專利名稱：依尼奧小單孢菌西索霉素生物合成基因簇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗生素合成領(lǐng)域，具體涉及一種依尼奧小單孢菌西索霉素生物合成基因簇。
背景技術(shù)：
微生物是生物制藥的重要源泉，放線菌位居首位。用依尼奧小單孢菌生產(chǎn)西索霉素已有報(bào)道，但是產(chǎn)量較低。抗生素產(chǎn)生菌的生物合成基因幾乎總是與其抗性基因相連鎖，從研究抗性基因入手有望從根本上提高小單孢菌生物合成抗生素的能力；借助抗性基因，可以方便地克隆相關(guān)抗生素生物合成基因簇。我國(guó)在小單孢菌基因克隆方面的研究少見(jiàn)報(bào)道，并且國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道西索霉素生物合成基因簇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種依尼奧小單孢菌西索霉素生物合成基因簇，該基因簇揭示了生物合成西索霉素的相關(guān)DNA序列，對(duì)應(yīng)的開(kāi)放性閱讀框，基因排列順序和可能的基因功能。
本發(fā)明的依尼奧小單孢菌西索霉素生物合成基因簇，其堿基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。其基因簇的分子量(37.739/1.575)*106≈23.96*106；幾何結(jié)構(gòu)DNA如附圖所示。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)為本發(fā)明首次從依尼奧小單孢菌Ts388中克隆到西索霉素生物合成基因，這些基因可用于研究西索霉素的生物合成機(jī)制，基因的功能，基因的組織和生物合成的基因調(diào)控等；對(duì)這些基因進(jìn)行改良，有可能得到高產(chǎn)的優(yōu)良菌種，用于工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)生豐厚的利潤(rùn)；利用這些基因進(jìn)行重新組織，或利用這些基因與其它基因進(jìn)行重組，有可能構(gòu)建出新的生理活性物質(zhì)或新藥物，最終獲得新化合物，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


附圖為西索霉素生物合成基因簇的相關(guān)DNA序列圖。
具體實(shí)施例方式
該西索霉素生物合成基因簇的來(lái)源為依尼奧小單孢菌Ts388。
該西索霉素生物合成基因簇總長(zhǎng)約37739p，包括多個(gè)orf和2個(gè)rRNA(rRNA1和rRNA2)。該西索霉素生物合成基因簇的DNA序列涉及到西索米星的生物合成的相關(guān)酶。估計(jì)有28個(gè)左右orf，其中sisT，sisU，sisV，srmO，sisW，sisX，sisY，sisZ，srmA，sisA，sisB，sisC，sisD，sisE，sisF，sisL，SCD2，SCD3已經(jīng)確定。
該西索霉素生物合成基因簇的制備步驟為1材料和方法1.1材料(1)菌種與質(zhì)粒伊紐小單孢菌(M.inyoensis)Ts388由本研究室保存；E.coli BL21(DE3)、E.coliDH5α和質(zhì)粒pUC18均由上海來(lái)益生物藥物研發(fā)中心提供。表達(dá)載體pET-30a購(gòu)自Novagen公司。
(2)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，根據(jù)需要添加氨芐青霉素(終濃度100μg/mL)；用于伊紐小單孢菌TS388生長(zhǎng)的培養(yǎng)基見(jiàn)以下文獻(xiàn)。使用的抗生素及濃度為氨芐青霉素100μg/mL，卡那霉素50μg/mL。其它常用化學(xué)藥品及試劑購(gòu)自上海生物工程公司和華美公司。
(3)主要試劑所有的工具酶購(gòu)自TaKaRa公司；氨芐青霉素(Amp)為華美生物工程公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Pharmacia產(chǎn)品；PCR引物由上海生物工程公司合成；DNA序列由TaKaRa公司測(cè)定。
1.2基因的克隆及其測(cè)序伊紐小單孢菌TS388染色體DNA的提取見(jiàn)以下文獻(xiàn)；質(zhì)粒DNA采用堿裂解法提取，DNA酶切、連接等均按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行；采用CaCl2方法制備感受態(tài)細(xì)胞，在含有抗生素的選擇性培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。DNA采用試劑盒回收(購(gòu)自TaKaRa公司)。
