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      用于微陣列的反應(yīng)緩沖液的制作方法

      文檔序號:433236閱讀:229來源:國知局
      專利名稱:用于微陣列的反應(yīng)緩沖液的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      0001本發(fā)明具##及用于微陣列的緩沖液。更具體地,本發(fā)明具##及
      用于微陣列的核酸擴增和雜交的集成反應(yīng)的緩沖液。
      背景技術(shù)
      0002核酸擴增技術(shù)提供了研究遺傳材料的強有力工具。聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)是頻率使用較高的技術(shù)之一,其廣泛用于克隆、基因表達分析、DNA 測序、基因圖譜、藥物開發(fā)、犯罪勘驗等領(lǐng)域。
      0003對于許多應(yīng)用而言,除了擴增耙核酸序列以外,使用核酸雜交探針 皿一步鑒定序列也是有用的。探針的實例可以是與全部或部分耙序列互補的 標記的單鏈多核苷酸。探針雜交可以提供比簡單PCR擴增更多的序列選擇性, 并且允許獨立鑒定耙核酸序列內(nèi)的多個序列位點。
      0004通常,PCR和探針雜交步驟作為獨立的反應(yīng)進行。最近,使用含核
      酸擴增試齊訴n雜交試齊啲單一試劑混合物,已將獨立的反應(yīng)集成為一個單一反
      應(yīng)。集成反應(yīng)的眾多優(yōu)點之一包括,可減少試劑的添加步驟,并可降低試劑的 4頓消耗。
      0005同時分析多基因的方法,該需求一直在增加。微陣列是諸如科學、 臨床和環(huán)境分析的理想平臺,因為微陣列的微小體積可以允許以相對狹小的空 間和反應(yīng)體積,排列成百上千的生物探針。微陣列是附著于固體表面的DNA顯 微陣點的集合,其可形成陣列用于表達分析(可同時監(jiān)觀喊百上千基因的表達 水平)。集成的核酸擴增反應(yīng)和雜交反應(yīng),可用于微陣列領(lǐng)域以優(yōu)化分析。
      0006目前,用于集成反應(yīng)的緩沖液具有較高的反應(yīng)溫度,其可導致膨脹 和反應(yīng)容器的潛在滲漏。較高的反應(yīng)溫度也可導致氣泡產(chǎn)生而干擾雜交信號的 識別。
      附圖簡述
      0007在并未必然按比例繪制的附圖中,相同的數(shù)字記載了所有各l見圖的 基本相似組件。帶有不同字母后綴的相同數(shù)字,表示不同實例的基本相似組件。附圖通常是以實例的方式而不是以限制的方式,來解釋本申請所討論的各具體 實施方式。
      0008

      圖1顯示了某些具體實施方式
      的檢測或定量核酸方法的方法框架流 程圖100。
      發(fā)明
      0009本發(fā)明具體涉及用于核酸擴增和雜交集成反應(yīng)的緩沖液組合物。緩 沖液包括約50-200mM的鹽,約10-30mM的Tris-HCl,約2-10mM的水可溶性 f魏,約0.05-1.5%的表面活性劑,約0.05-0.15mg/ml的穩(wěn)定化蛋白,約50-300nM 的一種或多種引物,約20-150|nM的一種或多種dNTPs,約5-15%的甘油,約 0.5-1.5 %的甲翻安,和至少約5單^/ml的聚合酶。本發(fā)明也具,及檢測或定 量核酸的方法。
      發(fā)明詳述
      0010下文詳述包括參照附圖的相關(guān)內(nèi)容,該內(nèi)容構(gòu)成本發(fā)明詳述的一部 分。附圖通過圖示來顯示本發(fā)明用以實施的具體實施方式
      。這些
      具體實施例方式
      (在本文中也稱為"實施例"),被記載得足夠詳細以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠 實施本發(fā)明。這些具體實施方式
      可以組合,可以利用,或者在不偏離本發(fā)明范 圍的情況下,可以進行結(jié)構(gòu)性和邏輯性改變。因此,下文詳述不認為是對本發(fā) 明的限制,即,本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書和其類似的文書予以限定。
      0011在本文中,術(shù)語"a"或"an"用于是指包括一個或多于一個,術(shù)語
      "or"用于表示非排除性的"或",除非另有說明。此外,應(yīng)當理解用在本文中 的措詞和術(shù)語,如果沒有相反的解釋,其僅用于說明的目的而不是限制的目的。 此外,本文獻所涉及的所有公開文獻、專禾訴口專禾湘關(guān)文獻,都全文合并至本 文作為參考,盡管它們可單獨合并作為參考。在本文與那些合并作為參考的文 獻內(nèi)容并不一致的情形下,合并參考文獻的內(nèi)容應(yīng)當認為是本文獻內(nèi)容的內(nèi)容 補充;對于相互矛盾的不一致情形,貝U應(yīng)以本文內(nèi)容為準。
