的一級序列同源性。根據(jù)建模和其它研究，認為IFN為這一家族的成員(Lee等人，J.InterferonCytokineRes.15:341(1995);Murgolo等人，Proteins17:62(1993);Radhakrishnan等人，Structure4:1453(1996);Klaus等人，J.Mol.Biol.274:661(1997))。根據(jù)建模和突變誘發(fā)研究，認為EPO為這一家族的成員(Boissel等人，/B/o/.CTze附.268:15983-15993(1993);Wen等人，J.Biol.Chem.269:22839-22846(1994))。包含睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、血小板生成素(TPO)、制素M、巨噬細胞集落剌激因子(M-CSF)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15以及粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)和IFN(諸如a、p、"、t、e及Y干擾素)的大量其它細胞因子和生長因子屬于這一家族(回顧于Mott和Campbell,Cwr腦r0—/。"浙w"調(diào)/5油gy5:114-121(1995);Silvennoinen和Ihle(1996)SignallingbytheHematopoieticCytokineReceptors中)。如今認為所有上述細胞因子和生長因子構(gòu)成一個大的基因家族。除共有類似的二級和三級結(jié)構(gòu)之外，這一家族的成員共有以下性質(zhì)其須使細胞表面受體寡聚以活化細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導路徑。一些GH家族成員(包含(但不限于)GH和EPO)與單一類型的受體結(jié)合且使其形成同二聚體。其它家族成員(包含(但不限于)IL-2、IL-4和IL-6)與超過一種類型的受體結(jié)合且使所述受體形成異二聚體或更高級聚集體(Davis等人，(1993),Sc/e"ce260:1805-1808;Paonessa等人，(1995),EMBOJ.14:1942-1951;Mott和Campbell,Qp油Hzw浙w"謹/5油gy5:114-121(1995))。突變誘發(fā)研究已證明，如同GH—樣，所述其它細胞因子和生長因子含有多個受體結(jié)合位點(通常兩個)且依次與其同源受體結(jié)合(Mott和Campbell,O^re"/0//"/on/"S,ra"wa/5fo/ogy5:114-121(1995);Matthews等人，(1996)iVoc.iVa//.93:9471-9476)。如同GH—樣，所述其它家族成員的主要受體結(jié)合位點主要存在于四個a螺旋和A-B環(huán)中。不同家族成員中參與受體結(jié)合的螺旋束中的特定氨基酸不同。與GH超基因家族成員相互作用的大多數(shù)細胞表面受體在結(jié)構(gòu)上相關(guān)且構(gòu)成第二個大的多基因家族。例如參看美國專利第6,608,183號，其是以引用的方式并入本文中。從GH超基因家族的各個成員的突變研究得到的一般結(jié)論為連接a螺旋的環(huán)通常傾向于不參與受體結(jié)合。具體來說，對于大多數(shù)(如果不是全部)家族成員中的受體結(jié)合來說，短B-C環(huán)似乎是非必需的。出于這一原因，在GH超基因家族成員中，B-C環(huán)可經(jīng)如本文中所述的非天然氨基酸取代。A-B環(huán)、C-D環(huán)(以及干擾素/GH超家族的類IL-10成員的D-E環(huán))也可經(jīng)非天然氨基酸取代。最接近螺旋A且遠離最后一個螺旋兩氨基酸也傾向于不參與受體結(jié)合中且也可為用于引入非天然氨基酸的位點。在一些實施例中，非天然氨基酸在環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)的任何位置(包含(但不限于)A-B、B-C、C-D或D-E環(huán)的前l(fā)、2、3、4、5、6、7或7個以上氨基酸)處取代。在一些實施例中，一個或一個以上非天然氨基酸在A-B、B-C、C-D或D-E環(huán)的后1、2、3、4、5、6、7或7個以上氨基酸內(nèi)取代。GH家族的某些成員(包含(但不限于)EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IFN、GM-CSF、TPO、IL-IO、IL-12p35、IL-13、IL-15和e干擾素)含有N鍵聯(lián)和/或0鍵聯(lián)的糖。蛋白質(zhì)中的糖基化位點幾乎僅存在于環(huán)區(qū)域中且不存在于a螺旋束中。因為環(huán)區(qū)域通常不參與受體結(jié)合中且因為其為用于共價連接糖基團的位點，所以其可為將非天然氨基酸取代引入蛋白質(zhì)中的適用位點。在蛋白質(zhì)中包括N鍵聯(lián)和0鍵聯(lián)糖基化位點的氦基酸可為非天然氨基酸取代的位點，因為所述氨基酸為表面暴露的。因此，天然蛋白質(zhì)可容許在所述位點處與蛋白質(zhì)連接的龐大糖基且糖基化位點傾向于遠離受體結(jié)合位點。未來可能發(fā)現(xiàn)GH基因家族的其它成員?？赏ㄟ^對所預測蛋白質(zhì)序列的計算機輔助二級和三級結(jié)構(gòu)分析來鑒別GH超基因家族的新成員。GH超基因家族的成員通常具有4個或5個由非螺旋氨基酸連接的兩性螺旋(環(huán)區(qū)域)。蛋白質(zhì)可在其N末端含有疏水性信號序列以促進自細胞分泌。所述后來發(fā)現(xiàn)的GH超基因家族成員也包含于本文所述的38方法和組合物內(nèi)。標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的國際專利申請案(WO05/07465,2005年8月18日)(其是以引用的方式全部并入本文中)提供位點選擇和將非天然氨基酸并入多肽中的方法。V.非天然氨基酸多種非天然氨基酸適用于本文中所述的方法和組合物中，只要非天然氨基酸具有以下四種性質(zhì)中的至少一種(1)非天然氨基酸的側(cè)鏈上的至少一個官能團具有至少一種與20種常見遺傳編碼氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)的化學反應(yīng)性正交、或至少與包含非天然氨基酸的多肽中存在的天然存在氨基酸的化學反應(yīng)性正交的特征和/或活性和/或反應(yīng)性；(2)所引入的非天然氨基酸對20種常見遺傳編碼氨基酸實質(zhì)上呈化學惰性；(3)非天然氨基酸可穩(wěn)定地并入多肽中；所述穩(wěn)定性可與天然存在氨基酸或典型生理條件下相當，且所述并入可經(jīng)由活體內(nèi)系統(tǒng)發(fā)生；以及(4)非天然氨基酸包含肟官能團或可通過與試劑反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡炕墓倌軋F，且可在不破壞包含非天然氨基酸的多肽的生物性質(zhì)的條件下反應(yīng)(當然除非所述生物性質(zhì)的破壞是出于修飾/轉(zhuǎn)變的目的)，或優(yōu)選其中轉(zhuǎn)變可在介于約4與約10之間的pH值或介于約4與約8之間的pH值下在水性條件下發(fā)生，且非天然氨基酸上的反應(yīng)性位點可為親電子位點?？捎糜诿绹鴮＠暾埌傅?0/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號(其是以引用的方式全部并入本文中)中進一步描述的組合物和方法的滿足非天然氨基酸的所述四種性質(zhì)的氨基酸的說明性非限定性實例?？蓪⑷我鈹?shù)目的非天然氨基酸引入到多肽中。非天然氨基酸也可包含經(jīng)保護或掩蔽的肟或可在將受保護基團去保護或?qū)⑹苎诒位鶊F去掩蔽之后轉(zhuǎn)變?yōu)殡炕慕?jīng)保護或掩蔽基團?？蛇m用于本文中所述的方法和組合物中的所關(guān)注非天然氨基酸包含(但不限于)包括可光活化交聯(lián)劑的氨基酸、經(jīng)自旋標記的氨基酸、熒光氨基酸、金屬結(jié)合氨基酸、含金屬氨基酸、放射性氨基酸、具有新穎官能團的氨基酸、與其它分子共價或非共價相互作用的氨基酸、光籠蔽和/或可光異構(gòu)化氨基酸、包括生物素或生物素類似物的氨基酸、經(jīng)糖基化氨基酸(諸如糖取代絲氨酸)、其它經(jīng)碳水化合物修飾的氨基酸、含酮氨基酸、包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸、經(jīng)重原子取代的氨基酸、可化學裂解和/或可光裂解的氨基酸、具有與天然氨基酸相比延長的側(cè)鏈的氨基酸(包含(但不限于)聚醚或長鏈烴，包含(但不限于)大于約5個碳或大于約10個碳)、碳鍵聯(lián)含糖氨基酸、氧化還原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸，以及包括一個或一個以上毒性部分的氨基酸。在一些實施例中，非天然氨基酸包括糖部分。所述氨基酸的實例包含N-乙?；?L-葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙?；?L-半乳糖胺基-L-絲氨酸、N-乙?；?L-葡糖胺基-L-蘇氨酸、N-乙?；?L-葡糖胺基-L-天冬酰胺以及O-甘露糖胺基-L-絲氨酸。所述氨基酸的實例也包含氨基酸與糖之間的天然存在N-鍵聯(lián)或O-鍵聯(lián)由自然界中不常見的共價鍵(包含(但不限于)烯烴、肟、硫醚、酰胺以及其類似物)代替的實例。所述氨基酸的實例也包含天然存在蛋白質(zhì)中不常見的糖類，諸如2-脫氧-葡萄糖、2-脫氧半乳糖以及其類似物。經(jīng)由非天然氨基酸可并入蛋白質(zhì)中的化學部分提供多種優(yōu)點和對蛋白質(zhì)的操縱。舉例來說，羰基官能團(包含酮基官能團)的獨特反應(yīng)性允許在活體外和活體內(nèi)用眾多含肼或含羥胺試劑中的任一種對蛋白質(zhì)加以選擇性修飾。重原子非天然氨基酸(例如)可適用于對X射線結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進行定相。使用非天然氨基酸進行重原子的位點特異性引入也在選擇重原子的位置時提供選擇性和靈活性。光反應(yīng)性非天然氨基酸(包含(但不限于)具有二苯甲酮和芳基疊氮化物(包含(但不限于)疊氮基苯)側(cè)鏈的氨基酸)(例如)允許蛋白質(zhì)的有效活體內(nèi)和活體外光交聯(lián)。光反應(yīng)性非天然氨基酸的實例包含(但不限于)對疊氮基-苯丙氨酸和對苯甲?；?苯丙氨酸。隨后可通過激發(fā)提供光反應(yīng)性基團的時間控制使具有光反應(yīng)性非天然氨基酸的蛋白質(zhì)隨意交聯(lián)。在一實例中，非天然氨基的甲基可通過使用(包含(但不限于))核磁共振和振動光譜經(jīng)作為局部結(jié)構(gòu)和動力學的探針的同位素標記(包含(但不限于))甲基取代。許多非天然編碼氨基酸可購自(例如)Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)、Novabiochem(EMDBiosciences,Darmstadt,Germany的分公司)或Peptech(Burlington,MA，USA)。不可購得的那些非天然編碼氨基酸視情況合成。關(guān)于有機合成技術(shù)，例如參看Fessendon禾口Fessendon的OrganicChemistry(1982,第2版，WillardGrantPress,BostonMass.);March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985,WileyandSons,NewYork);以及Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry(第3版，A及B部分，1990,PlenumPress,NewYork)。許多非天然氨基酸是以諸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸以及其類似物的天然氨基酸為基礎(chǔ)。A.非天然氨基酸的細胞吸收真核細胞對非天然氨基酸的吸收為設(shè)計且選擇(包含(但不限于))以供并入蛋白質(zhì)中的非天然氨基酸時通?？紤]的一個問題。舉例來說，a-氨基酸的高電荷密度表明所述化合物不太可能可透過細胞。通過以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的輸送系統(tǒng)的集合將天然氨基酸吸收入真核細胞中。可進行評估哪種非天然氨基酸(如果存在)是由細胞吸收的快速篩檢。例如參看標題為"ProteinArrays"的美國專利公開案第US2004/0198637號(其是以引用的方式并入本文中)；以及Liu，D.R.和Schultz,P.G(1999)Pragw^"w"Wf/2eevo/w"owo/朋orgam'jwawcode.PNASUnitedStates96:4780-4785中的毒性檢定。盡管通過各種檢定可容易地分析吸收，但設(shè)計適于細胞吸收路徑的非天然氨基酸的替代方案為提供在活體內(nèi)產(chǎn)生氨基酸的生物合成路徑。B.非天然氨基酸的生物合成許多生物合成路徑已存在于細胞中以用于產(chǎn)生氨基酸和其它化合物。盡管用于特定非天然氨基酸的生物合成方法在自然界中(包含(但不限于)在真核細胞中)可能不存在，但本文中所述的方法和組合物包含所述方法。舉例來說，非天然氨基酸的生物合成路徑是通過添加新的酶或改變現(xiàn)有宿主細胞路徑視情況在宿主細胞中產(chǎn)生。其它新酶視情況為天然存在的酶或人工演化的酶。舉例來說，對氨基苯丙氨酸的生物合成(如在標題為"Invivoincorporationofunnaturalaminoacids"的WO2002/085923中的實例中所呈現(xiàn))依賴于添加來自其它有機體的已知酶的組合。所述酶的基因可通過用包括所述基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細胞而引入真核細胞中。當在細胞中表達時，所述基因提供合成所需化合物的酶促路徑。視情況添加的酶的類型的實例提供于下文實例中。其它酶序列見于(例如)Genbank中。人工演化的酶也視情況以相同方式添加到細胞中。以此方式操縱細胞的細胞機構(gòu)和資源以產(chǎn)生非天然氨基酸。多種方法可用于產(chǎn)生用于生物合成路徑中或用于演化現(xiàn)有路徑的新穎酶。舉例來說，如由(包含(但不限于))Maxygen，Inc.開發(fā)的遞歸重組(可通過萬維網(wǎng)在www.maxvgen.com上獲得)視情況用于開發(fā)新穎酶和路徑。例如參看Stemmer(1994)，ia;/devo/wdowo/a_pro/""'wz'wvz7ro6>>Z)假Ai(/f7/ng，Nature370(4):389-391;以及Stemmer，(1994),DiV^4s/iMj9iwgrandom/ragmewfafz.onawdreassem&iy:vz'fnreco附6iwa^'ow/or附o/ecw/arevo/w"o",Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:10747-10751。類似地，由Genencor開發(fā)的DesignPath(可通過萬維網(wǎng)在genencor.com上獲得)視情況用于代謝路徑工程化，其包含(但不限于)工程化細胞中產(chǎn)生O-甲基-L-酪氨酸的路徑。此技術(shù)使用(包含(但不限于))經(jīng)由功能基因組學以及分子演化和設(shè)計鑒別的新基因的組合在宿主有機體中重建現(xiàn)有路徑。DiversaCorporation(可通過萬維網(wǎng)在diversa.com上獲得)也提供用于快速篩檢基因文庫和基因路徑的技術(shù)(包含(但不限于))以產(chǎn)生新路徑。通常，利用工程化生物合成路徑產(chǎn)生的非天然氨基酸是以足以進行有效蛋白質(zhì)生物合成(包含(但不限于)天然細胞量)，但未達到影響其它氨基酸的濃度或耗盡細胞資源的程度的濃度產(chǎn)生。以此方式在活體內(nèi)產(chǎn)生的典型濃度為約10mM至約0.05mM。一旦細胞用包括用于產(chǎn)生特定路徑所需的酶的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化且產(chǎn)生非天然氨基酸，那么視情況使用活體內(nèi)選擇以進一步優(yōu)化用于核糖體蛋白質(zhì)合成與細胞生長的非天然氨基酸的產(chǎn)生。VI.具有非天然氨基酸的多肽美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins"的WO04/035743和標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號(其是以引用的方式全部并入本文中)中進一步描述的組合物和方法提供將至少一個非天然氨基酸并入多肽中。非天然氨基酸可存在于多肽的任何位置，包含多肽的任何末端位置或任何內(nèi)部位置。本文中所述的非天然氨基酸多肽可以生物合成或非生物合成方式產(chǎn)生。生物合成意謂利用翻譯系統(tǒng)(細胞或非細胞)的任何方法，包含使用以下組分中的至少一種聚核苷酸、密碼子、tRNA以及核糖體。非生物合成意謂不利用翻譯系統(tǒng)的任何方法這種方法可進一步分成利用固態(tài)肽合成方法的方法、固相肽合成方法、利用至少一種酶的方法以及不利用至少一種酶的方法；當然任何所述亞類可重疊且許多方法可利用所述亞類的組合。本文中所述的方法、組合物、策略以及技術(shù)不限于多肽或蛋白質(zhì)的特定類型、種類或家族。實際上，幾乎任何多肽可包含(但不限于)美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003細82575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins"的WO04/035743、標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號以及標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案第WO05/074650號(其是以引用的方式全部并入本文中)中進一步描述的至少一種非天然氨基酸。所述非天然氨基酸多肽可如美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003細82575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins"的WO04/035743、標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號以及標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案第WO05/074650號(其是以引用的方式全部并入本文中)中所述進一步修飾或所述非天然氨基酸多肽可不經(jīng)進一步修飾即使用。一方面，組合物包含至少一種具有至少一個(包含(但不限于)至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個或十個以上)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。多肽可包括一個或一個以上天然氨基酸取代。雖然美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號(其是以引用的方式全部并入本文中)中進一步描述的非天然氨基酸多肽的實施例可通過固相肽合成方法(例如，在固體樹脂上)、液相肽合成方法和/或無需酶輔助化學合成，但本文所述的非天然氨基酸多肽的其它實施例允許通過細胞膜、細胞提取物或溶胞物系統(tǒng)或通過活體內(nèi)系統(tǒng)(即，使用原核或真核細胞的細胞機構(gòu))合成。VH.包括核酸和寡核苷酸的組合物和方法A.所用通用重組核酸方法美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650(其是以引用的方式全部并入本文中)討論編碼所關(guān)注的多肽(例如包括GH多肽)的核酸以及可如何使用重組方法將其加以分離、克隆且通常改造。所述實施例用于(包含(但不限于))蛋白質(zhì)表達或在產(chǎn)生來源于多肽的變體、衍生物、表達序列盒或其它序列的期間使用。在一些實施例中，編碼多肽的序列與異源啟動子可操作性連接?？梢阅阁w多肽的氨基酸序列為基礎(chǔ)來合成編碼包括非天然編碼氨基酸的多肽的核苷酸序列，且隨后改變核苷酸序列以實現(xiàn)相關(guān)氨基酸殘基的引入(即，并入或取代)或移除(即，缺失或取代)?？筛鶕?jù)常規(guī)方法通過定點突變誘發(fā)來方便地修飾核苷酸序列?；蛘?，核苷酸序列可由化學合成(包含(但不限于)通過使用寡核苷酸合成器，其中寡核苷酸是根據(jù)所需多肽的氨基酸序列來設(shè)計)來制備，且優(yōu)先選擇在將產(chǎn)生重組多肽的宿主細胞中偏好的那些密碼子。舉例來說，可通過PCR、連接或連接鏈式反應(yīng)來合成且組裝編碼所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如參看Barany等人，Prac.臉f/.88:189-193(1991);U.S.6,521,427，其是以引用的方式并入本文中。B.選擇密碼子美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650(其是以引用的方式全部并入本文中)中進一步描述的方法和組合物內(nèi)所涵蓋的選擇密碼子擴展蛋白質(zhì)生物合成機構(gòu)的遺傳密碼子框架。舉例來說，選擇密碼子包含(但不限于)獨特三堿基密碼子、無義密碼子(諸如終止密碼子，包含(但不限于)琥珀密碼子(UAG)或蛋白石密碼子(UGA)、赭石密碼子)、非天然密碼子、四個或四個以上堿基的密碼子、稀有密碼子或其類似密碼子。可引入所需基因中的選擇密碼子的數(shù)目范圍很廣，其包含(但不限于)在編碼所關(guān)注多肽的至少一部分的單一聚核苷酸中存在一個或一個以上、兩個或兩個以上、三個或三個以上、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上。在一些情況下，所述方法涉及使用作為用于在活體內(nèi)并入一個或一個以上非天然氨基酸的終止密碼子的選擇密碼子。可在真核宿主細胞無顯著擾動的情況下在活體內(nèi)進行非天然氨基酸的并入。選擇密碼子也包括延長密碼子，包含(但不限于)四個或四個以上堿基的密碼子，諸如，四個、五個、六個或六個以上堿基的密碼子。對于給定系統(tǒng)來說，選擇密碼子也可包含天然三堿基密碼子中的一種，其中內(nèi)源系統(tǒng)不使用(或很少使用)所述天然堿基密碼子。選擇密碼子視情況包含非天然堿基對。所述非天然堿基對進一步擴展現(xiàn)有遺傳代碼。對于活體內(nèi)使用來說，非天然核苷可透過膜且經(jīng)磷酸化以形成相應(yīng)三磷酸酯。另外，增加的遺傳信息是穩(wěn)定的且不被細胞酶破壞。翻譯旁路系統(tǒng)(translationalbypassingsystem)也可用于將非天然氨基酸并入所需多肽中。在某些實施例中，所關(guān)注蛋白質(zhì)或多肽(或其部分)是由核酸編碼。通常，核酸包括至少一個選擇密碼子、至少兩個選擇密碼子、至少三個選擇密碼子、至少四個選擇密碼子、至少五個選擇密碼子、至少六個選擇密碼子、至少七個選擇密碼子、至少八個選擇密碼子、至少九個選擇密碼子、十個或十個以上選擇密碼子。VHI.包括非天然氨基酸的多肽的活體內(nèi)產(chǎn)生可使用經(jīng)修飾tRNA和tRNA合成酶在活體內(nèi)產(chǎn)生多肽以加成到在天然存在系統(tǒng)中未編碼的氨基酸上或?qū)⑵淙〈?。用于在活體內(nèi)產(chǎn)生包括非天然氨基酸的多肽的所有產(chǎn)生方法、篩檢方法和有機體進一步描述于美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案第WO05/074650號(其是以引用的方式全部并入本文中)中。產(chǎn)生使用在天然存在系統(tǒng)中未編碼的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的方法描述于(例如)美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)(其是以引用的方式全部并入本文中)中。所述方法涉及產(chǎn)生獨立于翻譯44系統(tǒng)(且因此有時被稱作"正交")的內(nèi)源性合成酶和tRNA起作用的翻譯機構(gòu)。在其它或另外實施例中，翻譯系統(tǒng)包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)。在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已描述用于將特定合成氨基酸插入多肽中的多種正交tRNA和氨?；鵷RNA合成酶，且其通常適用于產(chǎn)生非天然氨基酸多肽的方法中。使用0-tRNA/氨?；?tRNA合成酶涉及選擇編碼非天然氨基酸的恃定密碼子。盡管可使用任何密碼子，但通常希望選擇在0-tRNA/氨?；?tRNA合成酶表達于其中的細胞中很少或從未使用的密碼子?？墒褂盟鶎?br>技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的突變誘發(fā)方法(包含(但不限于)位點特異性突變誘發(fā)、序列盒式突變誘發(fā)、限制選擇突變誘發(fā)等)將特定選擇密碼子引入聚核苷酸編碼序列中的適當位置中。A.在非真核細胞和真核細胞中的表達為獲得所克隆聚核苷酸的高水平表達，通常將編碼所需多肽的聚核苷酸亞克隆至含有指導轉(zhuǎn)錄的強啟動子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子以及(對于編碼蛋白質(zhì)的核酸來說)用于翻譯啟始的核糖體結(jié)合位點的表達載體中。所屬領(lǐng)域中熟知合適的細菌啟動子且其描述于(例如)Sambrook等人和Ausubel等人中?？墒褂眠M一步描述于美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案第WO05/074650號(其是以引用的方式全部并入本文中)中的細菌表達系統(tǒng)和真核宿主細胞或非真核宿主細胞系統(tǒng)來以較大適用量生物合成包括非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。1.表達系統(tǒng)、培養(yǎng)以及分離所需多肽可表達于任何數(shù)目的合適表達系統(tǒng)(包含(例如)酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、假單胞菌細胞以及細菌)中。例示性表達系統(tǒng)的描述進一步描述于美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案第WO05/074650號(其是以引用的方式全部并入本文中)中。2.非天然氨基酸多肽的純化通用純化方法可對包括所需多肽的細胞溶胞物、提取物、培養(yǎng)基、包涵體、宿主細胞的周質(zhì)空間、宿主細胞的細胞質(zhì)或其它材料或由任何分離步驟得到的混合物執(zhí)行多種分離步驟中的任一種，所述任何分離步驟包含(但不限于)親和力色譜、離子交換色譜、疏水相互作用色譜、凝膠過濾色譜、高效液相色譜("HPLC")、反相-HPLC("RP-HPLC")、膨脹床吸附或其任何組合和/或重復且以任何適當順序執(zhí)行。通用純化方法、設(shè)備、優(yōu)選實施例以及其它純化技術(shù)進一步描述于美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的WO05/074650(其是以引用的方式全部并入本文中)中。B.活體內(nèi)翻譯后修飾通過在真核細胞中產(chǎn)生具有至少一個非天然氨基酸的所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽，蛋白質(zhì)或多肽包含真核翻譯后修飾。在某些實施例中，蛋白質(zhì)包含至少一個非天然氨基酸和至少一個由真核細胞在活體內(nèi)產(chǎn)生的翻譯后修飾，其中翻譯后修飾不是由原核細胞產(chǎn)生。舉例來說，翻譯后修飾進一步描述于美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的WO05/074650(其是以引用的方式全部并入本文中)中。非天然氨基酸的一個優(yōu)點在于其存在可用于添加其它分子的其它化學部分。所述修飾可在真核或非真核細胞中活體內(nèi)產(chǎn)生或在活體外產(chǎn)生。因此，在某些實施例中，翻譯后修飾是通過非天然氨基酸進行。IX.在替代系統(tǒng)中的表達己使用若干種策略以在非重組宿主細胞、突變宿主細胞或無細胞系統(tǒng)中將非天然氨基酸引入蛋白質(zhì)中。所述系統(tǒng)也適用于制造非天然氨基酸多肽。氨基酸經(jīng)諸如Lys、Cys和Tyr的反應(yīng)性側(cè)鏈衍生化使得賴氨酸轉(zhuǎn)化為N、乙酰基-賴氨酸。化學合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。通過肽片段的酶促連接和天然化學連接的新近發(fā)展，有可能制造較大蛋白質(zhì)。例如參看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem,69:923(2000)?；瘜W肽連接和天然化學連接描述于美國專利第6,184,344號、美國專利公開案第2004/0138412號、美國專利公開案第2003/0208046號、WO02/098902以及WO03/042235中，其是以引用的方式并入本文中。已使用能夠支持蛋白質(zhì)生物合成的將經(jīng)所需非天然氨基酸以化學方式?；囊种苩RNA添加到活體外提取物中的通用活體外生物合成方法將IOO個以上非天然氨基酸位點特異性地并入幾乎任何大小的多種蛋白質(zhì)中。例如參看V.W.Cornish,D.Mendel以及P.GSchultz,Angew.Chem.Int.Ed.End.1995,34:621(1995);C丄Noren,S丄Anthony-Cahill,M.C.Gri伍th，RGSchultz,Jgewera/w"/zod/orwYe-印ec訴cz'wcor/)on3"owo/w朋^ayi/amz.woa"Wsz'ntopraf".ws,Science244:182-188(1989);以及J.D.Bain,C.GGlabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,5—57'/"e-印e"yc/wco^or加'owo/atw朋a/wfl/a/m.woac/(ia/o/y戸W叔J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已將多種官能團引入用于研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)折疊、酶機制以及信號轉(zhuǎn)導的蛋白質(zhì)中。已開發(fā)被稱作選擇性壓力并入的活體內(nèi)方法以使用野生型合成酶的雜亂性。例如參看N.Budisa，C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger，RM.Dong,L.Moroder以及R.Huber，F(xiàn)ASEBJ..13:41(1999)。使向細胞供應(yīng)特定天然氨基酸的相關(guān)代謝路徑已關(guān)閉的營養(yǎng)缺陷型菌株生長于含有有限濃度的天然氨基酸的基本培養(yǎng)基中，而標耙基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制。在穩(wěn)定生長期開始時，天然氨基酸耗盡且由非天然氨基酸類似物代替。重組蛋白質(zhì)表達的誘導使得含有非天然類似物的蛋白質(zhì)累積。舉例來說，使用這種策略將鄰氟苯丙氨酸、間氟苯丙氨酸以及對氟苯丙氨酸并入蛋白質(zhì)中，且其在紫外光譜中顯示兩個可容易地鑒別的特征性肩，例如參看C.Minks,R.Huber，L.Moroder以及N.Budisa,Anal.Biochem..284:29(2000);三氟甲硫氨酸已用于代替噬菌體T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通過19FNMR研究其與殼寡糖配位體的相互作用，例如參看H.Duewel,E.Daub，V.Robinson以及J.F.Honek，Biochemistry,36:3404(1997);且三氟亮氨酸已代替亮氨酸并入，使得亮氨酸拉鏈蛋白質(zhì)的熱和化學穩(wěn)定性增加。例如參看Y.Tang,G.Ghirlanda，W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado以及D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,40:1494(2001)。此外，己將硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各種重組蛋白質(zhì)中以促進X射線結(jié)晶學中相的解析。例如參看W.A.Hendrickson,J.R.Horton以及D.M.Lemaster,EMBOL,9:1665(1990);J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap，L.Lebioda以及M.Hatada,Nat.Struct.Biol.,1:283(1994);N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn，J.Kellermann以及R.Huber,Eur.J.Biochem.,230:788(1995);以及N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade，T.Neuefeind,L.Moroder以及R.Huber,J.Mol.Biol.,270:616(1997)。具有烯或炔官能團的甲硫氨酸類似物也已有效并入，其允許通過化學方式對蛋白質(zhì)進行其它修飾。例如參看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell,FEBSLett"428:68(1998);J.C.M.vanHest，K.L.Kiick禾QD.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.122:1282(2000);以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);美國專利第6,586,207號；美國專利公開案第2002/0042097號，其是以引用的方式并入本文中。這種方法的成功取決于氨?；?tRNA合成酶對非天然氨基酸類似物的識別，所述合成酶通常需要高選擇性以確保蛋白質(zhì)翻譯的保真度。擴展這種方法的范疇的一種方式在于放寬氨酰基-tRNA合成酶的底物特異性，此已在有限數(shù)目的情況下達成。舉例來說，在大腸桿菌苯丙氨?；?tRNA合成酶(PheRS)中由Gly置換Ala294可增加底物結(jié)合位點的大小，且導致對-Cl-苯丙氨酸(p-Cl-Phe)對tRNAPhe的?；?。參看，M.Ibba，RKast和H.Hennecke,Biochemistry,33:7107(1994)。含有這種突變型PheRS的大腸桿菌菌株允許對-Cl-苯丙氨酸或?qū)?Br-苯丙氨酸代替苯丙氨酸并入。例如參看M.Ibba和H.Hennecke,FEBSLett..364:272(1995);以及N.Sharma,R.Furter，P.Kast以及D.A.Tirrell,FEBSLett..467:37,0、。類似地，證明大腸桿菌酪氨?；?tRNA合成酶的氨基酸結(jié)合位點附近的點突變Phel30Ser允許重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。參看RHamano-Takaku，T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soil以及S.Nishimura，J.Biol.Chem.,275:40324(2000)。在活體內(nèi)將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中的另一種策略為修飾具有校對機制的合成酶。所述合成酶不能區(qū)分在結(jié)構(gòu)上與同源天然氨基酸類似的氨基酸且因此將其活化。此錯誤在單獨位點上得到修正，使來自tRNA的錯裝配氨基酸去酰基化以保持蛋白質(zhì)翻譯的保真度。如果合成酶失去校對活性，那么錯活化的結(jié)構(gòu)類似物可避開編輯功能且被并入。目前已用纈氨?；?tRNA合成酶(ValRS)證實這種方法。參看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.deCrecy-Lagard,P.Schimmel以及P.Marliere,Science,292:501(2001)。ValRS可以Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)錯氨酰基化tRNAVal;隨后通過編輯域來水解所述非同源氨基酸。在大腸桿菌染色體的隨機突變誘發(fā)之后，選擇在ValRS的編輯位點中具有突變的突變型大腸桿菌菌株。這種編輯缺陷型ValRS錯誤地用Cys裝配tRNAVal。因為Abu與Cys在空間上類似(Cys的-SH基團由Abu中的-CH3代替)，所以當這種突變型大腸桿菌菌株在Abu存在的情況下生長時，突變型ValRS也將Abu并入蛋白質(zhì)中。質(zhì)譜分析證明在天然蛋白質(zhì)中的各纈氨酸位置處約24%的纈氨酸由Abu代替。固相合成和半合成方法也已允許合成含有新穎氨基酸的多種蛋白質(zhì)。舉例來說，參看以下公開案和其中引用的參考文獻，其為如下Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin，R.Gewera/o/cocfe/orp/"他/肌Nature,192:1227-1232(1961);Hofmann，K.,Bohn,H.poZypeWdes.XOTF7'T7zeo//7>razo/e-z>n'<iazo/erep/acewew^yZ7eS-profe/wflcf/vfl"ng/ofewc少o/awS-pep/zV/e/ragw械J.AmChem，88(24):5914-5919(1966);Kaiser，E.T.5>wA"/c卿腦c/^MZn'o/ogz'ca〃_ya"z've/eWdesf"c/wdz'"gAceChemRes,22:47-54(1989);Nakatsuka,T.,Sasaki,T.