一種通過(guò)永生化細(xì)胞獲得生物活性物質(zhì)組合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含有人類生物活性物質(zhì)組合物的制造方法，特別是人類生物活性 物質(zhì)來(lái)源于永生化細(xì)胞。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了一種采集自體細(xì)胞制作的永生化細(xì)胞，在 適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件下獲得人類生物活性物質(zhì)組合物，獲取的人類生物活性物質(zhì)組合 物經(jīng)分離提取后可用于個(gè)性化化妝品供美容及皮膚保養(yǎng)使用。
【背景技術(shù)】
[0002] 正常組織來(lái)源的細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)、分裂，經(jīng)過(guò)有限次的細(xì)胞傳 代后就會(huì)停止增殖，出現(xiàn)衰老和死亡。永生化細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)了永生化（immortalization)的 細(xì)胞，則具有無(wú)限分裂和增殖的能力，如生殖細(xì)胞、干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和外源性基因轉(zhuǎn)染而 構(gòu)建的永生化細(xì)胞等。通常意義的永生化細(xì)胞是指體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過(guò)自發(fā)的或受外界因 素的影響從增殖衰老危機(jī)中逃離，從而具有無(wú)限增殖能力一類細(xì)胞，這樣的細(xì)胞群體稱為 永生化細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系。
[0003] 目前，建立永生化細(xì)胞系的方法是通過(guò)基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)，將外源永生相關(guān)基因轉(zhuǎn) 入目的細(xì)胞或通過(guò)物化的方法誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因發(fā)生突變，促使正常細(xì)胞永生化。經(jīng)人工 轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞能無(wú)限增殖生長(zhǎng)，可長(zhǎng)期傳代，但并不改變細(xì)胞本身的特性。具體方法包 括電穿孔法、磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法以及逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法；物理刺激 法通過(guò)X射線、電離輻射、C〇60等放射性因素進(jìn)行細(xì)胞永生化的方法，可能破壞了細(xì)胞的衰 老機(jī)制，使細(xì)胞周期得到延伸或促進(jìn)了與細(xì)胞永生相關(guān)基因的表達(dá)。比較常用的基因轉(zhuǎn)染 技術(shù)是將腫瘤病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等轉(zhuǎn)染正常組織細(xì)胞來(lái)構(gòu)建。此外，研究細(xì) 胞永生化最常用的方法還有通過(guò)構(gòu)建含端粒酶催化亞基（hT ERT)的表達(dá)載體，通過(guò)各種方 法來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得永生化細(xì)胞。
[0004] 應(yīng)用較為廣泛的腫瘤病毒包括EB病毒、腺病毒、猴腎細(xì)胞病毒、多瘤病毒等。EB病 毒（epstein-barr virus，EBV)在體外能使13淋巴母細(xì)胞永生化形成淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系， 它可能通過(guò)誘導(dǎo)其它細(xì)胞周期調(diào)控蛋白從而抑制了P53的促細(xì)胞衰老作用，使細(xì)胞永生。 導(dǎo)致B細(xì)胞永生的主要原因可能是端粒酶活性的提高。目前，可以直接用B淋巴細(xì)胞與EB 病毒共培養(yǎng)的方法是細(xì)胞實(shí)現(xiàn)永生，在其他細(xì)胞中的應(yīng)用很少。猿猴病毒SV40是一種真核 細(xì)胞病毒，它的T抗原片段是最常用的整合片段，此片段能夠整合進(jìn)靶細(xì)胞核內(nèi)并表達(dá)，可 導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力的改變并表現(xiàn)出多種與腫瘤相關(guān)的表型。近年來(lái)，人們通過(guò)野生型SV40 病毒共培養(yǎng)感染靶細(xì)胞、磷酸鈣法、電穿孔以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法等，成功獲得了多種永生 細(xì)胞株。其它病毒如人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV)已成功地將人的包皮細(xì) 胞、角化上皮以及乳腺、胰導(dǎo)管和口腔等的上皮細(xì)胞以及牛牙乳頭成纖維細(xì)胞永生化。此 外，也發(fā)現(xiàn)腺病毒可有效永生化大鼠腎細(xì)胞。
