專利名稱：簡便快速生物活性物質(zhì)篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一組能夠簡便、快速并且準確和較高 通量的通用篩選生物活性物質(zhì)的活性大小和量的多少的方法。
背景技術(shù)：
自從20世紀初發(fā)現(xiàn)青霉素并將其實現(xiàn)應(yīng)用以來，生物工程和技術(shù)領(lǐng)域蓬 勃發(fā)展，到目前，人類已經(jīng)開發(fā)出成千上萬種的生物活性物質(zhì)服務(wù)社會發(fā)展， 包括抗生素、維生素、氨基酸、有機酸、酶制劑、核酸類似物、激素等等諸多 物質(zhì)，涉及到醫(yī)藥、食品、化工等等諸多領(lǐng)域。初期，這些物質(zhì)都來自于自然 界，為人類所發(fā)現(xiàn)和利用，但是這些天然物質(zhì)一般活性弱，產(chǎn)量低，并且不太 適合于直接使用，如某些抗生素具有很大的副作用等等。在技術(shù)發(fā)展的中期， 人類使用諸如"誘變"、"代謝控制"、"細胞融合"等方法提高這些物質(zhì)的產(chǎn)量 和活性，甚至在一定程度上能夠改造其特性，這些技術(shù)促成了現(xiàn)代生物工業(yè)的 建立。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)可以在實驗室中通過諸如"定向進 化"等技術(shù)高效地改造天然物質(zhì)的特性，甚至人為加速進化進程，創(chuàng)造出自然 界不存在的物質(zhì)為我們所用。無論從自然界中發(fā)現(xiàn)天然生物活性物質(zhì)還是人為 改造或創(chuàng)造生物活性物質(zhì)，都需要對獲得的天然樣本文庫或改造后文庫進行篩 選，保留高活性和高產(chǎn)量的目的樣品，淘汰無價值的非目的樣品。但是在一般 情況下，文庫內(nèi)樣品的數(shù)量相當龐大，因此，傳統(tǒng)的逐一檢測的篩選方法耗時、 耗力，工作量大，效率低，雖然曾在歷史上發(fā)揮過重要作用，但現(xiàn)在已經(jīng)不適 合于現(xiàn)在實際應(yīng)用。近期，歐美等發(fā)達國家開發(fā)出全自動高通量篩選工作站， 應(yīng)用了最先進的計算機技術(shù)和機器人技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)高效高通量篩選，但是此 類大型設(shè)備價格相當昂貴，即使在發(fā)達國家，也只有財力雄厚的大型實驗室有 能力購置，難以在短期內(nèi)推廣應(yīng)用。因此，使用現(xiàn)有的通用低成本儀器設(shè)備， 開發(fā)一種簡便、快速并且準確和較高通量的通用篩選技術(shù)方法，具有重要的現(xiàn) 實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設(shè)計一種簡便、快速并且準確和較高通量地篩選生物活性 物質(zhì)的活性大小和量的多少的方法，適合于抗生素、維生素、氨基酸、有機酸、 酶制劑、核酸類似物、激素等等諸多物質(zhì)的篩選，這些生物活性物質(zhì)可以是來 自于天然的動物細胞、植物細胞、微生物細胞，也可以是來自于基因工程技術(shù) 或其它技術(shù)改造的細胞或克隆，前提是該待篩選物質(zhì)具有合適的檢測模型。該 方法有以下三個實施階段1. 培養(yǎng)階段 (1) 固體培養(yǎng)
對于適合固體培養(yǎng)的生物，使用該方法。在待篩選物質(zhì)的培養(yǎng)基中加入
1%-2%的瓊脂(或其它適當濃度的適合凝固劑)，高溫高壓滅菌處理，對于不能 高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基，按照其培養(yǎng)基特殊說明除菌后，加入滅菌的瓊脂溶液， 瓊脂溶液應(yīng)冷卻到4(TC左右再加入，加入量應(yīng)控制其加入后瓊脂終濃度為 1%-2%。將含瓊脂的培養(yǎng)基在無菌條件下倒在具有水平底部的皿中，皿和皿蓋 必須事先滅菌，由于皿的底部體積可以測量得到，因此，控制倒入的瓊脂培養(yǎng) 基的體積，就可以控制形成的固體培養(yǎng)基平板的厚度。使用滅菌打孔器制備完 全一樣的小瓊脂塊，用滅菌鑷子將其轉(zhuǎn)移至滅菌培養(yǎng)皿中。使用滅菌牙簽，將 待篩選的文庫中的樣品轉(zhuǎn)移接種到小瓊脂塊上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件視待篩選物質(zhì)的 特性而定。由于小瓊脂塊的體積和形狀完全一致，因此可以保證每個樣品所獲 得的營養(yǎng)一致，在培養(yǎng)條件一致的情況下，所獲得數(shù)據(jù)具有可靠的可比性。 (2 ) 液體培養(yǎng)