，Kaiser,E.T.尸e/"'c/esegwe"fco一/"gc加/，c/■ye7m'5>"^"/ce"2y7we//2z'osm6/z7/57'",JAmChemSoc,109:3808-3810(1987);Schnolzer，M.,Kent,SBH.Cow欲t/c"wg&yctoveto'"wgw"/rofe"eds戸f/ie"'cpep"'tfes:6ac化匿-ewgz',^W/fiy戸^ose,Science,256(5054):221-225(1992);Chaiken,I.M.Sew一wA"/c;e/7"'ifesam/prafe/叫CRCCritRevBiochem,11(3):255-301(1981);Offord，R.E./Vo"/"ewg/"ee〃力gc/zew/ca/附ea肌？ProteinEng.,1(3):151-157(1987);以及Jackson,D.Y"Burnier,J.，Quan,C,Stanley,M.,Tom,J.，Wells,J.A.jZ)e^"ecPeWf/eZ/ga>se/or7bto/5ywAe57jo/i/60肌c/eajejw"/CWa/_y"'cScience,266(5183):243(1994)?；瘜W修飾已用于在活體外向蛋白質(zhì)中引入多種包含輔因子、自旋標記以及寡核苷酸的非天然側(cè)鏈。例如參看Corey,D.R.,Schultz，P.G.Ge"era"o"0/ase《wewce邵ec(/cw'wg7e-欲a"(ie(ififeo:c>rz'6owwc/e<xye,Scicnc6,238(4832):1401-1403(1987);Kaiser,E.T.,LawrenceD.S.,Rokita,S.E.7Tec/ew/ca/7w0&yca"0wo/ewzywa/z'c，"yc"y,AnnuRevBiochem,54:565-595(1985);Kaiser，E.T.,Lawrence,D.S.C7e/m'ca/附由,z.owo/e"_yzmeac"'ves/to,Science,226(4674》505-511(1984》Neet，K.E.,NanciA,Koshland，D.E.iVo戸""0/腸/，雄《>,JBiol.Chem,243(24):6392-6401(1968);Polgar,L.etM丄.Bender,爿wewco由/m'wga^w/7z"/co^(y/or/wedwYe.77j/o/^w6n7/w.".J.AmChemSoc.88:3153-3154(1966);以及Pollack,S丄，Nakayama,G.Schultz,P.G./"加^c"'owq/^2wc/eo/7W/ess/ec加5ropz'cpraxesfwfoaw"60辦cow6/m'wgw7m,Science,242(4881):1038-1040(1988)?；蛘?，使用經(jīng)化學修飾氨?；?tRNA的生物合成方法已用于將若干種生物物理探針并入在活體外合成的蛋白質(zhì)中。參看以下公開案和其中所引用的參考文獻Brunner,J.iVew戶/o/"o/a6e"wgam/cmw/z'wAiwg附"/zo叔Annu.RevBiochem,62:483-514(1993);以及Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.i^WocTOw7/whwgo//7esz.gwa/se《wewceo/"oscewf/repra/ac">70/54-h7o^7/towpo/ypeWfife0/w'gwa/recogm'"'o"/w"c/e，Proc.Natl.Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。先前已證明可通過向由含有所需琥珀無義突變的基因編程的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中添加化學氨?；囊种苩RNA而在活體外將非天然氨基酸位點特異性地并入蛋白質(zhì)中。使用所述方法，可使用對特定氨基酸來說為營養(yǎng)缺陷型的菌株，用接近的結(jié)構(gòu)同源物取代20種常見氨基酸中多種氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如參看Noren,C丄,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz，P.G.^4gewera/mW/zod/or57Ye邵ec(/k/wcor/ora"'owo/w朋她ra/ac/<iy/論pra/^/wi1,Science,244:182-188(1989);M.W.49Nowak等人，Science268:439-42(1995);Bain，J.D.,Glabe,C.G,Dix，T.A.，Chamberlin，A.R.，Diala，E.S.5/05jwAWcw'/"e邵ec訴c/"cor/om"'owo/awow-wa^a/otw/wo/Woa/o/y;ep"We,J.AmChemSoc.111:8013-8014(1989);N.Budisa等人，F(xiàn)ASEBJ.13:41-51(1999);Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C丄，Schultz,P.G5—"、w"/od/or/w/ro<^c/"gm朋加wm/歸/wo"Ye邵e"yca/(y/w/ojrato'叫MethodsinEnz"301-336(1992);以及Mendel,D.,Cornish,V.W.以及Schultz,P.G.S"e-Dzre"ec/Mi/togewew'sawExpawcfec/Cew"/cCWe，AnnuRevBiophvs.BiomolStruct.24，435-62(1995)。舉例來說，制備識別終止密碼子UAG的抑制tRNA且用非天然氨基酸使其化學氨?；?。常規(guī)定點突變誘發(fā)用于在蛋白質(zhì)基因中的所關(guān)注位點處引入終止密碼子TAG。伊J女口參看Sayers，J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'Exowwc/eose/7/2(wjp/zo;"oA/oc^e-6a5^f/o"gwowc/eWzWe-力re"eJNucleicAcidsRes,16(3):791隱802(1988)。當將?；种苩RNA和突變型基因組合于活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中時，回應(yīng)UAG密碼子而并入非天然氨基酸，此舉得到在指定位置處含有所述氨基酸的蛋白質(zhì)。使用^H]-Phe的實驗以及使用a-羥基酸的實驗證實所需氨基酸僅在由UAG密碼子指定的位置處并入且此氨基酸未在蛋白質(zhì)中的任何其它位點處并入。例如參看Noren等人，同上文；Kobayashi等人，(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432;以及Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.GS"e-5pe"ycZwcorpora/7'owo/wove/6ac&6owe欲wc^wes/"fo;rato'"j1,Science,255(5041):197-200(1992)。tRNA可通過任何方法或技術(shù)(包含(但不限于)化學或酶促氨?；?經(jīng)所需氨基酸氨酰基化。可由氨?；鵷RNA合成酶或其它酶促分子(包含(但不限于)核糖核酸酶(ribozyme))來實現(xiàn)氨酰基化。術(shù)語"核糖核酸酶"可與"催化性RNA"互換。Cech和同事(Cech,1987，Science,236:1532-1539;McCorkle等人，1987,ConceptsBiochem.64:221-226)證實可充當催化劑(核糖核酸酶)的天然存在RNA的存在。然而，盡管僅已展示所述天然RNA催化劑作用于核糖核酸底物上以進行裂解和剪接，但關(guān)于核糖核酸酶的人工演化的新近發(fā)展己擴展對各種化學反應(yīng)的催化作用的清單。研究已鑒別出可在其自身(2')3'-末端上催化氨?；?RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995Science267:643-647)，以及可將氨基酸自一個RNA分子轉(zhuǎn)移到另一個RNA分子的RNA分子(Lohse等人，1996,Nature381:442-444)。美國專利申請公開案2003/0228593(其是以引用的方式并入本文中)描述建構(gòu)核糖核酸酶的方法和其在以天然編碼和非天然編碼氨基酸氨?；痶RNA中的用途?？砂滨；痶RNA的底物固定形式的酶性分子(包含(但不限于)核糖核酸酶)可使得能夠進行氨?；a(chǎn)物的有效親和力純化。合適底物的實例包含瓊脂糖、瓊脂糖凝膠以及磁性珠粒。用于氨?；牡孜锕潭ㄐ问降暮颂呛怂崦傅闹苽浜褪褂妹枋鲇贑hemistryandBiology2003,10:1077-1084以及美國專利申請公開案2003/0228593中，其是以引用的方式并入本文中。化學氨?；椒ò?但不限于)由Hecht和同事(Hecht，S.M.Ace.Chem.Res.1992,25,545;Heckler,T.G.;Roesser，J.R.;Xu，C;Chang,P.;Hecht,S.M.Biochemistry1988,27，7254;Hecht,S.M.;Alford，B.L.;Kuroda,Y.;Kitano，S.J.Biol.Chem.1978,253，4517)以及由Schultz、Chamberlin、Dougherty以及其它人(Cornish,V.W.;Mendel,D.;Schultz，P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621;Robertson,S.A.;Ellman,J.A.;Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991，113,2722;Noren,C.J.;Anthony-Cahill,S.J.;Griffith,M.C;Schultz,P.G.Science1989，244,182;Bain,J.D.;Glabe，C.G.;Dix,T.A.;Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989，111,8013;Bain,J.D.等人，Nature1992,356，537;Gallivan，J.P.;Lester,H.A.;Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4，740;Turcatti等人，J.Biol.Chem.1996,271,19991;Nowak，M.W.等人，Science,1995,268,439;Saks,M.E.等人，J.Biol.Chem.1996,271,23169;Hohsaka,T.等人，J.Am.Chem.Soc.1999,121,34)介紹的那些方法，以避免在氨?；惺褂煤铣擅?。所述方法或其它化學氨酰基化方法可用于氨酰基化本發(fā)明的tRNA分子。用于產(chǎn)生催化性RNA的方法可涉及產(chǎn)生隨機化核糖核酸酶序列的單獨集合，對集合執(zhí)行定向演化，就所需氨?；钚院Y檢集合，且選擇展現(xiàn)所需氨?；钚缘哪切┖颂呛怂崦傅男蛄?。核糖核酸酶可包括有利于酰化活性的基元和/或區(qū)域，諸如GGU基元和富含U的區(qū)域。舉例來說，已報導富含U的區(qū)域可有利于氨基酸底物的識別，且GGU基元可與tRNA的3'末端形成堿基對。GGU基元和富含U的區(qū)域組合起來同時促進氨基酸與tRNA的同時識別，且從而促進tRNA的3'末端的氨?；?。可通過使用與tRNAAsncccxj接合的部分隨機化r24mini進行活體外選擇，接著系統(tǒng)性工程化在活性克隆中發(fā)現(xiàn)的一致序列來產(chǎn)生核糖核酸酶。由這種方法獲得的例示性核糖核酸酶被稱作"Fx3核糖核酸酶"且描述于美國公開申請案第2003/0228593號(其內(nèi)容是以引用的方式并入本文中)中，其充當用于合成各種裝配有同源非天然氨基酸的氨?；?tRNA的通用催化劑?？蓪滨；痶RNA核糖核酸酶固定于底物上以使得能夠有效親和力純化氨?；痶RNA。合適底物的實例包含(但不限于)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠以及磁性珠粒。可利用RNA的化學結(jié)構(gòu)將核糖核酸酶固定于樹脂上，諸如RNA的核糖上的3'-順式二醇可經(jīng)高碘酸鹽氧化以產(chǎn)生相應(yīng)二醛以促進RNA在樹脂上的固定?？墒褂酶鞣N類型的樹脂(包含廉價酰肼樹脂)，其中還原性胺化使樹脂與核糖核酸酶之間的相互作用產(chǎn)生不可逆鍵聯(lián)?？赏ㄟ^此柱上氨?；夹g(shù)顯著促進氨酰基-tRNA的合成。Kourouklis等人，Methods2005;36:239-4描述以管柱為基礎(chǔ)的氨?；到y(tǒng)?？梢远喾N方式實現(xiàn)氨?；痶RNA的分離。一種合適方法為以緩沖液從管柱洗提氨?；痶RNA,其中所述緩沖液諸如具有10mMEDTA的乙酸鈉溶液、含有50mMN-(2-羥基乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mMKCl(pH7.0)、10mMEDTA的緩沖液或簡單經(jīng)EDTA緩沖的水(pH7.0)?？蓪滨；痶RNA添加到翻譯反應(yīng)中以在由翻譯反應(yīng)產(chǎn)生的多肽中的所選位置中并入用以氨?；痶RNA的氨基酸?？墒褂帽景l(fā)明的氨酰基化tRNA的翻譯系統(tǒng)的實例包含(但不限于)細胞溶胞物。細胞溶胞物提供自所輸入mRNA活體外翻譯多肽所必需的反應(yīng)組分。所述反應(yīng)組分的實例包含(但不限于)核糖體蛋白質(zhì)、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始和延伸因子以及與翻譯相關(guān)的其它因子。另外，翻譯系統(tǒng)可為分批翻譯或區(qū)隔式翻譯。分批翻譯系統(tǒng)將反應(yīng)組分組合于單一隔室中，而區(qū)隔式翻譯系統(tǒng)將翻譯反應(yīng)組分與可抑制翻譯效率的反應(yīng)產(chǎn)物隔開。所述翻譯系統(tǒng)在市面上有售。此外，可使用偶合轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。偶合轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)允許將所輸入DNA轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)mRNA，其轉(zhuǎn)而由反應(yīng)組分進行翻譯。市售偶合轉(zhuǎn)錄/翻譯的實例為快速翻譯系統(tǒng)(RapidTranslationSystem;RTS，RocheInc.)。所述系統(tǒng)包含含有大腸桿菌溶菌液以提供諸如核糖體和翻譯因子的翻譯組分的混合物。另外，包含RNA聚合酶以將所輸入DNA轉(zhuǎn)錄為用于翻譯的mRNA模板。RTS可經(jīng)由反應(yīng)隔室(包含供應(yīng)/廢料隔室和轉(zhuǎn)錄/翻譯隔室)之間插入的膜使用反應(yīng)組分的區(qū)隔化?？捎善渌噭?包含(但不限于)轉(zhuǎn)移酶、聚合酶、催化性抗體、多官能蛋白質(zhì)以及其類似物)進行tRNA的氨?；tephan于Scientist2005年10月；第30-33頁中描述將非天然編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中的其它方法。Lu等人在MolCell.2001年10月；8(4);759-69中描述將蛋白質(zhì)與含有非天然氨基酸的合成肽化學連接(所表達蛋白質(zhì)連接)的方法。微注射技術(shù)也已用于將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。例如參看M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.52Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz，D.A.Dougherty以及H.A.Lester,Science,268:439(1995);以及D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645(2000)。向爪蟾(Xenopus)卵母細胞中共注射在活體外產(chǎn)生的以下兩種RNA物質(zhì)在所關(guān)注氨基酸位置處具有UAG終止密碼子的編碼標靶蛋白質(zhì)的mRNA和經(jīng)所需非天然氨基酸氨?；溺暌种苩RNA。卵母細胞的翻譯機構(gòu)隨后在由UAG指定的位置處插入非天然氨基酸。這種方法已允許通常不適用于活體外表達系統(tǒng)的整合膜蛋白質(zhì)的活體內(nèi)結(jié)構(gòu)-功能研究。實例包含將熒光氨基酸并入速激肽神經(jīng)激肽-2受體中以通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移測量距離，例如參看G.Turcatti,K.Nemeth，M.D.Edgerton，U.Meseth,F.Talabot，M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel以及A.Chollet,J.Biol.Chem..271:19991(1996);并入生物素化氨基酸以鑒別離子通道中的表面暴露殘基，例如參看J.P.Gallivan,H.A.Lester以及D.A.Dougherty,Chem.Biol..4:739(1997);使用籠蔽酪胺酸類似物以實時監(jiān)控離子通道中的構(gòu)象變化，例如參看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty以及H.A.Lester,Neuron,20:619(1998);以及使用a羥基氨基酸以改變用于探測其選通機制的離子通道主干。例如參看P.M.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty以及H.A.Lester,￡^i，96:89(1999);以及T.Lu,A.Y.Ting，J.Mainland,L.Y.Jan,P.GSchultz和J.Yang,Nat.Neurosci.,4:239(2001)。在活體內(nèi)直接將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中的能力提供以下優(yōu)點突變型蛋白質(zhì)的產(chǎn)率高、技術(shù)簡便、在細胞中或可能在活有機體中研究突變型蛋白質(zhì)的可能性以及在治療性治療中使用所述突變型蛋白質(zhì)。將具有各種大小、酸度、親核性、疏水性以及其它性質(zhì)的非天然氨基酸包含入蛋白質(zhì)中的能力可極大地擴展我們合理且系統(tǒng)性地操縱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力，以探測蛋白質(zhì)功能且產(chǎn)生具有新穎,質(zhì)的新蛋白質(zhì)或有機體。然而，這一過程很困難，因為需要tRNA合成酶的復雜性質(zhì)以在蛋白質(zhì)翻譯中實現(xiàn)高保真度。在位點特異性地并入對-F-Phe的一次嘗試中，在對-F-Phe抗性、Phe營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌菌株中使用酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶對。例如參看R.Furter,ProteinSci.,7:419(1998)。使用無細胞(活體外)翻譯系統(tǒng)獲得聚核苷酸的表達也是可能的。翻譯系統(tǒng)可為細胞或無細胞翻譯系統(tǒng)，且可為原核或真核翻譯系統(tǒng)。細胞翻譯系統(tǒng)包含(但不限于)所需核酸序列可轉(zhuǎn)錄為mRNA且mRNA可翻譯的全細胞制劑，諸如滲透細胞或細胞培養(yǎng)物。無細胞翻譯系統(tǒng)在市面上有售且熟知許多不同類型和系統(tǒng)。無細胞系統(tǒng)的實例包含(但不限于)原核溶胞物，諸如大腸桿菌溶菌液；以及真核溶胞物，諸如麥芽提取物、昆蟲細胞溶胞物、兔網(wǎng)狀細胞溶胞物、兔卵母細胞溶胞物和人類細胞溶胞物。當所得蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化、磷酸化或以其它方式修飾時，可優(yōu)選真核提取物或溶胞物，因為許多所述修飾僅可能在真核系統(tǒng)中發(fā)生。一些所述提取物和溶胞物在市面上有售(Promega;Madison,Wis.;Stratagene;LaJolla,Calif.;Amersham;ArlingtonHeights,111.;GIBCO/BRL;GrandIsland,N.Y.)。也可用膜提取物(諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物)，其適于翻譯分泌型蛋白質(zhì)。在可包含mRNA作為模板(活體外翻譯)或DNA作為模板(組合型活體外轉(zhuǎn)錄和翻譯)的所述系統(tǒng)中，由核糖體指導活體外合成。對于開發(fā)無細胞蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)已作出相當大的努力。例如參看Kim,D.M.和J.R.Swartz,am/74:309-316(2001);Kim，D.M.和J.R.Swartz，萬她c/wo/ogy22,1537-1542，(2000);Kim,D.M.和J.R.Swartz,16，385-390,(2000》Kim,D.M.和J.R.Swartz,所o^c/mo/ogv朋d5/oe"g/"eer/"g,66,180-188,(1999);以及Patnaik,R.和J.R.Swartz,所o^c/zm々薦24,862-868,(1998);美國專利第6,337,191號；美國專利公開案第2002/0081660號；WO00/55353;WO90/05785,其是以引用的方式并入本文中?？蓱?yīng)用于非天然氨基酸多肽的表達的另一種方法包含mRNA-肽融合技術(shù)。例如參看R.Roberts和J.Szostak,尸rac.iVW/Jca^.Sc/,94:12297-12302(1997);A.Frankel等人，C&w&^y&10:1043-1050(2003)。在這種方法中，在核糖體上將與嘌呤霉素(puromycin)鍵聯(lián)的mRNA模板翻譯為肽。如果一種或一種以上tRNA分子己經(jīng)修飾，那么非天然氨基酸也可并入肽中。在已讀取最后一個mRNA密碼子之后，嘌呤霉素捕獲肽的C末端。如果發(fā)現(xiàn)所得mRNA-肽接合物在活體外檢定中具有引人關(guān)注的性質(zhì)，那么易于自mRNA序列揭示其特性。用這種方式，可篩檢非天然氨基酸多肽的文庫以鑒別具有所需性質(zhì)的多肽。最近，已報導利用經(jīng)純化組分的活體外核糖體翻譯，其允許合成經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的肽。例如參看A.Forster等人，/Voc.iV加/JcadScZ.100:6353(2003)。也可使用重構(gòu)翻譯系統(tǒng)。經(jīng)純化翻譯因子的混合物也已成功地用于將mRNA翻譯為蛋白質(zhì)以及溶胞物或補充有經(jīng)純化翻譯因子(諸如起始因子-l(IF-l)、IF-2、IF-3(a或0)、延伸因子T(EF-Tu)或終止因子)的溶胞物的組合。無細胞系統(tǒng)也可為偶合轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，其中將DNA引入系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄為mRNA且翻譯mRNA，如CwreWPwtoco"/"A/o/ecw/w(F.M.Ausubel等人編輯，WileyInterscience,1993)中所述，其是以引用的方式特定地并入本文中。于真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄的RNA可為異核RNA(hnRNA)或5'-端帽(7-甲基鳥苷)和3'-端polyA尾成熟mRNA的形式，此在某些翻譯系統(tǒng)中可為優(yōu)點。舉例來說，在網(wǎng)狀細胞溶胞物系統(tǒng)中加帽mRNA以高效率翻譯。多肽的非天然氨基酸組分的翻譯后修飾已開發(fā)在蛋白質(zhì)的活體內(nèi)翻譯期間位點特異性地并入非天然氨基酸的方法、組合物、技術(shù)以及策略。這一技術(shù)通過并入具有與天然存在的氨基酸的側(cè)鏈化學正交的側(cè)鏈化學的非天然氨基酸，使得重組蛋白質(zhì)的位點特異性衍生化成為可能。結(jié)果，方法、組合物、技術(shù)以及策略的主要優(yōu)點在于現(xiàn)在可以確定的均質(zhì)產(chǎn)物形式制備衍生蛋白質(zhì)。上述非天然氨基酸多肽適用于(包含(但不限于))新穎療法、診斷學、催化性酶、工業(yè)酶、結(jié)合蛋白質(zhì)以及(包含(但不限于))蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究。例如參看Dougherty,(2000)f/"MafMra/爿/m'wo^4c/cfeaw7Vo6eso//Vo/e/wS"M"wreFimc/iow,CurrentOpinioninChemicalBiology,4:645-652。上述非天然氨基酸多肽的其它用途包含(僅舉例來說)基于檢定、化妝品、植物生物學、環(huán)境、能量產(chǎn)生和/或軍事的用途。然而，上述非天然氨基酸多肽可經(jīng)受進一步修飾以并入新的或經(jīng)修飾的官能團，包含操縱多肽的治療功效、改良多肽的安全性概況、調(diào)節(jié)多肽的藥物動力學、藥理學和/或藥效學(例如，增加水溶性、生物可用性、增加血清半衰期、增加治療半衰期、調(diào)節(jié)免疫原性、調(diào)節(jié)生物活性或延長循環(huán)時間)、向多肽提供其它官能團、在多肽中并入標簽、標記或可檢測信號、易化多肽的分離性質(zhì)以及前述修飾的任何組合。本文中所述的方法、組合物、策略以及技術(shù)不限于多肽或蛋白質(zhì)的特定類型、種類或家族。實際上，幾乎任何多肽可包含至少一個非天然氨基酸。組合物可包含至少一種具有至少一個(包含(但不限于)至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個或十個以上)已經(jīng)翻譯后修飾的非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。經(jīng)翻譯后修飾的非天然氨基酸可相同或不同，包含(但不限于)在蛋白質(zhì)中可存在包括l、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10個以上不同經(jīng)翻譯后修飾非天然氨基酸的l、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10個以上不同位點。組合物可包含蛋白質(zhì)中存在的特定氨基酸中的至少一個(但少于全部)經(jīng)翻譯后修飾非天然氨基酸取代的蛋白質(zhì)。對于具有超過一個翻譯后修飾非天然氨基酸的給定蛋白質(zhì)來說，翻譯后修飾非天然氨基酸可相同或不同(包含(但不限于)所述蛋白質(zhì)可包含兩個或兩個以上不同類型的翻譯后修飾非天然氨基酸，或可包含兩個相同的翻譯后修飾非天然氨基酸)。對于具有兩個以上翻譯后修飾非天然氨基酸的給定蛋白質(zhì)來說，翻譯后修飾非天然氨基酸可相同、不同或為相同種類的多個翻譯后修飾非天然氨基酸與至少一個不同的翻譯后修飾非天然氨基酸的組合。舉例來說，翻譯后修飾可通過親核-親電子反應(yīng)進行。目前用于選擇性修飾蛋白質(zhì)的大多數(shù)反應(yīng)涉及親核與親電子反應(yīng)搭配物之間的共價鍵形成，其包含(但不限于)a-鹵代酮與組氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)。在所述情況下通過蛋白質(zhì)中親核殘基的數(shù)目和可接近性來確定選擇性。在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，可使用其它選擇性更大的反應(yīng)，諸如在活體外和活體內(nèi)的非天然酮基氨基酸與酰肼或氨基氧基化合物的反應(yīng)。例如參看Cornish等人，(1996)J.Am.Chem.Soc,118:8150-8151;Mahal等人，(1997)Science,276:1125-1128;Wang等人，(2001)Science292:498-500:Chin等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027:Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99:11020-11024;Wang等人,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci..100:56-61;Zhang等人，(2003)Biochemistry,42:6735-6746;以及Chin等人，(2003)Science,301:964-7。此允許用包含熒光團、交聯(lián)劑、糖衍生物以及細胞毒性分子的大量試劑選擇性標記幾乎任何蛋白質(zhì)。也參看標題為"Glycoproteinsynthesis"的美國專利第6,927,042號，其是以引用的方式并入本文中。A.非天然氨基酸組分的修飾非天然氨基酸組分(其包含非天然氨基酸以及多肽或其它聚合物的非天然氨基酸部分)的各種修飾包含(但不限于)(i)使含羰基非天然氨基酸組分與含羥胺試劑反應(yīng)以形成含肟非天然氨基酸組分；(ii)使含羥胺非天然氨基酸組分與含羰基試劑反應(yīng)以形成含肟非天然氨基酸組分；(iii)通過肟交換反應(yīng)，使由如(i)和(ii)中的羰基與羥胺的反應(yīng)形成的含肟非天然氨基酸組分與不同含羰基試劑反應(yīng)以形成新的含肟非天然氨基酸組分；(iv)使含二羰基非天然氨基酸組分與含羥胺試劑反應(yīng)以形成含肟非天然氨基酸組分；(v)使含羥胺非天然氨基酸組分與含二羰基試劑反應(yīng)以形成含肟非天然氨基酸組分；(vi)通過肟交換反應(yīng)，使由如(iv)和(v)中的二羰基與羥胺的反應(yīng)形成的含肟非天然氨基酸組分與不同含二羰基試劑反應(yīng)以形成新的含肟非天然氨基酸組分；所述反應(yīng)描繪于圖2中，其中經(jīng)翻譯并入(或以其他方式并入)多肽中的氨基酸官能團(A)與反應(yīng)物(B)反應(yīng)以產(chǎn)生經(jīng)修飾多肽。所述反應(yīng)可進一步與聚合物(包含(例如)聚核苷酸、聚核苷、多糖或其組合)上的氨基酸官能團(A)發(fā)生，其中與反應(yīng)物(B)的反應(yīng)產(chǎn)生經(jīng)修飾聚合物。為方便起見，本部分和本文中其它部分中所述的修飾使用(例如)"多肽"來說明各種修飾。然而，本文中所述的修飾同樣適用于并入其它分子(包含(但不限于)聚核苷酸、聚核苷、多糖、合成聚合物或其組合)中的非天然氨基酸。如本文所使用，術(shù)語"組分"指的是非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、含有非天然氨基酸的聚合物、含有選擇密碼子的核酸序列、與聚合物連接的非天然氨基酸多肽、與含有非天然氨基酸的聚合物連接的非天然氨基酸多肽、與核酸序列連接的非天然氨基酸多肽、與核酸序列連接的非天然氨基酸多肽；其各自可獨立地為多肽、非天然氨基酸多肽、核酸序列或聚合物的一部分或并入多肽、非天然氨基酸多肽、核酸序列或聚合物中。所述各個反應(yīng)流程的描述己揭露于美國臨時專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號和第60/696,068號中，其各以引用的方式全部并入本文中。各以上臨時專利申請案中所提供的揭露內(nèi)容全部適用于本文中所述的制備、檢測、純化、表征以及使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽以及經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的方法、組合物、技術(shù)以及策略中，適用的程度就如同所述揭露案完全呈示于本文中。使含羰基非天然氨基酸組分與含羥胺試劑反應(yīng)以形成含肟非天然氨基酸組分可將具有含親電子劑側(cè)鏈(包含(但不限于)羰基，諸如醛、酯、硫代酯以及酮)的非天然氨基酸并入多肽中。將具有所述親電子側(cè)鏈的所述非天然氨基酸并入多肽中使得通過親核攻擊羰基使這一側(cè)鏈位點特異性衍生化成為可能。當攻擊親核試劑為羥胺時，將產(chǎn)生肟衍生多肽。用于衍生化和/或進一步修飾的方法可用在衍生化步驟之前或衍生化步驟之后純化的多肽進行。另外，衍生化步驟可在適度酸性到弱堿性的條件(包含(例如)介于約2到約10的pH值之間，或介于約2到約8的pH值之間，或介于約4到約8的pH值之間)下進行。用含羥胺試劑或具有類似化學反應(yīng)性的其它官能團修飾并入多肽中的非天然氨基酸的羰基側(cè)鏈產(chǎn)生含肟鍵的經(jīng)修飾多肽。所述反應(yīng)和所述經(jīng)修飾多肽的所得結(jié)構(gòu)展示于圖3中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側(cè)鏈的非天然氨基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經(jīng)進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經(jīng)掩蔽肟基團(其可容易地轉(zhuǎn)化為肟基團)、經(jīng)保護肟基團(其在去保護之后，可容易地轉(zhuǎn)化為可用于其它化學反應(yīng)的肟基團)或通過肟交換反應(yīng)形成新的肟基團。所述經(jīng)修飾多肽肟鍵的非限定性實例展示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>使含羥胺非天然氨基酸組分與含羰基試劑反應(yīng)以形成含肟非天然氨基酸組分將含羥胺基團的非天然氨基酸并入多肽中允許與多種親電子基團(包含(但不限于)羰基，諸如酮、酯、硫代酯以及醛)反應(yīng)。羥胺基團的親核性準許其在溫和條件下在水性溶液中與含有羰基官能團或具有類似化學反應(yīng)性的其它官能團的多種分子有效且選擇性地反應(yīng)以形成相應(yīng)肟鍵。這一通過親核攻擊羰基進行的所述側(cè)鏈的位點特異性衍生化和/或進一步修飾可用在衍生化步驟之前或衍生化步驟之后純化的多肽進行。另外，衍生化步驟可在適度酸性到弱堿性的條件(包含(例如)介于約2到約10的pH值之間，或介于約2到約8的pH值之間，或介于約4到約8的pH值之間)下發(fā)生。用含羰基試劑修飾并入多肽中的非天然氨基酸的羥胺基團得到含肟鍵的經(jīng)修飾多肽。所述反應(yīng)和所述經(jīng)修飾多肽的所得結(jié)構(gòu)展示于圖4中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側(cè)鏈的非天然氨基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經(jīng)進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經(jīng)掩蔽肟基團(其可容易地轉(zhuǎn)化為肟基團)、經(jīng)保護肟基團(其在去保護之后，可容易地轉(zhuǎn)化為可用于其它化學反應(yīng)的肟基團)或通過肟交換反應(yīng)形成新的肟基團。所述經(jīng)修飾多肽后鍵的非限定性實例展示如下"^^^T^5多肽或聚合物^o^V"多肽或聚合物"t多肽或聚合物"&通過肟交換反應(yīng)，使由羰基與羥胺的反應(yīng)形成的含肟非天然氨基酸組分與不同含羰基試劑反應(yīng)以形成新的含肟非天然氨基酸組分含肟基團的非天然氨基酸允許與含有某些反應(yīng)性羰基(包含(但不限于)醛、酯、硫代酯以及酮)的多種試劑反應(yīng)以形成包括新肟基團的新的非天然氨基酸(其可并入多肽中)。所述肟交換反應(yīng)允許使非天然氨基酸多肽進一步官能化。用含羰基試劑或具有類似化學反應(yīng)性的其它官能團修飾并入多肽中的非天然氨基酸的肟側(cè)鏈產(chǎn)生含新肟鍵的經(jīng)修飾多肽。所述反應(yīng)和所述經(jīng)修飾多肽的所得結(jié)構(gòu)展示于圖5中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側(cè)鏈的非天然氨基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經(jīng)進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經(jīng)掩蔽肟基團(其可容易地轉(zhuǎn)化為肟基團)、經(jīng)保護肟基團(其在去保護之后，可容易地轉(zhuǎn)化為可用于其它化學反應(yīng)的肟基團)或通過肟交換反應(yīng)形成新的肟基團。使含二羰基非天然氨基酸組分與含羥胺試劑反應(yīng)以形成肟可將具有含親電子劑側(cè)鏈的非天然氨基酸并入多肽中，所述含親電子劑側(cè)鏈包含(但不限于)二羰基(諸如二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基以及酮硫代酯基)、類二羰基(其具有類似于二羰基的反應(yīng)性且在結(jié)構(gòu)上類似于羰基)、經(jīng)掩蔽二羰基(其可容易地轉(zhuǎn)化為二羰基)或經(jīng)保護二羰基(其在去保護后具有類似于二羰基的反應(yīng)性)。將具有所述親電子側(cè)鏈的所述非天然氨基酸并入多肽中使得通過親核攻擊羰基使這一側(cè)鏈位點特異性衍生化成為可能。當攻擊親核試劑為羥胺時，將產(chǎn)生肟衍生多肽。用于衍生化和/或進一步修飾的方法可用在衍生化步驟之前或衍生化步驟之后純化的多肽進行。另外，衍生化步驟可在適度酸性到弱堿性的條件(包含(例如)介于約2到約10的pH值之間，或介于約2到約8的pH值之間，或介于約4與約8的pH值之間)下發(fā)生。用含羥胺試劑或具有類似化學反應(yīng)性的其它官能團修飾并入多肽中的非天然氨基酸的二羰基側(cè)鏈產(chǎn)生含新后鍵的經(jīng)修飾多肽。