[0005] 另一種常用的獲得永生化細(xì)胞的方式是通過(guò)構(gòu)建含端粒酶催化亞基（hTERT)的 表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞來(lái)獲得永生化細(xì)胞。端粒酶轉(zhuǎn)染建立的永生化細(xì)胞是正常細(xì)胞，而 非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，這些細(xì)胞依然保持了正常細(xì)胞的生理特性，具有正常的生長(zhǎng)速率和核型。另 外，hTERT介導(dǎo)的永生化細(xì)胞已通過(guò)了 Ml期和M2期，具有同胚胎干細(xì)胞一樣的傳代能力， 可以算得上是真正意義上的永生化。
[0006] 端粒是位于染色體末端具有穩(wěn)定染色體及防止染色體末端融合等特殊功能的部 分。隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加端粒進(jìn)行性縮短，當(dāng)縮短到一定的限度即不能維持染色體的 穩(wěn)定時(shí)，細(xì)胞失去分裂增殖的能力，進(jìn)而衰老死亡。細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的保持需要激活端粒酶。 端粒酶（telomerase)則是催化合成并維持端粒一定序列的核糖核蛋白，由RNA和蛋白組 成，具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。人類端粒酶復(fù)合物的分子量約為500-1500kDa。目前發(fā)現(xiàn)，所有 的細(xì)胞永生化都與端粒的維持有關(guān)。目前大家比較認(rèn)同的細(xì)胞發(fā)生永生化的機(jī)理是M1-M2 理論，即進(jìn)入Ml期后，在病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等作用下，促使細(xì)胞繞過(guò)Ml期繼 續(xù)生長(zhǎng)。經(jīng)20-30次擴(kuò)增后進(jìn)入M2期，絕大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)退化，凋亡，極少數(shù)細(xì)胞的端粒酶 被激活，不斷合成端粒DNA來(lái)補(bǔ)充和延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度，維持染色體的穩(wěn)定性使細(xì)胞度過(guò)M2期， 最終細(xì)胞發(fā)生永生化（褚嘉祐，中華民族永生細(xì)胞庫(kù)的建立，2009 :9-12)。
[0007] 永生化細(xì)胞除了能在體外長(zhǎng)期傳代外，還具有很高的端粒酶活性。因此，利用永 生化細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞活性物質(zhì)能夠克服正常組織細(xì)胞傳代、增殖的限制，能夠作為質(zhì)量和遺 傳物質(zhì)均穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系。實(shí)際上，永生化細(xì)胞除了具有較高的端粒酶活性之外，其本 身還能夠分泌大量的細(xì)胞因子（Christian Unger 等 2009，Human Reproduction。24(10): 2567-2581)。然而，對(duì)永生化細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的研究非常少，可能是目前只是將永生化 細(xì)胞作為一種保存遺傳物質(zhì)的方式，而對(duì)細(xì)胞本身的代謝特征還沒(méi)有注意到。
[0008] 專利申請(qǐng)?zhí)枮?3134542. 5的專利公開(kāi)了"一種使皮膚成纖維細(xì)胞永生化的方法"； 專利申請(qǐng)?zhí)枮?01010109274. 6的專利公開(kāi)了"端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系及其構(gòu) 建方法";專利申請(qǐng)?zhí)枮?01010585718. 3的專利公開(kāi)了"永生化人椎間盤髓核細(xì)胞體系的制 備方法"。這幾個(gè)專利僅公開(kāi)了通過(guò)不同細(xì)胞制作永生化細(xì)胞的方法，其中并沒(méi)有涉及利用 其制造細(xì)胞生長(zhǎng)因子等人類生物活性物質(zhì)方面的內(nèi)容。
[0009] 目前，應(yīng)用的細(xì)胞因子，主要是采用人工化學(xué)合成或者遺傳重組技術(shù)進(jìn)行制造。 如專利申請(qǐng)?zhí)枮?00510069586. 8的專利公開(kāi)了 "雙功能表皮生長(zhǎng)因子及其制備方法和用 途"；專利申請(qǐng)?zhí)枮?01010137435.2的專利公開(kāi)了 "一種生產(chǎn)人表皮生長(zhǎng)因子（EGF)的制 備方法"。也有專利將上述通過(guò)基因重組的細(xì)胞因子用于美容護(hù)膚領(lǐng)域，如專利申請(qǐng)?zhí)枮?200710059770. 3的專利公開(kāi)了"含人血清白蛋白與皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)因子的融合蛋白護(hù)膚產(chǎn)品 制備工藝和用途";專利申請(qǐng)?zhí)枮?01210139430. 