專利名稱：：可變?nèi)莘e電穿孔室以及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及體外細(xì)胞和小泡的電穿孔。更具體地說，本發(fā)明涉及在電穿孔室、尤其是總?cè)莘e具有按照需要加以變化的易處理室中對細(xì)J包和'J、泡進(jìn)行電穿孔。
背景技術(shù)：
：以下描述包括可以用于理解本發(fā)明的信息。它并不是承認(rèn)任何這樣的信息是現(xiàn)有技術(shù)，或與目前要求的發(fā)明有關(guān)，或明確地或隱含地提及的任何出版物是現(xiàn)有技術(shù)。電穿孔
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充滿轉(zhuǎn)染生物細(xì)胞和小泡的活體外方式。例如，授權(quán)給Meserol的美國專利第5,720,921號披露了一種電穿孔室，其被i殳計(jì)成連續(xù)液流室，其中小泡被輸送到該室、電穿孔并在施加電穿孔脈沖以后^皮清洗。其它液流室包括授權(quán)給Nicolau(U.S.P.N.5,612,207)、Dzekunov(U.S.RA.N.2001/0001064)、以及Vernhes(U.S.P.N.6,623，964)的美國專利。在每一種這些披露內(nèi)容的情況下，對于電穿孔生物細(xì)胞的臨床應(yīng)用，液流室并不是一種最佳設(shè)計(jì)。這是因?yàn)闉榱藷o菌性必須解決的機(jī)械問題并且由于難以在細(xì)胞群體的電穿孔和當(dāng)細(xì)月包連續(xù)通過室時(shí)所4吏用的月永沖之間建立聯(lián)系。還"l皮露了其它的電穿孔室，其中并沒有使用含有(承載)小泡的介質(zhì)的連續(xù)液流，但電穿孔室裝置包括各種元件。例如，授權(quán)給Marshall的美國專利第4，906，576號4皮露了一種室，其連同其它元件一起具有^茲芯。授權(quán)給Jarvis的美國專利第6,897,069號披露了一種具有可移除電極的電穿孔樣品室。其它室是用于處理小樣品的小池型(cuvettestyle),即，約250jxl至1.5ml。還有其它室，如在4ti又給Walters的WO04/083,379中所才皮露的，4是供更大的容積，即，達(dá)到10毫升左右，但這樣的室并不是動態(tài)的，因?yàn)槭业某叽缡枪潭ǖ牟⑶也捎玫碾姌O是兩個(gè)平行板，該板僅用于包含小泡的介質(zhì)的固定范圍的電導(dǎo)率，其必須相對于容積/細(xì)月包密度和傳送到固定容積室的電導(dǎo)率加以計(jì)算。在Walters專利中，例如，介質(zhì)的電導(dǎo)率4皮降低，使得可以處理并在單個(gè)電穿孔事件中電穿孔較大的容積。具體地說，對介質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得介質(zhì)具有0.01至1.0毫西門子的電導(dǎo)率(100-1000歐姆的電阻)。在許多情況下，調(diào)節(jié)介質(zhì)的電導(dǎo)率并不是所希望的或不現(xiàn)實(shí)的，因?yàn)樽罾硐氲慕橘|(zhì)是鹽水基介質(zhì)，其是內(nèi)在導(dǎo)電的并為細(xì)胞提供穩(wěn)定的和能生存的環(huán)境。鹽水基介質(zhì)是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儽辉O(shè)計(jì)為4是供4妻近地類似細(xì)胞的自然生活環(huán)境的環(huán)境，從而使細(xì)胞死亡降至最小程度。最廣泛使用的介質(zhì)之一是磷酸緩沖鹽溶液(PBS),其是內(nèi)在導(dǎo)電的，這是起因于溶液的離子含量。在基因治療裝置中通常需要活體外轉(zhuǎn)染患者的細(xì)胞，其中從患者移出細(xì)胞，如祖細(xì)胞和其它所謂的"干"細(xì)胞，然后在細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞的數(shù)目擴(kuò)大許多倍。因?yàn)橥ǔＴ趹腋∨囵B(yǎng)中進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)大，所以這樣的細(xì)l包在其中擴(kuò)大的容積是非?？勺兊摹Ａ硗?，就它們在培養(yǎng)物中的存活而言以及就電穿孔過程而論，細(xì)胞密度是重要的。因此，在期望轉(zhuǎn)染大量細(xì)胞的情況下，個(gè)別樣品之間的容積差異可能是高度可變的。這意p未著，在臨床裝置中，一種才幾構(gòu)必須用來加入處理步驟以使樣品之間的容積變得均勻，以致可以使用固定尺寸的電穿孔室，或必須存在一種^M勾，用于適應(yīng)在這樣的介質(zhì)容積方面的差異而無需直接調(diào)節(jié)容積或細(xì)胞密度和/或適應(yīng)介質(zhì)的特定的低電導(dǎo)率。