專利名稱：基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過pcDNA基因載體體外轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子基 因，促使眼內(nèi)移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化，同時 特異性分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和大量相關(guān)生長因子，營養(yǎng)、支持周圍視網(wǎng) 膜神經(jīng)細(xì)胞的方法。
技術(shù)背景在細(xì)胞的分化過程中，細(xì)胞往往由于高度分化而完全失去了再分 裂的能力，最終衰老死亡。機體在發(fā)展適應(yīng)過程中為了彌補這一不足， 保留了一部分未分化的原始細(xì)胞，稱之為干細(xì)胞(stemcell)。 一旦 生理需要，這些干細(xì)胞可按照發(fā)育途徑通過分裂而產(chǎn)生分化細(xì)胞。即 干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)就是其中之一。在體內(nèi)、夕卜不同' 條件下，MSCs可以定向地被誘導(dǎo)分化為中胚層來源的細(xì)胞如成骨細(xì) 胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肌腱細(xì)胞，還可跨胚層向內(nèi) 胚層和神經(jīng)外胚層的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。有研究表明MSCs 能分泌某些神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)禾口神經(jīng)生長因子(neurotrophin, nerve growth factor, NGF)，此外MSCs分化的神經(jīng)元樣和星形膠質(zhì)樣細(xì)胞可 能也分泌生長因子。星形膠質(zhì)細(xì)胞也產(chǎn)生許多生長因子，包括神經(jīng)營 養(yǎng)素家族所有成員如NGF、 BDNF、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CiliaryNeurotrophic Factor, CNTF)和成纖維細(xì)胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)等，這些細(xì)胞因子能夠促進(jìn)中樞 神經(jīng)元細(xì)胞的增殖和分化。NGF是神經(jīng)元存活、生長、分化所必需的一類分泌性蛋白質(zhì)，其中 最具代表性的是BDNF。BDNF能促進(jìn)若干種離體培養(yǎng)的神經(jīng)元存活和突 起生長；在體內(nèi)能阻止某些神經(jīng)元的程序性死亡。視覺系統(tǒng)中視網(wǎng)膜 節(jié)細(xì)胞層(GCL)的無長突細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞都能表達(dá)BDNF的mRNA，并具有 BDNF受體，但BDNF的合成主要是在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)視神 經(jīng)橫斷后，眼內(nèi)注入BDNF能挽救大量的節(jié)細(xì)胞免于凋亡。 當(dāng)代基因工程提供了各種載體，可將核酸片段導(dǎo)入細(xì)胞中表達(dá)。其中 脂質(zhì)體基因載體是較為廣泛和安全的一種。該載體可將外源基因整合 到靶細(xì)胞中，使目的基因在靶細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。已經(jīng)有實驗證明。因此，利用pcDNA將BDNF基因?qū)隡SCs，這種重組了BDNF基因的 MSCs植入眼底后，由于BDNF的作用，較未經(jīng)基因修飾的MSCs可提高眼 內(nèi)存活能力及向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的比例，同時大量旁分泌的BDNF 因子和相關(guān)生長因子，可以營養(yǎng)、支持周圍的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，特別 是一些病變組織及周圍細(xì)胞。因此本方法可以為將來干細(xì)胞治療青光 眼、視網(wǎng)膜色素變性、視神經(jīng)挫傷及老年黃斑變性、糖尿病引起的視 網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜眼底疾病提供來源充足、可取自自體的種子細(xì)胞， 以及使種子細(xì)胞能更好地發(fā)揮補充受損視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，維持、保護(hù) 殘存視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞作用的新方法。另外，轉(zhuǎn)導(dǎo)某些缺陷基因或治療 基因，在提外對MSCs進(jìn)行功能激活和調(diào)控，將其作為基因治療的載體;利用MSCs在體內(nèi)的靶向性，還可將載有目的基因的MSCs用于治療遺傳 性神經(jīng)病和神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病，同時為與之相關(guān)的藥物開發(fā)和篩選提 供了一種新的模型。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù) 視網(wǎng)膜損傷的方法。通過自制的重組人類BDNF基因的脂質(zhì)體，將BDNF 基因?qū)隡SCs，經(jīng)篩選獲得重組了BDNF基因的MSCs (BDNF-MSCs)， 將BDNF-MSCs植入眼底，在自分泌的BDNF誘導(dǎo)下定向分化為視網(wǎng)膜 神經(jīng)細(xì)胞，并特異性分泌BDNF因子和相關(guān)生長因子修復(fù)視網(wǎng)膜損傷 的方法。采用以下技術(shù)方案 一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植 修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于移植前在體外用外源性神經(jīng)營養(yǎng) 因子對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方 法，其特征在于所述的外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子為人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 基因。