所述反應(yīng)和所述經(jīng)修飾多肽的所得結(jié)構(gòu)展示于圖6中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側(cè)鏈的非天然氨基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經(jīng)進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經(jīng)掩蔽肟基團(其可容易地轉(zhuǎn)化為肟基團)、經(jīng)保護肟基團(其在去保護之后，可容易地轉(zhuǎn)化為可用于其它化學反應(yīng)的肟基團)或通過肟交換反應(yīng)形成新的肟基團。所述經(jīng)修飾多肽肟鍵的非限定性實例展示如下-ON多肽或聚合物N.0多肽或聚合物多肽或聚合物R廣O、NO多肽或聚合物多肽或聚合物0NR廣o、NO多肽或聚合物多肽或聚合物zt"Q多肽或聚合物\G使含羥胺非天然氨基酸組分與含二羰基試劑反應(yīng)以形成肟將含羥胺基團的非天然氨基酸并入多肽中允許與多種親電子基團反應(yīng)，所述親電子基團包含(但不限于)二羰基(諸如二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基以及酮硫代酯基)、類二羰基(其具有類似于二羰基的反應(yīng)性且在結(jié)構(gòu)上類似于羰基)、經(jīng)掩蔽二羰基(其可容易地轉(zhuǎn)化為二羰基)或經(jīng)保護二羰基(其在去保護后具有類似于二羰基的反應(yīng)性)。羥胺基團的親核性準許其在溫和條件下在水性溶液中與含有所述二羰基官能團或具有類似化學反應(yīng)性的其它官能團的多種分子有效且選擇性地反應(yīng)以形成相應(yīng)s虧鍵。這一通過親核攻擊二羰基進行的所述側(cè)鏈的位點特異性衍生化和/或進一步修飾可用在衍生化步驟之前或衍生化步驟之后純化的多肽進行。另外，衍生化步驟可在適度酸性到弱堿性的條件(包含(例如)介于約2到約10的pH值之間，或介于約2到約8的pH值之間，或介于約4到約8的pH值之間)下發(fā)生。用含二羰基試劑修飾并入多肽中的非天然氨基酸的羥胺基團得到含肟鍵的經(jīng)修飾多肽。所述反應(yīng)和所述經(jīng)修飾多肽的所得結(jié)構(gòu)展示于圖7中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側(cè)鏈的非天然氨基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經(jīng)進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經(jīng)掩蔽后基團(其可容易地轉(zhuǎn)化為肟基團)、經(jīng)保護肟基團(其在去保護之后，可容易地轉(zhuǎn)化為可用于其它化學反應(yīng)的肟基團)或通過肟交換反應(yīng)形成新的肟基團。所述經(jīng)修飾多肽肟鍵的非限定性實例展示如下多欣或聚合物一"N^^nA^多肽或聚合物一N^Ok60通過肟交換反應(yīng)，使由二羰基與羥胺的反應(yīng)形成的含肟非天然氨基酸組分與含羰基或不同含二羰基的試劑反應(yīng)以形成新肟含肟基團的非天然氨基酸允許與含有某些反應(yīng)性二羰基的多種試劑反應(yīng)，所述反應(yīng)性二羰基包含(但不限于)二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基以及酮硫代酯基、類二羰基(其具有類似于二羰基的反應(yīng)性且在結(jié)構(gòu)上類似于羰基)、經(jīng)掩蔽二羰基(其可容易地轉(zhuǎn)化為二羰基)或經(jīng)保護二羰基(其在去保護后具有類似于二羰基的反應(yīng)性)，從而形成包括新肟基團的新非天然氨基酸(其可并入多肽中)。所述肟交換反應(yīng)允許使非天然氨基酸多肽進一步官能化。用含二羰基試劑或具有類似化學反應(yīng)性的其它官能團修飾并入多肽中的非天然氨基酸的肟側(cè)鏈產(chǎn)生含新肟鍵的經(jīng)修飾多肽。所述反應(yīng)和所述經(jīng)修飾多肽的所得結(jié)構(gòu)展示于圖8中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側(cè)鏈的非天然氨基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經(jīng)進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經(jīng)掩蔽后基團(其可容易地轉(zhuǎn)化為肟基團)、經(jīng)保護肟基團(其在去保護之后，可容易地轉(zhuǎn)化為可用于其它化學反應(yīng)的肟基團)或通過肟交換反應(yīng)形成新肟基團。B.增強對血清白蛋白的親和性各種分子也可與本文中所述的非天然氨基酸多肽融合以調(diào)節(jié)在血清中的半衰期。在一些情況下，使分子與本文中所述的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽連接或融合以增強對動物中內(nèi)源血清白蛋白的親和性。舉例來說，在一些情況下，制造多肽與白蛋白結(jié)合序列的重組融合體。在其它情況下，使本文中所述的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽經(jīng)脂肪酸酰化。在其它情況下，使本文中所述的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽直接與血清白蛋白(包含(但不限于)人類血清白蛋白)融合。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認識到多種其它分子也可與如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的非天然氨基酸多肽連接以調(diào)節(jié)與血清白蛋白或其它血清組分的結(jié)合。關(guān)于增強對血清白蛋白的親和性的其它討論描述于美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650中，其是以引用的方式全部并入本文中。C.本文中所述的非天然氨基酸多肽的糖基化本文中所述的方法和組合物包含并有一個或一個以上帶有糖殘基的非天然氨基酸的多肽。糖殘基可為天然(包含(但不限于)N-乙?；咸前?或非天然(包含(但不限于)3-氟半乳糖)糖殘基。糖可通過N或O鍵聯(lián)糖苷鍵(包含(但不限于)N-乙?；肴樘?L-絲氨酸)或非天然鍵(包含(但不限于)肟或相應(yīng)C或S鍵聯(lián)糖苷)與非天然氨基酸連接。可在活體內(nèi)或活體外將糖(包含(但不限于)糖基)部分添加到非天然氨基酸多肽上。在一些情況下，使包括含羰基非天然氨基酸的多肽經(jīng)以氨基氧基衍生化的糖修飾以產(chǎn)生通過肟鍵鍵聯(lián)的相應(yīng)糖基化多肽。一旦糖連接于非天然氨基酸，則其可通過用糖基轉(zhuǎn)移酶和其它酶處理而進一步修飾以產(chǎn)生與非天然氨基酸多肽結(jié)合的寡糖。例如參看H.Liu等人，爿附.C/zem.Soc.125:1702-1703(2003)。D.鍵聯(lián)基團和應(yīng)用(包含多肽二聚體和多聚體)的用途除將官能團直接添加到非天然氨基酸多肽上外，可首先用多官能(例如，雙、三、四)連接子分子修飾多肽的非天然氨基酸部分，然后接著進一步修飾多官能連接子分子。即，使多官能連接子分子的至少一個末端與多肽中的至少一個非天然氨基酸反應(yīng)且多官能連接子的至少一個其它末端可用于進一步官能化。如果多官能連接子的所有末端相同，那么(視化學計量條件而定)可形成非天然氨基酸多肽的均多聚體。如果多官能連接子的各末端具有不同化學反應(yīng)性，那么使多官能性連接子基的至少一個末端與非天然氨基酸多肽結(jié)合且另一末端可接著與不同官能團反應(yīng)，所述不同官能團包含(僅舉例來說)標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯(lián)劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應(yīng)性化合物；樹脂；第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反義聚核苷酸；糖；水溶性樹枝狀聚合物；環(huán)糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團；含金屬部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠蔽部分；可光化輻射激發(fā)的部分；可光異構(gòu)化部分；生物素；生物素類似物；結(jié)合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長側(cè)鏈；碳鍵聯(lián)糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經(jīng)同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發(fā)色團；能量轉(zhuǎn)移劑；生物活性劑；可檢測標記；小分子；量子點；納米傳遞素；以及上述各者的任何組合。鍵聯(lián)基團和應(yīng)用(包含多肽二聚體和多聚體)的其它用途進一步描述于美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650中，其是以引用的方式全部并入本文中。62E.添加官能團的實例易化多肽的分離性質(zhì)出于多種原因，包含(但不限于)多肽的溶解性或結(jié)合特征，可能難以從樣品中分離出天然存在的或非天然氨基酸多肽。舉例來說，在制備用于治療用途的多肽中，可從已工程化以過量產(chǎn)生多肽的重組系統(tǒng)中分離所述多肽。然而，由于多肽的溶解性或結(jié)合特征，因此通常證明難以達成所需純度通常。進一步描述于美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650(其是以引用的方式全部并入本文中)中的方法、組合物、技術(shù)以及策略提供這一情形的解決方案。F.添加官能團的實例檢測多肽的存在出于多種原因，包含(但不限于)缺乏可容易地與多肽結(jié)合的試劑或標記，可能檢測樣品(包含活體內(nèi)樣品和活體外樣品)中天然存在的或非天然氨基酸多肽。進一步描述于美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650(其是以引用的方式全部并入本文中)中的方法、組合物、技術(shù)以及策略提供這一情形的解決方案。G.添加官能團的實例改良多肽的治療性質(zhì)天然存在的或非天然氨基酸多肽將能夠向患有特定病癥、疾病或病狀的患者提供某種治療益處。所述治療益處將視許多因素而定，包含(僅舉例來說)多肽的安全性概況和多肽的藥物動力學、藥理學和/或藥效學(例如，水溶性、生物可用性、血清半衰期、治療半衰免疫原性、生物活性或循環(huán)時間)。另外，向多肽提供其它官能團可為有利的，所述其它官能團諸如連接的細胞毒性化合物或藥物，或可能希望連接其它多肽以形成本文中所述的均多聚體和雜多聚體。所述修飾優(yōu)選不破壞原始多肽的活性和/或三級結(jié)構(gòu)。進一步描述于美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650(其是以引用的方式全部并入本文中)中的方法、組合物、技術(shù)以及策略提供所述問題的解決方案。X.經(jīng)修飾多肽的治療用途發(fā)現(xiàn)本文中所述的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽(包含其均多聚體和雜多聚體)具有多種用途，包含(但不限于)治療、診斷、基于檢定、工業(yè)、化妝品、植物生物學、環(huán)境、能量產(chǎn)生和/或軍事的用途。以非限定性說明形式，提供(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的下列治療用途。本文中所述的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽適用于治療多種病癥。投與本文中所述的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽產(chǎn)品在人類中產(chǎn)生市售多肽制劑所顯示的任何活性。(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽產(chǎn)品的平均量可變化且尤其應(yīng)以合格醫(yī)師的推薦和處方為基礎(chǔ)。(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的確切量和與諸如所治療的病狀的確切類型、所治療患者的狀況以及組合物中的其它成分的因素一致的順序有關(guān)。所欲給予的量可由基于利用(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的療法的領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員容易地確定。A.投藥和醫(yī)藥組合物如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽(包含(但不限于)包括一個或一個以上非天然氨基酸的合成酶、蛋白質(zhì)等)視情況(包含(但不限于))與合適醫(yī)藥載劑組合用于治療用途。所述組合物(例如)包括治療有效量的如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽和醫(yī)藥學上可接受的載劑或賦形劑。所述載劑或賦形劑包含(但不限于)鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其組合。制備適用于投藥模式的調(diào)配物。一般來說，所屬領(lǐng)域中熟知投與蛋白質(zhì)的方法且其可應(yīng)用于投與如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽。根據(jù)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的方法，包括一種或一種以上如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的治療組合物視情況在一種或一種以上適當活體外和/或活體內(nèi)動物疾病模型中進行測試以確認功效、組織代謝且估算劑量。具體來說，劑量初始可通過非天然氨基酸與天然氨基酸同源物相比(包含(但不限于)比較包含一個或一個以上非天然氨基酸的(經(jīng)修飾)多肽與天然氨基酸多肽)(即，在相關(guān)檢定中)的活性、穩(wěn)定性或其它合適量度來確定。通過通常用于引入分子以最終與血液或組織細胞接觸的任何途徑進行投藥。如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽是視情況與一種或一種以上醫(yī)藥學上可接受的載劑以任何合適方式一起投與?？墒褂孟蚧颊咄杜c如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的合適方法，且盡管可使用一種以上途徑來投與特定組合物，但特定途徑通常可提供比另一種途徑更直接且更有效的作用或反應(yīng)。醫(yī)藥學上可接受的載劑部分由欲投與的特定組合物以及由用于投與組合物的特定方法決定。因此，存在多種本文中所述的醫(yī)藥組合物的合適調(diào)配物?？捎蛇m用于蛋白質(zhì)或肽的任何常規(guī)途徑(包含(但不限于)非經(jīng)腸，例如包含(但不限于)皮下或靜脈內(nèi)注射或任何其它形式的注射或輸液)來投與非天然氨基酸多肽?？捎砂?但不限于)口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、局部、舌下或經(jīng)直腸方式的多種途徑投與多肽組合物(包含本文中所述的各種多肽)。包括如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的組合物也可通過脂質(zhì)體投與。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常已知所述投藥途徑以及適當調(diào)配物。非天然氨基酸多肽可單獨使用或與其它合適組分(諸如醫(yī)藥載劑)組合使用。單獨或與其它合適組分組合的如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽也可制成通過吸入投與的氣溶膠調(diào)配物(即，其可"霧化")。氣溶膠調(diào)配物可置于加壓的可接受推進劑(諸如二氯二氟甲垸、丙垸、氮氣以及其類似物)中。適用于非經(jīng)腸投藥(諸如，通過關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑)的調(diào)配物包含水性和非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使調(diào)配物與預期接受者的血液等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。經(jīng)包裝核酸的調(diào)配物可于單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中提供。非經(jīng)腸投藥和靜脈內(nèi)投藥為優(yōu)選投藥方法。具體來說，己用于天然氨基酸同源物治療劑的投藥途徑(包含(但不限于)通常用于EPO、IFN、GM-CSF、IFN、白細胞介素、抗體和/或任何其它醫(yī)藥遞送蛋白質(zhì)的那些投藥途徑)以及目前使用的調(diào)配物一起提供優(yōu)選投藥途徑和如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的調(diào)配物。在本文中所述的組合物和方法的情況下，投與患者的劑量足以隨時間在患者中產(chǎn)生有益治療反應(yīng)。劑量是由以下因素決定特定調(diào)配物的功效和所使用的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期以及患者的狀況，以及欲治療的患者的體重或表面積。劑量大小也由特定患者中伴隨特定調(diào)配物或其類似物的投藥產(chǎn)生的任何有害副作用的存在、性質(zhì)以及程度決定。在確定在治療或預防疾病(包含(但不限于)癌癥、遺傳性疾病、糖尿病、AIDS以及其類似疾病)中欲投與的調(diào)配物的有效量時，醫(yī)師評估循環(huán)血漿含量、調(diào)配物毒性、疾病進程和/或(相關(guān)時)抗非天然氨基酸多肽抗體的產(chǎn)生。(例如)向70千克患者投與的劑量通常在相當于目前使用的治療性蛋白質(zhì)的劑量的范圍內(nèi)，其是根據(jù)相關(guān)組合物的改變的活性或血清半衰期加以調(diào)節(jié)。本文中所述的醫(yī)藥調(diào)配物可通過任何已知的常規(guī)療法來補充治療條件，所述常規(guī)療法包含抗體投藥、疫苗投藥、投與細胞毒性劑、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類似物、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑以及其類似物質(zhì)。對于投藥來說，本文中所述的醫(yī)藥調(diào)配物是以由相關(guān)調(diào)配物的LD-50或ED-50和/或各種濃度下經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的任何副反應(yīng)(包含(但不限于)當關(guān)系到患者的體重和整體健康時)的觀測結(jié)果所確定的速率投與?？赏ㄟ^單一劑量或分次劑量實現(xiàn)投藥。如果經(jīng)歷調(diào)配物輸液的患者出現(xiàn)發(fā)熱、發(fā)冷或肌痛，那么他/她接受適當劑量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetami加phen)或其它疼痛/發(fā)熱控制藥物。在即將輸液前30分鐘，用阿司匹林、醋氨酚或(包含(但不限于))苯海拉明(diphenhydramine)對經(jīng)歷輸液反應(yīng)(諸如發(fā)熱、肌痛和發(fā)冷)的患者進行前驅(qū)用藥。度冷丁(meperidine)用于不能對退熱劑和抗組胺劑迅速作出反應(yīng)的更嚴重的發(fā)冷和肌痛。視反應(yīng)的嚴重性而定減緩或中斷細胞輸液。如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽可直接投與哺乳動物個體。通過通常用于向個體引入多肽的任何途徑進行投藥。如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽包含適于口服、經(jīng)直腸、局部、吸入(包含(但不限于)通過氣溶膠)、經(jīng)頰(包含(但不限于)舌下)、經(jīng)陰道、非經(jīng)腸(包含(但不限于)皮下、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部(即，皮膚與粘膜表面，包含氣管表面)以及經(jīng)皮投藥者，但在任何給定情況下最合適途徑將視所治療的病狀的性質(zhì)和嚴重性而定。投藥可為局部或全身性投藥。調(diào)配物可于單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中提供。如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽可制備為單位劑量可注射形式(包含(但不限于)溶液、懸浮液或乳液)與醫(yī)藥學上可接受的載劑的混合物。也可通過連續(xù)輸液(使用(包含(但不限于))微型泵，諸如滲透泵)、單次快速注射或緩釋儲槽調(diào)配物來投與如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽。適于投藥的調(diào)配物包含水性和非水性溶液(等張無菌溶液)，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使調(diào)配物等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑?？捎上惹八鲱愋偷臒o菌粉末、顆粒和片劑來制備溶液和懸浮液。冷凍干燥為用于自所關(guān)注蛋白質(zhì)制劑移除水的用于提供蛋白質(zhì)的常用技術(shù)。冷凍干燥或凍干為使欲干燥材料首先冷凍且隨后通過在真空環(huán)境中升華來移除冰或冷凍溶劑的方法。在預凍干調(diào)配物中可包含賦形劑以增強在冷凍干燥過程中的穩(wěn)定性和/或改良凍干產(chǎn)品在儲存時的穩(wěn)定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員也己知藥物的噴霧干燥。舉例來說，參看Broadhead,J.等人，"TheSprayDryingofPharmaceuticals,"DrugDev.Ind.Pharm,18(11和12),1169-1206(1992)。除小分子藥物之外，多種生物材料也已經(jīng)噴霧干燥且所述生物材料包含酶、血清、血漿、微生物和酵母。噴霧干燥為適用技術(shù)，因為其可將液體藥物制劑在一步工藝中轉(zhuǎn)化為精細、無塵或聚集的粉末。基本技術(shù)包括以下四個步驟a)將進料溶液霧化成噴霧；b)噴霧-空氣接觸；c)使噴霧干燥；和d)自干燥空氣分離經(jīng)干燥的產(chǎn)物。美國專利第6,235,710號和第6,001,800號(其是以引用的方式并入本文中)描述通過噴霧干燥來制備重組促紅細胞生成素。本文中所述的醫(yī)藥組合物可包括醫(yī)藥學上可接受的載劑。醫(yī)藥學上可接受的載劑部分是由所投與的特定組合物以及由用于投與組合物的特定方法決定。因此，存在多種如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的醫(yī)藥組合物(包含可選的醫(yī)藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑)的合適調(diào)配物。(例如參看ie脂'"gto"k尸/2anKace^'ca/Sc/e"cM,第17版，1985))。合適載劑包含緩沖劑，含有琥珀酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、咪唑、乙酸鹽、碳酸氫鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包含(但不限于)抗壞血酸；低分子量多肽，包含(但不限于)少于約10個殘基的那些多肽；蛋白質(zhì)，包含(但不限于)血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，包含(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包含(但不限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、組氨酸或組氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包含(但不限于)海藻糖、庶糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，包含(但不限于)EDTA;二價金屬離子，包含(但不限于)鋅、鈷或銅；糖醇，包含(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，包含(但不限于)鈉；和/或非離子型表面活性劑，包含(但不限于)Tween(包含(但不限于)Tween80(聚山梨醇酯80)和Tween20(聚山梨醇酯20))、Pluronics和其它泊洛尼克酸(pluronicacid)(包含(但不限于)泊洛尼克酸F68(poloxamer188))或PEG。合適表面活性劑(例如)包含(但不限于)以聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)(即，(PEO-PPO-PEO))或聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)(即，(PPO-PEO-PPO))或其組合為基礎(chǔ)的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO以商品名Pluronics、R-Pluronics、Tetronics和R-Tetronics(BASFWyandotteCorp.,Wyandotte,Mich.)在市面上有售且進一步描述于美國專利第4，820，352號中，其是以引用的方式全部并入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可為合適的表面活性劑。表面活性劑或表面活性劑的組合可用于使(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽穩(wěn)定以抵抗一種或一種以上應(yīng)力(包含(但不限于)由攪拌產(chǎn)生的應(yīng)力)。一些上述物質(zhì)可被稱作"膨脹劑"。一些也可被稱作"張力調(diào)節(jié)劑"。如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽(包含與諸如PEG的水溶性聚合物鍵聯(lián)的所述多肽)也可通過持續(xù)釋放系統(tǒng)或作為其部分來投與。持續(xù)釋放組合物包含(包含(但不限于))呈定形物品(包含(但不限于)薄膜或微膠囊)形式的半滲透性聚合物基質(zhì)。持續(xù)釋放基質(zhì)包含生物相容性材料，諸如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(Langer等人，m她r.to,15:167-277(1981);Langer,C/j謡.Tfec/z.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)、聚乳酸(polylactide;polylacticacid)(美國專利第3,773,919號;EP58,481)、聚乙醇酸(乙醇酸的聚合物)、聚乳酸-共-乙醇酸(乳酸與乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸與y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，祝o/7o/;weAs,22,547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(諸如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯垸酮以及硅酮。持續(xù)釋放組合物也包含脂質(zhì)體截留的化合物。含有化合物的脂質(zhì)體是由本身已知的方法來制備DE3,218,121;Epstein等人，Prac.A^/.爿ca《Scz'US.A，82:3688-3692(1985);Hwang等人，Prac.Ato/爿cadSc/t/.S.A，77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;美國專利第4,619,794號；EP143,949;美國專利第5,021,234號；日本專利申請案83-118008;美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；以及EP102,324。所引用的所有參考文獻和專利都是以引用的方式并入本文中。脂質(zhì)體截留的多肽可由描述于以下文獻中的來制備，(例如)DE3,218,121;Epstein等人，尸rac.iVa"^c^.Sc/.C/.S.A,82:3688-3692(1985);Hwang等人，Proc.A^/.C/.S.A,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;美國專利第4,619,794號；EP143,949;美國專利第5,021,234號；日本專利申請案83-118008;美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；以及EP102,324中。脂質(zhì)體的組成和大小為眾所周知的或能夠由所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗容易地確定。脂質(zhì)體的一些實例描述于(例如)ParkJW等人，/Voc.爿cadScz'.92:1327-1331(1995);LasicD和PapahadjopoulosD(編)MedicalApplicationsofLiposomes(1998);DrummondDC等人，LiposomaldrugdeliverySystemsforcancertherapy,在TeicherB(編)CANCERDRUGDiscoveryandDevelopment(2002)中;ParkJW等人，C/z'".Omceri仏8:1172-1181(2002);NielsenUB等人，所ocW附.5/o;^:^.1591(1-3):109-118(2002);MamotC等人，Owe"i仏63:3154-3161(2003)中。所引用的所有參考文獻和專利都是以引用的方式并入本文中。在如本文中所述的組合物、調(diào)配物和方法的情況下，向患者投與的劑量應(yīng)足以隨時間在個體中產(chǎn)生有益反應(yīng)。通常，每劑量非經(jīng)腸投與的如本文中所述的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的總醫(yī)藥學有效量在每天每千克患者體重約0.01pg至約100嗎或約0.05mg至約lmg的范圍內(nèi)，但此服從于治療判斷。給藥頻率也服從于治療判斷，且可比獲準用于人類的市售產(chǎn)品的頻率大或小。通常，聚合物:多肽接合物(包含(僅舉例來說)如本文中所述的聚乙二醇化多肽)可通過上述任何投藥途徑投與。XI.分離和純化A.色譜法在本文中的任何實施例中，肽、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽、多肽的結(jié)合搭配物或受體的分離可通過色譜法進行。色譜法是以多肽的差異吸附和洗脫為基礎(chǔ)。將樣品溶解于可為氣體、液體或超臨界流體的流動相中。然后迫使這一流動相通過固定于管柱中或固體表面上的不混溶固定相。固定相的實例包含吸附于固體上的液體、鍵結(jié)于固體表面的有機物質(zhì)、固體、離子交換樹脂以及聚合固體間隙中的液體。多肽由不同色譜法或其它分離/純化法純化的能力可通過添加非天然氨基酸或用非天然氨基酸取代一個或一個以上非天然氨基酸視情況以及一個或一個以上天然氨基酸取代來調(diào)節(jié)。因此，多肽的性質(zhì)可通過改變氨基酸組成來改變，從而使得能夠增加或減小其與已知基質(zhì)的相互作用。氨基酸組成的改變包含(但不限于)疏水性氨基酸含量、親水性氨基酸含量以及多肽的電荷、pl或其它特征的改變。所述修飾可適用于分離難以分離的膜蛋白質(zhì)，因為其在性質(zhì)上是疏水性的且保持其天然構(gòu)象。氣相色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過氣相色譜法(GC)進行。將樣品氣化且注入到色譜柱的頭部上。流動氣相的實例包含(但不限于)氦氣、氬氣、氮氣、二氧化碳以及氫氣。在一實施例中，樣品是通過氣固色譜法分離，其中固定相是固體。固體固定相的實例為分子篩和多孔聚合物。在另一實施例中，多肽是通過氣液色譜法分離，其中固定相是固定于惰性固體表面上的液體。液體固定相的實例包含聚二甲基硅氧烷、聚(苯基甲基二甲基)硅氧垸(10%苯基)、聚(苯基甲基)硅氧烷(50%苯基)、聚(三氟丙基二甲基)硅氧烷、聚乙二醇以及聚(二氰基烯丙基二甲基)硅氧垸。常規(guī)GC管柱是呈填塞且開口的管狀或毛細管狀。GC色譜柱的長度為小于2米到50米或50米以上不等。用于其構(gòu)造的物質(zhì)的實例包含不銹鋼、金屬、玻璃、熔融硅石以及特氟綸(Teflon)。GC管柱通常具有約2毫米至4毫米的內(nèi)徑。微GC具有約1毫米的內(nèi)徑。毛細管GC利用內(nèi)徑約100微米至750微米的毛細管。納米GC可以50微米-l亳米的內(nèi)徑使用。液相色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過液相色譜法(LC)進行。LC涉及使用于固定相管柱的長度在IO厘米至30厘米范圍內(nèi)。LC管柱通常由滑腔不銹鋼管構(gòu)造，但偶爾會遇到重玻璃管。常規(guī)LC管柱具有約4.6毫米的內(nèi)徑和約1毫升/分鐘的流速。微LC具有約1.0毫米的內(nèi)徑和約40微升/分鐘的流速。毛細管LC利用內(nèi)徑約300微米且流速約5微升/分鐘的毛細管。納米LC可以50微米-1毫米的內(nèi)徑和200納升/分鐘的流速使用。納米LC的長度可不同，例如，5厘米、15厘米或25厘米。納米LC固定相也可為整塊材料，諸如聚合整料或溶膠-凝膠整料。液相色譜法中已使用兩種基本類型的填充材料，無孔粒子和多孔粒子。珠?；蛄Ｗ拥奶卣魍ǔＴ谟诹胶涂讖?。粒徑通常在3微米與50微米之間的范圍內(nèi)。較大粒子將產(chǎn)生較小系統(tǒng)壓力，且較小粒子將產(chǎn)生較大壓力。較小粒子通常產(chǎn)生較高分離效率。粒子孔徑以埃(angstrom)量度且通常在100埃-1000埃范圍內(nèi)。其可覆蓋有二氧化硅、氧化鋁、離子交換樹脂、有機表面層、聚合物、配位體、碳水化合物或特定輔助物質(zhì)的多孔層。在本發(fā)明的一實施例中，多肽可使用HPLC技術(shù)分離。在本發(fā)明的另一實施例中，多肽可使用管柱色譜法分離。在管柱色譜法中，將固體介質(zhì)填塞至色譜管柱上，且使含有多肽的初始混合物穿過管柱以允許結(jié)合。然后使洗滌緩沖液穿過管柱，且接著向管柱施加洗脫緩沖液以收集樣品。所述步驟可在周圍壓力下進行。在另一實施例中，多肽與固相的結(jié)合可使用以下步驟實現(xiàn)批處理，通過將初始混合物添加到容器中的固相中，將兩者混合在一起，分離固相(即，通過離心)，移除液相，洗滌，再離心，添加洗脫緩沖液，再離心以及移除洗脫液。在本發(fā)明的另一實施例中，使用混合方法，其中通過批處理法進行結(jié)合，然后將結(jié)合有標靶分子的固相填塞至管柱上，且在管柱上進行洗滌和洗脫。在本發(fā)明的又一實施例中，肽的分離在微流體裝置中進行。在本發(fā)明的另一實施例中，肽的分離在納米流體裝置中進行。分配色譜法在一實施例中，多肽的分離是通過分配色譜法進行。在一實施例中，多肽的分離是通過液-液分配色譜法進行。對液-液分配色譜法來說，液體固定相通過物理吸附保留在填料的表面上。在另一實施例中，多肽的分離可通過鍵結(jié)相分配色譜法進行。對鍵結(jié)相分配色譜法來說，固定相化學鍵結(jié)于支撐表面上。在另一實施例中，使用正相色譜法分離多肽。在正相色譜法中，使用極性固定相以及非極性溶劑。正相色譜法的固定相的實例包含(但不限于)水、醇以及三乙二醇。正相色譜法的非極性溶劑的實例包含(但不限于)乙基、醚、氯仿、四氫呋喃、氟烷、環(huán)己垸、l-氯丁垸、四氯化碳、甲苯、乙醚、己垸以及異丙醚。在一實施例中，分配色譜法使用反相填料；此稱為反相分配色譜法。在反相色譜法中，使用非極性固定相以及極70性流動相。反相分配色譜法的固定相的實例包含(但不限于)烴、醚、酯、酮、醛、酰胺以及胺。反相分配色譜法的流動固定相的實例包含水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二噁垸、硝基甲烷、乙二醇、四氫呋喃以及乙腈。在一實施例中，可用于分離多肽的反向色譜法的類型為離子對色譜法。離子對色譜法中的流動相由含有有機溶劑(諸如甲醇或乙腈)的水性緩沖液和含有具有多肽的相反電荷的抗衡離子的離子型化合物組成?？购怆x子與多肽結(jié)合形成離子對，所述離子對為由反相填料保留的中性物質(zhì)。然后用甲醇或另一水溶性有機溶劑(如以上所述的溶劑)的水溶液實現(xiàn)離子對的洗脫?？购怆x子的實例為C1(V、C12H25S03—、(C4H9)4N+、(C16H33)(CH3)3N+、(C4H9)4N+、雙-(2-乙基已基)磷酸根以及(C4H9)4N+。在一實施例中，多肽可使用具有手性固定相的分配色譜法分離。手性固定相的類型的實例包含(但不限于)基于蛋白質(zhì)的固定相、纖維素與直鏈淀粉的小分子量手性聚合物、大環(huán)糖肽以及基于環(huán)糊精的物質(zhì)。吸附色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過吸附色譜法進行。