一種基于稀有細(xì)胞檢測(cè)alk基因狀態(tài)的方法及相關(guān)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)，特別涉及腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。更具體地講，本發(fā)明涉及檢測(cè) 癌癥和評(píng)估患者的治療方案的診斷方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CirculatingTumorCell,CTC)指進(jìn)入到血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞， 其可由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落入血，亦可能在形成實(shí)體瘤病灶之前進(jìn)入血液中。腫瘤細(xì)胞侵 入循環(huán)系統(tǒng)，大部分由于機(jī)體的免疫識(shí)別、機(jī)械殺傷及自身凋亡在短期內(nèi)死亡，只有極少數(shù) 存活下來(lái)，并在遠(yuǎn)端或原發(fā)組織及器官種植，進(jìn)一步發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶，是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā) 的最直接因素。
[0003]CTC作為一種可以代表原發(fā)腫瘤的"液體活檢"樣本，外周血標(biāo)本易獲取、創(chuàng)傷性 小、可反復(fù)采集，是臨床檢測(cè)更為理想的標(biāo)本來(lái)源，可對(duì)腫瘤治療進(jìn)行實(shí)時(shí)全面監(jiān)測(cè)?？捎?效實(shí)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)警，療效及時(shí)評(píng)價(jià)以及腫瘤個(gè)體化治療用藥指導(dǎo)，目前CTC檢測(cè)已廣泛 運(yùn)用于臨床腫瘤患者的療效實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)、病情實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、耐藥析因、預(yù)后判斷中。
[0004]焚光原位雜交（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH)是一種細(xì)胞遺傳學(xué) 技術(shù)，可以用來(lái)對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)和定位。目前基于脫落稀有細(xì)胞的FISH技術(shù)一般為定性檢 測(cè)，很難做到精準(zhǔn)定量且保證其效果。究其根本原位在于目前適用于組織標(biāo)本的FISH檢測(cè) 方法及普通的脫落細(xì)胞學(xué)FISH檢測(cè)方法，當(dāng)數(shù)量級(jí)在0-100間的細(xì)胞涂片后，無(wú)法在著色 效果和有效保持細(xì)胞方面取得較好的平衡并保持較高的穩(wěn)定性，更難以形成有效穩(wěn)定定量 檢測(cè)的成型產(chǎn)品。目前雖有相應(yīng)專利闡述一種有效方法（US6, 524, 798)，但需極其高昂成 本的專用檢測(cè)設(shè)備，無(wú)法在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室完成這基于及少量稀有細(xì)胞、甚至是單細(xì)胞層面的 FISH檢測(cè)工作。
[0005] 此前已描述了來(lái)自生物樣品的腫瘤細(xì)胞、稀少細(xì)胞或其他生物實(shí)體的鑒定方法 (如中國(guó)專利【申請(qǐng)?zhí)枴?00810097889. 4、201310057307. 0)。此兩步法要求有效富集以確保 在分析之前獲取靶細(xì)胞，同時(shí)去除大量碎片和其他干擾物質(zhì)，使得可通過(guò)成像技術(shù)進(jìn)行細(xì) 胞檢驗(yàn)。此方法以獨(dú)特的陰性富集策略將免疫磁微粒與多密度離心方式、熒光原位雜交和 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分析組合起來(lái)，精確定量地檢測(cè)幾乎所有實(shí)體腫瘤類型中脫落至含血 液、胸/腹腔積液、尿液、腦脊液等多種生物體液標(biāo)本中的稀有細(xì)胞（含CTC)。此組合方法 用于富集和計(jì)數(shù)血樣中的染色體擴(kuò)增型腫瘤細(xì)胞，因此提供了一種量度癌癥的工具。
[0006]ALK最早是在間變性大細(xì)胞淋巴瘤（ALCL)的一個(gè)亞型中被發(fā)現(xiàn)的，因此定名為間 變性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphomakinase，ALK)。隨后，在發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中有ALK 基因重排之前，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和炎癥性肌纖維母細(xì)胞瘤（MT)中分別發(fā)現(xiàn)了有 多種類型的ALK基因重排，至此證明ALK是強(qiáng)力致癌驅(qū)動(dòng)基因。
