專利名稱：制備藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及一種制備藻藍蛋白類熒光蛋白 質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據(jù) 其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、 藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和 變藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基， 每個亞基中藻膽色素(phycobilin )通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白 (即o-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相 互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得 CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580咖的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā) 射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素 (phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素 (phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍膽素 (phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。
CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(TooleyAJ, CaiYA， Glazer A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98(19):10560 10565)。 PCB生物合成基因由力o7和pc州組成，可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)PCB (F. T. Landgraf, C. Forreiter， et al.Recombinant holophytochrome in Echerichia coli[J]. FEBSLetters，2001, 508:459-462)。與前人的方法不同，我們發(fā)現(xiàn)^a&e朋sp. PCC7120中a775^^效基因編碼betal55裂合酶，在其它藍藻中也存在同源的betal55裂合 酶。這些betal55裂合酶能催化PCB與CPC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的155位半胱氨 酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良熒光性質(zhì)的藻藍蛋白類熒 光蛋白質(zhì)。在絕大部分的藍藻和紅藻中，都存在有編碼CPE脫輔基蛋白、CPC脫輔基蛋 白、APC脫輔基蛋白、betal55裂合酶以及PCB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏 PE而具有異形胞的藍藻中存在PEC;隱藻中沒有藻膽體，不存在上述基因中的APC的基 因。藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。目前使用的 藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)主要從藍藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法， CN1344723， 2002.04.17。一種水華藍藻制備藻藍蛋白的方法，CN1563083， 2005.01.12)。 本方法不利用藻類作為原料，而是利用基因工程方法生產(chǎn)藻藍蛋白。藻藍蛋白類熒光蛋白 質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，為了發(fā)展藻藍蛋白類新型熒光探針，可以分子設(shè)計藻藍蛋白類熒 光蛋白質(zhì)。本方法為藻藍蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工
程領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供分子設(shè)計制備新型藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法。它是應用 betal55裂合酶催化PCB與藻藍蛋白類脫輔基蛋白共價結(jié)合，從而制備藻藍蛋白類熒光蛋 白質(zhì)。將含有betal55裂合酶基因、藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因和PCB生物合成酶基因的 表達質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到相應的工程菌，通過如此設(shè)計的基因工程菌生產(chǎn)藻藍蛋白 類熒光蛋白質(zhì)。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 一種制備藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì) 的方法，包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得 到betal55裂合酶表達質(zhì)粒
(2) 用基因工程方法將藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個表達 載體中，得到脫輔基蛋白表達質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法將PCB生物合成酶基因力o7和pc;^或其同源基因同時克隆于第 三個表達載體中或分別克隆于第三、第四個表達載體中，得到PCB合成質(zhì)粒；
(4) 將betal55裂合酶表達質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、PCB生物合成酶質(zhì)粒依次 轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌 發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的目的也可以這樣實現(xiàn) 一種制備藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，包括下述步
驟
(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋 白基因或其同源基因同時克隆于表達載體中，得到betal55裂合酶和藻藍蛋白類脫輔基蛋 白表達質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法將PCB生物合成酶基因力o7和p《W或其同源基因同時克隆于第 二個表達載體中，得到PCB合成質(zhì)粒；
(3) 將betal55裂合酶和藻藍蛋白類脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、PCB生物合成酶質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程 菌發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
上述的制備藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法中所述的宿主菌為大腸桿菌。所述的 betal55裂合酶基因是指與^7a&e朋sp. PCC7120中a〃M滯基因同源的基因。所述的 藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因是指與^朋&e朋sp. PCC7120或?qū)?柳/ym^ sp. PCC7603 中cp"基因同源的基因。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)，大腸桿菌繁殖 快，可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；
3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質(zhì) 類似的蛋白，提取方便；
4、 方便進行藻膽蛋白分子設(shè)計，有利于發(fā)展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料。


圖1為本發(fā)明中A115339催化下生成的藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的吸收與熒光光譜；其 中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實施例方式
下面以實例對本發(fā)明作進一步詳細地說明。 實施例1
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種A2a力朋朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， i/. 7a/w'/70Si/s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力朋力ae"a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M 7a/w'/70s"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^/7a6肪朋sp.PCC7120中的 a775J，效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775JJA在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將^7a6ae/ a sp. PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpcS克隆于Novagen 公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-cpC&在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻 藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-pcj^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpc^在pET30中是在化oRV和兩個酶切位點之間；裂合酶 基因a775JJ9在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是^ 711和J力o I ; PCB 合成酶基因是2個(力o7和pc/力)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o/處于第一個 多克隆位點，在7VcoI和尸Wl之間，pc^在第二個多克隆位點，在yWel和屈oI之間。 基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-aL^^久pET30-cpc萬和pACYCDuet-/ o7-; 《W轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當 這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基 中，37'C振蕩培養(yǎng)至006。