2"基因重組人型活性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用"。此外，也有通過(guò)干細(xì)胞的方法來(lái)大量制造細(xì)胞生長(zhǎng)因 子的技術(shù)，如來(lái)自韓國(guó)的專利申請(qǐng)?zhí)枮?00680051716. 8,名稱為采用脂肪來(lái)源成體干細(xì)胞 大量制造生長(zhǎng)因子的方法。但因技術(shù)難度或細(xì)胞來(lái)源等問(wèn)題，并未發(fā)現(xiàn)利用永生化細(xì)胞制 造細(xì)胞生長(zhǎng)因子的技術(shù)出現(xiàn)。無(wú)論是人工化學(xué)合成的還是基因重組獲得的細(xì)胞因子與人體 自身產(chǎn)生的細(xì)胞因子還是存在一些差異，如這些細(xì)胞因子都或多或少的存在過(guò)敏原，失去 特定的三維結(jié)構(gòu)，活性弱。而自體細(xì)胞具有與個(gè)體高基因一致性，不存在過(guò)敏原，不會(huì)產(chǎn)生 免疫排斥。由自體細(xì)胞制成的永生細(xì)胞不會(huì)導(dǎo)致癌癥，用于自體不會(huì)出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，并 且不受細(xì)胞來(lái)源核數(shù)量的限制，能夠做到質(zhì)量均一，活性穩(wěn)定，因此，能夠應(yīng)用于個(gè)性化的 需求，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
[0010] 本發(fā)明人注意到已有細(xì)胞因子的諸多問(wèn)題以及永生化細(xì)胞的諸多特點(diǎn)，擬采用體 細(xì)胞制作永生化細(xì)胞并在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件下制造人細(xì)胞生長(zhǎng)因子等生物活性物 質(zhì)組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)永生化細(xì)胞獲得生物活性物質(zhì)組合物的方法。該組 合物包含細(xì)胞因子以及端粒酶等多種生物活性物質(zhì)。此組合物能夠應(yīng)用于自體使用，具有 優(yōu)異的生物活性、免疫源性低、無(wú)排斥反應(yīng)、制作周期短、取材方便、費(fèi)用合理等特點(diǎn)。
[0012] 此外，本發(fā)明將提供一種安全、有效、個(gè)性化的化妝品。所述化妝品中含有通過(guò)永 生化細(xì)胞獲得生物活性物質(zhì)組合物，或者含有由此永生化細(xì)胞培養(yǎng)的含有上述生物活性物 質(zhì)組合物的培養(yǎng)基。
[0013] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了利用永生化細(xì)胞制造生物活性物質(zhì)組合物的方 法，所述方法包括以下步驟：1，制作永生化細(xì)胞；2,在無(wú)血清培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)所述永生 化細(xì)胞；3,通過(guò)中空纖維超濾系統(tǒng)分離純化生物活性物質(zhì)；4,對(duì)上述分離純化的生物活 性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。
[0014] 本發(fā)明中公布的方法能夠解決現(xiàn)有技術(shù)中不能通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)途徑有效獲得細(xì)胞 生長(zhǎng)因子等生物活性物質(zhì)的問(wèn)題。本發(fā)明的生物活性物質(zhì)組合物具有提高細(xì)胞膠原合成、 促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、抑制UV光導(dǎo)致的角化細(xì)胞增殖的作用。生物活性物質(zhì)組合物來(lái)源于 人體細(xì)胞，與人體自身的生物活性物質(zhì)具有一致的三維結(jié)構(gòu)和生物活性，具有確定的安全 性，較好的皮膚相容性。預(yù)期能夠很好地應(yīng)用于抗皺，美化皮膚，創(chuàng)傷愈合，去除疤痕。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是永生化B淋巴細(xì)胞顯微鏡照片；
[0016] 圖2是永生化B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間的生長(zhǎng)因子濃度Elisa檢測(cè)結(jié)果圖；
[0017] 圖3是永生化B淋巴細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果圖；
[0018] 圖4是永生化B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基刺激成纖維細(xì)胞增殖結(jié)果圖；
[0019] 圖5是永生化B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和生物因子刺激膠原生成Elisa檢測(cè)結(jié)果圖；
[0020] 圖6是永生化B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基促進(jìn)角化細(xì)胞UV防御功能檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了通過(guò)永