另外，通常利用具有相對較高電導(dǎo)率的介質(zhì)對懸浮液中的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，如磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，其具有0.017西門子/cm的電導(dǎo)率。當(dāng)試圖電穿孔大量的包含能生存的生物細(xì)胞的介質(zhì)時(shí)，甚至考慮使用具有0.4cm間隙的室，因此將需要較大的電流來同時(shí)對整個(gè)容積施加力永沖，這是由于試圖施加脈沖通過4交大^黃截面積所產(chǎn)生的低電阻，從而將可能受到損傷，或在脈沖條件下經(jīng)受可變性。而一些發(fā)明已設(shè)法通過設(shè)計(jì)使用低電導(dǎo)率介質(zhì)的系統(tǒng)來克服這樣的困難，這樣的系統(tǒng)的使用是不能實(shí)行的，因?yàn)榈碗x子強(qiáng)度介質(zhì)可能會4員害細(xì)月包生存力。^口最近在Cwre"fGe"eT7zera;^(Vol.5,pp375-385,2005)中指出的，目前的電穿孔方法并不是一種可行的工具來轉(zhuǎn)染某些細(xì)胞，這是由于較差的細(xì)胞存活(大約僅1%)，除非采用更加細(xì)胞友好的介質(zhì)。然而，甚至先前改善的介質(zhì)條件僅保證5-6%的細(xì)胞存活。因此，在本
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需要促進(jìn)使用活體外系統(tǒng)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞和小泡如干細(xì)胞，其中采用大容積4各式的分子，即，例如約1至高達(dá)100ml，其可以容易地和便宜地將上述分子傳送到細(xì)胞而無需在每種情況下進(jìn)行離子強(qiáng)度對容積對細(xì)胞密度的關(guān)鍵計(jì)算。因此，本發(fā)明通過提供在任何這樣的容積下其電穿孔細(xì)胞的能力為動態(tài)的系統(tǒng)來滿足上述需要。.
發(fā)明內(nèi)容在第一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種裝置，用于活體外大容積電穿孔細(xì)胞和小泡，尤其是抗原呈遞細(xì)胞、祖細(xì)胞和/或千細(xì)胞。一4殳地，這樣的容積是在1至100ml之間、通常在5至75ml之間以及優(yōu)選在10至50ml之間。干細(xì)胞是指來源于胚胎或成體來源的多能細(xì)胞，其保持可以被誘導(dǎo)以分化成各種細(xì)胞類型的表型，包括內(nèi)胚層、中胚層以及外胚層(Mendez等人，2005)。其它有用的用途包括為了4秦種疫苗和治療目的而轉(zhuǎn)染免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。借助于本發(fā)明可以轉(zhuǎn)染的免疫系統(tǒng)的細(xì)月包包4舌單核細(xì)月包、巨噬細(xì)月包、T和B、淋巴細(xì)月包、樹突細(xì)月包以及其它抗原呈遞細(xì)月包。雖然本發(fā)明涉及使用人細(xì)胞，但借助于本發(fā)明也可以處理其它物種的細(xì)胞。在第二具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于電穿孔細(xì)胞和小泡的裝置，其中所述裝置包括一種這樣的室，該室具有按照需要的能采耳又在1至100ml之間的任何遞增的容積的能力。在一種有關(guān)的具體實(shí)施方式中，該裝置可以在任何這樣的容積下進(jìn)4于才喿作，而無需相對于電極的容積或表面積調(diào)節(jié)或計(jì)算比離子強(qiáng)度，其中電極與含有所述細(xì)力包或'J、泡的介質(zhì)^妄觸。在第三具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的室包括許多單獨(dú)可尋址電才及，在一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，其能夠?qū)α黧w介質(zhì)的容積引發(fā)電脈沖而無需計(jì)算電極間隙與容積的比率，而如果僅使用跨越整個(gè)室的單電才及對，則可能需要計(jì)算電才及間隙與容積的比率。具體地說，對于使用的任何容積，脈沖條件(即，電壓、脈沖形式、以及脈沖持續(xù)時(shí)間)與所述容積無關(guān)。在一種有關(guān)的具體實(shí)施方式中，包含細(xì)胞的流體介質(zhì)的電導(dǎo)率可以包括可用于實(shí)施生物細(xì)胞和小泡的電穿孔的任何7K平的電導(dǎo)率。例如，包含細(xì)胞的介質(zhì)的電導(dǎo)率可以相當(dāng)于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)或更小。