從GenBank中選擇與伊紐小單孢菌親緣關(guān)系比較接近的、產(chǎn)慶大霉素的棘孢小單孢菌(M.echinospora)慶大霉素生物合成基因簇(AY524043)作為引物設(shè)計(jì)的參考模板，設(shè)計(jì)引物。PCR循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，59℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，循環(huán)30次；最后72℃保溫10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，經(jīng)相應(yīng)的限制性酶切割，開(kāi)與受同樣酶雙酶切的pUC18載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建含擴(kuò)增片段的亞克隆子，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，得到了陽(yáng)性克隆子，送TaKaRa公司測(cè)序，所得序列應(yīng)用vector NTI 9.1和Blast軟件進(jìn)行序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。
本發(fā)明的西索霉素生物合成基因簇的制備工藝、步驟、條件、收集、純化步驟和鑒定方法已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表于以下文獻(xiàn)中[1]洪文榮，許向前，朱春寶，陳代杰，朱寶泉。依紐小單胞菌2-脫氧蟹肌醇合成酶基因的克隆與表達(dá)。復(fù)旦學(xué)報(bào)，2006，45(3).283-287。
洪文榮，朱春寶，陳代杰，朱寶泉。紫蘇霉素抗性基因srml的克隆及其特性研究復(fù)旦學(xué)報(bào)，2005，44(4)549-554。
洪文榮，陳代杰，朱寶泉。依尼奧小單孢菌抗性基因sisR的克隆研究，生物工程學(xué)報(bào)，2005，21(1)，149～153。
本發(fā)明的西索霉素生物合成基因簇的DNA序列由TaKaRa公司檢測(cè)，應(yīng)用vector NTI 9.1和Blast軟件進(jìn)行序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)。
基因功能預(yù)測(cè)經(jīng)DNA序列及其蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析，與已知同類功能基因的同源性達(dá)90％以上，則初步推測(cè)其功能相似。以srmA抗性基因的功能預(yù)測(cè)為例，闡述如下sis-srmA為來(lái)自伊紐小單孢菌(Micromonosporainyoensis)Ts388的srmA基因；gen-grmA為來(lái)自產(chǎn)慶大霉素的棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora)的grmA基因srmA與grmA的DNA比對(duì)結(jié)果1 60gen-grmA-orf (1)ATGACGACATCTGCGCCTGAGGACCGTATCGACCAGGTCGAGCAGGCCATCACCAAGAGCsis-srmA-orf (1)ATGACGACATCTACGGGCGACGACCGTATCGACCAGATTCAGCAGGCCATCACCAAGAGCConsensus (1)ATGACGACATCT CG GA GACCGTATCGACCAG T AGCAGGCCATCACCAAGAGC61 120gen-grmA-orf (61)CGGCGCTACCAGACGGTGGCCCCGGCCACCGTGCGGCGCCTGGCCCGGGCTGCCCTCGTCsis-srmA-orf (61)CGGCGCTACCAGACGGTGGCCCCGGCCACCGTGCGTCGCCTGGCCCGGGCCGCCCTGGTCConsensus (61)CGGCGCTACCAGACGGTGGCCCCGGCCACCGTGCG CGCCTGGCCCGGGC GCCCT GTC121 180gen-grmA-orf (121)GCCGCGCGGGGCGACGTGCCGGACGCGGTGAAGCGCACCAAGCGCGGGCTGCATGAGATCsis-srmA-orf (121)GCCTCGCGGGGGGACGTGCCGGACGCGGTGAAGCGCACGAAGCGCGGGCTGCACGAGATCConsensus (121)GCC CGCGGGG GACGTGCCGGACGCGGTGAAGCGCAC AAGCGCGGGCTGCA GAGATC181 240gen-grmA-orf (181)TACGGGGCCTTCCTGCCGCCCAGCCCGCCCAACTACGCAGCGTTGCTGCGGCAGCTCGACsis-srmA-orf (181)TACGGCGCCTTTCTGCCGCCCAGTGCGCCTAACTACACAGCGTTGCTGCGGCACCTCGACConsensus (181)TACGG GCCTT CTGCCGCCCAG CGCC AACTAC CAGCGTTGCTGCGGCA CTCGAC241 300gen-grmA-orf (241)TCCGCTGTGGACGCCGGTGACGACGAGGCGGTCCGGGCGGCTCTGCGCCGCGCGATGTCAsis-srmA-orf (241)GCCGCAGTGGAGGCCGGTGACGACGAGGCGGTCCGTTCGTCCCTGTCTCGCGCGATGTCGConsensus (241) CCGC GTGGA GCCGGTGACGACGAGGCGGTCCG CG C CTG CGCGCGATGTC301 