所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方 法，其特征在于通過脂質(zhì)體將外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因?qū)腴g充質(zhì)干 細(xì)胞。所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方 法，其特征在于重組質(zhì)粒以特定的濃度、時間感染間充質(zhì)干細(xì)胞，從 而使外源基因在間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于通過以特定的劑量和頻率注射干細(xì)胞動員劑，從外周 血中提取間充質(zhì)干細(xì)胞。機體注入干細(xì)胞動員劑，動員骨髓干細(xì)胞到達(dá)外周血中，提取MSCs，利用梯度離心和反復(fù)貼壁的方法進(jìn)行培養(yǎng)純化。從人血白細(xì)胞 中克隆出人BDNF的DNA片段，構(gòu)建pcDNA-hBDNF。以重組BDNF基因的脂 質(zhì)體感染MSCs，通過耐要藥基因篩選，使BDNF在MSCs內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。本 發(fā)明能夠在通過高效轉(zhuǎn)導(dǎo)使外源性基因在MSCs中穩(wěn)定表達(dá)的同時，保 持MSCs在體內(nèi)、外的多分化潛能和其他干細(xì)胞的生物特性。本發(fā)明的另一個主要內(nèi)容是通過特定的細(xì)胞密度和注射方式使 BDNF-MSCs在眼內(nèi)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，同時通過特異性分泌BDNF因子和相關(guān)生長因子營養(yǎng)、支持周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。通過多焦視網(wǎng) 膜電生理可以證明BDNF-MSCs移植組與單純MSCs移植組和生理鹽水組 比較修復(fù)情況均有顯著提高(P〈0.01)。在一個月的時間點由為突出。 本發(fā)明的內(nèi)容未公開發(fā)表，本領(lǐng)域的技術(shù)人員如不花費創(chuàng)造性勞 動根本不能根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)推斷得到本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及眼底移植 的關(guān)鍵技術(shù)方法。
具體實施方式
實施例(一)、外周血動員的MSCs提取與純化每只兔皮下注射重組人粒細(xì)胞刺激因子(rhG-CSF) 10Pg/kg， 一 天兩次，連續(xù)注射5天。心臟取血10ml/只，用肝素化的無菌注射器 抽吸血液與PBS液1: l混勻，輕輕鋪于等量的淋巴細(xì)胞分離液上(相對密度1. 077) ， 1000g/min離心25min。吸取骨髓單個核細(xì)胞存在層， 加入PBS液洗滌3次。取骨髓單個核細(xì)胞1X107ml，接種于75ml 培養(yǎng)瓶中恒溫培養(yǎng)。于第二天換液，以后每3 4天換液。觀察細(xì)胞 達(dá)80%融合后，加入1 : 1的2. 5g/L胰蛋白酶和0. 2g/L EDTA混合液 消化，終止消化后，將上述篩選出來的MSCs重新接種至兩個75ml 培養(yǎng)瓶中，反復(fù)傳代、擴增、純化，傳至第4代流式細(xì)胞儀鑒定CD34(-)，CD45 (-)，和CD105(+)。(二)、重組pcDNA—hBDNF表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)NCBI Sequence (BC029795)hBDNF基因序列，設(shè)計引物5' gca agc tta tga cca tcc ttt tcc 3，(下戈機為Hind II聰切位點)； 5， get cta gat ctt ccc ctt tta atg 3'(下劃線為Xba I酶切位點)。 PCR技術(shù)克隆BDNF基因序列。真核表達(dá)載體pcDNA3. 1/myc-His (B) 和PCR特異性擴增產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶Hind III和Xbal進(jìn)行消 化，消化后的載體與hBDNF基因片段以1 : 3的摩爾數(shù)比混合，加5U 的T4連接酶，16"C反應(yīng)16h。反應(yīng)產(chǎn)物用CaCl2熱休克法轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5 a菌。轉(zhuǎn)化菌涂布于含100 u g/ml氨芐青霉素的LB固體平板培養(yǎng) 基，挑取菌落，用限制性內(nèi)切酶Hind III和Xba I酶切提取的質(zhì)粒， 然后進(jìn)行測序分析如下ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCA TGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAG GTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGA GAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACATGATAGAAGAGCTGTTGGATGA GGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGC AGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTT TGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTAC CTAGACGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTG ACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAG TGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACAT GTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCA AAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATC CCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAA GGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCG GGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCA TAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGG GGAAGAT (三)、通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)BDNF基因制備溶液A:取10 u g重組質(zhì)粒pcDNA—hBDNF溶于100 y 1無血 清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基。