在另一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的電穿孔室可以適應(yīng)流體容積而沒有暴露于露天環(huán)境，因而可以進(jìn)4亍才喿作而不涉及或不需要在室中i殳計(jì)有空氣過濾器或排氣孔(airbleedorifice)。在另一種具體實(shí)施方式中，許多電極包括一系列的平行"板"電才及，其可以布置在本發(fā)明的室內(nèi)<吏得所述4反的長度在和對應(yīng)的可變的容積可調(diào)節(jié)性相同的方向，即，柱塞的推拉方向進(jìn)行延伸，或可以在與室容積擴(kuò)大的方向成90度的方向進(jìn)4于延伸。在一種有關(guān)的具體實(shí)施方式中，單獨(dú)的才反可以包括任〗可有用的生物相容和導(dǎo)電材料，其包括鈦和金。在一種進(jìn)一步優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，板可以包4舌通常大于只于置電才及(對電才及，opposingelectrode)之間的距離或間隙的寬度尺寸，并且甚至優(yōu)選大于間隙距離的兩倍。每個(gè)電極板可以是由電脈沖獨(dú)立地可尋址的，其中電脈沖足以對位于任何陰才及與陽才及電扭j反對之間的;容液中的生物細(xì)胞和小泡進(jìn)4亍電穿孔。在另一種具體實(shí)施方式中，電極可以包括2至100個(gè)陰極和2至100個(gè)陽才及之間的陣列，并且總是存在偶數(shù)的陰極和陽極以形成陽極和陰才及對。在又一進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，陰極和陽極可以在儲存器的相反內(nèi)側(cè)相隔0.4至1cm之間的距離，即，電脈沖必須透過的間隙大約在0.4cm至1cm之間。在又一進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，可以以2.4和29.5歐姆之間的負(fù)載電阻(以歐姆為單位)(其取決于室尺寸)對每對所述陽極和陰極進(jìn)行供能。當(dāng)室中的每個(gè)電極對被順序地供能時(shí)，將用足以發(fā)生電穿孔而又不損傷細(xì)胞的等效能量對懸浮在室中的生物細(xì)胞(與它們在室中的位置無關(guān))施加脈沖。在一種進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明可以包括各種各樣的儀器或其它部件如指示器，用于檢測和顯示給與暴露于細(xì)胞介質(zhì)的系列電極的電穿孔脈沖序列已完成的通知。用戶可使用這樣的指示器來始終監(jiān)視是否室已經(jīng)暴露于脈沖。在另一個(gè)實(shí)例中，該室可以在其設(shè)計(jì)中包括一種4建控部件(keyingfeature)來幫助以適當(dāng)?shù)娜∠驅(qū)⒃撌夜潭ㄓ谄浠淄斜P以致以適當(dāng)序列將脈沖給予到每個(gè)電極上。根據(jù)以下附圖、詳細(xì)描述、以及所附權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將是明顯的。附圖"i兌明圖1是是示出了本發(fā)明的可變?nèi)莘e室10和電才及激勵4乇盤200的透^L圖。如圖所示，室10被構(gòu)造成可拆卸地連接或安裝到托盤200上，佳j尋室的每個(gè)電扭j反11的電招j妄觸小塊(electrodecontactnub)15接觸托盤電才及接頭(電才及調(diào)整片)201。在該具體實(shí)施方式中，接觸小塊15從室外殼并從室的底部或底側(cè)引出。圖2是本發(fā)明的室的—見圖，其示出了在端口14一側(cè)室的端4見圖(側(cè)一見圖)，該端口可以以^f壬《可方式加以構(gòu)造以適合連4妄于包含待電穿孔的細(xì)胞的流體介質(zhì)源，如小型快速接頭(luerfitting)。圖3是示出了本發(fā)明的室10的分解圖的透視圖，其中示出帶有推桿13和半彈性減震墊16的柱塞(活塞)12，其共同地并可滑動地接合室10的內(nèi)壁(側(cè)面、頂部以及底部)，從而提供密封，進(jìn)而^吏流體可以吸入和4,出室(類似于注射器)。電才及11沿室10的相反側(cè)排列。該圖進(jìn)一步示出了電極接觸小塊15，在該具體實(shí)施方式中，其/人室外殼的側(cè)面突出。圖4示出了包括端口14的室IO末端的部分透視圖?？蓪в邪霃椥詼p震墊的柱塞加以定位以在室內(nèi)產(chǎn)生不同的容積。圖5是本發(fā)明的室10的俯4見圖，其示出了柱塞12已定位在室的約一半容積、17。圖6A-E示出了如在圖5中的俯視圖并且描述了電極對2至6的逐步脈沖(圖6A-E),使得每個(gè)電極對之間的電場18相對均勻地穿過電極之間的間隙距離。星號表示正被供能的電極對。圖7是一種可替換室設(shè)計(jì)的透視圖，其中本發(fā)明的室100由相對較小表面積的電才及111構(gòu)成。這樣的構(gòu)造可以用于電4及之間的間隙3巨離為約1cm的室構(gòu)造中。圖8示出了來自經(jīng)處理的細(xì)胞(如在實(shí)施例中所描述的)的平均熒光讀數(shù)。