360gen-grmA-orf (301)GTGCATGTGTCCACTCGTGAGCGATTGCCGCACCTGGCGGAGTTCTACCAGGAGATCTTCsis-srmA-orf (301)GTGCACATGTCCACCCGAGAGCGGCTGCCGCACCTCGACGAGTTCTACCGGGAGATCTTCConsensus (301)GTGCA TGTCCAC CG GAGCG TGCCGCACCT G GAGTTCTACC GGAGATCTTC361 420gen-grmA-orf (361)CGTCACGTGCCCCAGCCCAACACGCTGCGTGACCTCGCCTGTGGCCTCAATCCGCTGGCCsis-srmA-orf (361)CGTCACGTGCCACGGCCGAACACGTTGCGTGACCTGGCGTGTGGCCTCAACCCGCTGGCCConsensus (361)CGTCACGTGCC C GCC AACACG TGCGTGACCT GC TGTGGCCTCAA CCGCTGGCC421 480
gen-grmA-orf (421)GCTCCCTGGATGGGCCTGTCGGACCAGACCGTCTACGTCGCCTCCGACATCGACGCCCGGsis-srmA-orf (421)GTGCCCTGGATGGGCCTGTCCGACGAGACCGTCTACGTCGCCTCCGACATCGACGCCCGCConsensus (421)G CCCTGGATGGGCCTGTC GAC AGACCGTCTACGTCGCCTCCGACATCGACGCCCG481 540gen-grmA-orf (481)CTGATCGGCTTCGTGGACGCCGCCCTGACGAGGCTGGGCGTCGCGCACCGTACGAGCGTGsis-srmA-orf (481)CTGATGGACTTCGTGGGCGCTGCCCTGACGAGGCTGGGGGTGGCGTACCGTACGAGCGTGConsensus (481)CTGAT G CTTCGTGG CGC GCCCTGACGAGGCTGGG GT GCG ACCGTACGAGCGTG541 600gen-grmA-orf (541)GTCGACCTCCTCGAGGACCGCCTTGACGAGCCGACCGACGTCACGCTATTGCTGAAGACGsis-srmA-orf (541)GTCGACCTCCTTGAGGCCCGCCTTGACGAGCCGGCCGACGTCACGCTATTGCTGAAGACGConsensus (541)GTCGACCTCCT GAGG CCGCCTTGACGAGCCG CCGACGTCACGCTATTGCTGAAGACG601 660gen-grmA-orf (601)CTGCCCTGTCTGGAGACTCAGCGACGAGGCTCCGGCTGGGAAGTGATTGACATTGTCAACsis-srmA-orf (601)CTCCCCTGTCTGGAGACTCAGCAACGAGGCTCCGGCTGGGAAGTGATTGACATTGTCAACConsensus (601)CT CCCTGTCTGGAGACTCAGC ACGAGGCTCCGGCTGGGAAGTGATTGACATTGTCAAC661 720gen-grmA-orf (661)TCGCCGATTATCGTGGTAACCTTCCCGACCAAGTCTCTCGGTCAGCGATCGAAGGGGATGsis-srmA-orf (661)TCGCCGATTATCGTGGTAACCTTCCCGACCAAGTCTCTCGGTCAGCGATCGAAGGGGATGConsensus (661)TCGCCGATTATCGTGGTAACCTTCCCGACCAAGTCTCTCGGTCAGCGATCGAAGGGGATG721 780gen-grmA-orf (721)TTTCAGAACTATTCACAAAGTTTTGAGTCCCAGGCCAGAGAACGGTCGTGCCGAATTCAGsis-srmA-orf (721)TTTCAGAACTATTCACAGAGTTTTGAGTCCCAGGCTAGCGAACGATCGTGCCGCATTCAGConsensus (721)TTTCAGAACTATTCACA AGTTTTGAGTCCCAGGC AG GAACG TCGTGCCG ATTCAG781 825gen-grmA-orf (781)CGACTGGAGATCGGCAACGAGCTGATTTACGTCATTCAGAAATAGsis-srmA-orf (781)CGACTGGAGATCGGCAACGAGCTGATTTACGTTATTCACAAATAGConsensus (781)CGACTGGAGATCGGCAACGAGCTGATTTACGT ATTCA AAATAGorf的DNA同源性達(dá)91.0％；ArmA與GrmA的aa比對(duì)結(jié)果1 60gen-grmA-aa(1)MTTSAPEDRIDQVEQAITKSRRYQTVAPATVRRLARAALVAARGDVPDAVKRTKRGLHEIsis-srmA-aa(1)MTTSTGDDRIDQIQQAITKSRRYQTVAPATVRRLARAALVASRGDVPDAVKRTKRGLHEIConsensus (1)MTTS DDRIDQI QAITKSRRYQTVAPATVRRLARAALVAARGDVPDAVKRTKRGLHEI61 120gen-grmA-aa (61)YGAFLPPSPPNYAALLRQLDSAVDAGDDEAVRAALRRAMSVHVSTRERLPHLAEFYQEIFsis-srmA-aa (61)YGAFLPPSAPNYTALLRHLDAAVEAGDDEAVRSSLSRAMSVHMSTRERLPHLDEFYREIFConsensus (61)YGAFLPPS PNY ALLR LDAAVDAGDDEAVRAAL RAMSVHMSTRERLPHL EFY EIF121 180gen-grmA-aa (121)RHVPQPNTLRDLACGLNPLAAPWMGLSDQTVYVASDIDARLIGFVDAALTRLGVAHRTSVsis-srmA-aa (121)RHVPRPNTLRDLACGLNPLAVPWMGLSDETVYVASDIDARLMDFVGAALTRLGVAYRTSVConsensus (121)RHVP PNTLRDLACGLNPLA PWMGLSD TVYVASDIDARLI FV AALTRLGVAHRTSV181 240gen-grmA-aa (181)VDLLEDRLDEPTDVTLLLKTLPCLETQRRGSGWEVIDIVNSPIIVVTFPTKSLGQRSKGMsis-srmA-aa (181)VDLLEARLDEPADVTLLLKTLPCLETQQRGSGWEVIDIVNSPIIVVTFPTKSLGQRSKGMConsensus (181)VDLLE RLDEP DVTLLLKTLPCLETQ RGSGWEVIDIVNSPIIVVTFPTKSLGQRSKGM
241 275gen-grmA-aa (241)FQNYSQSFESQARERSCRIQRLEIGNELIYVIQK-sis-srmA-aa (241)FQNYSQSFESQASERSCRIQRLEIGNELIYVIHK-Consensus (241)FQNYSQSFESQA ERSCRIQRLEIGNELIYVI K同源性達(dá)92.7％。
經(jīng)DNA序列和蛋白質(zhì)序列比對(duì)，其同源性達(dá)90％以上。推斷其功能與grmA相似，以下功能檢測(cè)證明了這一推測(cè)的可行性。
功能檢測(cè)(srmA對(duì)西索霉素的抗性能力)從伊紐小單孢菌(Micromonospora inyoensis)Ts388擴(kuò)增到包含紫蘇霉素抗性基因srmA的DNA序列(844bp)，并將其克隆到pUC19/18載體上。srmA基因是依靠它自身的啟動(dòng)子激活(ATG上游19bp序列)，在E.coli DH5α中表達(dá)，并不受LacZ啟動(dòng)子的控制。其開(kāi)放性閱讀框長(zhǎng)822bp，編碼含274aa的多肽鏈。預(yù)測(cè)的SrmA蛋白序列與GrmA(來(lái)自棘孢小單孢菌)的同源性依次為92.7％，其DNA序列的同源性為91.0％。srmA與grmA抗性基因具有相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)GGAGG。
srm A基因抗性范圍和抗性能力。對(duì)紫蘇霉素類及其它一些具代表性的抗生素的抗性測(cè)驗(yàn)，如四環(huán)類抗生素的金霉素(Chlortetracycline)，喹諾酮類的環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)以及亞胺青霉烯(Imipenem)等。抗性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1srm A基因的抗性范圍和抗性能力

表1的抗性檢測(cè)結(jié)果表明，srm A基因僅對(duì)紫蘇霉素類抗生素的抗性負(fù)責(zé)，功能檢測(cè)結(jié)果與推測(cè)相一致。
核苷酸序列表<110>福州大學(xué)<120>依尼奧小單孢菌西索霉素生物合成基因簇<160>1<210>1<211>37739<212>DNA<213>依尼奧小單孢菌(Micromonospora inyoensis)Ts388<220>
<223>該西索霉素生物合成基因簇總長(zhǎng)37739p，包括多個(gè)orf和2個(gè)rRNA(rRNA1和rRNA2)。
<400>1actcggatgc ttcacccccg gcacgacgct cccctaccca tccacacacc tgcaccagac 60atcaaggcct ggcgaagtaa aaatgtgaat gccacagctt cggcggtgtg cttgagcccc 120gctacattgt cggcgcggaa ccacttgacc agtgagctat tacgcactct ttaaagggtg 180gctgcttcta agccaacctc ctggttgtct atgcgacccc acatcctttt ccacttagca 240cacgcttagg ggccttagct ggtgatctgg gctgtttccc tctcgactac gaagcttatc 300ccccgcagtc tcactgccgc gctctcactt accggcattc ggagtttggc tgatttcggt 360aagcttgtgg gccccctaga ccatccagtg ctctacctcc ggcaagaaac acgcgacgct 420gcacctaaat gcatttcggg gagaaccagc tatcacggag