一吸附是物質(zhì)(流動相中所含的物質(zhì))通過物理力(分散、極性或離子)與固定相相互作用的過程，從而使得物質(zhì)層(或各層)粘附于固定相上。在大多數(shù)情況下，固定相將為固體(例如硅膠、氧化鋁、炭等)或有時為液體(例如，水表面上的表面活性劑)。表面層可為單層、雙層或多層?？捎糜谖缴V法中的溶劑的實例包含水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二噁垸、硝基甲垸、乙二醇、四氫呋喃、乙腈、乙基、醚、氯仿、四氫呋喃、氟垸、環(huán)己烷、l-氯丁烷、四氯化碳、甲苯、乙醚、己垸以及異丙醚。離子交換色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過離子交換色譜法進行。在離子交換色譜法中，多肽的分離是以離子交換樹脂為基礎(chǔ)。離子交換樹脂可為陰離子交換樹脂或陽離子交換樹脂。離子交換樹脂可由天然離子交換劑(諸如粘土和沸石)或合成離子交換劑制成。陽離子交換樹脂的常見活性位點的實例為磺酸基-S(VH+、羧酸基-COO—H+以及磷酸-P032+H2。陰離子交換樹脂的常見活性位點的實例為季胺基-N(CH3)+OH—或伯胺基-NH3+OH—。離子交換色譜法中的流動相通常為可含有中等量甲醇或其它水混溶性有機溶劑的水溶液；所述流動相也含有呈緩沖劑形式的離子物質(zhì)。在一實施例中，離子交換柱是用鹽濃度梯度洗脫。在一實例中，在緩沖液流經(jīng)管柱時泵將遞增量的鹽添加到緩沖液中，以便流經(jīng)管柱的離子濃度存在連續(xù)穩(wěn)定的增加。當緩沖液的離子強度中和蛋白質(zhì)電荷時，蛋白質(zhì)"洗脫"或離開管柱固定相。帶電最小的分子首先離開，而帶電最高的最后離開。在另一實例中，用具有遞增離子強度的緩沖液充分清洗管柱直到所需蛋白質(zhì)洗脫；每次用相同量的緩沖液重復這一完全相同的順序以得到蛋白質(zhì)的可重現(xiàn)的產(chǎn)率和純化。在一實施例中，通過離子交換色譜法分離所關(guān)注的多肽后，將使樣品經(jīng)受高鹽濃度移除。在一實施例中，高鹽濃度的移除將通過透析進行。透析利用半透性膜。透析膜的主要特征在于其是多孔的。然而，孔徑使得當小鹽離子可自由通過膜時，較大蛋白質(zhì)分子不能通過(即，其被保留)。因此，透析膜由將其保留的最小的典型球狀蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量表征。高鹽濃度的移除可以單個或多個透析步驟實現(xiàn)。在另一實施例中，高鹽濃度的移除通過電透析進行。電透析是在電勢梯度的影響下離子穿過離子可透膜從一種溶液運輸?shù)搅硪蝗芤褐械碾姼裟み^程。因為用于電透析中的膜具有選擇性運輸具有正電荷或負電荷的離子且排除具有相反電荷的離子的能力，所以電透析適用于電解質(zhì)的濃縮、移除或分離。在另一實施例中，高濃度鹽的移除是通過使用脫鹽管柱在重力流動凝膠過濾中實現(xiàn)。重力流動凝膠過濾涉及具有不同尺寸的分子基于其透入合適固定相中的相對能力的色譜分離。向脫鹽管柱中填塞小的多孔纖維素珠粒。所述管柱含有具有特定直徑的濕珠粒。所使用的珠粒的直徑將視所關(guān)注的肽的分子量而定。分離的不同程度可基于填塞至管柱中的介質(zhì)的孔徑實現(xiàn)?？蛇x擇介質(zhì)以完全排除蛋白質(zhì)或大分子，同時仍包含小溶質(zhì)。大分子被從凝膠的內(nèi)孔中排除出且首先從管柱中排出。較小分子能夠透過微孔，且然后以較低速率通過管柱前進。所述較小分子接著用另外的緩沖體積沖洗通過管柱。尺寸排除色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過尺寸排阻色譜法(也稱為凝膠滲透或凝膠過濾色譜法)進行。大于填料的平均孔徑的分子被排除且因此不經(jīng)受保留。尺寸排阻色譜法的填料的實例包含硅石、纖維素珠粒以及聚合物粒子。多孔玻璃和硅石粒子通常具有40埃至2500埃范圍內(nèi)的平均孔徑。在一些實施例中，具有102埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是700。在另一實施例中，具有103埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(O.l至20)X104。在另一實施例中，具有104埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(l至20)X104。在另一實施例中，具有105埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(l至20)X105。在又一實施例中，具有106埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(5至10)X106。在一些實施例中，具有125埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(0.2至5)X104。在另一實施例中，具有300埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(0.03至1)X1()S。在另一實施例中，具有500埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(0.05至5)X105。在又一實施例中，具有1000埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(5至20)X105。薄層色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過薄層色譜法進行。薄層色層法包含紙色譜法、薄層色譜法以及電色譜法。各利用自撐式或涂布于玻璃、塑料或金屬表面上的平坦的薄層材料。流動相通過毛細管作用、有時借助于重力或電勢輔助移動通過固定相。在一實施例中，平面分離是在涂布有薄且粘附的細粒層的平坦玻璃或塑料板上進行；這一層構(gòu)成固定相。固定相和流動相類似于吸附色譜法、正相和反相分配色譜法、離子交換色譜法以及尺寸排阻色譜法中所討論的那些。在一實施例中，通過噴灑與有機化合物反應(yīng)以產(chǎn)生深色產(chǎn)物的溶液將多肽置于板中。這類溶液的實例包含茚三酮、碘溶液以及硫酸溶液。在另一實施例中，通過將熒光物質(zhì)并入固定相中來放置多肽。在紫外光下檢測板。樣品組分猝滅熒光物質(zhì)，從而除放置非發(fā)熒光樣品組分以外的所有板均發(fā)熒光。親和力色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過親和力色譜法進行。親和力色譜法依賴于設(shè)計與分子已知子集可逆結(jié)合的固定相的能力。親和力純化通常包括以下步驟1)將粗樣品與經(jīng)固定的配位體支撐物質(zhì)一起培育以使樣品中的標靶分子與經(jīng)固定的配位體結(jié)合，2)從固體支撐物洗除未結(jié)合的樣品組分，以及3)通過改變緩沖條件以使結(jié)合相互作用不再發(fā)生，從固定配位體洗脫(解離且回收)標耙分子。用于親和力色譜法的洗脫緩沖液的實例包含(但不限于)100mM鹽酸甘氨酸、100mM擰檬酸、50-100mM三乙胺或三乙醇胺、150mM氫氧化銨、于10mMTris中的3.5-4.0M氯化鎂、于10mM磷酸鹽緩沖液中的5M氯化鋰、2.5M碘化鈉、0.2-3.0硫氰酸鈉、2-6M鹽酸胍、2-8M脲、1%脫氧膽酸鹽、1%SDS、10%二噁烷、50%乙二醇、0.1M甘氨酸-NaOH、具有50%乙二醇的0.1M甘氨酸-NaOH、3.0M氯化鉀、具有2.0MNaCl的0.1MTris-乙酸鹽、5.0M碘化鉀、1%SDS、1%脫氧膽酸鈉、2.0M脲、6.0M脲、2.0M鹽酸胍、l.OM硫氰酸銨以及>0.1M抗衡配位體或類似物。在一實施例中，固定相包含配位體，所述配位體包含(但不限于)特定碳水化合物或輔助物質(zhì)。在一實施例中，可隨后用高濃度碳水化合物或特定輔助物質(zhì)洗脫多肽。有時可使用結(jié)合位點的模擬物作為親和性固定相。用于固定相中的特定糖、抑制劑或輔助物質(zhì)將根據(jù)多肽的性質(zhì)而變化。本發(fā)明的實施例包含所屬領(lǐng)域中已知的任何配位體、碳水化合物或輔助物質(zhì)。在另一實施例中，所固定的固定相包含染料。常用于染料-配位體色譜法的染料的實例包含活性藍2(CibacronBlue3GA)、活性紅120(ProcionRedHE3B)、活性藍4(ReactiveBlueMRB)TC、活性綠5(ReactiveGreenH4G)TC、活性綠19(ReactiveGreenHE4BD)TC、綠色19A(ReactiveGreenHE4BD)TC、活性黃86(ReactiveYellowM8G)tc以及活性棕IO(ReactiveBrownM4R)TC。在另一實施例中，固定相包含金屬螯合樹脂。在金屬螯合物色譜法中，金屬離子(諸如Zn"、C^+以及NP+)通過螯合物鍵結(jié)參與與位于多肽表面中的電子供體基團可逆地相互作用固定于色譜固定相上。在電子基團供體至少部分以非質(zhì)子化形式存在的pH值下，多肽鍵結(jié)于固定相且接著可借助于具有使電子基團質(zhì)子化的較低pH值的緩沖液洗脫。螯合樹脂的實例包含8-羥基喹啉、水楊酸、二亞乙基三胺、二亞乙基三胺四乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、亞氨基二乙酸以及次氮基三乙酸。在另一實施例中，多肽的分離可通過免疫親和力色譜法進行。免疫親和力或免疫吸附色譜法的原理是以抗原與其抗體的高度特異性相互作用為基礎(chǔ)。免疫親和力色譜法利用抗體或抗體片段作為配位體，所述配位體以保留其結(jié)合能力的方式固定于固定相上。通過改變削弱抗體-抗原相互作用的流動相的條件實現(xiàn)所保留多肽的洗脫。洗脫條件意欲破壞將抗原與抗體保持在一起的離子鍵、疏水鍵以及氫鍵。成功的洗脫條件將視所發(fā)生的特異性抗原-抗體相互作用而定。可產(chǎn)生識別多肽中所存在的非天然氨基酸的抗體。所述抗體可用于親和力色譜法中以在檢測非天然氨基酸多肽的存在的免疫檢定中和使用抗體的其它檢定中從復雜混合物中純化非天然氨基酸多肽或能夠使多肽與支撐物(諸如樹脂)上的其它分子接合?？僧a(chǎn)生識別多肽N末端或C末端或多肽的其它部分中所存在的一個或一個以上非天然氨基酸的抗體。非天然氨基酸多肽可為抗體、抗體片段或抗原結(jié)合多肽或其片段，且通過親和力色譜法用于分離抗原。在一實施例中，多肽的分離可通過疏水性相互作用色譜法進行。多肽可含有親水性與疏水性天然氨基酸和親水性與疏水性非天然氨基酸。根據(jù)多肽的相對疏水性通過其與疏水性化合物可逆性結(jié)合的能力分離多肽。用于緩沖液中的遞減濃度的鹽從管柱洗脫多肽。疏水性化合物的實例包含(但不限于)疏水性脂肪酸鏈、具有正丁基官能團的化合物、具有正辛基官能團的化合物以及具有苯基官能團的化合物。超臨界流體色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過超臨界色譜法(SFC)進行。在SFC中，通過超臨界流體使樣品流經(jīng)分離柱，其中基于個別分析物與管柱中的固定相之間的相互作用的量將混合物分成獨特帶。常規(guī)SFC管柱呈填塞且開口的管狀或毛細管狀。開口管柱的長度為10米到20米或20米以上不等。開口管柱通常具有約0.05毫米至4毫米的內(nèi)徑。填塞管柱的直徑從0.5毫米或0.5毫米以下到4.6毫米不等，其中粒徑在3微米至10微米范圍內(nèi)。填塞管柱含有固定相粘附于其上的小的去活化粒子。管柱通常為不銹鋼。毛細管柱是由熔融硅石制成的具有狹窄內(nèi)徑的開口管柱，其中固定相鍵結(jié)于管柱壁。涂層類似于分配色譜法中所使用的涂層。用于SFC中的超臨界流體的實例包含(但不限于)二氧化碳、乙垸、戊垸、氧化亞氮、二氯二氟甲垸、乙醚、氨以及四氫呋喃。在一些應(yīng)用中，以低濃度(1-5%)引入極性有機調(diào)節(jié)劑(諸如甲醇)。B.沉淀法在一實施例中，肽、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽、多肽的結(jié)合搭配物或受體的分離可通過沉淀法進行。多肽的溶解性與溶液的離子強度和pH值相關(guān)。多肽具有等電點，在該點時其氨基酸側(cè)基的電荷彼此平衡。如果溶液的離子強度極高或極低，那么蛋白質(zhì)將傾向于在其等電點下沉淀。在一實施例中，溶液的離子強度將通過添加鹽而得以增加。沉淀法中所使用的鹽的實例包含(但不限于)硫酸銨和硫酸鈉。在本發(fā)明的任何實施例中，可使用蛋白質(zhì)沉淀的所屬領(lǐng)域中己知的任何鹽。在另一實施例中，將用聚合物迫使多肽離開溶液。通常用于沉淀多肽的聚合物的一個實例為聚乙二醇。在本發(fā)明的任何實施例中，可使用蛋白質(zhì)沉淀的所屬領(lǐng)域中已知的任何聚合物。在一實施例中，通過離心或過濾移除所沉淀的多肽。在一實施例中，通過向溶液中添加鹽使所關(guān)注的肽沉淀后，將使樣品經(jīng)受高鹽濃度的移除。脫鹽方法討論于離子交換色譜法部分中。免疫沉淀在本發(fā)明的一實施例中，多肽的分離可通過免疫沉淀法(immunoprecipitation，IP)進行。IP指的是使用特異性抗體的抗原的小規(guī)模親和力純化。經(jīng)典的免疫沉淀法包括以下步驟1)將特異性抗體與含有抗原的樣品一起培育，2)用固定的蛋白質(zhì)A或G瓊脂糖凝膠(蛋白質(zhì)A或G結(jié)合與其抗原結(jié)合的抗體)捕獲抗體-抗原復合物，3)用緩沖液洗滌凝膠以移除未結(jié)合樣品組分，4)洗脫抗原(和抗體)。在本發(fā)明的一實施例中，使用固定的蛋白質(zhì)A或G凝膠在微離心管中進行含多肽樣品的經(jīng)典IP。各步驟(洗滌和洗脫)后，通過離心使凝膠成團，且移除上清液。所洗脫的樣品通?？倳锌乖c抗體兩者，且所洗脫樣品的還原凝膠電泳會產(chǎn)生抗原帶與重鏈和輕鏈抗體片段帶。從分離的電泳凝膠獲得多肽的方法為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知。75在本發(fā)明的另一實施例中，為避免洗脫抗原被抗體污染，可對經(jīng)典IP方法進行修改，以便使抗體永久地固定且不會與抗原一起洗脫。在一實例中，首先使抗體結(jié)合于蛋白質(zhì)A或G凝膠，且然后使抗體共價交聯(lián)于蛋白質(zhì)A或G。在另一實例中，使抗體與經(jīng)活化親和性支撐物直接偶合。非天然氨基酸多肽可為抗原結(jié)合多肽且可用于免疫沉淀法中。在一實施例中，支撐物質(zhì)為多孔凝膠，諸如交聯(lián)珠粒瓊脂糖或交聯(lián)雙丙烯酰胺與吖內(nèi)酯的共聚物。在本發(fā)明的一實施例中，多肽可通過磁性親和力分離來分離。將含有所關(guān)注分子的樣品與用抗體或其它結(jié)合搭配物衍生化的磁性珠粒一起培育。使用磁場將磁性珠粒牽引出溶液且位于表面上。可小心地移除含有任何未結(jié)合分子的緩沖液。在此項技術(shù)中熟知使用用于分離所關(guān)注分子的磁性珠粒的方案。磁性珠?？山?jīng)衍生化以含有活性基團，所述活性基團包含(但不限于)羧酸或伯胺或特異性親和性分子，諸如抗生蛋白鏈菌素或山羊抗小鼠、抗兔或抗大鼠IgG或蛋白質(zhì)A或G。在另一實施例中，支撐物為微板。C.電泳在本文中的任何實施例中，多肽的分離可通過電泳進行。電泳是在電場中基于分子的大小和離子電荷通過經(jīng)由凝膠的差異遷移模式的離子型分子(諸如多肽)的分離。電泳可在凝膠、毛細管中或芯片上進行。用于電泳的凝膠的實例包含淀粉、丙烯酰胺、瓊脂糖或其組合。凝膠可通過其交聯(lián)、添加洗滌劑、固定酶或抗體(親和力電泳)或底物(酶譜法(zymography))以及pH梯度來修飾。從電泳凝膠獲得多肽的方法為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所已知。毛細管電泳在一實施例中，肽、(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽、多肽的結(jié)合搭配物或受體的分離可通過毛細管電泳法(CE)進行。CE可用于分離復雜親水性分子和高度帶電溶質(zhì)。CE的優(yōu)點包含其使用小樣品(規(guī)模在0.001微升到IO微升范圍內(nèi))、快速分離、易于重現(xiàn)、效率極高，此意謂可同時分離數(shù)百個組分，容易自動化，可定量使用且消耗有限量的試劑。CE技術(shù)通常涉及使用窄膛融合硅石毛細管來分離大分子和小分子的復雜陣列的分離技術(shù)。使用高電壓來基于電荷、大小以及疏水性的差異分離分子。視所使用的毛細管的類型和緩沖液而定，CE可進一步分成以下分離技術(shù)諸如毛細管區(qū)帶電泳(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)、毛細管等電點聚焦(capillaryisoelectricfocusing,CIEF)和毛細管電色譜法(capillaryelectrochromatography，CEC)。毛細管區(qū)帶電泳(CZE)(也稱為無溶液CE(FSCE))為CE的最簡單形式。CZE的分離機理是基于分析物荷質(zhì)比的差異。CZE的基本要求為毛細管整個長度上緩沖溶液的均一性和恒定的磁場強度。分離主要依賴于溶質(zhì)上酸性基團的pH控制解離或溶質(zhì)上堿性官能團的質(zhì)子化。毛細管等電點聚焦(CIEF)允許兩性分子(諸如，多肽)通過電泳在陰極與陽極之間產(chǎn)生的pH梯度下分離。溶質(zhì)會遷移到溶質(zhì)凈電荷為零的點。在此等電點(溶質(zhì)的pl)下，遷移停止且樣品聚焦于致密區(qū)帶中。在CIEF中，一旦溶質(zhì)在其pl下聚焦，則通過壓力或化學措施使區(qū)帶移動穿過檢測器。CEC為傳統(tǒng)液相色譜法(HPLC)與CE之間的混合技術(shù)。本質(zhì)上，向CE毛細管中填塞HPLC填料且在整個填塞毛細管上施加電壓，其產(chǎn)生電滲流(electro-osmoticflow,EOF)。EOF將溶質(zhì)沿毛細管朝向檢測器運輸。在溶質(zhì)朝向檢測器運輸期間，發(fā)生溶質(zhì)的差異分配與電泳遷移，此產(chǎn)生CEC分離。因此，與HPLC與CE相比，使用CEC有可能獲得獨特的分離選擇性。EOF的有利流動分布減小與流動相關(guān)的帶增寬且CEC中通常獲得每米數(shù)十萬塊板的分離效率。CEC也使得有可能使用小直徑填料和實現(xiàn)極高效率。膠束電動毛細管色譜法(Micellarelectrokineticcapillarychromatography,MECC)為允許分離不帶電溶質(zhì)的毛細管電泳法。在這一技術(shù)中，以超過形成膠束的臨界膠束濃度的量將表面活性劑(諸如，十二垸基硫酸鈉)添加至操作緩沖液中。這一類型的陰離子膠束的表面具有大的負電荷，此賦予其大的朝向陽電極的電泳遷移率。然而，大多數(shù)緩沖液展現(xiàn)朝向陰電極的高電滲速率，致使陰離子膠束被帶向陰電極，但以小得多的速率。此形成快速移動的水相和較慢移動的膠束相。當將樣品引入到系統(tǒng)中時，組分自身在膠束的內(nèi)部于水相與烴相之間分布?；蛘?，等速電泳(isotachophoresis，F(xiàn)TP)為通過使用不連續(xù)緩沖液的電泳分離來濃縮樣品的方法。在等速電泳中，使用兩種不同的緩沖液系統(tǒng)以產(chǎn)生分析物分離至其中的區(qū)帶。等速電泳實驗期間，有可能分離陽離子或陰離子，而不是兩者。在ITP中，將大體積的樣品放置在前導電解質(zhì)與末端電解質(zhì)之間。樣品中的分析物根據(jù)其移動性依次堆積于窄的帶中。所述技術(shù)可與毛細管電泳組合使用，其中在樣品注射到毛細管中的位點處使用不連續(xù)電解質(zhì)系統(tǒng)。此外，瞬時等速電泳(transientisotachophoresis，tITP)為通常與毛細管電泳(CE)組合使用的這一技術(shù)的變體。Foret，F(xiàn).等人在"TraceAnalysisofProteinsbyCapillaryZoneElectrophoresiswithOn-ColumnTransientIsotachophoreticPreconcentration".五/e"ra//zo^^1993，14,417-428(1993)中描述兩種用于執(zhí)行tITP的電解質(zhì)配置。一種配置使用通過毛細管連接的兩個貯液器。向毛細管和一個貯液器中填充前導電解質(zhì)(leadingelectrolyte,LE)，而向另一存儲器中填充終端電解質(zhì)(terminatingelectrolyte,TE)。首先將用于分析的樣品注入至填充有LE的毛細管中，且將毛細管的注入端插入含有TE的貯液器中。施加電壓且具有介于LE與TE的移動性中間的移動性的那些樣品組分堆積于尖銳的ITP區(qū)帶中且獲得穩(wěn)定態(tài)濃度。所述區(qū)帶的濃度與LE共離子的濃度相關(guān)，但不與TE的濃度相關(guān)。一旦達到穩(wěn)定狀態(tài)，就用含有LE的忙液器代替含有TE的存儲器。這使得尖銳ITP區(qū)帶去堆積，此允許個別物質(zhì)以區(qū)帶電泳模式移動。Foret，F(xiàn).等人所討論的另一配置使用類似方法，但在各貯液器中使用單一本底電解液(backgro皿delectrolyte,BGE)。BGE共離子的移動性較低，使得其可充當終端離子。用于分析的樣品含有另外的具有高電泳遷移率的共離子，使得其在tITP遷移期間可充當前導區(qū)帶。將樣品注入至毛細管中且施加電壓后，樣品中具有較高移動性的前導離子形成不對稱的前導且尖銳的后置邊界。正好在后置邊界后方，形成傳導不連續(xù)性，且此產(chǎn)生不均勻電場，且因此樣品離子堆積。當遷移前進時，前導區(qū)帶將因電遷移分散而增寬，且較高移動性鹽的濃度將降低。結(jié)果是沿遷移區(qū)帶的電場遞減不同。在前導區(qū)帶的某一濃度下，樣品帶將去堆積且在獨立的速度下以區(qū)帶電泳模式移動。肽的分離可涉及所屬領(lǐng)域中已知的任何程序，諸如毛細管電泳(例如，在毛細管中或芯片上)或色譜法(例如，在毛細管、管柱中或在芯片上)。D.移除污染物的程序在本發(fā)明的一些實施例中，在獲得所關(guān)注的多肽的一級純化程序后，可能需要二級純化步驟來移除污染物。污染物可為抑制劑、干擾物質(zhì)或不適當緩沖劑。在本發(fā)明的一實施例中，污染物的移除將通過從生物分子的復雜混合物中特定純化出其所關(guān)注的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)。在本發(fā)明的另一實施例中，污染物的移除將通過從含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)的樣品中特定移除污染物來實現(xiàn)。舉例來說，可使用固定的蛋白質(zhì)A從樣品中選擇性移除免疫球蛋白，在所述樣品中免疫球蛋白視為污染物。在又一實施例中，可使用過濾器從樣品中移除不想要的組分。實例包含(但不限于)尺寸排阻色譜法和超濾膜，其基于大小和分子量分離分子。在又一實施例中，可使用超離心法從樣品中移除不想要的組分。超離心法可涉及離心樣品，同時用光學系統(tǒng)監(jiān)測粒子的沉積(或無沉積)。在本發(fā)明的另一實施例中，使用電透析從樣品中移除不想要的組分。電透析為在電勢梯度的影響下將離子從一種溶液運輸穿過離子可透膜到另一溶液中的電隔膜過程。因為用于電透析中的膜具有選擇性運輸具有正電荷或負電荷的離子且排斥具有相反電荷的離子的能力，所以電透析適用于電解質(zhì)的濃縮、移除或分離。移除內(nèi)毒素在本發(fā)明的一些實施例中，可能有必要從樣品中移除內(nèi)毒素。內(nèi)毒素為革蘭氏陰性菌(Gram-negativebacteria)的致熱脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組分。因為所述細菌是普遍存在的，所以內(nèi)毒素為生物化學制劑的常見污染物并不驚奇。內(nèi)毒素污染通常以內(nèi)毒素單位(endotoxinunit,EU)量度，其中1EU對應(yīng)于足以產(chǎn)生致熱反應(yīng)的內(nèi)毒素的濃度(通常每千克體重約0.1納克)。在一實施例中，內(nèi)毒素的移除通過超離心法進行。在另一實施例中，內(nèi)毒素的移除通過使用經(jīng)固定的多粘菌素B(polymixinB)進行。降低內(nèi)毒素含量的方法為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所己知且包含(但不限于)使用硅石支撐物、玻璃粉或羥基磷灰石的純化技術(shù)、反相色譜法、親和力色譜法、尺寸排阻色譜法、陰離子交換色譜、疏水性相互作用色譜法，所述方法的組合，以及其類似方法。測量內(nèi)毒素含量的方法為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所已知且包含(但不限于)鱟阿米巴細胞溶胞物(LimulusAmebocyteLysate，LAL)檢定。移除清潔劑在本發(fā)明的一些實施例中，可能有必要移除樣品中的一些或所有洗滌劑。舉例來說，雖然許多水溶性多肽在洗滌劑增溶形式下起作用，但其它多肽可能被洗滌劑增溶作用改性和失活。在一實施例中，洗滌劑移除可通過透析進行。透析有效移除具有高臨界膠束濃度(criticalmicelleconcentrations,CMC)和/或小聚集數(shù)的洗滌劑，諸如N-辛基糖苷。在另一實施例中，從樣品中移除洗滌劑可通過蔗糖密度梯度分離進行。在又一實施例中，洗滌劑可通過尺寸排阻色譜法從樣品中移除。E.重組多肽在本發(fā)明的一實施例中，多肽的分離可使用遺傳工程化技術(shù)來合成雜交蛋白質(zhì)。通過融合所關(guān)注的多肽的編碼序列與對配位體具有高親和性的多肽的編碼序列，可由微生物直接產(chǎn)生具有親和性標簽的雜交蛋白質(zhì)。表達系統(tǒng)的實例為大腸桿菌(&c/zer/c/n'"co//)、枯草桿菌(5ac/腸s由他)、.熒光假單胞菌(i^e油膨wflw,omsc冊)、銅綠假單胞菌(Psewdowowasaen/g/"osa)、惡臭假單胞菌(i^ez^fo膨woy;7w"^f)、酵母、哺乳動物細胞以及昆蟲細胞中的桿狀病毒系統(tǒng)。然后可使用親和性標簽通過親和力色譜法從培養(yǎng)基、細胞溶胞物、提取物、包涵體、宿主細胞的周質(zhì)間隙、宿主細胞的細胞質(zhì)或其它材料回收產(chǎn)物。在本發(fā)明的一實施例中，可通過離心或過濾獲得分泌至介質(zhì)中的非天然氨基酸多肽。所述溶液可適于直接施加至色譜管柱。在本發(fā)明的另一實施例中，提取細胞內(nèi)累積的多肽，之后通過色譜純化。在一實施例中，通過細胞破壞提取多肽。細胞破壞技術(shù)的實例包含機械粉碎機，諸如玻璃珠粒研磨機和高壓均質(zhì)機。在本發(fā)明的另一實施例中，通過細胞滲透提取多肽。滲透劑的實例包含(但不限于)鹽酸胍和曲拉通X-100(TritonX-IOO)。除化學滲透外，可通過酶促溶解滲透細胞。細胞滲透后所獲得的細胞均勻混合物或粗提取物的澄清可通過離心或不同過濾法(諸如微過濾或超濾)進行。已開發(fā)出適用于離子交換色譜法、疏水性相互作用色譜法、親和力色譜法、免疫親和力色譜法以及金屬-螯合物色譜法的純化標簽。舉例來說，具有聚精氨酸標簽的雜交多肽可通過離子交換色譜法純化，具有聚苯丙氨酸標簽的雜交多肽可通過疏水性色譜法分離，具有e-半乳糖苷酶標簽的雜交多肽可通過親和力色譜法分離，具有蛋白質(zhì)A標簽的雜交多肽可通過IgG親和力色譜法分離，具有抗原標簽的雜交多肽可通過免疫親和力色譜法分離且具有聚組氨酸的雜交多肽可通過金屬螯合物色譜法分離。標簽可通過化學或酶促手段移除。在一些實施例中，通過分子內(nèi)反應(yīng)移除標簽。連接子分子可被釋放或可不被釋放。類似地，可使用非天然氨基酸產(chǎn)生純化標簽，且可使用色譜法或其它技術(shù)純化具有所述標簽的雜交多肽。在一實施例中，多肽的末端處包含多個非天然氨基酸。這種具有多個非天然氨基酸的多肽的純化可根據(jù)非天然氨基酸的性質(zhì)通過親和力色譜法或其它方式純化。為使具有多個非天然氨基酸標簽的多肽與另一分子接合，可進行以下程序。使多肽與與非天然氨基酸標簽結(jié)合的樹脂結(jié)合后，進行反應(yīng)以使多肽與另一分子(諸如PEG)接合。作為接合的結(jié)果或在接合完成后，可從樹脂釋放接合產(chǎn)物?？稍谧冃詶l件下進行接合且可在樹脂上進行多肽的再折疊?？墒沟诙肿优c多肽在多肽中所存在的天然或非天然氨基酸處接合?？墒沟诙肿优c多肽在非天然氨基酸標簽中所存在的天然或非天然氨基酸處接合。在另一實施例中，多肽末端所包含的多個非天然氨基酸為金屬結(jié)合氨基酸。這種多肽的純化可使用類似于用于以His標簽標記的蛋白質(zhì)的方法進行。在另一實施例中，多肽包括兩個或兩個以上非天然氨基酸，其中一個或一個以上非天然氨基酸用于使多肽與樹脂結(jié)合且第二個非天然氨基酸用于使多肽與另一分子(包含(但不限于)PEG)接合?？墒褂眠m用于純化技術(shù)的其它物質(zhì)代替樹脂。標簽可通過化學或酶促手段移除。在一些實施例中，通過分子內(nèi)反應(yīng)移除標簽。連接子可被釋放或可不被釋放。在另一實施例中，雜交多肽可在多肽與標簽接合處具有非天然氨基酸?？墒褂眠@一非天然氨基酸通過化學裂解使多肽與標簽分離，例如在使標簽與管柱結(jié)合期間或之后?？墒褂眠@一非天然氨基酸通過酶促裂解或通過分子內(nèi)化學反應(yīng)使多肽與標簽分離。在另一實施例中，使用"前藥"型方法。使非天然氨基酸多肽結(jié)合于純化基質(zhì)，且在包含(但不限于)分子內(nèi)反應(yīng)、曝露于紫外光(對釋放來說為光活化分子)、化學裂解或酶促裂解的事件后部分或整個多肽得以釋放。在另一實施例中，可在多肽部分之間的接合處引入特異性裂解位點。這使得能夠(例如)裂解雜交分子以產(chǎn)生不含親和性標簽的所關(guān)注蛋白質(zhì)。融合序列的移除可通過酶促裂解或化學裂解實現(xiàn)。為使親和性標簽從所關(guān)注的多肽分裂，可將特異性化學裂解或酶促裂解位點工程化于融合蛋白質(zhì)中。融合序列的酶促移除可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所己知的方法實現(xiàn)。如對于所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將顯而易見，用于移除融合序列的酶的選擇將由融合體的特性決定，而反應(yīng)條件將由酶的選擇指定?；瘜W裂解可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的試劑(包含(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶以及其它試劑)實現(xiàn)。裂解試劑的實例包含(但不限于)甲酸、羥胺、膠原酶、因子Xa、腸激酶、腎素、羧基肽酶A以及羧基肽酶B。經(jīng)裂解的hGH多肽可通過所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的方法從經(jīng)裂解的融合序列和裂解試劑中純化。如對于所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將顯而易見，所述方法將由融合序列和多肽的特性和性質(zhì)決定。用于純化的方法可包含(但不限于)尺寸排阻色譜法、疏水性相互作用色譜法、離子交換色譜法或透析或其任何組合。隨著發(fā)展中蛋白質(zhì)和肽治療劑的數(shù)目的增加，對成本不高且不難擴大規(guī)模的高效、經(jīng)濟且大規(guī)模的蛋白質(zhì)純化法存在需求?？墒褂脴渲蛩鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它物質(zhì)分離多肽。圖10展示利用與非天然氨基酸反應(yīng)的樹脂的非天然氨基酸多肽的純化方法的實例。在樹脂上的化學特異性親和性標簽與蛋白質(zhì)中存在的非天然氨基酸之間形成共價鍵。所述鍵在寬范圍的pH值和純化條件下為穩(wěn)定的。分離步驟可以交替模式進行，所述交替模式包含(但不限于)能夠進行大規(guī)模純化的浴模式。樹脂與親和性標簽在物理上和化學上都為穩(wěn)定的，且因此可再使用以降低規(guī)模擴大后的蛋白質(zhì)純化的成本。分離可與多肽與分子(包含(但不限于)PEG)的接合組合進行。這種"一鍋式"方法進一步簡化接合過程且降低蛋白質(zhì)(包含(但不限于)標靶治療蛋白質(zhì))的制造成本(圖11)。可根據(jù)多肽中所存在的非天然氨基酸選擇且使樹脂官能化。圖12展示樹脂選擇和官能化的實例。視多肽中的非天然氨基酸而定，用于純化的樹脂或其它基質(zhì)可用不同官能團官能化。舉例來說，圖13展示使用羥胺樹脂的非天然氨基酸多肽的親和力純化的實例。圖14展示使用醛樹脂的非天然氨基酸多肽的純化的實例。再生純化方法中所使用的基質(zhì)的能力也提供大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點。在一些實施例中，純化過程將多肽中所存在的一個或一個以上非天然氨基酸改為一個或一個以上天然氨基酸。圖15展示從非天然氨基酸前驅(qū)體純化天然蛋白質(zhì)的實例。在非天然氨基酸從純化過程中所使用的樹脂中釋放后，其轉(zhuǎn)化為酪胺酸。圖16展示非天然氨基酸的非限定性實例?？墒褂脙煞N或兩種以上蛋白質(zhì)的組中所存在的非天然氨基酸純化多肽復合物。非天然氨基酸可彼此鍵結(jié)或通過連接子、聚合物或使得能夠純化多肽復合物的另一分子接合?？梢赃@種方式分離的多肽包含(但不限于)多亞單元受體或酶。用于分離復合物的技術(shù)可使用一種或一種以上多肽中所存在的一個或一個以上另外的非天然氨基酸。用于分離大蛋白質(zhì)的技術(shù)為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所已知。多肽復合物的解離可使用一種或一種以上多肽中所存在的一個或一個以上非天然氨基酸進行。可使一個或一個以上非天然氨基酸與另一具有使得復合物中的多肽分離的官能團的分子反應(yīng)。在一些實施例中，多肽可因涉及多肽中所存在的一個或一個以上非天然氨基酸的非共價相互作用而形成復合物。在一些實施例中，歸因于多肽中所存在的一個或一個以上非天然氨基酸，可使用電/化學相互作用(諸如電場或磁場)純化多肽。在其它實施例中，可使用非天然氨基酸多肽實現(xiàn)單細胞純化或分離。XII.文庫篩檢1.高通量篩檢用于本文中所揭露的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的篩檢過程的技術(shù)方法包含(但不限于)基于多孔板的篩檢系統(tǒng)、基于細胞的篩檢系統(tǒng)、基于微流體的篩檢系統(tǒng)以及以固相合成藥物組分篩檢可溶性標靶。自動多孔格式為成熟的高通量篩檢系統(tǒng)。廣泛使用自動96孔板基篩檢系統(tǒng)?？芍苽浠诎宓暮Y檢系統(tǒng)以進一步減小反應(yīng)孔的體積，從而增加每板的孔密度。本發(fā)明中也可使用其它類型的高通量檢定，諸如微型化細胞基檢定。微型化細胞基檢定歸因于其活體內(nèi)性質(zhì)具有產(chǎn)生高質(zhì)量和準確性的篩檢數(shù)據(jù)的潛能。在活體外反應(yīng)中在溶液中測量的微流體基篩檢系統(tǒng)使用十微米到數(shù)百微米寬的通道。微泵、電滲流、整合式閥門以及混合裝置控制液體通過通道網(wǎng)絡(luò)的運動。用于篩檢的文庫可分為(僅舉例來說)基于通用篩檢或模板的文庫，諸如具有常見雜環(huán)晶格的組；目標選擇，諸如基于機制的選擇，例如激酶調(diào)節(jié)劑、GPCR配位體、抗感染劑、鉀通道調(diào)節(jié)劑以及蛋白酶抑制劑；優(yōu)先結(jié)構(gòu)，諸如含有化學基元的化合物，與其它結(jié)構(gòu)相比，其更通常與較高生物活性相關(guān)；多樣性，諸如預先選自具有最大化學82多樣性的可用庫存的化合物；植物提取物；天然產(chǎn)物/天然產(chǎn)物來源的產(chǎn)物等。A.化學文庫組合化學文庫為參與新化合物先導物的產(chǎn)生的方式。組合化學文庫為由化學合成或生物合成通過組合大量化學"基本組分(buildingblock)"(諸如試劑)產(chǎn)生的多樣性化合物的集合。通過化學基本組分的所述組合混合可合成數(shù)百萬種化合物。如Lipinski"5規(guī)則(ruleoffive)"需求中所述，H鍵供體和接受體的LogP、分子量、數(shù)目有助于確定類藥特征的強有力候選物。Lipinski"5規(guī)則"要求化合物具有以下性質(zhì)氫鍵供體為5個或5個以下；分子量小于或等于500Da;所計算出的LogP小于或等于5;以及氫鍵接受體為10個或10個以下。與通過組合化學和/或高通量合成法獲得的化合物文庫聯(lián)合的高通量篩檢技術(shù)可用于快速鑒別且優(yōu)化如本文中所揭露的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的配位體。有機化合物的化學多樣性文庫包含(但不限于)苯并二氮呼；多變體(diversomer),諸如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮呼以及小化合物文庫的類似有機合成；寡聚文庫，諸如肽、N-垸基甘氨酸、聚氨基甲酸酯以及聚脲；寡聚氨基甲酸酯和/或膦酸二肽酯；碳水化合物文庫；手性化合物文庫以及小有機分子文庫。已通過固相法合成多種雜環(huán)化合物文庫。所述化合物包含(僅舉例來說)苯并二氮呼、吡咯烷、乙內(nèi)酰脲、1,4-二氫吡啶、異喹啉酮、二酮哌嗪、苯甲基哌嗪、喹諾酮、二氫和四氫異喹啉酮、4-噻唑烷酮、e-內(nèi)酰胺、苯并異噻唑酮、吡咯以及咪唑。無機化合物的組合文庫包含(但不限于)(a)金屬和主族元素的氧化物，包含過渡金屬氧化物，諸如氧化鋯、二氧化鈦、氧化錳，稀土氧化物，諸如二氧化鈰和氧化鑭；二元、三元和三元以上復合固態(tài)氧化物以及陶瓷相；氧化鋁、二氧化硅、鋁硅酸鹽以及鋁磷酸鹽的各種形式；(b)鋁硅酸鹽和硅酸鹽沸石的天然和合成形式，諸如ZSM-5、e、沸石Y以及鎂堿沸石，分子篩的各種形式，諸如鋁磷酸鹽和鈦硅酸鹽；天然或合成粘土以及相關(guān)礦物質(zhì)，諸如高嶺土、硅鎂土、滑石、蒙脫石以及Laponite;(c)非氧化物陶瓷，諸如金屬碳化物和氮化物；(d)碳的各種形式，諸如活性碳、碳分子篩、石墨、富勒烯(fullerene)、納米碳管以及碳黑；(e)各種有機聚合物、寡聚物或樹脂，諸如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酰胺、鹵代烴聚合物、聚酯等；(f)金屬，諸如沉積、混合或交換于任何支撐物(諸如以上(a)-(e)中所述的任何物質(zhì))中的貴金屬和/或過渡金屬。所述相的實例包含Pt/氧化鋁、Pd/氧化鋁以及Cu-ZSM-5。B.生物文庫使用微生物的肽文庫免疫系統(tǒng)的抗體和免疫細胞受體為代表性生物文庫。在免疫系統(tǒng)中，所有文庫設(shè)計、合成以及優(yōu)化的過程都是由有機體自身控制的。僅抗原和形成胚胎因子的遺傳信息的結(jié)構(gòu)為外部條件，但其余由內(nèi)在因素自發(fā)控制。