具體實(shí)施例方式如本領(lǐng)域:技術(shù)人員將明了的，以下描述詳細(xì)地描述了本發(fā)明的某些優(yōu)選具體實(shí)施方式，并JU又是示例性的而不是描述本發(fā)明的實(shí)際范圍。在詳細(xì)描述本發(fā)明以前，應(yīng)當(dāng)明了，本發(fā)明并不限于所描述的特定的裝置布置(devicearrangement),系統(tǒng)以及方法，因?yàn)樗鼈兛梢宰兓?。還應(yīng)當(dāng)明了，本文所使用的術(shù)語僅是為了描述特定的具體實(shí)施方式，而不是用于限制由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍。本發(fā)明涉及電穿孔哺乳動物細(xì)l包和其它小泡，尤其是干細(xì)月包和-組細(xì)月包的活體外方法，其中細(xì)月包凈皮懸浮在較大容積室內(nèi)的導(dǎo)電介質(zhì)中。該^交大容積室包含許多電極對，其以這樣的方式加以布置4吏得在暴露于所述流體介質(zhì)的那部分室中在對置電極的每個(gè)連續(xù)對之間的介質(zhì)暴露于電能的多個(gè)順序脈沖。在這樣的室中，并不是同時(shí)電穿孔全容積的含有生物細(xì)胞的介質(zhì)而是通過對單個(gè)電極對或可替才奐;也對電才及對的組部分i也施加月永沖來進(jìn)4亍電穿孑L。這才羊的月永沖可以順序i也在單個(gè)或"i午多對中，或交錯(cuò)廿也由一個(gè)以上的電才及對施力口樂:K沖，例如，第一和第二對電極發(fā)送脈沖，接著是第二和第三對發(fā)送月永沖，然后是第三和第四對發(fā)送脈沖，等等。在一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的專交大容積室保證將來自用于整個(gè)室的單脈沖的電脈沖載荷分為一系列更小的載荷，以避免自然發(fā)生的物理限制，其是起因于給定表面積的電極能夠施加的最大極限能量，尤其是在使用高電導(dǎo)率介質(zhì)的情況下。在一種有關(guān)的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的室還便于避免特殊的處理要求，而如果采用許多單獨(dú)的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)小池或如果采用特殊選#^的低離子強(qiáng)度介質(zhì)，則將需要上述特殊的處理要求。在固定尺寸的電穿孔中可以逐漸減小脈沖載荷，但鑒于適應(yīng)各種各樣的容積的實(shí)際需要，本發(fā)明克服了采用特殊處理要求的需要，而對固定尺寸的室而言則是必要的，如容積調(diào)節(jié)、起因于容積調(diào)節(jié)的離子強(qiáng)度變化，以及需要泵或其它裝置來輸送介質(zhì)進(jìn)出這樣的室。在另一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種使用本發(fā)明的室的方法，其中含有細(xì)^^的介質(zhì)的電導(dǎo)率大于50毫西門子(電阻小于20歐姆)并且甚至大于500毫西門子(電阻小于2歐姆)。這相反于常夫見系纟充如由Bio-Rad制造的系纟充(即，GenePulserXcellElectroporationSystem),其被規(guī)定用來在大于20歐姆的條件下進(jìn)行操作，即，優(yōu)選用于這樣的裝置的介質(zhì)電導(dǎo)率(低電導(dǎo)率)是小于50毫西門子。雖然〗吏用高電導(dǎo)率溶液可以導(dǎo)致發(fā)生電弧或與其它性能問題有關(guān)，但僅當(dāng)同時(shí)將電穿孔脈沖傳送到整個(gè)室時(shí)才可能發(fā)生這樣的問題。然而，本發(fā)明的室并不易于發(fā)生電弧，這是由于它使用來自單獨(dú)電極對的一系列脈沖，從而在被電穿孔的總?cè)莘e的任4可給定部分逐漸減小了電^永沖載荷?，F(xiàn)轉(zhuǎn)向本發(fā)明的室，在第一優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，如圖1所示，室10優(yōu)選包括矩形室，其內(nèi)部容積(取決于其構(gòu)造)能夠接收多達(dá)并且甚至大于100ml的流體介質(zhì)的容積。實(shí)際上，雖然較大容積室的設(shè)計(jì)便于容積按比例擴(kuò)大到任何容積，但本發(fā)明的裝置通常被構(gòu)造成處理在實(shí)驗(yàn)室和臨床裝置中通常要處理(experienced)的容積，即，小于100ml的容積。因此，通常，本發(fā)明的室可以優(yōu)選被構(gòu)造成容納5、10、15、20、25、30、35、40、50或甚至100ml的最大容積或在5至100ml之間的任何遞增容積的流體介質(zhì)。本發(fā)明的室10的構(gòu)造類似于注射器和柱塞，其中通過將矩形柱塞12插入矩形室來增加或減少所述室的容量。