tttgattggc ctttcacccc 480taaccacagg tcatccccca acttttcaac gttggtgggt tcggccctcc acgcggtctt 540acccgcgctt cagcctgccc atggctagat cactccgctt cgggtctaga gcatgcgact 600aaaaacgccc tattcagact cgctttcgct acggctcccc cacacgggtt aacctcgcca 660catgccacta actcgcaggc tcattcttca aaaggcacgc cgtcaccccg caaggctccg 720acggattgta ggcgaacggt ttcaggtact atttcactcc cctcccgggg tacttttcac 780cattccctca cggtacttgt ccgctatcgg tcaccaggaa gtatttaggc ttaccaggtg 840gtcctggcag attcacggca gatttcagga gtccgccgct actcgggaac acccacagaa 900ggtcagcaac tttcacctac cggactctca ccgcctacgg tcagcctttc cagactgttc 960ggctagccac tgactttata actcctcgaa cacgtgtcag catgttcagc agggtcccac 1020aaccccgacc acgcaacccc tgacaggtat cacacgcagc cggtttagcc tcaatccgct 1080ttcgctcgcc actactcacg gaatcactat ttgttttctc ttcctacggg tactgagatg 1140tttcacttcc ccgcgttccc cccatacacc ctatgtgttc aggtgcaggt gacatcacat 1200gactgatgcc aggtttcccc attcggacac cctgggatca cagcttggtt gacagctccc 1260ccaggcctat cgcggcctcc cacgtccttc atcggctcct ggtgccaagg catccaccgt 1320tcgcccttga caacttgacc acaaagatgc tcgcgtccac tgtgcaattc tcaaccaacg 1380accaacccac aacccaccac atcccacacc taaacccaca cggatccggt ttgcgagacc 1440aggtcatgcc tggcagtaat cacctagaag aaccaaccac cacgggttgt tccttcagga 1500cccaacaggg tgccatccgc ccctccccag ccgcaccaca acccccgttc caccaccccc 1560gaagagatgc gtactagaag attccggccg ttgccaggga aaaactcacc agtgtctccg 1620ccatcgagca ccccgacccg acattcgcag gtcgcgggct ccttaccacc cttcggtgga 1680aggtgctcct tagaaaggag gtgatccagc cgcaccttcc ggtacggcta ccttgttacg 1740acttcgtccc aatcgccagc cccaccttcg acggctccct ccacaagggt tgggccaccg 1800gcttcgggtg ttgccgactt tcgtgacgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt 1860attcaccgca gcgttgctga tctgcgatta ctagcgactc cgacttcacg gggtcgagtt 1920gcagaccccg atccgaactg agaccggctt tttgggattc gctccacctc acggtatcgc 1980agcccattgt accggccatt gtagcatgcg tgaagccctg gacataaggg gcatgatgac 2040ttgacgtcat ccccaccttc ctccgagttg accccggcag tcttcgatga gtccccgcca 2100
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權(quán)利要求
1.一種依尼奧小單孢菌西索霉素生物合成基因簇，其特征在于其堿基序列如序列表中SEQID NO.1所示。
全文摘要
本發(fā)明從西索米星產(chǎn)生菌依尼奧小單孢菌Ts388高產(chǎn)菌株中克隆到西索米星生物合成基因簇，該基因簇總長(zhǎng)約37739p，包括多個(gè)orf和2個(gè)rRNA(rRNA1和rRNA2)；分子量(37.739/1.575)*10
文檔編號(hào)C12N15/31GK101045930SQ20071000867
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2007年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日
發(fā)明者洪文榮, 李殿殿, 許向前, 林玉雙 申請(qǐng)人:福州大學(xué)