因為免疫系統(tǒng)使用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)文庫，所以其是使用氨基酸作為基本因子的文庫。因為由氨基酸形成的肽或蛋白質(zhì)是通過翻譯遺傳信息所合成的第一產(chǎn)物，通過遺傳工程技術(shù)，可通過將經(jīng)修飾遺傳信息插入如細菌或病毒的微生物中容易地獲得所需序列的蛋白質(zhì)。微生物文庫合成具有數(shù)個優(yōu)點。有可能克隆微生物以每種微生物僅產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)，且即使僅獲得一個細胞，但克隆的數(shù)目可通過細胞增殖容易地增加。使用微生物的另一優(yōu)點在于當存在足夠供應(yīng)時，其可自我繁殖。合成產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)序列的DNA鏈后，需要時通過酶來合成其互補鏈。對用于在微生物中適當復制且翻譯的所合成的DNA來說，需要用載體包裝且插入微生物中。下一步是使蛋白質(zhì)表達于微生物表面上且尋找所需蛋白質(zhì)。為制造文庫，需要各種遺傳信息?？墒褂锰囟ㄓ袡C體的隨機DNA合成或切割cDNA或整個基因組DNA?？尚揎棶a(chǎn)生特定蛋白質(zhì)的DNA序列的部分以制造突變型蛋白質(zhì)文庫?？紤]到微生物培育的體積限制和表達速率，可制造109(十億)種文庫。與106至107種合成文庫相比，此為一個巨大的數(shù)目。5單元肽的數(shù)目是205(320萬)，6單元肽的數(shù)目是6400萬，且7單元肽的數(shù)目超過十億。因此，如果改變超過7個氨基酸，那么制造出并非含有所有可能的組合的不完整文庫。對長蛋白質(zhì)來說，可獨立選擇7個不同氨基酸并替換。當隨機合成DNA時，DNA代碼可重復且指定同一氨基酸，且產(chǎn)生頻率改變。因此，為產(chǎn)生所有可能的組合，需要更多數(shù)量的克隆。線性組合生物文庫(諸如多肽文庫)是通過以任何可能的方式組合一組化學基本組分(稱為氨基酸)達給定的化合物長度(即，多肽化合物中的氨基酸的數(shù)目)來形成。蛋白質(zhì)可為蛋白質(zhì)家族的成員，所述蛋白質(zhì)家族諸如受體家族(實例生長因子受體、兒茶酚胺受體、氨基酸衍生物受體、細胞激素受體、凝集素)、配位體家族(實例細胞激素、絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin))、酶家族(實例蛋白酶、激酶、磷酸酶、類rasGTP酶、水解酶)、轉(zhuǎn)錄因子(實例類固醇激素受體、熱休克轉(zhuǎn)錄因子、鋅指、白胺酸拉鏈、同源異型結(jié)構(gòu)域)、HIV蛋白酶或丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶以及抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)ab)。其它實例諸如類肽、所編碼的肽、隨機生物寡聚物、二肽、插烯多肽、具有0D葡萄糖支架的非肽擬肽、抗體文庫以及肽核酸文庫。噬菌體文庫其為許多蛋白質(zhì)文庫法中的一種。噬菌體生活在細菌宿主中且為一種具有遺傳物質(zhì)和衣殼的病毒。M13和入病毒最著名。M13為細長病毒，且因其具有小的基因組大小而可容易地制造出眾多文庫。與其它病毒不同，其可來到宿主細胞外部而不對宿主細胞產(chǎn)生損傷或抑制宿主細胞生長。己知M13在宿主細胞中擴增其遺傳信息且當排出時穿戴上衣殼。其產(chǎn)生IO種蛋白質(zhì)且其中pvin和piii衣殼常用于文庫合成。pvm蛋白質(zhì)包裹周身且具有約50個氨基酸。通常每個病毒表達2700個。因為其氨基端伸出衣殼外部，所以其可經(jīng)修飾以在其上表達不同肽。雖然通常不能表達長肽，但有可能表達6單元肽。因為同時表達大量相同文庫分子，所以盡管其尺寸相對較短，但其適于與各種配位體的反應(yīng)。pm蛋白質(zhì)表達于病毒末端，且通常表達3至5個具有406個氨基酸的蛋白質(zhì)。其可表達非常大的蛋白質(zhì)，從而其用于整個蛋白質(zhì)或抗體分子文庫。正?？贵w使用Fab、抗原識別區(qū)或Fvs鏈。噬菌體文庫和融合瘤為制造抗體的最著名的方法。M13對于制造隨機肽文庫為理想的，且所述病毒足夠穩(wěn)定來沉淀且濃縮，從而可能以l-10微升的體積篩檢109個文庫。與M13不同，A病毒在細胞質(zhì)中使其自身包覆衣殼且當存在足夠數(shù)目時從其宿主細胞釋放出來，而不是在排出時穿戴衣殼。換句話說，如果表達不同蛋白質(zhì)，那么其將很可能以具有適當功能的折疊形狀排出。pV和D蛋白質(zhì)常用于文庫合成。對可表達于噬菌體表面上的蛋白質(zhì)來說，存在隨機肽、天然蛋白質(zhì)片段、突變型特定蛋白質(zhì)文庫以及部分抗體片段，且其用于色譜物質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互反應(yīng)、受體結(jié)合位點搜尋以及藥物發(fā)現(xiàn)。噬菌體呈現(xiàn)為廣泛使用的制造肽文庫的技術(shù)。所述肽文庫適用于篩檢以鑒別具有特定所需活性(諸如與另一多肽或其它分子結(jié)合)的肽。在噬菌體呈現(xiàn)中，使肽文庫與噬菌體蛋白質(zhì)(通常呈現(xiàn)于噬菌體表面上的鞘蛋白)融合。使帶有肽的噬菌體的文庫與經(jīng)固定結(jié)合搭配物(諸如細胞表面或純化蛋白質(zhì))接觸，且隨后分離特定結(jié)合物。噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)和文庫描述于美國專利第5580717號、第5702892號、第5750344號、第5821047號、第5962255號、第6140471號、第6475806號、第5427908號、第5667988號、第5733743號、第5750373號、第5824520號、第6096551號、第6225447號、第6492160號中，其是以引用的方式全部并入本文中。美國專利第5,750,373號(其是以引用的方式全部并入本文中)描述選擇新穎蛋白質(zhì)(諸如生長激素)和對各自受體分子具有改變的結(jié)合性質(zhì)的抗體片段變異體的方法。所述方法包括使編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的基因與絲狀噬菌體M13的基因m鞘蛋白的羧基未端域融合。細菌和酵母文庫不僅具有衣殼的病毒，而且具有細胞壁和細胞膜的細菌也可用于文庫表達?？墒褂酶锾m氏陽性菌(gram-positivebacteria)與革蘭氏陰性菌將蛋白質(zhì)表達于細胞表面上，且通常使用革蘭氏陰性菌大腸桿菌。細菌文庫可尋找與某種抗體強有力結(jié)合的抗原且將其用作疫苗，或其可表達用于分析特定物質(zhì)的診斷抗體或受體文庫。此稱為翻譯修飾，其是在蛋白質(zhì)合成后，通過磷酸化或糖添加來修飾高等動物的蛋白質(zhì)。但原核生物細菌不具有這種功能，且即使合成蛋白質(zhì)時，在大多數(shù)情況下，其因其不良溶解性而沉淀，或失活。因此，使用真核生物釀酒酵母(S.cerevisiae)。盡管釀酒酵母像細菌一樣為單細胞，但其具有翻譯修飾功能，且可制造極類似于原始物質(zhì)的蛋白質(zhì)。與病毒不同，其具有微米尺寸細胞，從而可使用熒光活化細胞分選術(shù)(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)?？蓪⒔?jīng)熒光標記的標耙分子添加到表達于細胞表面上的蛋白質(zhì)的文庫中且流經(jīng)FACS機器的薄壁管。FACS通過熒光色和強度分選處于生活狀態(tài)下的各細胞。有可能篩檢具有不同顏色的不同靶分子，且也有可能分選具有不同強度和選擇性的細胞。另一優(yōu)點為液相篩檢。沒必要分離強烈粘附的分子。使所分選的細胞再次增殖且對其進行再篩檢。酵母表面呈現(xiàn)技術(shù)也廣泛用于產(chǎn)生和呈現(xiàn)肽文庫。酵母表面呈現(xiàn)可與熒光活化細胞分選組合用于選擇呈現(xiàn)所需肽的細胞。酵母表面呈現(xiàn)技術(shù)和文庫描述于美國專利第6083693號、第6406863號、第6410271號、第6232074號、第6410246號、第6610472號中，其是以引用的方式全部并入本文中。細菌表面呈現(xiàn)已以多種形式用于將肽呈現(xiàn)于細胞表面上或周質(zhì)中。多種細菌宿主可用于這一系統(tǒng)中，如多種將所呈現(xiàn)的肽錨定于細胞表面上的多肽錨定域。細菌表面呈現(xiàn)技術(shù)和文庫描述于美國專利第5348867號、第5866344號、第6277588號、第5635182號、第6180341號中，其是以引用的方式全部并入本文中。使用其它活體內(nèi)系統(tǒng)制造多肽文庫且鑒別由氨基酸序列的變化產(chǎn)生的活性的變化，諸如標靶蛋白質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)?；铙w內(nèi)系統(tǒng)的實例包含(但不限于)酵母雙雜交系統(tǒng)(Schneider,S等人，Nat.Biotechnol.,17,170-175(19卯))和二氫葉酸還原酶蛋白質(zhì)片段互補檢定(Pellitier,N丄等人，Nat.Biotechnol.,17,683-6卯，(19卯))，其是以引用的方式并入本文中。生物淘選可使用所合成的微生物文庫尋找以高親和力與特定分子結(jié)合的肽。可將標靶分子(諸如如本文中所揭露的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段)均勻地放置在測試板上?？蓪⑺苽涞奈⑸镂膸焯砑拥桨迳稀H與標耙分子強有力結(jié)合的微生物將保留且其余將留在溶液中。不久，可舍棄未結(jié)合的微生物，且隨后可用適當溶液洗滌弱或偶然結(jié)合的微生物。標靶分子的結(jié)合親和力決定洗滌方法。仍保留的微生物可通過添加低pH值或高濃縮標靶分子分開，且通過再培育擴增數(shù)量。有時，當親和力太強時，可能難以在不殺死細菌的情況下將其分離。如果其為噬菌體，則可直接感染其宿主細胞，而不是分離。因為仍會存在一些偶然結(jié)合的不想要的微生物，所以第一擴增微生物可經(jīng)歷重復篩檢和擴增過程以增加含有活性蛋白質(zhì)的克隆的數(shù)目。最后，在其以低濃度培育后，可分離各克隆，且通?？蛇x擇數(shù)十個克隆且將其用于DNA序列分析。如果來自DNA信息的肽結(jié)構(gòu)可識別且大部分克隆展示一致肽序列，那么此為成功的。然而，因為蛋白質(zhì)的數(shù)種克隆可具有毒性且DNA表達速率可變化，所以可能存在選擇比所需篩檢結(jié)果更快的增殖和充分表達的克隆的可能性。因此，通過測量肽合成和結(jié)合親和力的證實步驟是必要的。微生物蛋白質(zhì)文庫技術(shù)根本上使用生活有機體的自我繁殖能力。g卩，通過擴增(饋給)少量所獲得的候選分子，可增加純度和數(shù)量。核糖體呈現(xiàn)核糖體呈現(xiàn)和mRNA呈現(xiàn)技術(shù)也廣泛用于制造肽文庫。核糖體呈現(xiàn)和mRNA呈現(xiàn)為在核糖體上或通過使用嘌呤霉素(puromycin)使編碼肽的mRNA與所編碼的肽偶合的活體外技術(shù)。核糖體呈現(xiàn)和mRNA呈現(xiàn)技術(shù)和文庫描述于美國專利第6416950號、第6436665號、第6602685號、第6660473號、第6429300號、第6489116號、第6623926號、第6589741號、第6348315號、第6207446號、第6258558號、第6416950號、第6440695號、第6228994號、第6281344號、第6429300號、第6660473號、第5580717號、第5688670號、第6238865號、第6261804號、第6518018號、第6281344號、第6258558號、第6214553號中，其是以引用的方式全部并入本文中。DNA、RNA-文庫DNA擴增技術(shù)PCR的發(fā)展已使得能夠使用核酸作為文庫。因為DNA和RNA由4種單元構(gòu)成，所以10寡聚物具有410(約106-—百萬)種，且20寡聚物文庫可具有約1012種。通過使用自動固相DNA合成器，固定序列中的5'端和3'端且隨機放置A、T、C以及G，各占序列的約25%。當已制成一條鏈時，可將其通過使用酶復制或通過PCR擴增。雖然通常制造且使用約1014-15個分子，但偶爾存在約40個位置(1024種)以供隨機引入，有時其以不完整組的文庫開始。對DNA文庫來說，簡單地使用DNA自身，但對RNA文庫來說，需要T7RNA聚合酶來轉(zhuǎn)錄。所制備的文庫通過標靶分子結(jié)合篩檢加以分選；對DNA來說，通過PCR擴增，且對RNA來說，通過RT-PCR擴增。可使用如本文中所揭露的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段作為標靶分子。重復所擴增文庫的篩檢和擴增直到開始數(shù)目1014—15范圍變窄到數(shù)百個，且隨后分析所獲得的候選分子的序列，且測量各自的結(jié)合親和力。所述所獲得的DNA和RNA稱為適體(aptamer)，且其對蛋白質(zhì)標靶分子展示強親和力。適體在活體內(nèi)抑制標靶分子的功能，但其被活體內(nèi)核酸酶快速破壞。為解決這一問題，文庫的一些部分經(jīng)人工核酸取代以增加對核酸酶的抗性。生物文庫的數(shù)個實例包含(但不限于)生物活性脂質(zhì)文庫；內(nèi)源性大麻素文庫在大麻素(cannabinoid，CB)和辣椒素(vanniloid，VR)受體處具有活性的化合物，其包含各類配位體，例如酰胺、乙醇酰胺、脂氨基酸、?；?Y-氨基丁酸(Acyl-GABA)以及酰基多巴胺(Acyl-d(jpamine)等；已知生物活性文庫，諸如GPCR配位體、第二信使調(diào)節(jié)劑、細胞核受體配位體、肌動蛋白和微管蛋白調(diào)節(jié)劑、激酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、離子通道阻斷劑、基因調(diào)控劑、脂質(zhì)生物合成抑制劑等；離子通道配位體文庫；激酶/磷酸酶抑制劑文庫；天然產(chǎn)物文庫天然產(chǎn)物為化學多樣性的非常卓越的來源且為藥理學活性小分子的任何篩檢程序的理想起點；神經(jīng)傳遞素文庫CNS受體配位體，諸如腎上腺素能藥、多巴胺能藥、血清素能藥(Serotonergics)、鴉片樣物質(zhì)(和o配位體)、膽堿能藥、組織胺能藥(和抑黑素配位體)、離子移變谷氨酸能藥(IonotropicGlutamatergics)、代謝移變谷氨酸能藥(MetabotropicGlutamatergics)、Y-氨基丁酸能藥(GABAergics)以及嘌呤能藥(Purinergics)(和腺苷)等；細胞核受體配位體文庫細胞核受體配位體文庫含有在細胞核受體處結(jié)合的化合物?？砂荏w激動劑和拮抗劑；孤配位體文庫孤配位體文庫含有具有生物活性的化合物，但其蛋白質(zhì)結(jié)合搭配物尚未鑒別出。舉例來說，痕量胺、神經(jīng)傳遞素代謝物、內(nèi)源性e-咔啉、尿中代謝物、煙堿同源物以及D-氨基酸等。2.篩檢方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供鑒別與蛋白質(zhì)結(jié)合或充當?shù)鞍踪|(zhì)的結(jié)合特征或生物活性的調(diào)節(jié)劑的候選藥劑的方法。檢定可以多種方式進行，所述方式包含用已知分子篩檢非天然氨基酸多肽文庫，或反之亦然。在一實施例中，在單個試管中或以小規(guī)模進行所述方法。在另一實施例中，同時多重執(zhí)行所述方法。舉例來說，可在多孔篩檢板中同時對多個檢定混合物執(zhí)行所述方法。因此，在一方面中，本發(fā)明提供高通量篩檢系統(tǒng)。在一實施例中，在檢定相互作用方面，利用熒光或吸光度讀數(shù)來確定活性。僅舉例來說，檢定的其它生物活性為乙?；?、羧化、?；?、磷酸化、脫磷酸化、泛素化、糖基化、脂質(zhì)修飾、ADP核糖基化、生物可用性以及半衰期。存在許多所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的也可用于在篩檢檢定中檢測非天然氨基酸多肽與另一分子之間的相互作用的方法。所述方法可包含(僅舉例來說)熒光結(jié)合-結(jié)合檢定、熱轉(zhuǎn)移檢定、電泳遷移率轉(zhuǎn)移檢定、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合檢定、生物化學篩檢檢定、免疫檢定(即，免疫沉淀法)和基于細胞的檢定(即雙或三雜交篩檢、GST釣餌(GSTpulldown)、TAP-TAG系統(tǒng))、表達檢定、蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合檢定、功能檢定(磷酸化檢定等)以及其類似方法。例如參看美國專利第6,495,337號，其是以引用的方式并入本文中。其它方法也可包含蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)，所述系統(tǒng)可篩檢有助于進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相免疫檢定的酶、受體蛋白質(zhì)或抗體(MacBeath和Schreiber,Sc/e"ce2000289:1760-1763)。另一實施例可涉及通過對DNA和已知與非天然氨基酸多肽相互作用的其它蛋白質(zhì)使用熒光染色且使用熒光顯微術(shù)產(chǎn)生的圖片來測量細胞特性的變化探測細胞生理學來繪示可在引入功能性非天然氨基酸多肽的完整細胞中起作用的藥物(Mayer,T.U.，Kapoor,T.M.,Haggarty,S.J.，King,R.W"Schreiber，S丄.，Mitchison，T丄(1999).Scze"ce.篇，971-4)。具體來說，存在眾多可進行測試配位體與非天然氨基酸多肽結(jié)合的檢測(且因此進行非天然氨基酸多肽的配位體的鑒別)的方法。適用的方法為可區(qū)別折疊非天然氨基酸多肽與展開的非天然氨基酸多肽的那些方法。僅舉例來說，如下所述的方法為一些可進行此操作的方法。在各種情況下，在已度過足以使非天然氨基酸多肽與其配位體結(jié)合的時間后，對測試組合(測試配位體-非天然氨基酸多肽組合)執(zhí)行所述檢測方法，且對對照組合(其與測試組合相同，其中例外為不存在測試配位體)執(zhí)行所述檢測方法。A.確定折疊非天然氨基酸多肽的存在的方法在本發(fā)明方法中，可將測試配位體與非天然氨基酸多肽組合，其中所述多肽的配位體(即，結(jié)合非天然氨基酸多肽的因子)正待鑒別。所得組合為測試配位體-非天然氨基酸多肽組合或測試組合。測試配位體通常以相對于非天然氨基酸多肽過量的摩爾量存在。本發(fā)明方法可以溶液形式進行，或在所述方法的一些實施例中，非天然氨基酸多肽可存在于固相上(例如，通過連接子共價鍵聯(lián)或以其他方式共價鍵聯(lián)于珠粒)。在適于使非天然氨基酸多肽與配位體結(jié)合的條件(例如，溫度、pH值、鹽濃度、時間)下，使測試配位體與非天然氨基酸多肽組合。另外，對可逆展開的非天然氨基酸多肽來說，測試配位體與非天然氨基酸多肽組合的條件通常為使得在不存在測試配位體的情況下，實質(zhì)比例的非天然氨基酸多肽以展開形式存在的條件，但所述比例可根據(jù)所使用的檢測方法而變化。在不可逆展開的非天然氨基酸多肽的情況下，條件通常為使得在不存在配位體的情況下，非天然氨基酸多肽以實質(zhì)速率展開的條件。所述條件經(jīng)選擇以確保非天然氨基酸多肽展開到適當程度；因此可方便地測量所觀察到的信號(例如，通過蛋白酶消化；與抗體、伴侶蛋白(chaperonin)或表面的結(jié)合)。如果太少的非天然氨基酸多肽展開，那么所觀察到的信號將以太低而不能方便地測量的程度或速率出現(xiàn)。對所評估的各測試配位體-非天然氨基酸多肽組合來說，將使用已知方法憑經(jīng)驗確定執(zhí)行本發(fā)明方法的條件。所述條件包含反應(yīng)溫度和所使用的離液劑或變性劑。執(zhí)行所述方法的溫度由正使用的非天然氨基酸多肽確定且可使用已知方法憑經(jīng)驗確定。為調(diào)節(jié)或優(yōu)化展開非天然氨基酸多肽的比例，對一些非天然氨基酸多肽來說，可能需要變性條件。所述變性條件89可包含使用高溫、向培育混合物中添加蛋白質(zhì)變性劑(例如，脲、胍)或使用兩者。另外，可通過工程化非天然氨基酸多肽中的不穩(wěn)定或穩(wěn)定氨基酸取代來調(diào)節(jié)一些非天然氨基酸多肽的穩(wěn)定性。將測試配位體與非天然氨基酸多肽組合，維持在適當條件下且歷時足以使非天然氨基酸多肽與配位體結(jié)合的時間。非天然氨基酸多肽與配位體結(jié)合所需的時間將視測試配位體、非天然氨基酸多肽以及所使用的其它條件而變化。在一些情況下，結(jié)合會即刻發(fā)生(例如，大體上與測試配位體與非天然氨基酸多肽的組合同時發(fā)生)，而在其他情況下，將所得測試配位體-非天然氨基酸多肽組合在檢測結(jié)合之前維持較長時間。在不可逆展開的非天然氨基酸多肽的情況下，展開速率也須考慮確定結(jié)合測試配位體的適當時間。以以下數(shù)種方式中的一種評估測試配位體與非天然氨基酸多肽的結(jié)合通過確定折疊非天然氨基酸多肽存在于測試配位體-非天然氨基酸多肽組合中的程度；通過確定展開非天然氨基酸多肽存在于測試配位體-非天然氨基酸多肽組合中的程度或通過確定組合中折疊非天然氨基酸多肽與展開非天然氨基酸多肽的比率。即，在存在測試配位體的情況下和不存在測試配位體的情況下，測定折疊非天然氨基酸多肽的量、展開非天然氨基酸多肽的量之間的差異或折疊非天然氨基酸多肽與展開非天然氨基酸多肽的比率。如果測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽(即，如果測試配位體為非天然氨基酸多肽的配位體)，那么與不存在結(jié)合非天然氨基酸多肽的測試配位體的情況相比，會存在較多折疊非天然氨基酸多肽和較少展開非天然氨基酸多肽(且因此，較高的折疊與展開非天然氨基酸多肽的比率和較低的展開與折疊非天然氨基酸多肽的比率)。不必測定折疊和展開非天然氨基酸多肽的數(shù)量或比例。僅需知道，在存在和不存在配位體的情況下，折疊或展開蛋白質(zhì)的量存在差異(兩種形式平衡時的變化)或展開速率的變化。這一差異可通過比較折疊和/或展開非天然氨基酸多肽存在于測試組合(測試配位體-非天然氨基酸多肽組合)中的程度與其存在于對照組合中(不存在測試配位體情況下的非天然氨基酸多肽)的程度來確定?；蛘?，對可逆展開來說，在不存在測試配位體的情況下，可通過測定其最初(例如，在向非天然氨基酸多肽溶液或固體支撐物結(jié)合測試蛋白質(zhì)中添加測試配位體之前)和隨后在適于發(fā)生非天然氨基酸多肽-配位體結(jié)合的條件下測試配位體與非天然氨基酸多肽組合后的出現(xiàn)率來評估兩種形式出現(xiàn)的程度的差異。在任一種情況下，可使用多種如下所述的已知方法進行非天然氨基酸多肽的兩種形式的測定。通過本發(fā)明方法展示結(jié)合非天然氨基酸多肽的測試配位體稱為非天然氨基酸多肽的配位體。1.使用蛋白質(zhì)水解確定配位體結(jié)合在本發(fā)明方法的一實施例中，通過使用蛋白質(zhì)水解檢測測試配位體與非天然氨基酸多肽的結(jié)合。在這一實施例中，使優(yōu)先作用于展開非天然氨基酸多肽的蛋白酶與測試配位體-非天然氨基酸多肽組合(測試組合)加以組合，且在適當培育期后，使用下文詳細描述的方法中的一種檢定所得測試組合-蛋白酶混合物以測定在存在和不存在測試配位體的情況下，完整或降解非天然氨基酸多肽之間的差異。對測試配位體-非天然氨基酸多肽組合和對照組合執(zhí)行相同檢定且比較兩個檢定的結(jié)果。與對照組合相比，測試組合中的較多完整蛋白質(zhì)或較少降解蛋白質(zhì)表明測試配位體已結(jié)合非天然氨基酸多肽，且因此表明測試配位體為非天然氨基酸多肽的配位體。類似地，與對照相比，測試組合中較高的完整非天然氨基酸多肽與降解蛋白質(zhì)的比率表明測試配位體為非天然氨基酸多肽的配位體。在這一實施例中可使用多種蛋白酶，諸如胰蛋白酶、糜蛋白酶、V8蛋白酶、彈性蛋白酶、羧基肽酶、蛋白酶K、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)以及枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)。僅需在所選擇的培育條件下，所使用的蛋白酶能夠作用于所使用的非天然氨基酸多肽(水解其肽鍵)且這一作用優(yōu)先針對蛋白質(zhì)的展開形式。為避免被直接抑制蛋白酶的標靶配位體干擾，可同時或在并行檢定中使用一種以上蛋白酶。為有效消化肽鍵，肽底物(非天然氨基酸多肽)須到達所選蛋白酶的酶活性位點。因為折疊蛋白質(zhì)分子中的原子緊密壓實，所以當?shù)鞍踪|(zhì)處于折疊狀態(tài)時，大部分易受影響的肽鍵在空間上被阻斷進入蛋白酶活性位點。在展開狀態(tài)時，肽鍵暴露較多且因此相對較易受蛋白酶作用。因此，添加結(jié)合折疊非天然氨基酸多肽的測試配位體，從而使其穩(wěn)定為蛋白酶抗性形式，這改變蛋白質(zhì)水解的速率。因此，通過將測試配位體與非天然氨基酸多肽一起培育，添加蛋白酶以優(yōu)先降解展開蛋白質(zhì)，且隨后使用檢定以定量完整或降解非天然氨基酸多肽，有可能探知測試配位體是否結(jié)合非天然氨基酸多肽，且因此探知其是否為非天然氨基酸多肽的配位體，從而指示其在治療上潛在適用?；蛘撸鞍酌缚蔀槲醇兓虿糠旨兓姆翘烊话被岫嚯臉悠匪鶅?nèi)在的。2.通過檢測表面結(jié)合確定配位體結(jié)合在本發(fā)明方法的另一實施例中，利用展開蛋白質(zhì)粘附于表面的傾向。這一實施例依賴于折疊蛋白質(zhì)以特定三維排列保持且因此不同于其展開對應(yīng)物而結(jié)合表面的事實。如果測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽(即，其為非天然氨基酸多肽的配位體)，那么其將使非天然氨基酸多肽的折疊形式穩(wěn)定。因此，測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽的能力可通過評估在存在和不存在測試配位體的情況下非天然氨基酸多肽結(jié)合于適當固體表面的程度來測定。出于此目的，可使用下文詳細描述的方法。在這一實施例中，將非天然氨基酸多肽、測試配位體以及優(yōu)先結(jié)合展開蛋白質(zhì)的表面組合且維持在適于使非天然氨基酸多肽與配位體結(jié)合和使展開非天然氨基酸多肽與表面結(jié)合的條件下。出于此目的，存在眾多合適的表面，包含由多種經(jīng)處理或未經(jīng)處理的塑料構(gòu)造的微量滴定板、經(jīng)處理用于組織培養(yǎng)或高蛋白質(zhì)結(jié)合的板、硝化纖維素過濾器以及PVDF過濾器。如果測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽，那么與可比對照組合相比，測試配位體-非天然氨基酸多肽組合中存在較多折疊非天然氨基酸多肽和較少展開非天然氨基酸多肽。目卩，在存在為非天然氨基酸多肽的配位體的測試配位體的情況下，與不存在非天然氨基酸多肽的配位體的情況相比，較少展開蛋白質(zhì)可用于結(jié)合優(yōu)先結(jié)合展開蛋白質(zhì)的表面。可使用如下所述的方法中的一種進行表面結(jié)合的非天然氨基酸多肽的量或保留在溶液中的非天然氨基酸多肽的量的測定。如果與不存在測試配位體的情況相比，在存在測試配位體的情況下，較多非天然氨基酸多肽未結(jié)合表面(即，如果較多非天然氨基酸多肽存在于溶液中)，那么測試配位體為非天然氨基酸多肽的配位體。與測試配位體不為非天然氨基酸多肽的配位體的情況相比，在測試配位體為非天然氨基酸多肽的配位體的情況下，溶液中的非天然氨基酸多肽相比表面結(jié)合的非天然氨基酸多肽的比率較高。相反地，與測試配位體不為非天然氨基酸多肽的配位體的情況相比，在測試配位體為非天然氨基酸多肽的配位體的情況下，表面結(jié)合的非天然氨基酸多肽相比溶液中的非天然氨基酸多肽的比率較低。3.使用抗體結(jié)合確定配位體結(jié)合在第三實施例中，通過使用僅針對展開狀態(tài)("變性特異性抗體"或"DS抗體")或僅折疊狀態(tài)("性質(zhì)特異性抗體"或"NS抗體")的特定抗體評估存在折疊與展開非天然氨基酸多肽的程度且因此評估測試配位體與非天然氨基酸多肽的結(jié)合。當非天然氨基酸多肽處于折疊狀態(tài)且通過為非天然氨基酸多肽的配位體的測試配位體穩(wěn)定于這一狀態(tài)時，DS抗體的表觀結(jié)合親和力將降低(Breyer,(1989)"ProductionandCharacterizationofMono-clonalAntibodiestotheN-terminalDomainoftheLambdaRepressor",/扁.C&附.,264(5):13348-13354)且NS抗體的表觀結(jié)合親和力將增強。如果與不存在測試配位體的情況相比，在存在測試配位體的情況下，與非天然氨基酸多肽結(jié)合的DS抗體較少或如果NS抗體結(jié)合較多，那么測試配位體為非天然氨基酸多肽的配位體o存在眾多所屬領(lǐng)域中已知的制造與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的方法(Harlow,E.和D.Lane,ANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratory,1988，其是以引用的方式并入本文中)。為制備對變性狀態(tài)具有特異性的抗體，可用來自在天然狀態(tài)下受到掩蔽的蛋白質(zhì)的區(qū)域的肽使動物免疫。如果蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)未知，那么可制備針對數(shù)種肽的抗體，且隨后可就與變性狀態(tài)的優(yōu)先結(jié)合篩檢抗體?？贵w產(chǎn)生是通過標準技術(shù)進行，諸如用于產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)，其詳細描述于Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.,BocaRaton，F(xiàn)la.(1987)中，其是以引用的方式并入本文中。存在至少三種可利用DS或NS抗體檢測配位體誘導的折疊非天然氨基酸多肽的出現(xiàn)率、展開蛋白質(zhì)的出現(xiàn)率或彼此間的比率的變化的基本方法。在一方法中，諸如在涂布有變性非天然氨基酸多肽或其肽片段的微量滴定板中，在適于使非天然氨基酸多肽與其配位體結(jié)合和使DS抗體與展開非天然氨基酸多肽結(jié)合的條件下培育含有針對展開非天然氨基酸多肽的DS抗體、非天然氨基酸多肽以及測試配位體的測試溶液。以與測試溶液相同的方式處理與測試溶液相同但例外為不含測試配位體的對照溶液。通過比較測試溶液與對照溶液中的結(jié)合于板的抗體的量或保留在溶液中的量，檢測非天然氨基酸多肽折疊的差異。可如下所述測量結(jié)合于板或保留在溶液中的抗體的量。在第二種方法中，在涂布有稱為固相抗體的第二抗體的板中培育含有DS抗體、測試配位體以及非天然氨基酸多肽的測試溶液，所述第二抗體不能與DS抗體同時與非天然氨基酸多肽結(jié)合且其對非天然氨基酸多肽具有特異性，但對折疊狀態(tài)("天然特異性"或"NS抗體")具有特異性或不能區(qū)分天然狀態(tài)與變性狀態(tài)("非區(qū)分"或"ND抗體")。將所得測試組合或溶液維持在適于使非天然氨基酸多肽與非天然氨基酸多肽的配位體結(jié)合和使抗體與其識別(對其具有特異性)的蛋白質(zhì)結(jié)合的條件下。以與測試溶液相同的方式處理與測試溶液相同但例外為不含測試配位體的對照溶液。在兩種溶液中，變性(展開)非天然氨基酸多肽結(jié)合DS抗體且關(guān)于結(jié)合固相抗體受到抑制?？赏ㄟ^測定測試溶液中與固相抗體結(jié)合的非天然氨基酸多肽的量且將其與在不存在測試配位體的情況下非天然氨基酸多肽與固相抗體結(jié)合的程度(其轉(zhuǎn)而反映呈折疊狀態(tài)的非天然氨基酸多肽的量)比較來計量測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽的能力?？赏ㄟ^如下所述的方法檢測通過第二抗體結(jié)合于板或保留在溶液中的非天然氨基酸多肽的量。對溶液中的抗體和于固相上的DS或ND抗體來說，可以可比于NS抗體的方式使用這種方法。在第三種方法中，在容器(諸如已涂布有DS或NS抗體的微量滴定孔)中培育含有非天然氨基酸多肽和測試配位體的測試溶液，且維持在適于使非天然氨基酸多肽與其配位體結(jié)合和使抗體與非天然氨基酸多肽結(jié)合的條件下。或者，抗體可存在于珠粒表面上。通過測定在存在和不存在測試配位體的情況下非天然氨基酸多肽保留在溶液(未結(jié)合于抗體)中或固體表面(結(jié)合于抗體)上的程度或兩者的比率來計量測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽的能力。如果測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽(其為非天然氨基酸多肽的配位體)，那么與對照溶液中結(jié)合于抗體的情況相比，會存在較少結(jié)合于DS抗體的非天然氨基酸多肽或較多結(jié)合于NS抗體的非天然氨基酸多肽(即，在DS抗體的情況下，溶液中會有較多非天然氨基酸多肽，而對NS抗體來說，溶液中會較少)。在另一實施例中，抗體可存在于溶液中，且可將非天然氨基酸多肽連接至固相，諸如板表面或珠粒表面。4.使用分子伴侶確定配位體結(jié)合在第四實施例中，使用分子伴侶確定測試配位體與非天然氨基酸多肽的結(jié)合。伴侶為多種結(jié)合展開蛋白質(zhì)作為其正常生理功能的部分的蛋白質(zhì)。其通常涉及裝配寡聚蛋白質(zhì)，確保某些蛋白質(zhì)恰當折疊，促進蛋白質(zhì)定位以及生理應(yīng)力期間阻止蛋白質(zhì)聚集體形成。Hardy,(1991"AKineticPartitioningModelofSelectiveBindingofNormativeProteinsbytheBacterialChaperoneSecB",ScZe"ce251:439-443。所述蛋白質(zhì)具有在不特異性識別確定序列基元的情況下與許多展開或部分變性蛋白質(zhì)相互作用的能力。大腸桿菌中可見的一種分子伴侶為SecB。已證明SecB參與其它無關(guān)蛋白質(zhì)的子集的輸出。競爭實驗已展示SecB與所有所測試的展開蛋白質(zhì)(包含其特定輸出子集外部的蛋白質(zhì))緊密結(jié)合，但似乎不與折疊蛋白質(zhì)相互作用。在這一實施例中，在涂布有分子伴侶的微量滴定板或其它合適表面上在適于使非天然氨基酸多肽與其配位體結(jié)合和使所使用的分子伴侶與展開非天然氨基酸多肽結(jié)合的條件下培育含有測試配位體和標靶的測試溶液。溶液中的展開非天然氨基酸多肽相對于經(jīng)配位體穩(wěn)定的折疊非天然氨基酸多肽將具有較大的結(jié)合分子伴侶覆蓋表面的傾向。因此，可通過使用下文詳述的方法測定保持未結(jié)合的非天然氨基酸多肽的量或結(jié)合于伴侶涂布表面的量確定測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽的能力?；蛘?，可利用與分子伴侶結(jié)合的競爭檢定?？稍谌萜?諸如涂布有變性(展開)非天然氨基酸多肽的微量滴定孔)中在適于使非天然氨基酸多肽與其配位體結(jié)合和使分子伴侶與展開非天然氨基酸多肽結(jié)合的條件下培育含有經(jīng)純化非天然氨基酸多肽、測試配位體以及分子伴侶的測試溶液。以相同方式處理與測試溶液相同但例外為不含測試配位體的對照溶液。溶液中的變性非天然氨基酸多肽將與伴侶蛋白結(jié)合，且因此，抑制其與結(jié)合于容器表面(微量滴定孔表面)的變性非天然氨基酸多肽的結(jié)合。測試配位體與非天然氨基酸多肽的結(jié)合將產(chǎn)生較小量的展開非天然氨基酸多肽，且因此，與不存在測試94配位體的結(jié)合的情況相比，較多伴侶將可用于與固相變性非天然氨基酸多肽結(jié)合。因此，測試配位體的結(jié)合可通過評估測試溶液和對照溶液中的結(jié)合于表面和在溶液中的伴侶且比較所述結(jié)果來確定。與對照溶液中相比，測試溶液中伴侶與固相變性非天然氨基酸多肽的結(jié)合的程度較大表明測試配位體與非天然氨基酸多肽結(jié)合(即，表明鑒別出非天然氨基酸多肽的配位體)。在這一檢定中，通常不以過量提供分子伴侶，從而可測量其結(jié)合的競爭。或者，可在容器(諸如，微量滴定孔)中培育含有非天然氨基酸多肽、測試配位體以及分子伴侶的測試溶液，所述容器表面涂布有抗血清或?qū)φ郫B非天然氨基酸多肽具有特異性(NS抗體)且不能結(jié)合結(jié)合于伴侶的非天然氨基酸多肽的單株抗體。展開非天然氨基酸多肽將結(jié)合溶液中的伴侶且因此抑制結(jié)合固相抗體。通過檢測溶液中或結(jié)合于孔壁的非天然氨基酸多肽且比較適當對照(無測試配位體的相同組合)中的所述任一者-或兩者的程度，可確定測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽的能力。如果測試配位體為非天然氨基酸多肽的配位體，那么與對照溶液中相比，在測試溶液中將有較多非天然氨基酸多肽與結(jié)合于容器表面的抗血清或單株抗體結(jié)合。相反地，與對照溶液中相比，測試溶液中將存在較少未結(jié)合(溶液中)的非天然氨基酸多肽。測試溶液和對照溶液中的結(jié)合非天然氨基酸多肽、未結(jié)合非天然氨基酸多肽或兩者的比率的檢測和比較表明測試配位體是否為非天然氨基酸多肽的配位體。5.通過測量蛋白質(zhì)聚集確定配位體結(jié)合呈折疊形式的蛋白質(zhì)的比例越高，可用于與僅與折疊狀態(tài)結(jié)合的配位體結(jié)合的蛋白質(zhì)的量越大。因此，如果蛋白質(zhì)具有已知配位體，那么有可能通過添加結(jié)合蛋白質(zhì)上的另一位點的配位體來增加蛋白質(zhì)與已知配位體的結(jié)合。在這一方法中，將已知與非天然氨基酸多肽結(jié)合的配位體固定于固體基板上。然后添加含有非天然氨基酸多肽的溶液以及測試配位體或配位體。在不存在測試配位體的情況下，相對于相同檢定，與固定配位體結(jié)合的非天然氨基酸多肽的量的增加表明測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽。可通過使用下文概述的檢測方法對固體基板取樣或?qū)θ芤喝觼碓u估結(jié)合于固體基板的非天然氨基酸多肽的量。6.通過測量蛋白質(zhì)聚集確定配位體結(jié)合對不可逆展開的蛋白質(zhì)來說，展開蛋白質(zhì)通常形成不可溶聚集體。蛋白質(zhì)聚集的程度可通過下文概述的諸如光散射、離心以及過濾的技術(shù)測量。在這一方法中，培育非天然氨基酸多肽和測試配位體，且隨時間或在固定培育時間后，測量蛋白質(zhì)聚集的量。比較測試混合物中的蛋白質(zhì)聚集的程度與不存在測試配位體的情況下對照檢定的相同測量。