矩形柱塞^皮構(gòu)造成典型的注射器柱塞式樣，其中半彈性惰性橡膠減震墊16連接于柱塞的室側(cè)面以及柱塞桿13在另一側(cè)。在室開口(其中柱塞被插入室內(nèi)部)的末端附近，存在至少一個(gè)由調(diào)整片(tab)或室本身的端壁形成的柱塞止動件，其使柱塞免于完全脫離室內(nèi)部?？梢越?jīng)由端口14進(jìn)入室內(nèi)部，其中端口14可以^f立于室的端壁或可替才奐i也在端壁附近〗旦在頂部、底部或側(cè)壁上。該室進(jìn)一步包括許多對置陽極和陰極11。在一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，對置陰極與陽極(即，在室的相反側(cè)上的電極)之間的3巨離或間隙是在0.4cm至0.1cm之間。在特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，每個(gè)電極的寬度大于對置電極之間間隙的測量結(jié)果并且優(yōu)選大于間隙距離的兩倍。因此，電極的寬度可以在0.4至5cm的范圍內(nèi)。該特征可以保證電場的強(qiáng)度在間隙距離的范圍內(nèi)保持相對均勻，而如果距離大于電極的寬度，則電場將易發(fā)生顯著的減弱。在一種有關(guān)的具體實(shí)施方式中，布置在室中的電才及11可以垂直于柱塞的4立伸方向、或這樣設(shè)置在室中使得它們平行于柱塞拉伸的方向延伸室的長度。如圖l進(jìn)一步示出的，通過將室設(shè)置到基底接觸器托盤200中用電穿孔脈沖給室電極11供能，其中基底接觸器托盤200保證室中的電極和基底托盤200中電極接頭之間的接觸以及電能源?；?妾觸器托盤200可以包括另外的實(shí)施方式，用于控制如電極脈沖的順序?？商鎿Q地，電才及脈沖的控制可以集成到電脈沖源，即，電穿孔發(fā)生器。在又一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的室可以構(gòu)造成具有任何數(shù)目的電極對(即，包括陽極和陰極的對)，但優(yōu)選對的數(shù)目將取決于每個(gè)電才及的表面積與它們之間的間隙。這是因?yàn)?，在有具有生理范圍、即離子強(qiáng)度范圍類似于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的電導(dǎo)率的細(xì)胞介質(zhì)存在的情況下，對可以施加通過給定尺寸的間隙而沒有發(fā)生電弧的電力負(fù)載量存在物理性限制。例如，如表1所示，電極可以設(shè)計(jì)成具有各種表面積供各種間隙距離之用，從而利用各種各樣的月永沖條件來電穿孔才羊品。在每種情況下，電穿孔的實(shí)際容積與實(shí)際月永沖條件無關(guān)，因?yàn)槭襘皮構(gòu)造成併3正容易地在遠(yuǎn)^氐于最大載荷的脈沖載荷下使用電極，其中如果同時(shí)對所有電極施加脈沖則最大載荷是必要的。因此，在一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，電極可以被構(gòu)造成具有0.8至20cm2之間的表面積。對于另一個(gè)實(shí)例，對于具有最大容積20ml的室，電極數(shù)目可以在1至50之間，每個(gè)具有1至20cm2之間的表面積，其取決于對置電極之間的間隙距離。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>沒有陰影=所期望的電穿孔載荷；灰色陰影=可工作的電穿孔載荷；深色陰影=不可工作的電穿孔載荷如表1所示，室可以被構(gòu)造成具有各種各樣的最大容量、各種各樣的電才及間隙、各種各樣的電極數(shù)目，其保證逐漸減小每個(gè)脈沖的電力負(fù)載，并同時(shí)保持與在生理范圍的細(xì)胞介質(zhì)電導(dǎo)率相容。用于電穿孔的最廣泛-使用的介質(zhì)之一是PBS,由于溶液的離子含量，其是內(nèi)在導(dǎo)電的。因?yàn)镻BS具有0.017西門子/cm的電導(dǎo)率，所以在標(biāo)準(zhǔn)0.8ml小池中使用PBS將產(chǎn)生大約12歐姆的電阻負(fù)載。用小于IOO歐姆的負(fù)載電阻進(jìn)行電穿孔是難以實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)樽畛Ｒ?guī)的電穿孔設(shè)備不能在低電阻的范圍內(nèi)進(jìn)行操作。例如，由Biorad制造的電穿孔設(shè)備，具體地說，GenePulserXcell具有/>布的20歐姆的低載荷限制。其它設(shè)備如BTX電穿孔發(fā)生器具有限制，其是基于設(shè)備、導(dǎo)線以及連接(connections)的固有容量。在導(dǎo)線、連接器以及電容器中要求0.2歐姆至1歐姆電阻并不是不合理的。當(dāng)在這樣的系統(tǒng)中對2歐姆載荷施加脈沖時(shí)，在設(shè)備中可以損失多達(dá)33%的電穿孔電壓(和能量)。