對于適合液體培養(yǎng)的生物，使用該方法。使用多孔細胞培養(yǎng)板，如96孔 板，如果是一次性已滅菌板，無需滅菌，若重復(fù)使用，可以使用放射性元素滅 菌，在對無菌要求不是非常嚴格的情況下，可以使用酒精等消毒物質(zhì)浸泡、紫 外線照射等等簡便方式滅菌。使用移液裝置(如多道移液器、連續(xù)進樣器等等) 將事先除菌的培養(yǎng)液加入，加入量視培養(yǎng)情況而定。使用滅菌牙簽，將待篩選 的文庫中的樣品轉(zhuǎn)移接種到培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件視待篩選物質(zhì)的特性而 定。如果樣品需要通氣培養(yǎng)，則事先對培養(yǎng)板板蓋做如下改進使用鉆子在板 蓋上打孔，然后在板蓋外側(cè)覆蓋上一層通氣過濾除菌層(可以使用八層紗布、 海綿或其它功能相當物質(zhì))。
U) 鑒定板檢測
將能與待測活性物質(zhì)反應(yīng)并能被檢測的物質(zhì)以凝膠狀固態(tài)的形式(如將檢 測物質(zhì)加入1°/。-2%的瓊脂溶液中，鋪板，冷卻凝固后即成為固態(tài))鋪于透明水
平鑒定平板上。如果待測物質(zhì)以固體瓊脂塊的方式培養(yǎng)獲得,則在無菌條件下 將培養(yǎng)后的小瓊脂塊排列在鑒定板上；如果待測物質(zhì)以液體培養(yǎng)的方式獲得， 則使用培養(yǎng)板復(fù)制器取微量的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到鑒定板上。待測物質(zhì)與檢測物質(zhì) 反應(yīng)之后， 一般能夠在待測物質(zhì)周圍形成透明圈、變色圏等等發(fā)生顏色改變的 區(qū)域。使用掃描儀將鑒定板掃描成電子圖片，使用計算機圖像處理軟件識別并 區(qū)分背景色和顏色改變區(qū)域，從而可測量顏色改變區(qū)域的尺寸大小和顏色，將 獲得的數(shù)值輸入數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理軟件，進行統(tǒng)計分析。 一般情況下，區(qū)域所占面 積越大，待測物質(zhì)活性和含量越高，而顏色變化與活性及含量的關(guān)系則要根據(jù)實際情況判斷處理。 (2 ) 酶標儀檢測
對于液體培養(yǎng)的物質(zhì)，將能與待測物質(zhì)發(fā)生顏色反應(yīng)的檢測物質(zhì)加入到培 養(yǎng)液中，混勻反應(yīng)之后，使用酶標儀測定其在某一波長處的吸光度。
3. 保存階段
將選定的目的菌株轉(zhuǎn)移接種到菌種斜面或者制備菌種凍存管。
具體實施例方式
實施例1
(1 ) 將經(jīng)過紫外線輻射誘變處理的胞外脂肪酶產(chǎn)生細菌GZ分離于固體培 養(yǎng)基平板(培養(yǎng)基為傳統(tǒng)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)上，37'C恒溫培養(yǎng)48個小 時。
(2) 在水平底部面積為50平方厘米的滅菌皿中，倒入體積為25立方厘米 的滅菌培養(yǎng)基A (%):麩皮7,豆餅粉3, (NH4)2S04 0.25, pH7. 0，瓊脂2。 將皿置于水平臺面上，待培養(yǎng)基凝固以后，使用直徑為0.5厘米的滅菌打孔器 將培養(yǎng)基平板制備成小瓊脂塊，再用滅菌鑷子將小瓊脂塊轉(zhuǎn)移到滅菌培養(yǎng)皿 中，如果沒有立即使用，應(yīng)置于低溫環(huán)境中保存。