[0007]《中國(guó)ALK陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識(shí)》中指出，隨著分子醫(yī)學(xué)進(jìn)展和靶向藥 物的不斷涌現(xiàn)，晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)的治療已進(jìn)入到個(gè)體化治療的時(shí)代。目前臨床 應(yīng)用的個(gè)體化靶向治療主要針對(duì)EGFR突變型和ALK融合基因型肺癌，這兩種基因變異型 肺癌均具有明確的分子靶點(diǎn)、靶點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)及上市的靶向藥物，臨床療效得到明顯提高。其 他基因變異型肺癌的革G向藥物和伴隨分子診斷（companiondiagnostics)技術(shù)正在快速研 發(fā)中。肺癌中ALK變異主要為ALK基因發(fā)生重排與其他基因融合。其中，EML4-ALK(棘皮 動(dòng)物微管結(jié)合蛋白樣4-間變性淋巴瘤激酶）融合基因變異是其主要類型，約占所有NSCLC 的5%左右。肺癌中與ALK基因融合的其他基因還包括TFG、KIF5B等。
[0008] 針對(duì)ALK靶點(diǎn)的小分子抑制劑克唑替尼（Crizotinib)是一種ATP競(jìng)爭(zhēng)性酪氨酸 激酶抑制劑，可特異性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROSl等信號(hào)通路。臨床試驗(yàn) 顯示對(duì)于ALK陽(yáng)性的晚期NSCLC患者，克唑替尼的療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療，二線單藥治療患 者的中位PFS為7. 7個(gè)月，有效率達(dá)到65. 3%?；谄淞己玫寞熜Ш湍褪苄裕?013年初，中 國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理總局（CFDA)已批準(zhǔn)克唑替尼用于治療ALK融合陽(yáng)性的局部晚期或 轉(zhuǎn)移性NSCLC患者。
[0009] 檢測(cè)基因融合（genefusion，又稱基因重排，generearrangement)的方法有多 種，包括原位雜交技術(shù)、蛋白表達(dá)檢測(cè)技術(shù)和PCR檢測(cè)技術(shù)。目前針對(duì)ALK融合基因檢測(cè)常 用的方法有三種--熒光原位雜交（FISH)、基于PCR擴(kuò)增技術(shù)（RACE-PCR或RT-PCR聯(lián)合測(cè) 序技術(shù)、qRT-PCR等）和免疫組織化學(xué)法（IHC)。上述三種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。FISH是經(jīng) 過(guò)大規(guī)模臨床試驗(yàn)驗(yàn)證的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但價(jià)格昂貴，操作規(guī)范要求較高；RT-PCR對(duì)標(biāo)本取 材要求較高，需專用的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；IHC簡(jiǎn)便易行，但陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一。
[0010] 但是臨床檢測(cè)時(shí)，會(huì)由于例如已手術(shù)切除、患者主觀意愿不脅從等諸多無(wú)法有效 獲得腫瘤組織的情況，而存在以下局限性：
[0011] 1、作為有創(chuàng)性且受限于病灶位置的組織學(xué)檢測(cè)，存在標(biāo)本取材不易或無(wú)法取材等 局限性，且術(shù)后不能反復(fù)取材，導(dǎo)致組織取材無(wú)法提供實(shí)時(shí)性的監(jiān)測(cè)信息。
[0012] 2、且受治療的影響等，腫瘤細(xì)胞的分子信息有可能發(fā)生動(dòng)態(tài)改變。如：有研究報(bào) 道，接受新輔助化療的乳腺癌患者，在化療前接受活檢，并將結(jié)果與術(shù)后病理進(jìn)行對(duì)照，發(fā) 現(xiàn)存在治療前后ALK表達(dá)不一致的情況。
[0013] 3、腫瘤組織異質(zhì)性的存在以及單點(diǎn)活檢造成的只是局部信息反映的現(xiàn)狀，使得傳 統(tǒng)組織學(xué)檢測(cè)缺乏全面整體性的評(píng)價(jià)，如原發(fā)灶、多發(fā)轉(zhuǎn)移灶信息的綜合評(píng)價(jià)等。