另外，低電阻載荷還引起其它困難，其是起因于需要較大的沖擊電流。這些復(fù)雜情況可以進(jìn)一步包括瞬時(shí)轉(zhuǎn):換信號噪聲、4義器可靠性以及樣品加熱。就本發(fā)明而論，我們已發(fā)現(xiàn)，將載荷分為負(fù)栽電阻為2歐姆或用于^寺電穿孔的介質(zhì)的整個(gè)容積的單個(gè)電相^于施加力永沖。在一種有關(guān)的具體實(shí)施方式中，使用生理離子強(qiáng)度可保證電穿孔過程的簡化，因?yàn)榧?xì)胞可以摘:取自細(xì)胞培養(yǎng)物、用PBS洗滌、以及直接放入可變?nèi)莘e室中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員明了的，使用中，制備患者細(xì)胞群體樣品，如擴(kuò)大的干細(xì)胞或其它祖細(xì)胞的群體，用于分送到室中。通常，在其中對細(xì)l包進(jìn)4亍處理的介質(zhì)具有相當(dāng)于生理鹽水的離子強(qiáng)度。另外，取決于特定的細(xì)胞樣品，樣品的容積大約在5至50ml的范圍內(nèi)。在用包含細(xì)胞的介質(zhì)填充室以后，將該室力文置在基底托盤中并將傳感器加入托盤中以確定暴露于流體介質(zhì)的電極數(shù)目。在包括載荷才企測器、或電極暴露于流體介質(zhì)的具體實(shí)施方式中，檢測器可以測量這才羊的要素如電流。然后，在4全測了脈沖的適當(dāng)電一及以后，從室的一端到另一端，對暴露于介質(zhì)的電極的每個(gè)相反對逐步施加脈沖。可^^纟奐地，可以以各種各樣的形式對電才及施加力永沖。例如，不是一個(gè)^妄一個(gè)地逐步給一對對置電纟及施加^永沖，而是可以對兩個(gè)對置電招J寸同時(shí)施加萬永沖，^接著乂于第二個(gè)兩個(gè)相反對施加月永沖?？梢砸灾丿B形式對電才及進(jìn)一步施加力永沖，其中，例如，在對電才及的兩個(gè)相反對施加脈沖以后，接著的要給予脈沖的電才及可以和已經(jīng)剛一皮給予脈沖的相鄰電極同時(shí)纟皮施加脈沖。在每種情況下，脈沖的形式將可能提供足夠的電能來電穿孔在樣品中的所有細(xì)胞。另外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所很好明了的，填充室的每個(gè)操作、柱塞的移動、以及電才及的〖敫活者卩可以通過單調(diào)方式來完成，如通過電子i殳備或電動機(jī)。實(shí)施例以下實(shí)施例是用來i兌明本發(fā)明的某些方面具體實(shí)施方式、以及用途，以及幫助本4頁i或才支術(shù)人員實(shí)施它。該實(shí)施例并不以<壬<可方式限制本發(fā)明的范圍。該實(shí)施例描述了一系列實(shí)驗(yàn)，其中利用了一系列三個(gè)小池對單個(gè)小池。在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)燒瓶中并在補(bǔ)充有10%胎兒牛血清和90g/ml艮他霉素的Mcoy:s介質(zhì)中將鼠B16細(xì)胞(ATCCCRL6475)培養(yǎng)成單層。利用0.05%月夷蛋白酶和0.02%EDTA的溶液，,人燒并瓦中除去細(xì)胞。在除去以后，通過在225xg下的離心作用并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞三次，然后懸浮在小容積的PBS中。利用標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺盼藍(lán)排阻染料對得到的懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)。大約90%的細(xì)月包是能生存的。在計(jì)lt的懸浮液中細(xì)胞的濃度^皮調(diào)節(jié)到1xio6個(gè)細(xì)力包/ml。細(xì)胞以1:1比率與120新鮮制備的釣黃綠素溶液(在PBS中)進(jìn)^亍〉'昆合，然后利用BTXT820電穿3U永沖發(fā)生器進(jìn)4亍電處理。在標(biāo)準(zhǔn)4mm間隙電穿孔小池或三寫關(guān)(triple)小池中對細(xì)胞進(jìn)行處理，其中三聯(lián)小池是通過緊密并置三個(gè)4mm間隙電穿孔小池而制成，并在中心小池和每個(gè)相鄰小池之間插入有月交質(zhì)玻璃隔離物。在組裝前，對膠質(zhì)玻璃隔離物和待并置的中心和末端小池的側(cè)面進(jìn)4亍機(jī)械力cr工，以使流體可以在三個(gè)小池之間流動。使用了三聯(lián)小池的三種不同的才莫型。一種才莫型在相鄰小'池之間具有2mm間隔，另一種模型在小池之間具有3mm間隔，以及第三種模型在相鄰小池之間具有4mm隔離物。通過應(yīng)用一個(gè)電極作為陽極和另一個(gè)電極作為陰極(其被集成到裝置中)，將"永沖施加于標(biāo)準(zhǔn)4mm間隙小池。然而，以非常特定的方式將脈沖施加于三聯(lián)小池。