(3) 將培養(yǎng)好的細菌GZ平板取出，在無菌條件下，使用滅菌牙簽將單個 菌落分別轉(zhuǎn)移接種到步驟(2)中所制備的小瓊脂塊上，將小瓊脂塊置于37'C 恒溫培養(yǎng)48個小時。
(4) 在透明的水平的底部面積為50平方厘米的滅菌皿中，倒入體積為25 立方厘米的已經(jīng)加熱熔解的鑒定凝膠B制備鑒定平板。鑒定凝膠B配方橄欖 油乳化液5%,瓊脂2%，使用蒸餾水補足體積。將皿置于水平臺面上，待鑒定 凝膠B凝固以后，將步驟O)中培養(yǎng)好的小瓊脂塊在無菌條件下轉(zhuǎn)移到鑒定 平板上，整齊排列，鑒定平板所用的皿和皿蓋都要事先滅菌。將帶有小瓊脂塊 的鑒定平板放置于48'C培養(yǎng)24個小時。
(5) 將鑒定平板取出，由于細菌GZ分泌的脂肪酶水解了鑒定平板上的橄 欖油乳化液，因此在小瓊脂塊周圍產(chǎn)生了透明圈，未被脂肪酶作用的區(qū)域為乳 白色。用掃描儀對平板進行掃描，獲得圖像。
(6) 使用photoshop軟件的"色彩范圍"選擇功能選定圖像上的水解圈區(qū) 域，使用"度量工具"測定水解圈尺寸大小，在"信息"欄讀取尺寸信息。將 各個透明圈的尺寸信息導(dǎo)入Excel軟件，進行統(tǒng)計分析，選取目的菌株。
(7) 將選中的小瓊脂塊上的菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上保存。
實施例2U)將經(jīng)過紫外線輻射誘變處理的胞外脂肪酶產(chǎn)生細菌GZ分離于固體培養(yǎng) 基平板(培養(yǎng)基為傳統(tǒng)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)上，37°C恒溫培養(yǎng)48個小時。
(2) 在一次性已滅菌的96孔細胞培養(yǎng)板的每個孔中加入200|iL的滅菌培 養(yǎng)基CU):麩皮7,豆餅粉3， (NH4)2SO40. 25， PH7， 0。如果重復(fù)使用96孔 板，可以使用鈷60滅菌，或者將96孔板清洗干凈，使用75%酒精浸泡24個 小時，再置于紫外線下照射l小時。加入培養(yǎng)基可以使用多道移液器或者連續(xù) 進樣器等裝置。
(3) 使用滅菌牙簽將步驟(1)中培養(yǎng)得到的各個細菌菌落接種于96孔板 上每個孔內(nèi)的培養(yǎng)基中，蓋上板蓋，置于恒溫搖床之上，以220rpm的轉(zhuǎn)速， 37'C恒溫培養(yǎng)48個小時。
(4) 制備例1(4)中的鑒定平板，使用培養(yǎng)板復(fù)制器取微量的步驟(3)中 的培養(yǎng)液，點加于鑒定平板之上，將鑒定平板放置于48'C培養(yǎng)24小時。
(5) 同例一(5)(6)
(6) 將選中的菌株從孔中轉(zhuǎn)移接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上保存。 實施例3
(1) 同例2(1)(2)(3)
(2 ) 使用多道移液器或者連續(xù)進樣器等設(shè)備向96孔板的每個孔中加入
10|iL的橄欖油乳化液，混勻，48C培養(yǎng)24小時后加入燦爛綠鑒定液(終濃 度為0.004%)。混勻后置于室溫靜置5分鐘。
(3) 將96孔板放入酶標儀，測定640nm處的吸光度。
(4) 將測得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel軟件進行統(tǒng)計分析處理，選擇目的菌株。 (5 ) 將選中的菌株從孔中轉(zhuǎn)移接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上保存。
實施例4
(1) 將細胞培養(yǎng)板的板蓋使用記號筆在對應(yīng)于孔洞處做記號，使用電 動鉆頭打孔，打孔直徑與培養(yǎng)板的孔洞直徑相當為宜，在皿蓋外表面覆蓋上八 層紗布，滅菌處理。滅菌最好使用放射性物質(zhì)滅菌法(如鈷60法)。
(2) 同實施例2或者實施例3。
權(quán)利要求
1.一種通過制備無菌培養(yǎng)基小瓊脂塊，培養(yǎng)待篩選樣品的固體發(fā)酵方法。其特征在于制備體積和形狀完全一樣的無菌培養(yǎng)基小瓊脂塊，將樣品接種于其上培養(yǎng)，可保證每個樣品獲得的營養(yǎng)一致。