如果測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽，那么與不存在測試配位體的情況相比，非天然氨基酸多肽展開的速率將較低。對隨時間的測量來說，與測試配位體不為非天然氨基酸多肽的配位體的情況相比，在測試配位體為非天然氨基酸多肽的配位體的情況下，展開蛋白質(zhì)且因此聚集蛋白質(zhì)的增長速率將較低。對固定時間的測量來說，與測試配位體不為非天然氨基酸多肽的配位體的情況相比，在測試配位體為非天然氨基酸多肽的配位體的情況下，會存在較少的展開蛋白質(zhì)且因此存在較少聚集蛋白質(zhì)。因此，測試配位體結(jié)合非天然氨基酸多肽的能力可通過評估在存在和不存在測試配位體的情況下蛋白質(zhì)聚集的程度來確定。XIV.蛋白質(zhì)檢測技術(shù)在檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的本發(fā)明方法中可使用所屬領(lǐng)域中已知的檢測蛋白質(zhì)、小肽或游離氨基酸存在與否的方法。所使用的方法可由待檢測的產(chǎn)物(蛋白質(zhì)、肽、游離氨基酸)決定。舉例來說，可使用檢測蛋白質(zhì)大小的技術(shù)測定非天然氨基酸多肽的蛋白質(zhì)水解降解的程度。放射性標記、熒光標記以及酶鍵聯(lián)標記可通過測量放射性、熒光或酶活性來檢測在溶液中或基板上的存在與否。免疫學方法可檢測已知非天然氨基酸多肽在溶液中或底物上的存在與否，諸如通過對所述蛋白質(zhì)具有特異性的抗體的結(jié)合。圖la呈示多種可用于檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。A.熒光顯微術(shù)本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的熒光顯微術(shù)。熒光顯微術(shù)為使得所觀察的結(jié)構(gòu)的分子組成能夠通過使用具有高化學特異性的熒光標記探針得以鑒別的廣泛使用的顯微技術(shù)。所述探針可為包括非天然氨基酸的抗體、抗體片段或抗原結(jié)合多肽。熒光顯微術(shù)可用于研究固定試樣。對可以合理豐度提取和純化的蛋白質(zhì)來說，可使熒光團接合于蛋白質(zhì)且將接合物引入細胞中?？墒篃晒鈭F接合于多肽中的非天然氨基酸。假定熒光類似物具有類似天然蛋白質(zhì)的特性且因此可用于揭露這一蛋白質(zhì)在細胞中的分布和特性。蛋白質(zhì)固有熒光衰減和其熒光各向異性、碰撞猝滅以及共振能量傳遞的相關(guān)觀察結(jié)果連同NMR、紅外光譜學、圓二色譜以及其它技術(shù)為蛋白質(zhì)檢測的重要技術(shù)。測量熒光衰減使得能夠直接觀察蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)變化的動力學。此外，當使用外在熒光探針時，從氨基酸酪氨酸和色氨酸發(fā)射的蛋白質(zhì)的天然熒光的激發(fā)消除局部環(huán)境擾動的可能性。在使用熒光探針用于生物研究中的一個發(fā)展為使用天然熒光蛋白質(zhì)作為熒光探針。二十世紀九十年代后期發(fā)現(xiàn)天然存在的染料，所謂的熒光蛋白質(zhì)(GFP、YFP、CFP、TOPAS、GFT、RFP)(Clonetech,USA)。所述染料以其對試樣的影響較低而著名。因此，其尤其適于在活制備物中標記細胞區(qū)域。維多利亞多管水母(jellyfishAequoreavictoria)產(chǎn)生天然熒光蛋白質(zhì)，稱為綠色熒光蛋白質(zhì)(greenfluorescentprotein,GFP)。所述熒光探針與標靶蛋白質(zhì)的融合使得能夠通過熒光顯微術(shù)觀測和通過流式細胞術(shù)定量。因為GFP標簽為遺傳編碼的且不需要輔助因子，所以其可用于分析活細胞和完整有機體中的蛋白質(zhì)表達和定位。這一蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)克隆且可轉(zhuǎn)染至其它有機體中。GFP標簽可用于定位有機體中特定基因所表達的區(qū)域或用于鑒別特定蛋白質(zhì)的位置。在許多情況下，所述嵌合蛋白質(zhì)保持其原始功能。因此，通常有可能(例如)使用這一技術(shù)觀測蛋白質(zhì)(包含(但不限于)細胞骨架蛋白質(zhì))的細胞內(nèi)分布。用GFP可觀察到未染色或未固定的樣品。目前存在數(shù)種GFP變異體，其提供光譜上可分離的發(fā)射顏色。使GFP突變已產(chǎn)生藍色、青色和黃色熒光發(fā)射形式?？捎糜跇擞洷景l(fā)明非天然氨基酸肽、多肽、抗體以及抗體片段的熒光蛋白質(zhì)包含(但不限于)綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、青色熒光蛋白質(zhì)(cyanfluorescentprotein,CFP)、紅色熒光蛋白質(zhì)(redfluorescentprotein,RFP)、黃色熒光蛋白質(zhì)(yellowfluorescentprotein,YFF)、增強型GFP(EGFP)、增強型YFP(EYFP)以及其類似物。已通過突變開發(fā)GFP的新穎形式，包含"人類化"GFPDNA，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物已增加在哺乳動物細胞中的合成。(參看Cormack等人，(1996)Gene173，33-38;Haas等人，(1996)CurrentBiology6,315-324;以及Yang等人，(1996)NucleicAcidsResearch24,4592-4593)。一種所述人類化蛋白質(zhì)為"增強型綠色熒光蛋白質(zhì)(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)"?？墒笹FP、GFP的變異體或其它天然存在的染料與非天然氨基酸多肽偶合。GFP可用作生物傳感器，通過以特征方式發(fā)熒光報導離子含量或pH值的結(jié)果。一種可用于自動檢測鋅離子含量的分子為展示為蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank,PDB)登錄號lkys的藍色熒光蛋白質(zhì)。一旦鋅與經(jīng)修飾發(fā)色團結(jié)合，則蛋白質(zhì)就發(fā)射產(chǎn)生可容易檢測的可見信號兩倍亮的熒光。包括非天然氨基酸的其它肽和蛋白質(zhì)生物傳感器的構(gòu)造可展現(xiàn)對其環(huán)境、寡聚狀態(tài)、配位體結(jié)合后的構(gòu)象、結(jié)構(gòu)或直接配位體結(jié)合的變化響應(yīng)的熒光性質(zhì)改變。經(jīng)適當標記的熒光生物分子允許空間上和時間上檢測活細胞內(nèi)部的生化反應(yīng)。例如參看Giuliano,K.A.等人，iev.5/o//2".Aowo/.1995，24:405-434;Day,R.N.Mo/.五m/ocn"o/.1998,12:1410-9;Adams,S.R.等人，iVa^re1991,349:694;Miyawaski,A.等人，A^wre1997，388:882-7;Hahn,K.等人，Atowre1992,359:736;Hahn,K.M.等人，5/o/.19卯，265:20335;以及Richieri,GV.等人，Mo/.Ce〃.to.1999,192:87-94。美國專利第6,951,947號(其是以引用的方式并入本文中)討論檢測環(huán)境變化的生物傳感器和熒光團。目前，所述技術(shù)是由現(xiàn)有探針的新應(yīng)用和新的且具有創(chuàng)新性的探針的設(shè)計和合成驅(qū)動。在不限制本發(fā)明的范疇的情況下，一些探針如下標記熒光的靈敏性和安全性(與放射方法相比)已越來越多地用于特異性標記核酸、蛋白質(zhì)以及其它生物分子。除熒光素外，存在覆蓋整個400納米至820納米范圍的其它熒光標記。僅舉例來說，一些標記包含(但不限于)熒光素和其衍生物、羧基熒光素、羅丹明(Rhodamine)和其衍生物、Atto標記、熒光紅和熒光橙Cy3/Cy5替代物、具有長壽命的鑭系金屬配合物、長波長標記(高達800納米)、DY菁標記、藻膽素蛋白質(zhì)。能夠在一波長下吸收輻射而在較長波長下發(fā)射輻射的熒光分子包含(但不限于)Alexa-532、羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、香豆素、級聯(lián)藍(CascadeBlue)、羅氏黃(LuciferYellow)、P-藻紅素、R-藻紅素、(PE)、PE-Cy5接合物、PE-Cy7接合物、紅613、熒光素、BODIPY-FL、BODIPYTR、BODIPYTMR、Cy3、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明B(LissamineRhodamineB)、PerCP、得克薩斯紅(TexasRed)、Cy5、Cy7、別藻藍蛋白(APC)、TruRed、APC-Cy7接合物、俄勒閃綠(OregonGreen)、四甲基羅丹明、丹磺酰(Dansyl)、丹磺酰氮丙啶、Indo-l、Fura-2、FM1-43、DilC18(3)、羧基-SNARF-l、NBD、Indo-l、Fluo-3、DCFH、DHR、SNARP、Monochlorobimane、鈣黃綠素、N-(7-硝基苯并-2-氧雜-l,3-二唑-4-基)胺(NBD)、苯胺基萘、deproxyl、鄰苯二甲酰胺、氨基pH鄰苯二甲酰胺、二甲基氨基-萘磺酰胺、可比于氟硅酸鈉(prodan)、洛丹(Lordan)或丙烯丹基(Acrylodan)以及其衍生物的探針。香豆素熒光染料包括(例如)氨基甲基香豆素、7-二乙基氨基-3-(4'-(l-馬來酰亞胺基)苯基)-4-甲基香豆素(CPM)以及N-(2-(l-馬來酰亞胺基)乙基)7-二乙基氨基香豆素-3-甲酰胺(MDCC)。其它適用的分子包含那些呈現(xiàn)熒光共振能量傳遞(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)的分子。己知許多所述供體-接受體對且其包含熒光素-羅丹明、香豆素-熒光素或羅丹明等。另一類適用的標記對包含熒光團-猝滅劑對，其中第二基團為減小熒光基團的熒光強度的猝滅劑。一些已知猝滅劑包含丙烯酰胺基團、重原子(諸如碘離子和溴酸根)、氮氧化物自旋標記(諸如TEMPO)等?？墒怪T如所述標記的標記與非天然氨基酸多肽接合。接合于非天然氨基酸多肽的熒光團可在所有時間發(fā)熒光或僅當多肽結(jié)合于標耙時才發(fā)熒光。其它類型的熒光團包含接合物僅舉例來說，一些接合物包含(但不限于)異硫氰酸鹽接合物、抗生蛋白鏈菌素接合物以及生物素接合物?？贵w接合物已廣泛用于追蹤活細胞和整個有機體中的生物分子。其可經(jīng)產(chǎn)生以對幾乎任何抗原決定基具有特異性且因此原則上適用于使許多生物分子成像。包含(但不限于)抗體接合物的接合物可包括非天然氨基酸。酶底物酶底物包含(但不限于)發(fā)熒光底物和發(fā)色底物。微米粒子和納米粒子多種技術(shù)允許制備在大小、基質(zhì)化學、熒光染料類型、熒光強度以及表面官能團方面不同的多種熒光微球。僅舉例來說，一些所使用的熒光染料為-FITC(綠色熒光，激發(fā)/發(fā)射=506/529納米)、羅丹明B(橙色熒光，激發(fā)/發(fā)射=560/584納米)、尼羅藍A(NileBlueA)(紅色熒光，激發(fā)/發(fā)射=636/686納米)。在(例如)生物化學、生物分析以及醫(yī)學領(lǐng)域中，熒光納米粒子為光數(shù)據(jù)存儲與其它技術(shù)應(yīng)用的有前景的手段。現(xiàn)行醫(yī)學和生物熒光成像方法主要以染料標記物為基礎(chǔ)，所述標記物在每分子光發(fā)射以及光學穩(wěn)定性方面受到限制。納米粒子克服那些問題，提供強且穩(wěn)定的熒光。熒光納米粒子已成功用于各種類型的免疫檢定。熒光納米粒子以諸如聚丙烯腈和聚苯乙烯等的不同材料為基礎(chǔ)。分子轉(zhuǎn)子熒光分子轉(zhuǎn)子是只要轉(zhuǎn)動受到限制即變得發(fā)熒光的微環(huán)境限制傳感器。熒光強度的變化通過限制繞熒光團的供體-接受體鍵的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)弛豫引起。分子限制的實例包含(但不限于)染料增加(聚集)、與抗體結(jié)合或捕獲于肌動蛋白聚合中。IEF標記物等電點聚焦(IsoelectricFocusing,IEF)為分離兩性電解質(zhì)(主要為蛋白質(zhì))的強有力分析手段。為確保分析的高效能，需要pl標準物(pl標記物)。利用熒光IEF-標記物的IEF-凝膠電泳的優(yōu)點是直接觀察梯度形成的可能性。熒光IEF-標記物也可在280納米(20'C)下通過紫外線吸收檢測。任何或所有所述熒光探針可用于檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段。圖9呈示通過在并入多肽中的非天然氨基酸的羰基與分子的羥胺之間形成肟來位點特異性地連接至蛋白質(zhì)的分子的非限定性實例。所展示的分子為熒光團、生物素以及螯合劑。生物正交化學報導體小分子具有通向細胞內(nèi)和血管外區(qū)隔的較佳通過性。其作為成像劑的用途需要使小探針選擇性靶向所需生物分子的方法。親核官能團存在于大部分類型的生物聚合物中，此準許用生物素、熒光團以及眾多其它小分子報導體輕易衍生化。已確立的生物接合方案已使所述操作對活體外經(jīng)純化生物聚合物來說價值不高。用標簽標記生物分子的替代策略為摻合遺傳編碼標簽的簡單性與抗體標記的特異性和小分子探針的多功能性。這種方法涉及使用細胞自身的生物合成機構(gòu)將獨特的化學官能團(生物正交化學報導體)并入標靶生物分子中。生物正交化學報導體為可通過與外源傳送探針的高選擇性反應(yīng)在活系統(tǒng)中經(jīng)修飾的非天然的非擾動化學手柄。這種兩步標記法根據(jù)探針的性質(zhì)可用于裝備用于檢測或分離的標靶生物分子。生物正交偶合反應(yīng)的實例包含(但不限于)疊氮化合物與三芳基膦的施陶丁格連接(Staudingerligation)、酮/醛-肼反應(yīng)以及休斯根氏1,3-偶極疊氮化合物-炔烴環(huán)加成(Huisgen's1，3-dipolarazide-alkynecycloaddition)。用空間上不顯著的疊氮基代替大體積熒光標簽可提供更能以不偏方式分布在活細胞、組織或有機體中的探針。同樣，也消除熒光標簽對針對特異性蛋白質(zhì)的探針結(jié)合親和力的可變且通常對抗的效應(yīng)。最后，使用疊氮化合物-炔烴環(huán)加成化學可通過移除對產(chǎn)生和純化大量在結(jié)構(gòu)上多樣的熒光團標記試劑的需要使探針合成簡單化。利用非天然氨基酸多肽的偶合反應(yīng)可提供為熒光標記多肽的替代物的探針。可使用休斯根氏1,3-偶極疊氮化合物-炔烴環(huán)加成來連接其它分子或提供多肽純化或檢測的其它方法。可在固體支撐物上合成肽文庫，且通過使用著色受體，可逐個選擇染色固體支撐物。如果受體不能指示任何顏色，那么可將其結(jié)合抗體染色。因為有可能在顯微鏡或甚至放大鏡下通過鑷子分離固體支撐物，所以所述方法不僅可用于蛋白質(zhì)受體，而且也可用于篩檢合成人工受體的結(jié)合配位體以及篩檢新金屬結(jié)合配位體。這一方法適用于搜尋新前導化合物，因為其使得能夠篩檢大量化合物。然而，根據(jù)染料強度來測定活性可能不精確，且大量固體支撐物可能不能總是逐個處理。因此，需要高通量篩檢(HTS)的自動方法且可使用熒光活化細胞分選器(FluorescenceActivatedCellSorter,FACS)方法。這一機器最初使細胞穿過毛細管且通過檢測其熒光強度分離細胞。可對固體支撐物而不是細胞使用相同方法。因為其為細胞而設(shè)計，所以可操作具有細胞大小的小樹脂，但具有正常大小(50至200皮摩爾)的固體支撐物需要經(jīng)特別改進的機器。也可進行化合物的部分或完全分離。對化合物的部分分離來說，使用時間控制感光分解或在不同條件下裂解數(shù)種官能團。同時，可將固體支撐物分散到軟瓊脂上且通過感光分解分離一些化合物。然后將經(jīng)分離化合物散開在固體支撐物周圍，從而可同時進行篩檢和固體支撐物分離。B.免疫檢定本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的免疫檢定。免疫檢定組合化學和免疫學原理以使得能夠進行科學測試，例如特異性且靈敏檢測所關(guān)注的分析物(非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段)的酶免疫檢定和免疫印跡法。所述檢定的基本原理為抗體-抗原反應(yīng)的特異性。類似于西方印跡法(Westernblot)，對免疫印跡法來說，單一蛋白質(zhì)可由其抗體鑒別?？蛇M行競爭結(jié)合免疫檢定，其中分析物與經(jīng)標記抗原競爭抗體分子的有限池(例如，放射性免疫檢定(radioimmunoassay,EMIT))。免疫檢定可不具競爭性，以使得抗體以過量存在且經(jīng)標記。當分析物抗原增加時，經(jīng)標記抗體-抗原復合物的量也增加(例如，ELISA)。如果抗體通過將抗原注射到實驗動物中產(chǎn)生,則其可為多克隆抗體，或如果抗體通過細胞融合和細胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生，則其可為單克隆抗體。在免疫檢定中，抗體充當分析物抗原的特異性試劑?？乖蔀榉翘烊话被岫嚯?、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段。另一方面，免疫檢定中所使用的抗體或其片段可為非天然氨基酸多肽，且可用于檢測可或可不包括非天然氨基酸的抗原。在不限制本發(fā)明的范疇和內(nèi)容的情況下，免疫檢定的一些類型為(僅舉例來說)放射性免疫檢定(Radioimmunoassay,RIA)和酶免疫檢定，如酶聯(lián)免疫吸附檢定(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、酶倍增免疫檢定(EnzymeMultipliedImmunoassay,EMIT)、微粒酶免疫檢定(MicroparticleEnzymeImmunoassay,MEIA)、發(fā)光免疫檢定(luminescentimmunoassay，LIA)以及熒光免疫檢定(fluorescentimmunoassay,FIA)。所述技術(shù)可用于檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段。用作一次或二次抗體的抗體可經(jīng)放射性同位素(例如，125I)、熒光染料(例如，F(xiàn)ITC)或催化發(fā)熒光或發(fā)光反應(yīng)的酶(例如，HRP或AP)標記。1.酶倍增免疫檢定技術(shù)(EnzymeMultipliedImmunoassayTechnique,EMIT)EMIT為無需分離步驟的競爭結(jié)合免疫檢定。其為一種允許定量未標記蛋白質(zhì)的免疫檢定類型，其中蛋白質(zhì)經(jīng)酶標記且酶-蛋白質(zhì)-抗體復合物經(jīng)酶促失活。2.酶聯(lián)免疫吸附檢定(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的ELISA。酶聯(lián)免疫吸附檢定是以連接于固體支撐物的選擇性抗體以及產(chǎn)生能夠檢測低含量的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)的酶反應(yīng)為基礎(chǔ)。其也稱為酶免疫檢定或EIA。抗原(包含(但不限于)蛋白質(zhì))由針對其(即，對抗體來說，其為抗原)產(chǎn)生的抗體檢測。通常使用單克隆抗體。測試可要求抗體固定于固體表面，諸如試管的內(nèi)表面；且制備與酶偶合的相同抗體。酶為由無色底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶(例如，e-半乳糖苷酶)。測試(例如)是通過用待檢定的抗原溶液(例如，蛋白質(zhì))填充試管來進行。任何存在的抗原分子都可與固定抗體分子結(jié)合。將抗體-酶接合物添加至反應(yīng)混合物中。接合物的抗體部分與先前結(jié)合的任何抗原分子結(jié)合，產(chǎn)生抗體-抗原-抗體"夾心"。洗除任何未結(jié)合接合物后，添加底物溶液。一組時間間隔后，使反應(yīng)停止(例如，通過添加1NNaOH)且在分光光度計中測量由底物與接合于二次抗體的分子的反應(yīng)形成的有色產(chǎn)物的濃度。顏色強度與所結(jié)合抗原的濃度成比例。ELISA也可經(jīng)改適以測量抗體的濃度，在此情況下，將孔涂布適當抗原。添加含有抗體的溶液(例如，血清)。歷時與固定抗原結(jié)合的時間后，添加由針對正測試的抗體的抗體組成的酶接合抗免疫球蛋白。洗除未反應(yīng)試劑后，添加底物。所產(chǎn)生的顏色的強度與所結(jié)合的經(jīng)酶標記抗體的量成比例(且因此與正檢定的抗體的濃度成比例)。3.放射性檢定本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的放射性免疫檢定。放射性免疫檢定具有高靈敏度。使用具有高親和力(例如，K(^10S-10"M—1)的抗體，有可能檢測試管中的幾皮克(10—12克)的抗原?？墒褂梅派湫酝凰貋硌芯可倭炕衔锏幕铙w內(nèi)代謝、分布以及結(jié)合。使用^、12(3、31P、32S、1271的放射性同位素，諸如3H、"C、32P、35S、125I。放射性同位素與非放射性同位素具有幾乎相同的化學性質(zhì)，從而其可容易地轉(zhuǎn)化。同時，因為其輻射能相對較大，所以僅需要極少的量。受體固定法對96孔板格式來說，通過使用抗體或化學方法將受體固定于各孔中，且將放射性標記配位體添加到各孔中以誘導結(jié)合。洗除未結(jié)合配位體，且隨后通過結(jié)合配位體或洗除配位體的放射性的定量分析測定標準物。添加用于篩檢的標靶化合物誘導與受體的競爭結(jié)合反應(yīng)。如果與標準放射性配位體相比，標靶化合物對受體展示較高親和力，那么大部分放射性配位體不與受體結(jié)合且留在溶液中。因此，通過分析結(jié)合放射性配位體(或洗除配位體)的數(shù)量，可容易地指示標靶化合物與受體的親和力。當受體不能固定于96孔板或配位體結(jié)合須在溶液相中進行時，可使用濾膜法。對這種方法來說，在溶液中進行配位體-受體結(jié)合反應(yīng)后，經(jīng)硝化纖維素濾紙過濾反應(yīng)溶液。包含配位體的小分子將穿過濾紙，且僅蛋白質(zhì)受體將留在濾紙上。僅與受體強有力結(jié)合的配位體將留在濾紙上，且所添加化合物的相對親和力可通過標準放射性配位體的定量分析鑒別。這種方法也可用于篩檢蛋白激酶抑制劑。在此情況下，可使用Y-"P-ATP作為磷酸基團供應(yīng)者，且可通過檢査放射性標記蛋白質(zhì)底物來分析酶活性。不反應(yīng)的放射性ATP將被過濾且移除。僅舉例來說，可通過制備放射性抗原與針對所述抗原的抗體的混合物來進行放射性免疫檢定?？蓪⒌庠右氲降鞍踪|(zhì)中的酪氨酸殘基中，通常使用放射性同位素1251或1311?？蓪⒁阎康奈礃擞?"冷")抗原添加到混合物的樣品中。所述抗原競爭抗體的結(jié)合位點。在遞增濃度的未標記抗原下，遞增量的放射性抗原被從抗體分子上置換下來。將抗體結(jié)合抗原與上清液中的游離抗原分離，且測量各自的放射性。從所述數(shù)據(jù)可繪制標準結(jié)合曲線。平行操作待檢定的樣品("未知物")。確定各未知物中的結(jié)合抗原與游離抗原的比率后，可從標準曲線直接讀取抗原濃度?？捎糜跈z測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的放射性免疫檢定的其它方法為(僅舉例來說)通過添加針對第一抗體的"第二"抗體使抗原-抗體復合物沉淀。舉例來說，如果使用兔IgG來結(jié)合抗原，那么可通過添加抗兔IgG抗血清(例如，通過用兔子IgG使山羊免疫來產(chǎn)生)使復合物沉淀。或者，可使抗原特異性抗體與試管內(nèi)壁偶合。培育后，移除未結(jié)合內(nèi)含物；洗滌試管，且測量未結(jié)合與結(jié)合物質(zhì)的放射性?？墒箍乖禺愋钥贵w與如葡聚糖凝膠(Sephadex)的顆粒偶合。離心反應(yīng)混合物使結(jié)合計數(shù)(在球粒中)與上清液中的游離計數(shù)分離。4.熒光免疫檢定本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的熒光免疫檢定?；跓晒獾拿庖叻ㄊ且詷擞浥湮惑w對未標記配位體對高特異性受體部位的競爭性結(jié)合為基礎(chǔ)。其為蛋白質(zhì)分析中非常重要的臨床和分析生物化學手段。這種技術(shù)可用于以熒光壽命隨分析物濃度變化的變化為基礎(chǔ)的免疫檢定。這種技術(shù)利用具有短壽命的染料，所述染料如異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC))(供體)，其熒光通過能量轉(zhuǎn)移到曙紅(Eosin)(接受體)而猝滅。許多分子物質(zhì)已用于使能量從供體分子轉(zhuǎn)移到接受體分子。具體來說，夾心型免疫復合物形成可用于這一技術(shù)。在本發(fā)明的方法中可使用許多光致發(fā)光化合物，且其包含以上熒光顯微術(shù)中所列的化合物以及以下基團，諸如菁、噁嗪、噻嗪、卟啉、酞菁、熒光紅外發(fā)射多核芳烴、藻膽蛋白、方酸(squamine)和有機金屬配合物、烴以及偶氮染料?；跓晒獾拿庖邔W法可為(舉例來說)異源或同源方法。異源免疫檢定包括使所結(jié)合的分析物與游離標記分析物物理分離。可使分析物或抗體連接于固體表面。這一技術(shù)可為競爭性(較高選擇性)或非競爭性技術(shù)(較高靈敏度)。檢測可為直接檢測(僅使用一種類型的抗體)或間接檢測(使用第二類型的抗體)。同源免疫檢定不包括物理分離。雙抗體熒光團標記抗原參與與針對抗原與熒光團兩者的抗體的平衡反應(yīng)。標記和未標記抗原競爭有限數(shù)目的抗抗原抗體。103簡單熒光標記法通過使用相關(guān)熒光其可用于受體-配位體結(jié)合、酶活性，且其可用作多種活體內(nèi)生理變化(諸如pH值、離子濃度以及電壓)的熒光指示劑。氨基酸(諸如酪氨酸和色氨酸)的自發(fā)熒光產(chǎn)生背景輻射，且為克服所述弱點，通常使用吸收波長大于520納米的紫外線的熒光化合物，諸如菁。FRET:熒光共振能量傳遞FRET可用于測量活體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用且可測量納米尺度的距離和距離(構(gòu)象)變化。因此，其用于測量簡單蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)折疊、構(gòu)象以及穩(wěn)定性的變化(參看Philipps，B.;Hennecke,J.;GlockshuberR.MolBiol.2003,327，239-249;Riven，I.;Kalmanzon,E.;Segev,L.;ReuvenyE.Neuron.2003,38,225-235)。使兩種不同熒光分子(熒光團)接合于兩種所關(guān)注的蛋白質(zhì)。在FRET中可使用與熒光團接合的非天然氨基酸多肽。當使用兩種熒光化合物而不是單一熒光化合物時，存在非熒光能量轉(zhuǎn)移。當熒光供體的發(fā)射波長類似于接受體的吸收波長時，處于激發(fā)態(tài)的供體會將其能量轉(zhuǎn)移到接受體而不是發(fā)射熒光，且因此發(fā)射在接受體的發(fā)射波長下發(fā)生。FRET分析已使用許多不同熒光團對，包含與所關(guān)注蛋白質(zhì)融合的綠色熒光蛋白質(zhì)(greenfluorescentprotein,GFP)變異體CFP(青色)和YFP(黃色)。50。/。FRET效應(yīng)的距離R0視供體發(fā)射范圍與接受體吸收范圍的重疊和接受體的量子產(chǎn)率和溶劑而定。如果兩種熒光分子彼此相距短于R0的距離，那么當發(fā)射供體的吸收光時，理論上接受體的熒光將較強。如果距離變得比R0長，那么當發(fā)射相同光時，供體的熒光將檢測為較強。因此，如果熒光分子鍵聯(lián)于可用作激酶(諸如蛋白酶)的小肽的末端時，那么酶活性可容易地測量。Xu等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，96,151-156)開發(fā)出生物發(fā)光共振會g量傳遞(Bioluminesceneresonanceenergytransfer,BRET)。其以類似于FRET的原理作用且以海腎(Renilla)熒光素酶的發(fā)射光譜類似于CFP的發(fā)射光譜的發(fā)現(xiàn)結(jié)果為基礎(chǔ)。當利用細胞器靶向熒光蛋白質(zhì)變異體時，所述技術(shù)允許研究特定亞細胞區(qū)隔內(nèi)的相互作用，包含膜蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。也可在哺乳動物細胞中研究翻譯后修飾事件。時間分辨熒光(TimeResolvedFluorescence,TRF):為減小熒光背景，開發(fā)出時間分辨熒光。常見熒光分子的激發(fā)態(tài)壽命通常僅幾微秒，但鑭系元素具有數(shù)毫秒的壽命。TRF為在其它熒光分子的發(fā)射完成后，選擇性測量鑭系熒光的方法。TRF也可與FRET一起使用，且鑭系變成供體或接受體。5.多種檢定格式多種檢定格式可用于檢測本文中所揭露的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段，包含"夾心"免疫檢定和探針檢定。舉例來說，在第一檢定格式中，使已涂布于固相上的多克隆或單克隆抗體或其片段或所述抗體的組合與測試樣品接觸以形成第一混合物。將此第一混合物在足以形成抗原/抗體復合物的條件下培育足以形成所述復合物的時間。然后，使包括其上已連接信號產(chǎn)生化合物的單克隆或多克隆抗體或片段或所述抗體的組合的指示劑試劑與抗原/抗體復合物接觸以形成第二混合物。然后將所述第二混合物在足以形成抗體/抗原/抗體復合物的條件下培育足以形成所述復合物的時間。通過檢測信號產(chǎn)生化合物所產(chǎn)生的可測量的信號確定測試樣品中和捕獲于固相上的抗原(如果有)的存在。測試樣品中所存在的抗原的量與所產(chǎn)生的信號成比例。在替代檢定格式中，通過使以下物質(zhì)接觸形成混合物(1)結(jié)合于固體支撐物的與抗原特異性結(jié)合的多克隆抗體、單克隆抗體或其片段或所述抗體的組合；(2)測試樣品；以及(3)包括其上連接信號產(chǎn)生化合物的與不同抗原決定基特異性結(jié)合的單克隆抗體、多克隆抗體或其片段(或所述抗體的組合)的指示劑試劑。然后將這一混合物在足以形成抗體/抗原/抗體復合物的條件下培育足以形成所述復合物的時間。通過檢測信號產(chǎn)生化合物所產(chǎn)生的可測量的信號確定存在于測試樣品中和捕獲于固相上的抗原(如果有)的存在。測試樣品中所存在的抗原的量與所產(chǎn)生的信號成比例。在另一檢定格式中，本發(fā)明的單克隆抗體中的一種或至少兩種的組合可用作用于檢測抗原的抗體的競爭探針。舉例來說，將本文中所揭露的非天然氨基酸多肽單獨或組合涂布于固相上。然后將懷疑含有抗原的抗體的測試樣品與包括信號產(chǎn)生化合物和至少一種單克隆抗體的指示劑試劑在足以形成測試樣品與指示劑試劑的結(jié)合于固相的抗原/抗體復合物或結(jié)合于固相的指示劑試劑的條件下一起培育足以形成所述復合物的時間。可定量測量單克隆抗體與固相的結(jié)合的減少。在另一檢測方法中，單克隆或多克隆抗體可通過免疫組織化學分析用于組織切片以及細胞中的抗原的檢測中。組織切片可從冷凍或化學固定的組織樣品切割。如果將在細胞中檢測抗原，那么可從血液、尿、乳房抽吸液或其它體液中分離細胞。可通過手術(shù)活檢或穿刺針活檢獲得細胞。細胞可在經(jīng)磁性粒子或鐵磁流體標記后通過離心或磁力吸引分離以富集細胞的特定部分以用于經(jīng)抗體染色。所述抗體直接經(jīng)標記(經(jīng)(例如)熒光素、膠體金、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等標記)或通過使用二次標記抗物質(zhì)抗體標記(經(jīng)多種本文中例示的標記標記)以追蹤疾病的組織病理學的細胞化學分析也在本發(fā)明的范疇內(nèi)。單克隆抗體(和其片段)的組合也可一起用作連同與本文中所揭露的非天然氨基酸多肽的其它區(qū)域特異性結(jié)合的抗體的混合物中的組分，各抗體具有不同的結(jié)合特異性。檢定中所使用的多克隆抗體可單獨使用或以多克隆抗體的混合物形式使用。因為檢定格式中所使用的混合物包括對本文中所揭露的非天然氨基酸多肽具有不同結(jié)合特異性的單克隆抗體或多克隆抗體，所以其適用于檢測、診斷、分級、監(jiān)測、預后、活體內(nèi)成像、預防或治療或確定多種疾病和病狀的誘因。本發(fā)明涵蓋且在本發(fā)明的范疇內(nèi)的是通過使用重組抗原以及通過使用合成多肽或純化多肽(所述多肽包括本文中所揭露的非天然氨基酸多肽的氨基酸序列)可在檢定中檢測本文中所揭露的非天然氨基酸氨基酸。也在本發(fā)明的范疇內(nèi)的是鑒別本文中所揭露的非天然氨基酸多肽的不同抗原決定基的不同的合成、重組或純化多肽可組合用于檢測、診斷、分級、監(jiān)測、預后、活體內(nèi)成像等的檢定中。在此情況下，可將所有所述多肽涂布于一個固相上；或可將各獨立的多肽涂布于獨立的固相上，諸如微粒，且隨后組合以形成隨后可用于檢定中的多肽混合物。隨后使涂布于固相上或經(jīng)可檢測標記標記的多肽與樣品中所存在的多肽競爭有限量的抗體。合成、重組或純化肽與抗體的結(jié)合的減少為存在本文中所揭露的非天然氨基酸多肽的指示。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知檢定格式的變體。6.用于免疫檢定的掃描探針顯微術(shù)(SPM)本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的SPM。在掃描探針顯微術(shù)中，在捕獲相中，(例如)將至少一種單克隆抗體粘附于固相且利用掃描探針顯微術(shù)檢測可能存在于固相表面上的抗原/抗體復合物。使用掃描隧道顯微術(shù)消除對許多免疫檢定系統(tǒng)中通常須利用以檢測抗原/抗體復合物的標記的需要?？梢栽S多方式進行使用SPM來監(jiān)測特異性結(jié)合反應(yīng)。在一實施例中，使特異性結(jié)合搭配物的一個成員(為單克隆抗體的分析物特異性物質(zhì))連接于適于掃描的表面。分析物特異性物質(zhì)的連接可通過吸附于包括塑料或金屬表面的固相的測試件實現(xiàn)?？衫锰禺愋越Y(jié)合搭配物(分析物特異性物質(zhì))與測試件的共價連接，其中所述測試件包括經(jīng)衍生化的塑料、金屬、硅或玻璃的固相。共價連接方法為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所巳知且包含多種使特異性結(jié)合搭配物與測試件不可逆鍵聯(lián)的方法。如果測試件為硅或玻璃，那么在連接特異性結(jié)合搭配物之前，表面須活化。同時，可使用聚電解質(zhì)相互作用將特異性結(jié)合搭配物通過使用技術(shù)和化學固定于測試件的表面上。優(yōu)選連接方法是通過共價方式進行。特異性結(jié)合成員連接后，可將表面用諸如血清、蛋白質(zhì)或其它阻斷劑的物質(zhì)進一步處理以使非特異性結(jié)合最小化。出于檢定目的，也可在制造場所或使用時掃描表面以驗證其適用性。不期望掃描過程改變測試件的特異性結(jié)合性質(zhì)。C.光譜學1.核磁共振(NMR)本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的NMR。核磁共振光譜學能夠在原子分辨水平上確定如蛋白質(zhì)和核酸的生物巨分子的結(jié)構(gòu)。另外，有可能用NMR研究時間依賴性現(xiàn)象，諸如巨分子中的分子內(nèi)動力學、反應(yīng)動力學、分子識別或蛋白質(zhì)折疊。本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸多肽和經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的NMR。NMR的理論和實施能力的進步使得NMR光譜的信息內(nèi)容得到越來越有效地利用。生物化學方法(重組蛋白質(zhì)表達)的平行發(fā)展允許可簡單且快速地制備蛋白質(zhì)樣品。可通過均一或選擇性同位素標記將如15N、13C以及211的異核并入蛋白質(zhì)中?？捎辛喕鰳悠返墓庾V。另外，用所述方法可確定一些關(guān)于巨分子的結(jié)構(gòu)和動力學的新信息。所有所述發(fā)展目前允許結(jié)構(gòu)測定具有高達30千道爾頓或30千道爾頓以上的質(zhì)量的蛋白質(zhì)。2.X-射線結(jié)晶學本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的X-射線結(jié)晶學。X射線結(jié)晶學為結(jié)晶學中的技術(shù)，其中記錄通過X射線衍射穿過晶體中原子的緊密晶格產(chǎn)生的圖案，且隨后分析以揭露所述晶格的性質(zhì)。這通常產(chǎn)生對物質(zhì)的材料和分子結(jié)構(gòu)的了解。可使用布拉格定律(Bragg'slaw)確定晶體晶格中的間隔。環(huán)繞原子的電子而不是原子核本身為與進入的X射線光子物理相互作用的實體。這一技術(shù)在化學和生物化學中廣泛用于確定多種分子(包含無機化合物、DNA以及蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)。通常使用材料的單晶進行X射線衍射，但如果所述單晶不可得，那么也可使用微晶粉末樣品，但這需要不同設(shè)備且很不直接。對X射線結(jié)晶學來說，分子須經(jīng)結(jié)晶。不能可靠地檢測通過一個電子衍射的一個光子，然而，由于規(guī)則的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，在許多對稱排列的分子中通過相應(yīng)電子使光子衍射。因為峰匹配的具有相同頻率的波相互增強，所以信號變得可檢測。為確定結(jié)構(gòu)，使用一些結(jié)晶方法使所關(guān)注的分子的晶體生長。收集晶體且通常將其用液氮冷凍。冷凍晶體降低數(shù)據(jù)收集期間發(fā)生的輻射損傷且減少晶體的熱運動。將晶體放置在發(fā)射X射線束的機器衍射計上。X射線衍射出晶體中的電子，將衍射圖案記錄在膜上且掃描到計算機中。將所述衍射圖像組合且最終用于構(gòu)造結(jié)晶分子的電子密度的圖，然后使原子配合電子密度圖且改進各種參數(shù)(諸如位置)以最佳配合所觀察到的衍射數(shù)據(jù)。3.熒光光譜學本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的熒光光譜學。