首先施加脈沖穿過末端小池的4mm間隙。才妄著施力口月永穿過中心小;也的4mm間隙。最后，施力口月永沖穿過另一末端小池的4mm間隙。手控開關(guān)盒用來將脈沖,人BTXT820電穿孔電源引導(dǎo)到三聯(lián)小池。在單個(gè)和所有三個(gè)三耳關(guān)小池中，通過施加標(biāo)稱場強(qiáng)為1600V/cm的8個(gè)直流脈沖，對與鈣黃綠素混合的B16細(xì)胞進(jìn)行處理。只十于單個(gè)小池，施力o—纟且8個(gè)月永沖。對于每個(gè)三聯(lián)小;也，施力口三纟且月永沖，每《且為8個(gè)月永沖。4尋一ia施力o穿過每個(gè)連#:的d、;;也的4mm間隙。在電處理以后，從小池移走B16細(xì)胞并在37。C下溫育20分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞三次，同時(shí)通過離心作用(225xg)在洗滌之間進(jìn)行造粒。在洗滌以后，將在每個(gè)樣品中的細(xì)胞再懸浮在400(il的PBS中并利用熒光孩i量滴定4反讀出器(Biotek)進(jìn)行熒光光i普(spectrafluorametrically)分沖斤。i亥分沖斤包4舌^f來自每個(gè)才羊口口口的三個(gè)100pl等分的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行分析。計(jì)算平均熒光數(shù)據(jù)以獲得每個(gè)樣品的單個(gè)讀數(shù)。匯集來自三份樣品的平均數(shù)據(jù)。圖8示出了平均熒光讀數(shù)，其來自暴露于鈣黃綠素(沒有被施加脈沖)的細(xì)胞、暴露于鈣黃綠素并在單個(gè)室中被施加脈沖的細(xì)胞、以及暴露于鈣黃綠素并在三個(gè)三聯(lián)室中被施加脈沖的細(xì)胞。數(shù)據(jù)表明，相對于僅暴露于釣黃綠素的細(xì)胞，在所有四種類型的小池中施加電場均導(dǎo)致增加的細(xì)力包焚光。才艮據(jù)本文4皮露的內(nèi)容，可以進(jìn)4亍和執(zhí)行本文4皮露和要求的所有結(jié)構(gòu)(《且成，composition)和方法，而無需過度的實(shí)馬全。雖然已通過優(yōu)選的具體實(shí)施方式描述了本發(fā)明的結(jié)構(gòu)和方法，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說明顯的是，可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對結(jié)構(gòu)和方法以及本文描述的方法的步驟或步驟順序施加變化。更具體地說，描述的具體實(shí)施方式在各個(gè)方面都僅是說明性的而不是限制性的。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說明顯的是，所有類似置換和改進(jìn)^皮i人為是在如所附4又利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。在本說明書中提及的所有專利、專利申請、以及出版物表示在與本發(fā)明有關(guān)的領(lǐng)域中技術(shù)人員的水平。所有專利、專利申請、以及出版物(包括對其要求優(yōu)先權(quán)或另外益處的那些專利、專利申請、以及出版物)以引用方式結(jié)合于本文，其結(jié)合程度與如單個(gè)出版物被具體和單個(gè)指明被結(jié)合于此作為參考是一樣的。本文描述的發(fā)明可以適當(dāng)?shù)卦跊]有任何在本文中未具體4皮露的元件的情況下加以實(shí)施。因此，例如，在本文的每一種情況下，任何術(shù)語"包括"、"基本上由…組成"、以及"由…組成"可以用其它兩個(gè)術(shù)語的4壬何一個(gè)加以代替。已采用的術(shù)語和表達(dá)是用作描述的而不是限制的術(shù)語，因此使用這樣的術(shù)語和表達(dá)并不意p未著全部或部分地排除所示出和描述的特征的任何等效替換，而是應(yīng)當(dāng)明了，在本發(fā)明要求的范圍內(nèi)各種改進(jìn)是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)明了，雖然已通過優(yōu)選的具體實(shí)施方式和可選特征具體地4皮露了本發(fā)明，4旦本領(lǐng)i或，技術(shù)人員可以利用本文4皮露的構(gòu)思的改進(jìn)和變化，并且這樣的改進(jìn)和變化被認(rèn)為是在如由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種用于在懸浮介質(zhì)中電穿孔生物細(xì)胞和小泡的可變?nèi)莘e電穿孔室，包括形成儲存器的外殼，其中所述外殼包括所述儲存器的四個(gè)側(cè)壁、頂部以及底部；閥，所述閥包括外孔和內(nèi)腔，所述內(nèi)腔將所述孔連接至所述儲存器，所述腔與所述儲存器的所述連接位于所述外殼中；在所述儲存器內(nèi)的可滑動調(diào)節(jié)裝置，用于通過所述腔和孔將流體介質(zhì)吸入或排出所述儲存器；彼此相對平行并且沿著所述儲存器的至少兩個(gè)對置內(nèi)側(cè)壁放置的許多隔開的細(xì)長陰極和陽極，其中電極是單獨(dú)地用電脈沖可尋址的；以及連接于所述電極的電能源，其中可以用足夠電能對所述電極施加脈沖以在所述儲存器中引起包含在流體介質(zhì)中的生物細(xì)胞和小泡的電穿孔。