[0014] 本發(fā)明在于提供了一種檢測(cè)ALK重排狀態(tài)的方法。以獲得更加全面的信息。本發(fā) 明在分離獲取血液中CTC(或其他稀有細(xì)胞）的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單細(xì)胞分子分析，檢測(cè)ALK表 達(dá)情況，以此來(lái)從單細(xì)胞水平上，即時(shí)地發(fā)現(xiàn)ALK的分子信息，以便對(duì)患者的狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí) 觀察。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明提供一種對(duì)ALK重排狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)的方法。直接幫助臨床醫(yī)師了解腫瘤患 者實(shí)時(shí)的基因狀態(tài)，以輔助預(yù)測(cè)生存情況并擬定下一步治療方案。
[0016] 本發(fā)明的方法包括以下全部及部分步驟：
[0017] 步驟1，從患者獲得血液樣本或其他含有稀有細(xì)胞的體液樣本，樣本中包含CTC或 其他稀有細(xì)胞與白細(xì)胞的混合細(xì)胞群；
[0018] 步驟2,用緩沖液稀釋樣本，離心去除血漿，并回收CTC或其他稀有細(xì)胞；
[0019] 步驟3,用紅細(xì)胞裂解液裂解，離心去除紅細(xì)胞并回收CTC或其他稀有細(xì)胞；
[0020] 步驟4,用包被有抗人白細(xì)胞相關(guān)抗原抗體的磁微粒同步驟3所得的回收細(xì)胞混 勻孵育，以使磁微粒同標(biāo)的白細(xì)胞充分結(jié)合并形成磁微粒-白細(xì)胞混合體；
[0021] 步驟5,離心將磁微粒-白細(xì)胞混合體與其他細(xì)胞分離，得到含有CTC或其他稀有 細(xì)胞及少量白細(xì)胞的混合細(xì)胞群；
[0022] 步驟6,使用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)與熒光原位雜交的相結(jié)合的方法，測(cè)定對(duì)CTC或其 他稀有細(xì)胞的ALK基因重排的狀態(tài)。
[0023] 本發(fā)明所述的方法，其中，步驟2所述緩沖液為一種與血液密度相近的緩沖液，含 有BSA、PBS等物質(zhì)，pH7-8之間，能夠保證去除血漿的同時(shí)，保護(hù)各種有核細(xì)胞。
[0024] 本發(fā)明所述的方法，其中，步驟3所述紅細(xì)胞裂解液為一種紅細(xì)胞裂解液，利用等 滲不等張的原理，裂解紅細(xì)胞的同時(shí)，不會(huì)損傷其他有核細(xì)胞。
[0025] 如以下配方的裂解液：
[0026]NH4C1 82. 9g
[0027]KHC03IOg
[0028]EDTA0. 37g
[0029] 加H20至1000ml(高壓滅菌，4°C保存）
[0030]或
[0031] 紅細(xì)胞裂解液（Tris-MMCl):稱取3. 735g氯化銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris)I. 3g 加水溶解并稀釋至500ml。0. 22ym濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0032] 本發(fā)明所述的方法，其中，步驟4所述包被有抗人白細(xì)胞相關(guān)抗原抗體的磁微粒 為一種包被抗白細(xì)胞共同抗原抗體的鏈親和素磁珠。能夠最大量地、牢固地結(jié)合白細(xì)胞，利 于后續(xù)的分選處理。
[0033] 本發(fā)明所述的方法，其中步驟5所述離心介質(zhì)為一種密度介于1. 070-1. 080之間 的密度梯度離心液，其中以1. 072最優(yōu)，可以在去除結(jié)合磁珠的白細(xì)胞的同時(shí)，保存其他單 個(gè)有核細(xì)胞不丟失。
[0034] 本發(fā)明所述的方法，其中，步驟6所述使用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)與熒光原位雜交的 方法，對(duì)CTC或其他稀有細(xì)胞的ALK的基因重排狀態(tài)進(jìn)行鑒別，方法如下：
[0035] ALK重排型CTC:將標(biāo)本置于熒光顯微鏡相應(yīng)通道下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)至少一個(gè)橙色信 號(hào)點(diǎn)與一個(gè)綠色信號(hào)點(diǎn)分離時(shí)，計(jì)為一個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。
[0036] -種用于上述方法的試劑盒一，包括如下成分：
[0037]
[0038] 其中，IOX、20X表示濃度，即該溶液為10倍/20倍的濃度。
[0039] 本發(fā)明所述的試劑盒制備方法如下：
[0040] 試劑盒一包含下述富集及鑒別兩部分的試劑。
[0041] 富集部分：
[0042] CSl濃縮緩沖液（IOX):
[0043] 每1000 mL水中，含有 60gBSA，5 包PBS粉末（2L/ 包），IOOmL0? 5M的EDTA，0? 8mL Proclin300。
[0044] CS2濃縮儲(chǔ)存液（IOX):
[0045] 每1000 mL水中，稱取 82. 9gNH4Cl、10gKHC03、0. 37gEDTA，水以及 0? 8mL Proclin300,進(jìn)行充分的攪拌溶解，定容，配制為IOX濃縮液。
[0046] CS3分離介質(zhì)：
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