除標準熒光測量外，已開發(fā)出多種其它方法。常規(guī)熒光分析法涉及在確定波長下測量熒光團某一發(fā)射最大值的發(fā)射光強度?？偀晒夥治龇ㄉ婕笆占者B續(xù)區(qū)以及發(fā)射波長的數(shù)據(jù)。在熒光偏振中，使用偏振光激發(fā)且熒光染料標記抗原與特異性抗體的結(jié)合影響偏振程度。窄線光譜學(LineNarrowingSpectroscopy)涉及低溫固體光譜學，其從其提供的窄線發(fā)射光譜中獲得其選擇性。時間依賴性熒光光譜學包括與穩(wěn)態(tài)測量相比含有較多信息的時間分辨測量，因為穩(wěn)態(tài)值代表時間分辨測定的時間平均值。其為單光子計時技術(shù)，其中測量激發(fā)光脈沖與樣品所發(fā)射的第一光子之間的時間。頻域熒光光譜學是時間分辨方法的替代方法。熒光的時間衰減通常在給定頻率下使用具有正弦調(diào)制的強度的光源通過測定熒光信號相對于激發(fā)光的相位延遲和相對調(diào)制來測量。4.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MatrixAssistedLaserDesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometry，MALDITOF-MS)本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的MALDITOF-MS。線性TOF-MS:質(zhì)譜已顯現(xiàn)為分析和表征具有不同復雜性的大生物分子的重要手段。于1987年開發(fā)的基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)技術(shù)已將生物分子的質(zhì)譜分析的質(zhì)量上限增加到超過300,000Da且已使得通過質(zhì)譜來分析大生物分子能夠變得更容易且更靈敏。TOF質(zhì)譜計基于以下原理操作在使時間上和空間上明確的一組具有不同質(zhì)量/電荷(m/z)比的離子經(jīng)受同一施加電場(K.E.=[mv2]/2=zeEs，其中K.E.=動能；m=離子的質(zhì)量；V=離子的速度；z=電荷數(shù)；e=電子電荷(庫侖)；E=電場梯度；以及3=離子源區(qū)的距離)且使其遷移恒定電場區(qū)中時，其將在視其m/z比而定的時間內(nèi)橫穿這一區(qū)。反射TOF-MS:已通過利用單級或二級反射(RETOF-MS)獲得MALDITOF-MS中的改進的質(zhì)量分辨率。使用位于飛行管末端的反射器利用離子反射器補償具有略微不同的動能的相同m/z離子的飛行時間的差。這使得在空間和時間上將離子包聚焦于檢測器。在反射質(zhì)譜中，充分分辨同位素多重峰產(chǎn)生約3400的半最大寬度(fullwidthhalf108maximum,FWHM)質(zhì)量分辨率。關(guān)于高達約3000Da的肽用RETOF-MS已獲得高達6000的質(zhì)量分辨率(FWHM)。當測定離子質(zhì)量時，增強質(zhì)量分辨率也可增加質(zhì)量精確性。歷史上主要利用線性與反射MALDI-TOF-MS進行分子離子和酶促消化物的分子量測定，從而獲得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。通常在經(jīng)純化或不經(jīng)純化的情況下對所述消化物進行質(zhì)量分析，之后測定分子量。已開發(fā)出多種方法以利用MALDITOF-MS獲得蛋白質(zhì)和肽的主要序列信息?？刹捎脙煞N不同方法。第一種方法稱為蛋白質(zhì)梯狀測序且用于在插入TOF質(zhì)譜計之前產(chǎn)生分析物的結(jié)構(gòu)信息片段且接著分析。第二種方法利用TOF質(zhì)譜計內(nèi)部發(fā)生的亞穩(wěn)離子衰減現(xiàn)象產(chǎn)生序列信息。利用TOF-MS的梯狀測序可使用MALDI-TOF-MS以梯狀測序技術(shù)對蛋白質(zhì)或肽進行測序，所述技術(shù)由將蛋白質(zhì)或肽的N-末端或C-末端時間依賴性或濃度依賴性化學降解為片段(各相差一個氨基酸殘基)組成。在單一MALDI-TOF-MS實驗中對混合物進行質(zhì)量分析，其中相鄰質(zhì)譜峰之間的質(zhì)量差對應(yīng)于特定氨基酸殘基。可認為這一類型的分析是簡單地測定單一MALDI樣品中所存在的一系列肽/蛋白質(zhì)的質(zhì)量。質(zhì)譜中的出現(xiàn)順序確定原始蛋白質(zhì)或肽中的氨基酸序列。利用RETOF-MSMALDI的源后衰減歷史上認為其為幾乎僅產(chǎn)生完整質(zhì)子化假分子離子物質(zhì)的"軟"電離技術(shù)。顯著程度的亞穩(wěn)離子衰減在離子加速后和檢測之前發(fā)生。由肽和蛋白質(zhì)的亞穩(wěn)離子衰減產(chǎn)生的離子片段通常包含中性分子丟失(諸如水、氨以及氨基酸側(cè)鏈的部分)與肽鍵處的隨機裂解。MALDI質(zhì)譜中的所述亞穩(wěn)離子衰變產(chǎn)物的觀察結(jié)果視TOF儀器配置而定。MALDITOF-MS在生物科學中已發(fā)展為用于獲得精確質(zhì)量測定與主要序列信息的重要手段。本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸多肽和經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的MALDITOF-MS。從序列已推導獲知的質(zhì)譜獲得的序列信息決不是暗指從亞穩(wěn)離子衰減質(zhì)譜推導出未知肽或蛋白質(zhì)序列的直接流程。預想所述MALDI技術(shù)最適用于與常規(guī)生物化學技術(shù)(諸如，蛋白質(zhì)消化)組合。其可適用于以此方式鑒別已知蛋白質(zhì)中的經(jīng)阻斷氨基末端、翻譯后修飾和突變位點。同時，對完全未知物來說，應(yīng)可能對極小量(小于10pmol)的分析物進行大量初步結(jié)構(gòu)測定。對梯狀測序和源內(nèi)破碎研究來說，重要的是使?jié)撛陔碾s質(zhì)減到最少。利用線性TOF-MS的源內(nèi)衰減用于研究產(chǎn)生離子的MALDI的亞穩(wěn)離子衰減的RETOF-MS的替代方法是利用具有線性TOF-MS的DE。通過使用DE技術(shù)，也可獲得肽和蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)信息。對產(chǎn)生肽或蛋白質(zhì)離子的MALDI來說，通常不存在解吸事件(即，離子形成)時所產(chǎn)生的迅速的離子破碎。通過在離子形成與離子提取之間并入時間延遲，允許源內(nèi)離子在提取之前在相對較短的時間(<100納秒)內(nèi)破碎為較小離子和中性物質(zhì)。然后施加抽出電勢以提取破碎離子。連續(xù)質(zhì)譜峰由所述亞穩(wěn)衰減離子產(chǎn)生，從而產(chǎn)生肽和蛋白質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)信息。5.表面增強激光解吸電離飛行時間(SELDI-TOF)蛋白質(zhì)混合物的定量分析中涉及的另一蛋白質(zhì)組技術(shù)稱為表面增強激光解吸電離飛行時間(SELDI-TOF)。本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的SELDI-TOF。這一技術(shù)利用經(jīng)直徑為l-2毫米的化學(親水性、疏水性、預活化、正相、固定金屬親和力以及陽離子或陰離子)或生物(抗體、抗原結(jié)合片段(包含(但不限于)scFv)、DNA、酶或受體)餌表面工程化的不銹鋼或鋁基支撐物或芯片。所述改變的化學和生物化學表面允許基于蛋白質(zhì)本身的固有性質(zhì)來差異捕獲蛋白質(zhì)。將體積小至0.1微升的溶解組織或體液直接施加于所述表面，其中蛋白質(zhì)將以各種親和力與餌表面結(jié)合。一系列洗滌以移除非特異性或弱結(jié)合蛋白質(zhì)后，將結(jié)合蛋白質(zhì)激光解吸且電離以用于MS分析?；陲w行時間計算從小于1000道爾頓的小肽到大于300千道爾頓的蛋白質(zhì)范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。當將在不同樣品內(nèi)分析蛋白質(zhì)的混合物時，各測試樣品將產(chǎn)生獨特的樣品指紋圖譜或特征。因此，通過SELDI分析產(chǎn)生質(zhì)量圖案而不是實際蛋白質(zhì)鑒別。使用所述質(zhì)譜圖案彼此區(qū)分患者樣品，諸如區(qū)分患病的與正?；颊叩臉悠?。雖然可就差異生物標記物表達來分析蛋白質(zhì)指紋圖譜，但這一技術(shù)目前不能使用MS特異性鑒別樣品內(nèi)的蛋白質(zhì)。然而，這一情形正快速發(fā)展，因為正在測試使SELDI-TOF技術(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜計聯(lián)合的原型。所述類型的儀器的聯(lián)合將使得能夠進行氨基酸測序和后續(xù)蛋白質(zhì)鑒別。6.UV-Vis本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的UV-Vis。光學吸收光譜學(UV/VIS)對濃度(蛋白質(zhì)、DNA、核苷酸等)測定起重要作用?？墒褂糜袡C染料增強吸收且將其遷移至可見范圍內(nèi)(例如考馬斯藍色試劑(coomassiebluereagent))。理解控制蛋白質(zhì)彼此間的相互作用的力有助于理解諸如大分子裝配、伴侶輔助蛋白質(zhì)折疊以及蛋白質(zhì)易位的過程。共振拉曼光譜學(ResonanceRamanSpectroscopy,RRS)為可用于研究分子結(jié)構(gòu)和動力學的手段。共振拉曼散射要求在電子吸收帶內(nèi)激發(fā)且使得散射大大增加。極少數(shù)分子具有可見吸收帶；然而所有事物在深紫外中吸收。通過使用紫外光，有可能研究多種無色發(fā)色團，且具有避免熒光干擾的額外益處。此外，可選擇性激發(fā)具有不同激發(fā)波長的不同官能團的電子。這種方法有助于通過使用不同激發(fā)波長研究巨分子的特定部分。7.液相色譜法(LC)液相色譜法已成為從復雜混合物中分離蛋白質(zhì)、肽和其它分子的有效手段。本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的LC。液相色譜法可為親和力色譜法、凝膠過濾色譜法、陰離子交換色譜法、陽離子交換色譜法、二極管陣列-液相色譜法以及高效液相色譜法(HPLC)。凝膠過濾色譜法基于大小分離蛋白質(zhì)、肽以及寡核苷酸。分子移動穿過多孔珠粒床，或多或少分散于珠粒中。較小分子進一步分散于珠粒的微孔中，且因此較緩慢地移動穿過床，而較大分子較少或根本不進入且因此較快速地移動穿過床。分子量與三維形狀為保留度提供貢獻。可使用凝膠過濾色譜法分析分子大小、分離混合物中的組分或從巨分子制劑移除鹽或與之進行緩沖液交換。親和力色譜法為生物選擇性吸附且隨后從固定配位體回收化合物的過程。這一過程允許高度特異性且高效地純化許多不同蛋白質(zhì)和其它化合物。這一過程要求利用適當選擇性配位體，所述配位體通常將以10—4至10—8范圍內(nèi)的解離常數(shù)結(jié)合所需化合物同時準許在溫和條件下回收。通常將配位體固定在珠粒和可呈管柱填料或分批吸附介質(zhì)形式的多孔基質(zhì)上。離子交換色譜法基于蛋白質(zhì)總電荷之間的差異分離分子。其通常用于蛋白質(zhì)純化，但可用于寡核苷酸、肽或其它帶電分子的純化。所關(guān)注的蛋白質(zhì)須具有與連接于樹脂的官能團的電荷相反的電荷以便結(jié)合。舉例來說，通常具有總正電荷的免疫球蛋白將與含有帶負電的官能團的陽離子交換劑良好結(jié)合。因為這一相互作用為離子型，所以結(jié)合須在低離子條件下進行。通過增加離子強度來瓦解離子相互作用或通過改變蛋白質(zhì)的pH值實現(xiàn)洗脫。HPLC可用于分離、純化以及檢測本文中所揭露的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段。肽在合成肽制備中，使用反相色譜法(RPC)已變成普遍且重要的步驟。RPC也已用于純化天然序列。雖然使用分析管柱進行這一過程，但歸因于組織中有限量的"活性"蛋白質(zhì)，所述程序在性質(zhì)上可為制備型的。一些其它優(yōu)點在于因肽大小縮短而有利于純化后生物活性的恢復和暴露于RPC后二級或三級結(jié)構(gòu)的重新形成?？蓪⒋纸M織提取物直接負載于RPC系統(tǒng)上且通過梯度洗脫移動。如果準許或必需進一步純化，在相同條件下再色譜分離為一種選擇。RPC也可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)確定過程中。這一過程的正常程序是1)通過蛋白水解或化學裂解破碎；2)純化；以及3)測序。肽的RPC的常見移動相為于水中的O.P/。三氟乙酸(TFA)到于有機溶劑(諸如乙腈)中的O.P/。TFA的梯度，因為所述有機溶劑1)溶解肽，2)允許在約230-240納米下檢測，以及3)可蒸發(fā)脫離樣品。生物活性蛋白質(zhì)使用尺寸排阻色譜法(SEC)和離子交換色譜法(IEC))非常適合用于生物活性蛋白質(zhì)(諸如酶、激素以及抗體)，因為各蛋白質(zhì)具有其自身獨特的結(jié)構(gòu)且所述技術(shù)可在生理條件下進行。可實現(xiàn)暴露于色譜法后的活性完全恢復，且目前，SEC管柱的可用性足夠多，允許分級分離l萬道爾頓到IOO萬道爾頓。極具堿性或疏水性的蛋白質(zhì)可能不展示真實的SEC特征，因為管柱傾向于具有輕微的疏水性和陰離子特征。對IEC管柱使用梯度洗脫是有利的，因為具有與聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)等效的分辨率和當與SEC相比時，具有增加的負載能力。在液體親和力色譜法(liquidaffinitychromatography,LAC)中，歸因于模仿底物、受體等，相互作用是以蛋白質(zhì)的結(jié)合為基礎(chǔ)。通過引入競爭結(jié)合劑或改變蛋白質(zhì)構(gòu)象(有利于解離)洗脫蛋白質(zhì)。膜蛋白質(zhì)膜蛋白為周圍蛋白質(zhì)(位于外表面)或整合蛋白質(zhì)(部分橫跨、完全橫跨或完全位于膜內(nèi))。雙層的親脂性將蛋白質(zhì)的親脂性特征(即，疏水性氨基酸)傳輸?shù)侥?nèi)。RPC將為所述蛋白質(zhì)的分析和純化的合理選擇，但也使用IEC。膜蛋白的分離中所使用的另一程序是使用非離子型洗滌劑(諸如曲拉通X-100(TritonX-100))或?qū)EC來說，通過有機溶劑使蛋白質(zhì)增溶。HPLC可與MS聯(lián)合。二極管陣列檢測器-液相色譜法(DAD-LC)為各HPLC峰提供完整的多光譜，比較起來，其可提供峰純度的指示。所述數(shù)據(jù)也可指定Tyr、Trp、Phe以及可能其他氨基酸(His、Met、Cys)的存在且可通過第二衍生物或多組分分析定量所述氨基酸。通過管柱后衍生化，DAD-LC也可鑒別且定量個別肽中的Cys、His以及Arg。因此，有可能在單一LC實驗中分析各分離肽的20種氨基酸中的6種，且可在單一步驟中獲得關(guān)于給定肽中所述氨基酸存在與否的信息。對此通過獲知各肽中殘基的數(shù)目加以輔助。同樣，通過在205納米下修正側(cè)鏈發(fā)色團的吸光度，這一技術(shù)可給出對各肽的相對量的更佳估算。D.電泳本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的電泳。電泳可為凝膠電泳或毛細管電泳。凝膠電泳凝膠電泳為可用于分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。大(巨)分子的分離依賴于兩種力電荷和質(zhì)量。當將生物樣品(諸如蛋白質(zhì))混合于緩沖溶液中且施加于凝膠時，這兩種力同時起作用。來自一個電極的電流排斥分子，而另一電極同時吸引分子。凝膠材料的摩擦力充當按大小分離分子的"分子篩"。電泳期間，當施加電流時，巨分子被迫移動穿過微孔。其穿過電場的遷移速率依賴于場強度、分子的大小和形狀、樣品的相對疏水性以及分子移動的緩沖液的離子強度和溫度。染色后，在一系列從凝膠的一端到另一端展開的帶中可見各泳道中的所分離的巨分子。使用這一技術(shù)，有可能分離和鑒別因少至單個氨基酸不同的蛋白質(zhì)分子。其優(yōu)點在于可觀測分離的蛋白質(zhì)，從而準許研究人員快速估算混合物中的蛋白質(zhì)的數(shù)目或特定蛋白質(zhì)制劑的純度。同樣，凝膠電泳允許確定蛋白質(zhì)的關(guān)鍵性質(zhì)，諸如其等電點以及近似分子量。等電聚焦或等電點聚焦為通過電荷差異(如果其具有任何電荷)分離不同分子的技術(shù)。其最常用于蛋白質(zhì)。其為區(qū)帶電泳的一種，其利用分子的電荷隨其環(huán)境的pH值的改變而改變的事實。分子分布于具有pH值梯度(通常由脂肪族兩性電解質(zhì)產(chǎn)生)的介質(zhì)內(nèi)。使電流通過介質(zhì)，產(chǎn)生"正極"端和"負極"端。帶負電粒子穿過pH值梯度向"正極"端遷移，而帶正電粒子向"負極"端移動。當粒子移動到中和其電荷的pH值中時，其將停止跟隨電流。具有相同初始電荷的粒子沉積(或聚焦)關(guān)于pH值梯度相同的地點周圍。毛細管電泳毛細管電泳為大量分離技術(shù)的總稱，其涉及對整個緩沖液填充的毛細管施加高電壓來實現(xiàn)分離。變體包含基于分析物之間的大小和電荷差異的分離(稱為毛細管區(qū)帶電泳，CZE;或自由溶液毛細管電泳，F(xiàn)SCE)、使用表面活性劑膠束分離中性化合物(膠束電動毛細管色譜法，MECC,或有時稱為MEKC)、通過凝膠網(wǎng)狀物篩分溶質(zhì)(毛細管凝膠電泳，GCE)、基于電泳遷移率分離陽離子(或陰離子)(毛細管等速電泳，CITP)以及在pH值梯度內(nèi)分離兩性離子溶質(zhì)(毛細管等電點聚焦，CIEF)。毛細管電色譜法(CEC)為相關(guān)電動分離技術(shù)，其涉及對整個填充有硅膠固定相的毛細管施加電壓。CEC中的分離選擇性為電泳過程與色譜過程的組合。許多CE分離技術(shù)依賴于毛細管中將溶質(zhì)泵送到檢測器中的溶液電誘導流的存在(電滲流，EOF)。GCE和CIEF對生物分子(諸如蛋白質(zhì))的分離來說具有重要性。CE通常使用水性基電解質(zhì)進行，然而在CE中逐漸使用非水性溶劑。CE系統(tǒng)的操作涉及對整個窄膛(25-100毫米)毛細管施加高電壓(通常10-30千伏)。向毛細管中填充在整個毛細管內(nèi)部傳導電流的電解質(zhì)溶液。將毛細管的末端浸在填充有電解質(zhì)的存儲器中。也將由惰性材料(諸如鉑)制成的電極插入電解質(zhì)存儲器中以完成電路。將小體積的樣品注射到毛細管的一端。毛細管穿過位于毛細管另一端的檢測器，通常為紫外吸收檢測器。電壓的施加引起樣品離子向其適當?shù)碾姌O移動，通常穿過檢測器。產(chǎn)生檢測器響應(yīng)隨時間的曲線，稱為電泳圖譜。電解質(zhì)流(稱為電滲流，EOF)產(chǎn)生沿毛細管通常朝向檢測器的溶液流。所述流可顯著減少分析時間或迫使離子克服其向正因其電荷符號而被吸引到的電極的遷移傾向。E.陣列本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的陣列。陣列涉及以已知蛋白質(zhì)標耙進行多個樣品的平行分析。各種微陣列平臺的發(fā)展已顯著使得能夠且加速細胞或組織中蛋白質(zhì)豐度、定位以及相互作用的測定。微陣列提供允許鑒別針對一組經(jīng)表征蛋白質(zhì)、抗體或肽的蛋白質(zhì)相互作用或功能的平臺。蛋白質(zhì)基芯片將蛋白質(zhì)排列在小表面上且可使用熒光基成像直接測量組織中蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)可排列在平坦固相上或毛細管系統(tǒng)中(微流陣列)，且數(shù)種不同蛋白質(zhì)可應(yīng)用于所述陣列。目前，最流行的陣列依賴于抗體-抗原相互作用，其也可檢測抗原-蛋白質(zhì)相互作用。目前，抗體陣列的可能性受到對所關(guān)注的標靶具有高特異性(消除與樣品中非特異性蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng))與高親和力(允許檢測樣品內(nèi)的小數(shù)量)的抗體的可用性所限制。蛋白質(zhì)陣列技術(shù)的另一挑戰(zhàn)是將蛋白質(zhì)保持為其生物活性形狀和形式的能力。除使用抗體作為陣列探針外，特異性通過活體外洗脫優(yōu)化的單鏈寡核苷酸(適體)提供有前途的替代物。適體允許其與同源蛋白質(zhì)通過光交聯(lián)共價連接，從而減弱背景。隨后，使用非特異性蛋白質(zhì)染色檢測結(jié)合蛋白質(zhì)。標題為"ProteinArrays"的國際公開案第WO04/58946號(其是以引用的方式并入本文中)描述非天然氨基酸多肽與固體支撐物的連接。陣列包含(但不限于)珠粒陣列、珠?；嚵?、生物陣列、生物電子陣列、cDNA陣列、細胞陣列、DNA陣列、基因陣列、基因表達陣列、冷凍細胞陣列、基因組陣列、高密度寡核苷酸陣列、雜交陣列、微懸壁陣列、微電子陣列、多路DNA雜交陣列、納米陣列、寡核苷酸陣列、寡糖陣列、平面陣列、蛋白質(zhì)陣列、溶液陣列、點陣列、組織陣列、外顯子陣列、過濾器陣列、宏陣列、小分子微陣列、懸浮液陣列、主題陣列、疊片陣列以及轉(zhuǎn)錄物陣列。F.傳感器本文中揭露的用于蛋白質(zhì)檢測的方法包含檢測非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的傳感器。傳感器可用于活體內(nèi)與活體外檢測。傳感器可用于檢測諸如非天然氨基酸多肽與其標靶結(jié)合、非天然氨基酸多肽中構(gòu)象變化的事件和/或測量非天然氨基酸多肽或其環(huán)境的其它相互作用、修飾或變化。傳感器可為化學傳感器、光學傳感器以及生物傳感器?；瘜W傳感器為微型化分析裝置，其傳送關(guān)于復雜樣品中特定化合物或離子的存在的實時和在線信息。光學傳感器是以分析物的固有光學性質(zhì)或連接于固體支撐物的指示劑染料或標記生物分子的光學性質(zhì)的測量為基礎(chǔ)。生物傳感器可為基于酶使"底物"轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的能力的親和性生物傳感器；或催化型生物傳感器?？蓽y量非天然氨基酸多肽與其標靶(包含(但不限于)抗體、抗體片段或抗原結(jié)合多肽或其片段)的結(jié)合。使非天然氨基酸多肽接合于諸如納米傳遞素的分子。當納米傳遞素活體內(nèi)結(jié)合于其標靶時，其發(fā)射信號，所述信號通過醫(yī)學成像儀器離體讀取。G.鑒別來自文庫篩檢的蛋白質(zhì)的方法為鑒別與非天然氨基酸多肽相互作用的蛋白質(zhì)，可使用許多方法。蛋白質(zhì)分離有助于分離復雜混合物，從而個別蛋白質(zhì)較易用其它技術(shù)處理。蛋白質(zhì)鑒別方法包含(但不限于)通過Edman降解的低通量測序、質(zhì)譜技術(shù)、肽質(zhì)量指紋圖譜、從頭開始測序、基于抗體的檢定以及蛋白質(zhì)定量檢定，諸如熒光染料凝膠染色、標記或化學改性方法(即，同位素標記親和性標簽(isotope-codedaffinitytags,ICATS)、組合分級分離對角線色譜法(combinedfractionaldiagonalchromatography,COFRADIC))。也可使用純化蛋白質(zhì)測定三維晶體結(jié)構(gòu)，其可用于對分子間相互作用建模。測定三維晶體結(jié)構(gòu)的常見方法包含X射線結(jié)晶學和核磁共振光譜學。下文詳述幾種鑒別蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)測序N-末端測序和C-末端測序。N-末端測序有助于鑒別未知蛋白質(zhì)；證實重組蛋白質(zhì)一致性和保真度(閱讀框架、翻譯起始位點等)；有助于解釋NMR和結(jié)晶學數(shù)據(jù)；證明蛋白質(zhì)之間的一致性程度；或提供用于設(shè)計用于抗體產(chǎn)生的合成肽的數(shù)據(jù)等。N-末端測序利用充分確立的Edman降解化學，依次從蛋白質(zhì)的N-末端移除氨基酸殘基且通過反相HPLC對其進行鑒別。靈敏度處于100s飛摩爾(femtomole)的水平且長序列讀數(shù)(20-40殘基)通?？蓮臄?shù)lOs皮摩爾起始物質(zhì)獲得。純蛋白質(zhì)(>90%)產(chǎn)生容易解釋的數(shù)據(jù)，但不夠純的蛋白質(zhì)混合物也可提供適用的數(shù)據(jù)，以供精確數(shù)據(jù)解釋。N-末端修飾(尤其乙酰化)蛋白質(zhì)不能直接測序，因為自由伯氨基的缺乏而不能發(fā)生Edman化學。然而，經(jīng)阻斷蛋白質(zhì)的有限蛋白質(zhì)水解(例如，使用溴化氰)可允許在儀器的各循環(huán)中產(chǎn)生氨基酸混合物，可使所述混合物經(jīng)受數(shù)據(jù)庫分析以解釋有意義的序列信息。認為C-末端測序是重要的翻譯后修飾，有時關(guān)鍵性地影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性。多種疾病情形與蛋白質(zhì)加工受損相關(guān)，且C-末端測序提供研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和加工機制的另一手段。蛋白質(zhì)組分析對蛋白質(zhì)組來說，蛋白質(zhì)可主要通過計算機檢索算法鑒別，所述算法將序列指定到從對所關(guān)注的蛋白質(zhì)進行電噴霧電離(electrosprayionization,ESI)、基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)、飛行時間(TOF)儀器或三維四極離子阱所產(chǎn)生的一組憑經(jīng)驗獲得的質(zhì)量/強度數(shù)據(jù)。其它檢測方法其他檢測方法涉及聯(lián)吡啶；金屬配位；納米技術(shù)(金)；生物素-抗生蛋白鏈菌素/抗生物素蛋白；UV/Vis;涉及結(jié)合事件和偶合事件的兩步系統(tǒng)，歸因于非天然氨基酸與標靶的接近，產(chǎn)生從熒光團、結(jié)合于多肽、脂質(zhì)運載蛋白(e桶狀)、脂肪酸結(jié)合蛋白中所存在的非天然氨基酸的小分子基熒光/發(fā)熒光分子以及由深到淺或由淺到深的熒光團的發(fā)射。XV.成像和診斷本文中揭露利用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的用于成像和診斷的方法。分子成像為涉及鑒別分子成像標靶的分子和細胞生物學、開發(fā)合適成像探針的放射化學和生物接合化學、優(yōu)化獲得最佳耙向功效和有利活體內(nèi)動力學的探針的藥理學以及活體內(nèi)非侵襲性監(jiān)測分子成像探針歷程的成像捕獲技術(shù)的成果的多學科領(lǐng)域。除基本診斷應(yīng)用外，分子成像也在治療功效評估、藥物發(fā)現(xiàn)以及活系統(tǒng)中的分子機制的理解中發(fā)揮作用。分子成像探針(單克隆抗體、微型抗體、蛋白質(zhì)、肽以及擬肽)可用于觀測和定量分子標靶。解剖學(微MRI和微CT)和分子成像技術(shù)(微PET、微SPECT以及NIR熒光成像)的組合可允許獲得分子和功能信息且監(jiān)測特異性分子治療功效。生物成像方法可使用光透射、反射、散射以及熒光發(fā)射策略以高空間和光譜分辨率用于檢測空間定向(即，分布)且定量細胞和組織天然成分、結(jié)構(gòu)、細胞器以及所投與的組分，諸如經(jīng)標簽標記的探針(例如，熒光探針)和藥物。未經(jīng)標記化合物與經(jīng)標記探針對具有已知藥理學特征和功效的藥劑的活體內(nèi)競爭檢定可用于藥物評估程序。藥物靶向的非侵襲性特征、受體占位性、有效受體或酶抑制所需的濃度等可加速前導化合物的評估。當新穎藥物候選物進行至藥效和藥物動力學研究時，成像分析可定量且重復地監(jiān)測標靶可接近性、標靶位點處的保留持續(xù)時間和其與藥物功效的相關(guān)性，以及從不相干組織的清除率。在臨床試驗中，成像檢定可有利于評估患者中的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的藥理學性質(zhì)與治療功效。通過用合并結(jié)構(gòu)和功能數(shù)據(jù)的多模態(tài)成像儀器組合成像探針，醫(yī)師可同時進行多功能成像檢定和解剖學分析。隨后可使來源于結(jié)構(gòu)研究和藥物分布和濃度的非侵襲性重復監(jiān)測的信息與關(guān)于信號轉(zhuǎn)導路徑、標靶酶活性、抗原含量、受體活化、細胞增殖、蛋白酶體活性等的生物效應(yīng)相關(guān)聯(lián)。所述非侵襲性檢定可準許實時監(jiān)測和修改靶向介入和治療策略。分子成像技術(shù)可用于在臨床前研究中研究小鼠模型。舉例來說，用于癌癥和其它病癥的許多藥物通過誘導細胞凋亡發(fā)揮其治療效應(yīng)。重復地使活動物中的細胞凋亡反應(yīng)成像的能力可有利于所述藥物的臨床前評估。對研究轉(zhuǎn)殖基因小鼠來說，通過非侵襲性成像鑒別可以適當空間和時間模式表達轉(zhuǎn)殖基因的建立者小鼠可準許鑒別未經(jīng)配種的建立者。分子成像可提供治療基因的表達的位置、量值以及持續(xù)時間以優(yōu)化基因治療方案。光學成像可與靶向基因轉(zhuǎn)移聯(lián)合。報導體基因的分子成像也可用于監(jiān)測細胞基療法的生物分布和功效。成像探針成像探針可為經(jīng)放射性同位素標記的分子或光發(fā)射或近紅外(nearinfrared，NIR)發(fā)射分子。在研究中，分子成像探針的濃度和/或光譜性質(zhì)通過特定生物過程而改變?？捎糜诠δ艹上裱芯康奶结樀膬煞N類型為(僅舉例來說)直接結(jié)合探針和間接探針。直接結(jié)合探針和間接探針可為非天然氨基酸多肽。直接結(jié)合探針的實例包含(但不限于)抗體、抗體片段、抗原結(jié)合多肽以及其片段和受體配位體。直接探針可用于檢測其標靶的濃度，因為其結(jié)合為化學計量的。因此，直接探針適用于研究在病理學病狀中(例如)在治療之前和之后過表現(xiàn)的標靶。間接探針用于監(jiān)測其大分子標靶的活性，包含催化活性。所述探針的實例由Herschman描述于Science2003302:605-608中。探針可開發(fā)用于監(jiān)測內(nèi)源靶向分子和生物過程。所述探針可為(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽?？墒褂贸上裉结樠芯績?nèi)源過程的重要調(diào)節(jié)劑和/或指示劑。酶(諸如激酶或蛋白酶)的底物可通過放射性核素或熒光分子標記，以使得通過分子成像檢定檢測諸如磷酸化或蛋白酶裂解的事件。所述在蛋白酶裂解后發(fā)射NIR熒光的熒光探針可稱為"可活化"光學成像探針。直接和間接探針可通過高產(chǎn)量篩檢化學文庫發(fā)現(xiàn)。直接探針也可通過篩檢大重組抗體和噬菌體文庫發(fā)現(xiàn)。所述文庫可包括(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽。量子點利用本文中所揭露的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段的用于成像和診斷的方法包含熒光半導體納米晶體(也稱為量子點(quantumdot或qdot))。量子點可用于研究單個分子水平上的細胞內(nèi)過程、高分辨率細胞成像、細胞通行的長期活體內(nèi)觀察、腫瘤靶向以及診斷。膠體半導體量子點是直徑為數(shù)納米的單晶，其尺寸和形狀可通過合成中所使用的持續(xù)時間、溫度以及配位體分子精確控制。這種方法可產(chǎn)生具有組成和尺寸依賴性吸收和發(fā)射的量子點。吸收具有大于半導體帶隙能的能量的光子可使得產(chǎn)生電子-空穴對(或激發(fā)子)。與標準熒光團鮮明對照，吸收在較高能量(即，較短波長)下可具有增加的概率且產(chǎn)生寬帶吸收譜。對小于所謂的玻爾激發(fā)子半徑(Bohrexcitonradius)(數(shù)納米)的納米晶體來說，能級可能是量子化的，其值直接與量子點的尺寸相關(guān)(稱為量子限制的效應(yīng)，由此得名"量子點")。激發(fā)子(特征在于壽命長，>10納秒)的輻射復合可使得發(fā)射窄的對稱能帶的光子。量子點的長熒光壽命可使得能夠使用時間選通檢測來從具有較短壽命的物質(zhì)的信號(諸如細胞中遇到的背景自發(fā)熒光)中分離其信號。可經(jīng)延長時間用(例如)共焦顯微術(shù)、全內(nèi)反射顯微術(shù)或基本視野表熒光顯微術(shù)觀察和追蹤單個量子點。熒光相關(guān)光譜可允許測定每粒子的亮度以及提供平均量子點尺寸的測量。量子點也可用作雙光子共焦顯微術(shù)的探針，因為其特征在于非常大的吸收截面。其可與標準染料同時使用。量子點具有作為熒光共振能量傳遞(FRET)對的可定制供體的潛能。對諸如量子點標記靶分子(諸如非天然氨基酸多肽)的應(yīng)用來說，可將單個識別部分移植到量子點中(例如，DNA寡核苷酸或適體、抗體、抗體片段、抗原結(jié)合多肽等)或用作量子點增溶配位體。含有(例如)胺或羧基的量子點配位體可利用標準生物接合反應(yīng)提供含有硫醇基或N-羥基琥珀酰亞胺酯部分的交聯(lián)分子的可能性。另一種方法可為使用量子點與帶電接頭分子之間或量子點與經(jīng)修飾而并入帶電域的蛋白質(zhì)之間的靜電作用。可重復所述官能化步驟以添加或改變官能團。舉例來說，經(jīng)抗生蛋白鏈菌素涂布的量子點可與經(jīng)生物素標記蛋白質(zhì)或抗體組合使用。諸如使用(i)針對特異性靶的抗體，(ii)針對第一抗體的經(jīng)生物素標記的二次抗體，以及(iii)經(jīng)抗生蛋白鏈菌素涂布的量子點的三層法可允許量子點標記如本文中所揭露的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段。許多潛在表面連接基團可用于將不同官能團"移植"到個別量子點中，從而產(chǎn)生多能探針。舉例來說，除識別部分外，可使量子點具備膜交連或細胞內(nèi)化能力和/或酶促功能。肽可經(jīng)定制，且通過選擇序列，單步表面活性劑交換可產(chǎn)生必要的功能(i)保護核心/殼層結(jié)構(gòu)且維持原始量子點光物理學，(ii)溶解量子點，(iii)提供生物界面，以及(iv)允許并入多種功能。所得粒子可具有膠體性質(zhì)、光物理學以及生物適應(yīng)性，且所述"肽工具包"可適合于提供其他官能團。所述官能團可通過分子演化來改進?？墒褂没罴毎麑嶒?諸如全細胞標記、標記膜結(jié)合蛋白質(zhì)以及細胞質(zhì)或細胞核標靶標記)進行細胞或病原體檢測、細胞追蹤以及細胞譜系研究。此可通過量子點的微量注射、電穿孔或吞噬在不經(jīng)任何官能化的情況下實現(xiàn)?？梢允沽孔狱c耙向細胞表面蛋白質(zhì)的方式探究不同類型的官能化。一些實例包含抗生蛋白鏈菌素、二次抗體或一次抗體、受體配位體(諸如表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)或血清素)、識別肽以118及親和性對，諸如使標靶蛋白質(zhì)工程化后的生物素-抗生物素蛋白。另一策略可由使一次抗體與量子點交聯(lián)組成。一些蛋白質(zhì)可由肽識別，所以可使用肽以供量子點官能化。微量注射可允許將經(jīng)適當靶向肽序列官能化的量子點傳送到線粒體或細胞核中。量子點的長期穩(wěn)定性和亮度使其成為活動物耙向和成像的候選者。在合成中，新組成可使量子點必然具有以下性質(zhì)，諸如(i)對電場或磁場的靈敏性；(ii)較窄的熒光發(fā)射和較長的壽命(使用鑭系金屬摻雜量子點)；(iii)較小的尺寸和如三元混合物所證明的NIR光譜的擴展；(iv)納米桿量子點的末端特異性官能化；(V)抑止閃爍和量子產(chǎn)率增加；以及(Vi)內(nèi)建式啟閉開關(guān)或光電生物轉(zhuǎn)換器。生物轉(zhuǎn)換器光激發(fā)量子點可將其電荷轉(zhuǎn)移到充當電子或空穴接受體的結(jié)合酶，從而使得其控制能夠通過光活化進行。相反地，量子點可通過電子或空穴供體酶經(jīng)化學發(fā)光發(fā)亮。納米材料的肽涂層可為賦予有機-無機界面新穎功能的手段?？墒褂冒雽w的能帶隙(通過合理設(shè)計)與肽的氧化還原電勢(通過分子演化)的同時工程化設(shè)計優(yōu)化量子點組成和用于結(jié)合的肽序列以及所需光學、電子、磁性以及化學性質(zhì)。總之，不同的形狀、末端特異性以及組成可產(chǎn)生更復雜的生物無機結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)可用作細胞機構(gòu)的光電子界面。量子點可用作對比試劑與MRI、PET、計算機斷層成像以及IR熒光成像(后者通過表皮直接成像或通過導管基共焦纖維顯微鏡)組合用于功能成像?；铙w內(nèi)光學活檢可證實病理學，且隨后可通過將能量(用于k-殼層吸收的單色X射線或激光IR輻射)沉積于靶向量子點中來選擇性、局部以及臨時性地進行治療?；蛘?，有可能將治療性酶移植到量子點表面且通過光將其活化或通過光學循環(huán)量子點產(chǎn)生自由基(諸如單重態(tài)氧)。成像儀器多種儀器可用于成像和診斷如本文中所揭露的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽以及其片段。對探針的監(jiān)測可由(1)測量系統(tǒng)和(2)分析軟件組成。測量系統(tǒng)可包含所有光學器件、電子器件以及照明樣品的方式(例如，光源選擇)、測量模式(例如，熒光或透射)以及最適于由測量提取所需結(jié)果的校正。分析軟件可包含以有意義的方式分析和呈現(xiàn)重要結(jié)果所必需的所有軟件和數(shù)學算法。測量可使用與以下系統(tǒng)連接的幾乎任何光學系統(tǒng)進行例如垂直或倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、微距透鏡、內(nèi)窺鏡以及底部照相機。此外，可使用任何標準實驗方法，包含光透射(明視場和暗視場)、所投與的探針的自發(fā)熒光和熒光等。熒光測量可用任何標準濾光片組(由屏障濾光片、激發(fā)濾光片以及二色鏡組成)或用于專門應(yīng)用的任何定制濾光片組進行，只要發(fā)射光譜屬于系統(tǒng)靈敏度的光譜范圍內(nèi)。光譜生物成像也可與任何標準空間濾光法(諸如暗視場和相差)且甚至與偏振光顯微術(shù)組合使用。放射性核素標記探針可通過PET或單光子發(fā)射斷層成像(single-photonemissiontomography,SPECT)檢測，探針發(fā)射光(熒光、生物發(fā)光或MR發(fā)射)可通過光學成像檢測，且無線電波發(fā)射可通過MRI檢測。