2.才艮據(jù)^l利要求l所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述可滑動調(diào)節(jié)裝置包括4主塞。3.才艮據(jù)4又利要求1所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述室包括矩形。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述室包括圓筒形。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述柱塞包括矩形。6.才艮據(jù)4又利要求4所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述柱塞包4舌圓筒形。7.才艮據(jù)4又利要求1所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述孔包括停止旋塞以及用于連接至外部管道或其它裝置的連接器。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述許多電極包括陽極和陰極，所述陽極沿著所述儲存器的一個(gè)內(nèi)側(cè)壁排列而所述陰極沿著相反側(cè)的內(nèi)側(cè)壁進(jìn)行排列。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述電極平行于所述柱塞沿其可以在所述々者存器中滑動i也移動的纟從向排列。10.才艮據(jù)外又利要求9所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述陰才及和所述陽才及在所述儲存器的相反側(cè)上相隔0,4至1.0cm。11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述電極垂直于所述柱塞沿其可以在所述4諸存器中滑動i也移動的纟從向排列。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述陰極和所述陽才及在所述〗諸存器的相反側(cè)上相隔0.4至1.0cm。13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述許多電極包括3至20個(gè)陰才及以及3至20個(gè)陽才及，陰極和陽才及的數(shù)目總是彼此相等。14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的可變?nèi)莘e室，其中，所述陰極和陽極包括寬度在0.4至5cm之間的板。15.—種在液體介質(zhì)中活體外電穿孔生物細(xì)月包和小泡以將感興趣的分子遞送到所述細(xì)胞和小泡的方法，包括將所述細(xì)力包/小泡和所述感興趣的分子》丈置在纟又利要求1所述的電穿孔室中，其中通過在將所述液體介質(zhì)引導(dǎo)入所述儲存器的方向上滑動所述柱塞而將所述細(xì)力包/小泡和分子吸入所述儲存器；將所述室"&置在包括電能源的底座中并激活所述電能源以將電能的至少一個(gè)電穿孔脈沖給予每對暴露于所述液體介質(zhì)的陰才及和陽才及；通過在迫使所述細(xì)胞/、泡流出所述儲存器的方向上滑動泡，從而將所述感興趣的分子遞送到所述細(xì)胞和小泡。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括通過測量電流信號來才全測穿過電才及間隙的載荷。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述生物細(xì)月包包4舌哺乳動物;^且細(xì)力包和/或干細(xì)月包。全文摘要本發(fā)明披露了一種室式裝置，用于體外電穿孔相對較大容積的含有生物細(xì)胞或小泡的流體介質(zhì)，其中用于含有所述細(xì)胞和小泡的儲存器的容積可按照需要加以變化并且其中所選容積直接與待電穿孔樣品的容積有關(guān)。該裝置具有進(jìn)一步的具體實(shí)施方式，其中室是易處理的并且可以以與患者分離或與其相連的方式進(jìn)行操作。文檔編號C12M1/42GK101370927SQ200680046389公開日2009年2月18日申請日期2006年12月7日優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日發(fā)明者安德烈·S·蓋米林申請人:基因特倫尼克斯公司