同時制備溶液B:將20 ul Lipofectamine稀釋于80 u 1無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基?；?合A、 B液體室溫靜置15分鐘后，加0. 8ml無血清、無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基中。棄去六孔板中的培養(yǎng)基，并將lmlA、 B混合液加入六孔板 中，37° C、 5%0)2條件下培養(yǎng)8小時。棄轉(zhuǎn)染液，加入2ml完全培養(yǎng) 基，繼續(xù)培養(yǎng)。ELISA測定轉(zhuǎn)染后24小時、48小時、72小時、96小時間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清在450nm處的吸光度，確定hBDNF表達(dá)的相 對含量隨時間增加hBDNF表達(dá)量增高，72小時達(dá)到高峰。間充質(zhì) 干細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)蛋白純化柱HisTrapHP過柱純化后，進(jìn)行 Western-blot檢測hBDNF蛋白的表達(dá)，得到分子量約為12. 3KD的單 一陽性條帶。(四)、兔視網(wǎng)膜移植BDNF-MSCs修復(fù)視網(wǎng)膜損傷烏拉坦5ml/kg耳緣靜脈注射青紫藍(lán)兔，麻醉后行玻璃體切割手 術(shù)，去除玻璃體及后界膜后，于視乳頭下方6-8PD位置，氬激光能量 0.2W，暴光時間O. 15S，光斑直徑50um，每光斑間距100um，造成4 X6排列，共24個激光斑。角膜緣平坦部進(jìn)針，緩慢推針l誦/rain，射 BDNF-MSCsl07m10. 5ml。結(jié)果細(xì)胞移植后7、 14、 30天觀察眼壓，B 超結(jié)果，證明其安全性(P<0.05)。比較各個時間點的眼底照影和病 理切片和多焦ERG統(tǒng)計學(xué)分析，可以證明BDNF-MSCs移植組與單純MSCs 移植組和生理鹽水組比較修復(fù)情況均有顯著提高(P<0.01)。在一個 月的時間點由為突出。
權(quán)利要求
1、一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于移植前在體外用外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。
2、 按照權(quán)利要求1所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù) 視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于所述的外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是人腦源 性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因。
3、 按照權(quán)利要求1或2所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植 修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于通過脂質(zhì)體將外源性神經(jīng)營養(yǎng)因 子基因?qū)腴g充質(zhì)干細(xì)胞。
4、 按照權(quán)利要求1或2所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植 修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于重組質(zhì)粒以特定的濃度、時間感 染間充質(zhì)干細(xì)胞，從而使外源基因在間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。
5、 按照權(quán)利要求1所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù) 視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于通過以特定的劑量和頻率注射干細(xì)胞 動員劑，從外周血中提取間充質(zhì)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法。技術(shù)方案用干細(xì)胞動員劑將間充質(zhì)干細(xì)胞動員到外周血中，用自身的生物學(xué)特性分離、擴增、純化間充質(zhì)干細(xì)胞；從人血白細(xì)胞基因組中克隆人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子序列，構(gòu)建重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的pcDNA表達(dá)載體，將腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因?qū)腴g充質(zhì)干細(xì)胞；制作視網(wǎng)膜激光損傷模型；通過玻璃體及后界膜切除后，將腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞植入眼底。在間充質(zhì)干細(xì)胞的分化和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的特異性表達(dá)下，視網(wǎng)膜損傷部位的修復(fù)程度顯著提高。本發(fā)明可以明顯修復(fù)視網(wǎng)膜損傷，提高干細(xì)胞移植的應(yīng)用價值，為基因、干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜疾病提供了新的技術(shù)。
文檔編號C12N5/10GK101333542SQ200710011839
公開日2008年12月31日 申請日期2007年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月25日
發(fā)明者何星儒 申請人:何星儒