小動物裝置可用于放射性核素基成像(例如，微SPECT和微PET)、可見光光學成像(使用靈敏的冷卻電荷耦合裝置(charged-coupleddevice,CCD)照相機)和NIR發(fā)射。解剖學(微MRI和微CT)和分子成像技術(shù)(微PET、微SPECT以及NIR熒光成像)的組合可有助于獲得分子和功能信息且監(jiān)測特定分子治療功效。非侵襲性報導體基因檢定可用于活動物的分子成像研究。使用直接結(jié)合FESP探針或單純皰疹病毒1型胸苷激酶(herpessimplexvirustype1-thymidinekinase,HSVl-TK)，經(jīng)放射性核素標記的探針可用于監(jiān)測活小鼠中報導體基因的表達。HSV1-TK可用經(jīng)正電子標記的胸苷類似物監(jiān)測。如同F(xiàn)DG，作為酶依賴性磷酸化的結(jié)果，己糖激酶的間接底物探針HSV1-TK的正電子標記底物可保留在細胞中。對光學成像檢定來說，酶從其底物產(chǎn)生的光可用靈敏的CCD照相機監(jiān)測?？捎脽晒?、生物發(fā)光或放射性核素探針成像的編碼融合蛋白質(zhì)的新穎報導體基因可允許用許多不同成像探針和適于不同應(yīng)用的儀器研究單個動物。微PET儀器可提供對功能檢定的較佳解剖學區(qū)分例如精確定位器官中腫瘤的位置、更精確地確定細胞遷移的位置等。熒光介導的斷層成像可改進光學成像程序的分辨率和定量。光譜成像技術(shù)可區(qū)分多個熒光探針的發(fā)射，從而準許同時分析不同光學探針且顯著降低背景自發(fā)熒光。多肽和文庫的非天然氨基酸掃描待經(jīng)取代以調(diào)節(jié)多肽的活性或性質(zhì)的氨基酸的鑒別可通過定點突變誘發(fā)來進行。調(diào)節(jié)功能的本發(fā)明的多肽和多肽文庫中的氨基酸可通過在多肽的任何或所有位置用非天然編碼氨基酸代替天然氨基酸來鑒別或調(diào)節(jié)?？赏ㄟ^所屬領(lǐng)域中已知的方法將天然編碼氨基酸取代到多肽的選定位置中，所述方法諸如定點突變誘發(fā)或丙胺酸掃描突變誘發(fā)(例如參看Cunningham等人，1989)，所述揭露案是以引用的方式全部并入本文中。丙胺酸掃描突變誘發(fā)程序在分子中的選定或每個殘基處引入單個丙胺酸突變。代替取代天然編碼氨基酸丙胺酸，用非天然編碼氨基酸取代多肽鏈中的天然編碼氨基酸。隨后就生物活性使用適于測量特定多肽或蛋白質(zhì)的功能的檢定測試所得包括非天然編碼氨基酸的突變型多肽分子。尤其受關(guān)注的可為用非天然編碼帶電氨基酸或非天然編碼中性氨基酸取代天然編碼帶電和/或中性氨基酸。所述取代可產(chǎn)生具有高度希望的經(jīng)改進或調(diào)節(jié)特征的蛋白質(zhì)，所述特征諸如經(jīng)調(diào)節(jié)的受體結(jié)合、經(jīng)調(diào)節(jié)的酶活性、經(jīng)調(diào)節(jié)的抗原結(jié)合或經(jīng)調(diào)節(jié)的聚集或溶解性。實例提供以下實例以說明而不是限制本發(fā)明。實例1本實例描述可與非天然氨基酸多肽一起形成的接合物。分子可直接鍵結(jié)至多肽中的一個或一個以上非天然氨基酸或可通過連接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子連接。圖9呈現(xiàn)通過在并入多肽中的非天然氨基酸的羰基與分子的羥胺之間形成肟鍵的反應(yīng)來位點特異性地連接至多肽的分子的非限制性實例?？蓪?但不限于)熒光團、生物素以及螯合劑的分子連接至非天然氨基酸多肽。實例2可使用樹脂或所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員己知的其它物質(zhì)分離多肽。圖10展示利用與非天然氨基酸反應(yīng)的樹脂的非天然氨基酸的純化方法的實例。共價鍵形成于樹脂上的化學特異性親和性標簽與蛋白質(zhì)中存在的非天然氨基酸之間。所述鍵聯(lián)在寬范圍的pH值和純化條件下穩(wěn)定。分離步驟可以交替模式進行，所交替模式包含(但不限于)能夠進行大規(guī)模純化的浴模式。樹脂與親和性標簽在物理上和化學上都是穩(wěn)定的，且因此可重復使用以降低規(guī)模擴大后的蛋白質(zhì)純化的成本。分離可與多肽與分子(包含(但不限于)PEG)的接合組合進行。所述"一鍋式"方法進一步簡化接合過程且降低蛋白質(zhì)(包含(但不限于)標靶治療蛋白質(zhì))的制造成本(圖11)?？山雍系钠渌肿影?但不限于)熒光團?？筛鶕?jù)多肽中所存在的非天然氨基酸選擇且官能化用于純化的樹脂或其它物質(zhì)。圖12展示樹脂選擇和官能化的實例。視多肽中所存在的非天然氨基酸而定，可不同地官能化用于純化的樹脂或其它物質(zhì)。舉例來說，圖13展示使用羥胺樹脂親和力純化非天然氨基酸多肽的實例。圖14展示使用醛樹脂純化非天然氨基酸多肽的實例。展示羥胺樹脂及醛樹脂的非限定性實例。在一些實施例中，純化過程的一個或一個以上步驟將多肽中所存在的一個或一個以上非天然氨基酸修飾為一個或一個以上天然氨基酸。圖15展示從非天然氨基酸前驅(qū)體純化天然蛋白質(zhì)的實例。在從純化過程中所使用的樹脂釋放后，使非天然氨基酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸。圖16展示非天然氨基酸的非限定性實例。121實例3非天然氨基酸掃描突變誘發(fā)這一實例詳述包含非天然編碼氨基酸的hGH多肽在大腸桿菌中的克隆和表達。這一實例也描述一種評估經(jīng)修飾hGH多肽的生物活性的方法?？寺GH和其片段的方法詳述于美國專利第4,601,980號、第4,604,359號、第4,634,677號、第4,658,021號、第4,898,830號、第5,424,199號以及第5,795,745號中，其是以引用的方式并入本文中。編碼全長hGH和成熟形式的缺乏N末端信號序列的hGH的cDNA分別展示于SEQIDNO:21和SEQIDNO:22中。關(guān)于完整全全長天然存在GH氨基酸序列以及成熟天然存在GH氨基酸序列和天然存在突變體，參看SEQIDNO:1、SEQIDNO:2以及SEQIDNO:3。使用包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)的所引入翻譯系統(tǒng)來表達含有非天然編碼氨基酸的hGH。O-RS優(yōu)先用非天然編碼氨基酸氨酰基化O-tRNA。轉(zhuǎn)而翻譯系統(tǒng)回應(yīng)所編碼的選擇密碼子將非天然編碼氨基酸插入hGH中。表1:O-RS和O-tRNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>用含有經(jīng)修飾hGH基因和正交氨?；鵷RNA合成酶/tRNA對(對所需非天然編碼氨基酸具特異性)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌允許將非天然編碼氨基酸位點特異性地并入hGH多肽中。在37'C下在含有介于0.01-100mM之間的特定非天然編碼氨基酸的培養(yǎng)基中生長的經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌以高保真度和高效率表達經(jīng)修飾hGH。含有非天然編碼氨基酸的經(jīng)His標簽標記的hGH是由大腸桿菌宿主細胞以包涵體或聚集體形式產(chǎn)生。在6M鹽酸胍中在變性條件下將聚集體溶解且進行親和力純化。在4'C下在50mMTRIS-HCl(pH8.0)、40CuS04和2%(w/v)Sarkosyl中通過透析進行再折疊過夜。隨后將物質(zhì)以20mMTRIS-HC1(pH8.0)、100mMNaCl、2mMCaCl2透析，接著移除His標簽。參看Boissel等人，(1993)268:15983-93。用于純化hGH的方法在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知且由SDS-PAGE、西方印跡分析(WesternBlotanalysis)或電噴霧-電離離子阱質(zhì)譜以及其類似方法證實。使用ProBond鎳螯合樹月旨(ProBondNickel-ChelatingResin;Invitrogen，Carlsbad,CA)通過由制造商提供的標準經(jīng)His標簽標記的蛋白質(zhì)純化程序，接著通過陰離子交換管柱，之后負載于凝膠上來純化經(jīng)His標簽標記的突變型hGH蛋白質(zhì)。為進一步評估經(jīng)修飾hGH多肽的生物活性，使用測量hGH與其受體的相互作用的下游標記物的檢定。hGH與其內(nèi)源產(chǎn)生的受體的相互作用使得人類IM-9淋巴細胞系中的信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄活化因子家族成員STAT5的酪氨酸磷酸化。從IM-9cDNA文庫中鑒別出STAT5的兩種形式STAT5A和STAT5B。例如參看Silva等人，Mol.Endocrinol.(1996)10(5):508-518。IM-9細胞上人類生長激素受體對人類生長激素具有選擇性，而不對大鼠生長激素和人類催乳激素具選擇性產(chǎn)生可檢測的STAT5磷酸化。重要的是，大鼠GHR(L43R)胞外域與帶有hGH的G120R高效競爭hGH剌激的pSTAT5磷酸化。用本發(fā)明的hGH多肽刺激IM-9細胞。人類IM-9淋巴細胞是購自ATCC(Manassas,VA)且在補充有丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素(Invitrogen,Carlsbad,SanDiego)以及10%熱滅活胎牛血清(Hyclone,Logan，UT)的RPMI1640中培養(yǎng)。將MI-9細胞在檢定培養(yǎng)基(無苯酚紅的RPMI、10mMHepes、1%熱滅活木炭/葡聚糖處理的FBS、丙酮酸鈉、青霉素以及鏈霉素)中饑餓過夜，之后在37'C下用12點劑量范圍的hGH多肽刺激10分鐘。將經(jīng)刺激的細胞用1%甲醛固定，之后在冰上用90%冰冷甲醇滲透1小時。通過用初級磷酸基STAT5抗體(CellSignalingTechnology,Beverly,MA)在室溫下細胞內(nèi)染色30分鐘，接著用PE接合二次抗體染色來檢測STAT5磷酸化程度。在FACS陣列上進行樣品獲取，其中所獲取的數(shù)據(jù)是用Flowjo軟件(TreeStarInc.,Ashland,OR)分析。自利用SigmaPlot以平均熒光強度(MFI)對蛋白質(zhì)濃度繪制的劑量反應(yīng)曲線得到EC50值。下表2概述由突變型hGH多肽產(chǎn)生的IM-9數(shù)據(jù)。如所述用人類IM-9細胞測試各種在不同位置處具有非天然氨基酸取代的hGH多肽。在所指示位置處用對乙?；交彼徇M行所示取代。使用相同檢定評估經(jīng)聚乙二醇化的包括非天然氨基酸的hGH多肽的生物活性。由表中所示的數(shù)據(jù)，顯然受體結(jié)合活性根據(jù)用非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸的位置而存在差異。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>實例4這一實例詳述經(jīng)修飾hIFN多肽在大腸桿菌中的克隆和表達。這一實例演示包含非天然編碼氨基酸的hIFN多肽可如何表達于大腸桿菌中。參看Nagata等人，Nature,第284巻，316-320(1980)和美國專利第4,364,863號。編碼全長hIFN和成熟形式的缺乏N末端信號序列的hIFN的cDNA分別展示于SEQIDNO:23和SEQIDNO:24中。在不改變氨基酸序列的情況下優(yōu)化用于克隆和表達的序列之后，將全長和成熟hlFN編碼cDNA插入pBADHISc、pET20b以及pET19b表達載體中。使用包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)的所引入的翻譯系統(tǒng)來表達含有非天然編碼氨基酸的hGH。O-RS優(yōu)先用非天然編碼氨基酸氨?；疧-tRNA。轉(zhuǎn)而翻譯系統(tǒng)回應(yīng)所編碼的選擇密碼子將非天然編碼氨基酸插入hGH中。適用于干擾素表達的O-RS和O-tRNA序列包含實例3中的展示的那些序列。用含有經(jīng)修飾hIFH基因和正交氨?；鵷RNA合成酶/tRNA對(對所需非天然編碼氨基酸具特異性)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌允許將非天然編碼氨基酸位點特異性地并入hlFN多肽中。在37'C下在含有介于0.01-100mM之間的特定非天然編碼氨基酸的培養(yǎng)基中生長的經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌以高保真度和高效率表達經(jīng)修飾hIFN。含有非天然編碼氨基酸的經(jīng)His標簽標記的hlFN是由大腸桿菌宿主細胞產(chǎn)生且經(jīng)親和力純化。用于純化hlFN的方法在所屬領(lǐng)域中眾所周知且由SDS-PAGE、西方印跡分析或電噴霧-電離離子阱質(zhì)譜以及其類似方法證實。結(jié)合檢定如美國專利第6,566,132號、第5,889,151號、第5,861,258號、第5,731,169號、第5,578,707號(其是以引用的方式并入本文中)中所述來制備hIFN受體。對于包括非天然氨基酸的非聚乙二醇化多肽來說，可通過使用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的BIAcore生物傳感器(Pharmacia)技術(shù)測量激素對其受體的親和性。BIAcore生物傳感器檢定用于測量包括在表3中所示的位置處取代的非天然編碼氨基酸的hIFN分子的結(jié)合特征以及受體結(jié)合數(shù)據(jù)。由表中所示的數(shù)據(jù)，顯然受體結(jié)合活性根據(jù)用非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸的位置而存在差異。表3IFNa2A變體Kd(nM)IFNa2A變體KdCnM)SigmaIFNaA116His-Q61pAF216His-IFNa2A66His-N65pAF7ClSIFNa2A116His曙E78pAF7ClSE107pAF96His-Y89pAF96His-F36S13006His-E96pAF126His陽F38L186His-I100pAF106His-F38S426His-G102pAF276His-L9pAF146His-V103pAF146His-R12pAF86ffis國T106pAF8.6His-R13pAF146His-E107pAF56His-M16pAF186His-P109pAF176His-I24pAF56His-L110pAF136His-F27pAF86His-E113pAF196His-K31pAF526His-L117pAF86His-H34pAF46His-R120pAF46His-G37pAF126HisY122S3006His-P39pAF176His-R125pAF196His-E41pAF166ffis-K134pAF106His-N45pAF76His-R149pAF756His-Q48pAF176His-E159pAF3.56ffis-K49pAF10實例5蛋白質(zhì)與寡核苷酸之間的接合物和復合物在診斷和治療(諸如免疫PCR、基因治療以及最近RNAi的靶向傳送)中具有廣泛應(yīng)用。位點特異性接合使得能夠產(chǎn)生特異性設(shè)計的分子和具有新穎功能的納米結(jié)構(gòu)。目前位點特異性接合已主要通過馬來酰亞胺化學實現(xiàn)，其中工程化蛋白質(zhì)表面半胱氨酸選擇性地與馬來酰亞胺反應(yīng)以形成硫醚。非天然氨基酸位點特異性地并入多肽中的發(fā)展已使得大量化學能夠用于分子與蛋白質(zhì)的接合。已將超過30個非天然編碼氨基酸位點特異性地并入蛋白質(zhì)中。在此實例中，使用如下所述的非天然氨基酸作為手柄，使寡核苷酸與蛋白質(zhì)位點特異性地接合。此外，使用單鏈DNA作為模板，以確定方式在一維程度上裝配接合蛋白質(zhì)。這一實驗中所使用的蛋白質(zhì)為人類生長激素Y35突變體，其中酪氨酸35由非天然編碼氨基酸9.2代替(流程1)。在-8(TC下，將單鏈DNA以25mM溶液形式存儲于水中。ssDNAFTam27的序列為5'-CAGCCAGCGTGCACG(SEQIDNO:21)。用酰肼修飾FTam27的5'。模板序列為FTam28-dh5'-CGTGCACGCTGGCTGCGTGCACGCTGGCTG(SEQIDNO:21);FTam-d2:5'-CGTGCACGCTGGCTGTCGTGCACGCTGGCTG(SEQIDNO:22);FTam28-d3:5'-CGTGCACGCTGGCTGTTCGTGCACGCTGGCTG:FTam28-tl(SEOIDNO:23):5'-CGTGCACGCTGGCTGCGTGCACGCTGGCTGCGTGCACGCTGGCTG(SEOIDNO:24):FTam28-t2:5'-CGTGCACGCTGGCTGTCGTGCACGCTGGTCTGCGTGCACGCTGGCTG(SEQIDNO:25);FTam28-t3:5'-CGTGCACGCTGGCTGTTCGTGCACGCTGGTTCTGCGTGCACGCTGGCTG(SEQIDNO:26)。蛋白質(zhì)單鏈DNA接合使用PDIO凝膠過濾管柱將蛋白質(zhì)(Img)緩沖液交換至反應(yīng)緩沖液(150mMNaCl，20mMNaOAc，400mMArg，5mMEDTA，pH4.0)中。使用10kDMWCOCENTROCON(Vivascience)將蛋白質(zhì)溶液濃縮為90微升。將5微升25mM具有酰肼5'修飾的ssDNAFTam27的水溶液分配到40微升反應(yīng)緩沖液中。將ssDNA溶液緩慢添加到蛋白質(zhì)溶液中。最初出現(xiàn)沉淀，但又溶解。在28'C下培育20小時后，添加5mM氰基硼氫化鈉。將反應(yīng)混合物再培育20小時且使其經(jīng)受分析和純化。接合物的純化使用1毫升苯基HIC管柱進行接合物的FPLC純化。緩沖液A:2MNaCl，10mMTrisHC1，pH7.0;緩沖液B:10mMTrisHC1，pH7.0。純化中所使用的梯度為10管柱體積(columnvolume,CV)0%B，5CV到50%B，在50。/。B下保持5CV，然后30CV到100%B。濃縮經(jīng)純化接合物，與存儲緩沖液(200mMNaCl，50mMTris*HC1，1mMEDTA，pH8.0)進行緩沖液交換且在MES緩沖液中以200V使用4-12%SDS凝膠使其經(jīng)受PAGE分析。雜交將5微升蛋白質(zhì)-ssDNA接合物添加到于存儲緩沖液(200mMNaCl，50mMTris.HCl，lmMEDTA，pH8.0)中的互補ssDNA中。向混合物中補充存儲緩沖液以產(chǎn)生20微升的最終體積且在42'C下加熱30秒，隨后冷卻到室溫。通過在125V，4'C下天然TRIS甘氨酸凝膠電泳3至5小時分析最終產(chǎn)物。NaCNBHs■5'ssDNAhGH流程1:hGH突變體(Y35/非天然氨基酸9.2)與在5'末端處經(jīng)酰肼修飾的單鏈DNA的接合流程將具有1,3二酮部分的非天然編碼氨基酸9.2并入人類生長激素(hGH)中的氨基酸位置35處，且用作與在5'處經(jīng)酰肼官能團修飾的15mer單鏈DNAFTam27接合(流程1)的手柄。這一接合最初產(chǎn)生腙，所述腙進一步被氰基硼氫化鈉還原以產(chǎn)生不可逆的共價鍵。在5倍過量的ssDNA的情況下，獲得70%的產(chǎn)率(圖17)。使用HIC管柱將接合物純化到約90%純且使其經(jīng)受雜交。接合物經(jīng)設(shè)計以與具有兩個(d)或三個(t)其間具有零個(1)、一個(2)以及兩個(3)堿基T作為間隔基的串聯(lián)互補序列(FTam28)重復的ssDNA雜交(圖18)。為確定hGH-DNA接合物的相對濃度，將5微升hGH-ssDNA接合物與一系列濃度的FTam28-d3(具有兩個與FTam27互補的重復序列和兩個在其間作為間隔基的T堿基的單鏈DNA)混合。將結(jié)果用4'C下，125V3小時的14。/。天然甘氨酸凝膠電泳分析(圖19)。最完全的雜交是與4微升10nMFTam28-d3混合的5微升hGH-ssDNA，其產(chǎn)生約16nM的接合物濃度。根據(jù)凝膠，具有FTam28-d3的hGH-ssDNA和hGH-ssDNA雜交單體比hGH自身更易移動，可能歸因于DNA主鏈上的大量負電荷。所述現(xiàn)象也在對照實驗中得到證明(圖20)。當將hGH與1微升100FTam28-d3混合時，未觀察到雜交(泳道4)。另一方面，當將1微升100FTam28-d3與hGH-ssDNA接合物混合時，通過雜交形成hGH二聚體。hGH與DNA之間不存在非特異性相互作用。所接合hGH的二聚作用為特異性DNA雜交的結(jié)果。當添加大大過量的FTam28-d3時，形成較多雜交單體和較少雜交二聚體。當將80皮摩爾hGH-ssDNA接合物與10當量FTam28-d3混合時(泳道3)，出現(xiàn)實質(zhì)量的雜交二聚體。此指示雜交二聚體在熱力學上比雜交單體更穩(wěn)定。為證明蛋白質(zhì)-ssDNA以充分確定的方式裝配(圖21)，使用單鏈DNA作為模板裝配六個一維結(jié)構(gòu)的hGH。所述結(jié)構(gòu)因各hGH分子之間不同的價數(shù)和間隔基而不同。將hGH-ssDNA與1當量各DNA模板混合。將混合物在5(TC下培育5分鐘，冷卻到室溫且在天然甘氨酸凝膠上分析。所述一維結(jié)構(gòu)被高度有效地裝配。泳道1至泳道3展示DNA序列重復之間分別具有零、一和二個T堿基的間隔基的二聚體形成的結(jié)果。泳道4至泳道6展示具有零、一以及三個T堿基作為間隔基的間隔基的三聚體形成的裝配結(jié)果。使用非天然編碼氨基酸作為化學手柄，使單鏈DNA位點特異性地與蛋白質(zhì)表面接合。這一單鏈DNA-蛋白質(zhì)接合物可用于使用DNA作為模板高度有效地裝配蛋白質(zhì)一維結(jié)構(gòu)。位點特異性寡核苷酸接合也可用于裝配產(chǎn)生具有新穎功能的新穎納米結(jié)構(gòu)的充分確定的三維結(jié)構(gòu)。此外，蛋白質(zhì)-寡核苷酸接合技術(shù)可適用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)藥物"即插即用(plugandplay)"文庫。在此情況下，寡核苷酸可用作編碼個別小分子和/或蛋白質(zhì)的鍵聯(lián)與"名稱標簽"。蛋白質(zhì)-寡核苷酸接合物可用于免疫PCR以供診斷應(yīng)用。這一技術(shù)也可用于產(chǎn)生可用于靶向RNAi療法中的蛋白質(zhì)RNA或PNA接合物。應(yīng)了解本文中所述的實例和實施例僅出于說明性目的且所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將提出根據(jù)其的各種修飾或更改且其包含在本申請案的精神和范圍和隨附權(quán)利要求書的范疇內(nèi)。雖然本文中已展示和描述本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見所述實施例僅以舉例的方式提供。在不悖離本發(fā)明的情況下，現(xiàn)在所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將想到許多變化、更改和取代。應(yīng)了解，本文中所述的本發(fā)明的實施例的各種替代形式可用于實施本發(fā)明。希望隨附權(quán)利要求書界定本發(fā)明的范疇且從而涵蓋權(quán)利要求書范疇內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)以及其等效物。權(quán)利要求1.一種檢測多肽的方法，其包括檢測所述多肽中的非天然編碼氨基酸側(cè)鏈。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽是使用選自由以下方法組成的群組的技術(shù)檢測免疫檢定、微陣列、顯微術(shù)、熒光顯微術(shù)、電子顯微術(shù)、電泳、光譜學、顯色反應(yīng)、放射性檢測、無線電發(fā)射、亞原子粒子檢測、金屬結(jié)合、螯合、結(jié)構(gòu)或構(gòu)象變化、酶活性、特異性結(jié)合、攝影術(shù)、磁場測量、傳感器、電磁能檢測、基因表達、可見或不可見光檢測、溫度檢測以及化學檢測。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述免疫檢定選自由以下檢定組成的群組放射性免疫檢定、酶聯(lián)免疫吸附檢定、酶倍增免疫檢定、微粒酶免疫檢定、發(fā)光免疫檢定以及熒光免疫檢定。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述光譜學選自由以下方法組成的群組SELDI、MALDI、熒光光譜學、NMR、UV-Vis以及X射線結(jié)晶學。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述電泳選自由以下方法組成的群組凝膠電泳、區(qū)帶電泳、等電點聚焦電泳、毛細管電泳、毛細管區(qū)帶電泳、毛細管凝膠電泳、毛細管等速電泳、毛細管等電點聚焦電泳以及毛細管電色譜法。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽是由核糖體合成。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述非天然氨基酸多肽經(jīng)翻譯后修飾。8.—種檢測多肽的方法，其包括檢測所述己經(jīng)翻譯后修飾的多肽中的非天然編碼氨基酸側(cè)鏈。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述多肽使用選自由以下方法組成的群組的技術(shù)檢測免疫檢定、微陣列、顯微術(shù)、熒光顯微術(shù)、電子顯微術(shù)、電泳、光譜學、顯色反應(yīng)、放射性檢測、無線電發(fā)射、亞原子粒子檢測、金屬結(jié)合、螯合、結(jié)構(gòu)或構(gòu)象變化、酶活性、特異性結(jié)合、攝影術(shù)、磁場測量、傳感器、電磁能檢測、基因表達、可見或不可見光檢測、溫度檢測以及化學檢測。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述免疫檢定選自由以下方法組成的群組放射性免疫檢定、酶聯(lián)免疫吸附檢定、酶倍增免疫檢定、微粒酶免疫檢定、發(fā)光免疫檢定以及熒光免疫檢定。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述光譜學選自由以下方法組成的群組SELDI、MALDI、熒光光譜學、NMR、UV-Vis以及X射線結(jié)晶學。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述電泳選自由以下方法組成的群組凝膠電泳、區(qū)帶電泳、等電點聚焦電泳、毛細管電泳、毛細管區(qū)帶電泳、毛細管凝膠電泳、毛細管等速電泳、毛細管等電點聚焦電泳以及毛細管電色譜法。13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述多肽是由核糖體合成。14.一種檢測所述多肽中非天然編碼氨基酸側(cè)鏈的方法，其包括使所述非天然編碼氨基酸側(cè)鏈與包括與所述非天然編碼氨基酸側(cè)鏈特異性相互作用的官能團的分子接觸。15.—種篩檢分子文庫的方法，其包括a)使包括非天然編碼氨基酸的多肽與所述文庫分子在允許所述文庫分子與所述包括非天然編碼氨基酸的多肽相互作用的條件下組合，b)鑒別所述與所述包括非天然編碼氨基酸的多肽相互作用的文庫分子。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述非天然氨基酸多肽是由核糖體合成。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸的側(cè)鏈經(jīng)翻譯后修飾。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述非天然氨基酸多肽是由核糖體合成。19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述文庫為化學文庫或生物文庫。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述化學文庫為有機文庫或無機文庫。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述生物文庫分子選自由以下各物組成的群組蛋白質(zhì)、肽、多肽、DNA、RNA、病毒、核糖體、翻譯復合物、噬菌體、細菌以及酵母。22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述文庫分子與所述多肽的所述相互作用為所述文庫分子與所述多肽的特異性結(jié)合。23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述文庫分子與所述多肽的所述相互作用為所述文庫分子與所述多肽的共價鍵形成或復合物形成。24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其進一步包括以下步驟c)回收與所述非天然氨基酸多肽相互作用的文庫分子；以及d)從所述文庫分子分離所述非天然氨基酸多肽，從而獲得經(jīng)分離文庫分子。25.—種核糖體制造的多肽的文庫，其包括多個具有不同氨基酸序列的多肽，其中各多肽包括非天然氨基酸。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的文庫，其中各多肽包括相同非天然氨基酸。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的文庫，其中各多肽包括不同非天然氨基酸。28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的文庫，其中至少一種多肽經(jīng)翻譯后修飾。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的文庫，其中所述多肽除所述非天然編碼氨基酸外為一致的。30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的文庫，其中各多肽與包括天然氨基酸的多肽同源。31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的文庫，其中各多肽除所述非天然氨基酸的位置外為一致的。32.—種純化多肽鏈中具有非天然編碼氨基酸的多肽的方法，其包括使所述多肽和與所述多肽中的非天然編碼氨基酸相互作用的物質(zhì)接觸。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述物質(zhì)為選自由液相色譜法、氣相色譜法以及超臨界流體色譜法組成的群組的色譜基質(zhì)。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述液相色譜法選自由分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法、薄層色譜法以及親和力色譜法組成的群組。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述液相色譜法選自由HPLC、管柱色譜法以及批處理法組成的群組。36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述多肽與所述物質(zhì)的所述接觸在微流體裝置中發(fā)生。37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述多肽與所述物質(zhì)的所述接觸在納米流體裝置中發(fā)生。38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述分配色譜法選自由正相色譜法、反相色譜法以及離子對色譜法組成的群組。39.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述薄層色譜法選自由紙色譜法、薄層色譜法以及電色譜法組成的群組。40.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述親和力色譜法選自由配位體色譜法、染料色譜法、金屬螯合物色譜法、免疫親和力色譜法以及疏水性相互作用色譜法組成的群組。41.一種純化多肽鏈中具有非天然編碼氨基酸的多肽的方法，其包括使所述多肽沉淀，其中當與多肽鏈中無非天然編碼氨基酸的所述多肽的溶解性相比時，所述非天然編碼氨基酸改變所述多肽的溶解性。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述沉淀通過選自由鹽、酸、堿以及聚合物組成的群組的化合物進行。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述純化是通過免疫沉淀法達成。44.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述物質(zhì)是磁性物質(zhì)。45.—種純化多肽側(cè)鏈中具有非天然編碼氨基酸的核糖體制造的多肽的方法，其包括使所述多肽電泳，其中當與多肽側(cè)鏈中無非天然編碼氨基酸的所述多肽的電泳遷移率相比時，所述非天然編碼氨基酸改變所述多肽的電泳遷移率。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述電泳選自由凝膠電泳和毛細管電泳組成的群組。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述凝膠電泳選自由區(qū)帶電泳和等電點聚焦電泳組成的群組。48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述毛細管電泳選自由以下方法組成的群組毛細管區(qū)帶電泳、毛細管凝膠電泳、毛細管等速電泳、毛細管等電點聚焦電泳、毛細管電色譜法、膠束電動毛細管色譜法、等速電泳以及瞬時等速電泳。49.一種純化多肽側(cè)鏈中具有非天然編碼氨基酸的核糖體制造的多肽的方法，其包括使所述多肽透析，其中當與多肽側(cè)鏈中無非天然編碼氨基酸的所述多肽的擴散速率相比時，所述非天然編碼氨基酸改變所述多肽的擴散速率。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述透析是電透析。51.—種純化非天然氨基酸多肽的方法，其包括通過超濾純化所述多肽。52.根據(jù)權(quán)利要求32、41、45或49所述的方法，其中所述多肽是在微生物中表達。53.根據(jù)權(quán)利要求32、41、45或49所述的方法，其中所述多肽是在選自由大腸桿菌(Esc/je〃.c&'aco//)、熒光假單胞菌(i^eMctowowcw^/7MoreyceAW)、枯草桿菌(5acz7/iwsw6/z7/51)、酵母、哺乳動物細胞以及昆蟲細胞組成的群組的微生物中產(chǎn)生。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述非天然氨基酸多肽為含有親和性標簽的雜交肽。55.根據(jù)權(quán)利要求32、41、45或49所述的方法，其中所述非天然氨基酸多肽經(jīng)翻譯后修飾。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述翻譯后修飾是通過肟交換反應(yīng)達成。57.根據(jù)權(quán)利要求32、41、45或49所述的方法，其中所述非天然氨基酸經(jīng)翻譯后修飾以包括肟基團。58.—種方法，其包括a)在具有至少一種已知生物活性的預選定多肽中的單個預選定位點處用非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸；和b)測量所述包括所述非天然編碼氨基酸的預選定多肽的生物活性；以及c)比較步驟b)的所述預選定多肽與已在所述預選定多肽鏈的不同位置處用非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸的預選定多肽或多肽鏈中無取代非天然編碼氨基酸的預選定多肽的生物活性。59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述多肽鏈中的用于以非天然編碼氨基酸取代的所述預選定位置為連續(xù)的。60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中對于所述多肽鏈中的每一個別位置重復在所述預選定多肽鏈的單個位點處用所述非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸。61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中用相同非天然編碼氨基酸取代。62.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中用不同非天然編碼氨基酸取代。63.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述預選定多肽鏈中一個以上的位置經(jīng)非天然編碼氨基酸取代。64.—種選擇用于翻譯后修飾預選定多肽的位置的方法，其包括a)在具有至少一種已知生物活性的預選定多肽中的單個預選定位點處用非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸；和b)測量所述包括所述非天然編碼氨基酸的預選定多肽的生物活性；以及c)比較步驟b)的所述預選定多肽與已在所述預選定多肽鏈的不同位置處用非天然編碼氨基酸取代天然編碼氨基酸的預選定多肽或多肽鏈中無取代非天然編碼氨基酸的預選定多肽的生物活性。.65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述翻譯后修飾為與水溶性聚合物偶合。66.—種包括一種多肽的組合物，所述多肽在所述多肽的一個或一個以上特定氨基酸位置處與核酸分子共價連接，其中所述多肽和核酸分子共價連接至所述多肽的一個或一個以上非天然編碼氨基酸的氨基酸側(cè)鏈。全文摘要本發(fā)明公開了檢測非天然氨基酸和包含至少一個非天然氨基酸的多肽的方法。自身或作為多肽的一部分的非天然氨基酸可包含多種官能團，包含(但不限于)肟基、羰基和/或羥胺基。本發(fā)明還公開了經(jīng)進一步翻譯后修飾的非天然氨基酸多肽和檢測所述多肽的方法。文檔編號C12P21/06GK101454461SQ200680043001公開日2009年6月10日申請日期2006年11月16日優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日發(fā)明者安娜-瑪麗亞·A·海斯·普特南,鋒田,苗振偉,英·布徹勒申請人:Ambrx公司