2. —種培養(yǎng)好氧樣品用的對培養(yǎng)板板蓋進行改造的方法。其特征在于使 用鉆子在板蓋上打孔，然后在板蓋外側(cè)覆蓋上一層通氣過濾除菌層。
3. —種包括培養(yǎng)和檢測的篩選方法，其具體步驟包括a. 培養(yǎng)階段(1) 固體培養(yǎng)適用于適合固體培養(yǎng)的生物。其特征在于在適合于待篩選物質(zhì)的培養(yǎng)基 中加入適當濃度的適合凝固劑。將培養(yǎng)基在無菌條件下倒在具有水平底部的皿 中，由于皿的底部體積可以測量得到，因此，控制倒入的培養(yǎng)基的體積，就可 以控制形成的固體培養(yǎng)基平板的厚度。使用滅菌打孔器制備完全一樣的小瓊脂 塊，用滅菌鑷子將其轉(zhuǎn)移至滅菌培養(yǎng)皿中。使用滅菌牙簽，將待篩選的文庫中 的樣品轉(zhuǎn)移接種到小瓊脂塊上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件視待篩選物質(zhì)的特性而定。 (2 ) 液體培養(yǎng)適用于適合液體培養(yǎng)的生物。其特征在于使用多孔細胞培養(yǎng)板，用移液 裝置將事先除菌的培養(yǎng)液加入，加入量視培養(yǎng)情況而定。使用滅菌牙簽，將待 篩選的文庫中的樣品轉(zhuǎn)移接種到培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件視待篩選物質(zhì)的特性 而定。如果樣品需要通氣培養(yǎng)，則事先對培養(yǎng)板板蓋按權(quán)利要求2所述的方法 進行改進。b. 檢測階段(1) 鑒定板檢測其特征在于將能與待測活性物質(zhì)反應(yīng)并能被檢測的物質(zhì)以凝膠狀固態(tài)的 形式鋪于透明水平鑒定平板上。如果待測物質(zhì)以固體瓊脂塊的方式培養(yǎng)獲得， 則在無菌條件下將培養(yǎng)后的小瓊脂塊排列在鑒定板上；如果待測物質(zhì)以液體培 養(yǎng)的方式獲得，則使用培養(yǎng)板復(fù)制器取微量的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到鑒定板上。待測 物質(zhì)與檢測物質(zhì)反應(yīng)之后， 一般能夠在待測物質(zhì)周圍形成透明圈、變色圈等等 發(fā)生顏色改變的區(qū)域。使用掃描儀將鑒定板掃描成電子圖片，使用計算機圖像 處理軟件識別并區(qū)分背景色和顏色改變區(qū)域，從而可測量顏色改變區(qū)域的尺寸 大小和顏色，將獲得的數(shù)值輸入數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理軟件，進行統(tǒng)計分析。(2 ) 酶標儀檢測其特征在于對于液體培養(yǎng)的物質(zhì)，將能與待測物質(zhì)發(fā)生顏色反應(yīng)的檢測物質(zhì)加入到培養(yǎng)液中，混勻反應(yīng)之后，使用酶標儀測定其在某一波長處的吸光 度。C.保存階段其特征在于將選定的目的菌株轉(zhuǎn)移接種到菌種斜面或者制備菌種凍存管。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組能夠準確和較高通量的通用簡便快速生物活性物質(zhì)篩選方法。該方法屬于生命科學(xué)領(lǐng)域。生物活性物質(zhì)樣品文庫的篩選需要保留高活性和高產(chǎn)量的目的樣品，淘汰無價值的非目的樣品。但是在一般情況下，文庫內(nèi)樣品的數(shù)量相當龐大，因此，傳統(tǒng)的逐一檢測的篩選方法耗時、耗力，工作量大，效率低。而全自動高通量篩選工作站價格昂貴，無法普及。本發(fā)明采用常規(guī)的儀器設(shè)備，設(shè)計出一種包括培養(yǎng)和檢測的全套篩選方法，適用于大多數(shù)樣品和情況下的篩選。
文檔編號C12N1/00GK101307292SQ20071000981
公開日2008年11月19日 申請日期2007年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日
發(fā)明者峻 林 申請人:峻 林