      0012本發(fā)明具,及用于微陣列的核酸擴增和雜交集成反應(yīng)的緩沖液。 緩沖液組合物提供了用于微陣列的用以成功進行兩反應(yīng)的試劑和pH環(huán)境。而 且,本緩沖液可在核酸擴增反應(yīng)中斷氐退力鵬約8-約10攝氏度,從而可增強 反應(yīng)中的有效密封并減少因膨脹所致的滲漏幾率。本發(fā)明具體實施方式
      的緩沖 液,與目前〗頓的緩沖液相比,具有更高的雜交效率。此外,本緩沖液使用時的DNA變性、TO,比4頓常規(guī)緩沖液時,低大約5-約10攝氏度。所述較低的 溫度有利于反應(yīng)室的密閉和雜交信號的分析,因為較高的溫度可增加膨脹壓力 進而可增加反應(yīng)緩沖液的滲漏風險。
      0013艦圖1 ,根據(jù)某些具體實施方式
      ,示出了一個檢測或定量核酸的方 法框架流程圖100??梢栽谙嗤木彌_液中擴增核酸102,其中可以雜交核酸 104。該集成反應(yīng)可用于產(chǎn)生核酸樣品而形成微陣列106。然后分析微陣列結(jié)果 亂
      0014核酸擴增102,例如可以是聚合 反應(yīng)(PCR)。待擴增的核酸片 段取決于所選的弓胸。弓l物是與待擴增核酸片段的起始端或終末端互補的較短 人工核酸鏈。弓卿在這些起始位點和終末位點通過粘附核酸模板而退火,在那 里,核酸聚合酶結(jié)合并開始新核 合成。
      0015弓,長度和解鏈鵬(Tm)的選擇,取決于多種因素。引物的解鏈 溫度定義為, 一半的弓卿結(jié)合位點被占據(jù)時的a^。特別短的弓卿可在較長核 酸模板的多個位置發(fā)生退火,由此,其會導致非特異性的復制拷貝。反言之, 弓嫩的長度受限于允許使用的解鏈最大溫度,這是因為解鏈 M會隨著弓l物的 長度增加而增加。解鏈,太高會產(chǎn)生問題,因為核酸聚合酶在該溫度下可能 減低活性。例如,弓l物長度通常為約15到約40個核苷酸,其解鏈鵬為約55 。C到約65。C。
      0016PCR步 常由20到35個循環(huán)系列組成。每一循環(huán)包括下列步驟: 將雙鏈核酸,例如DNA,加熱至足以變性核酸樣品或分離雙鏈的 鵬。例如, 顯度為約94-98"。在第一次循環(huán)之前,核酸可以變性稍長時間,以確保模板核 酸與弓卿完全分離,及然后僅形成單鏈。此外,有些聚合酶在此步驟被激活。
      0017在分離核酸各鏈之后,降低溫度以使引物能自身與核酸單鏈結(jié)合, 即退火。退火溫度取決于引物,其通常比引物的解鏈溫度約低5°C。例如,本發(fā) 明具體實施方式
      提供了可斷氐退火MJt約8-約10。C的緩沖液,所述退火溫度的 降低有利于密閉。退火步驟期間的錯誤纟鵬,可導致弓l物根本不與模板核酸結(jié) 合或者導致弓,的隨機結(jié)合。
      0018核酸聚合酶可以最終復制核酸鏈。核酸聚合酶可以從退火的弓嫩開 始,沿著核^f繊行,即延伸。延伸aS取決于核酸聚合酶。Taq聚合酶,例如 在約72"C^jg下延伸。延伸步驟的時間,取決于核酸聚合 身和待擴增的核酸片段的長度。最后一輪循環(huán)之后進行最終延伸步驟,以確保任何剩余單鏈核 酸被完全復制。
      0019雜交104,例如可以包括探針雜交。雜交探針,例如可以是核酸截短 片段(short piece of nucleic add),例如DNA,所述核酸截短片段先變性為單鏈 和然后再進行放射標記,例如使用磷。將放射性磷引入至核酸的單個核苷酸的 磷酸基團,由此,通過與聚合酶溫育而引入至核賺骨架。這樣可以產(chǎn)生具有 已知序歹啲截短片段的方爐標記核酸,其與任意互補核醚連雜交、。探針可用于 Northern或Southern印跡,以檢測與其具有同源性(含有相似的g^對序列的 區(qū)域)的基因或RNA轉(zhuǎn)錄本。雜交探針的位置可以利用微陣列來確定。例如, 緩沖液中包含有放射或熒光標記(即帶有熒光染料分子附著的dNTPs)的 dNTPs,由此每輪PCR循環(huán)完成之后,所獲得核酸都是方M標記或熒光的。
      0020微陣列例如可以包括由本發(fā)明具體實施方式
      的集成反應(yīng)所產(chǎn)生的顯 微的核酸位點的集合,其連結(jié)于諸如玻璃、塑料或硅芯片的固體表面。微陣列 可形成以用于表達分析譜,例如同時監(jiān)測上千個基因的表達水平。
      0021實時PCR和雜交可用于同時定量和擴增給定核酸分子的特定部分。 例如,它可用于確定樣品中是否存在某特定序列,如果存在,它可確定樣品中 的復制數(shù)。本發(fā)明緩沖液可用于實時PCR微陣列,例如這樣的微陣列記載在通 認的美國專利申請
      發(fā)明者孫震宏, 亮 許 申請人:霍尼韋爾國際公司
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