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、 破碎細胞后，離心收集上清液，通過NP親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋 白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。其吸收與熒光光譜見附圖1中所示，其中實線為吸收光譜， 而虛線為熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜；取100pL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5raL LB培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)至 0D6。。=0. 3 0. 4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min;離心lmin (10000g, 4'C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmL預冷的O.lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體,離心 30s(10000g, 4。C)去上清，菌體沉淀用lOOpL預冷的0.1mol/L CaCl2重懸，放置于冰上， 加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30min， 42'C熱休克90s，冰浴5niin后加入 30(VL LB培養(yǎng)基，37。C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基平 板上，倒置于37'C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。
提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和； 分別從中取10(^L轉(zhuǎn)接至5ral含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37。C振蕩培養(yǎng)至0D6oo-0. 5-0. 7 時，冰浴約30min，加入IPTG誘導表達；避光、20'C、 150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。離心 收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進行大量表達。 實施例2
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋力se朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 7s加'/7asM sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力朋6朋朋sp. PCC7120在GeneBank中編號
為BA000019，尨7a/MV os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^a力aey7a sp. PCC7120中的 a775義效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775J3A在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將/!/7a&e朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc"C84S)克隆于 Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-cpc5(C84S)，在大腸桿菌中能表達 脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和pcy力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-Z o7-pcj^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因c; c5(C84S)在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個酶切位點之間； 裂合酶基因W7MW在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是5g/II和J力o
I; PCB合成酶基因是2個(Z o7和pc州)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力W處于 第一個多克隆位點，在I和尸"I之間，/7C州在第二個多克隆位點，在7Vofe I和J力o
I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a775^J9、 pET30-c/ c萬(C84S)和pACYCDuet-力o卜pc//1轉(zhuǎn)入大腸桿 菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB 培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋 白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例3
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^ a6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， yK 7柳i/ os^ sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必Ja/w'/7o幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7^站朋sp.PCC7120中的 aL 5J39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775"J3義在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將尨7a肌'加s^ sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^克隆于 Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-c/x^，在大腸桿菌中能表達脫輔基 蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-; 《W，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因c; c5在pET30中是在iboRV和J/w I兩個酶切位點之間；裂合酶 基因aL 5JJ9在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是^^ n和Wol ; PCB 合成酶基因是2個(力o7和/ cy力)，它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力o7處于第一個 多克隆位點，在AfcoI和/^I之間，pc;^在第二個多克隆位點，在/W/el和i7 oI之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a^5JJ義pET30-cpc^和pACYCDuet-力o7-; 《W轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當 這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基 中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D柳為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lraraol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、 破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋
白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例4
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋6ae/7a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， yK 7a/zuV7oms sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019， J/. 7柳i/7o^Assp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將力/7atee/7a sp. PCC7120中的 aL^JJ9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a7J5^J》，在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將;K 7ayz7i/70s"s sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c/7C^(C84S)克隆 于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-cpc5(C84S)，在大腸桿菌中能 表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和/7C^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o卜/ 《W，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因c/ cMC84S)在pET30中是在fcoRV和i7 o1兩個酶切位點之間； 裂合酶基因aWMW在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是5Wn和i7w
I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc/力)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，Z o7處于 第一個多克隆位點，在儉o I和At I之間，在第二個多克隆位點，在yWe I和J力o
I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a7/5^J久pET30-cpcj (C84S)和pACYCDuet-力o/-pc_M轉(zhuǎn)入大腸桿 菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、 破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋 白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例5
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋6朋/73 sp. PCC7120的全序列己經(jīng)測定完成， 必7a/w'"o^As sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^ a6朋/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨^/JU'/ ow5"sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將力朋tee朋sp.PCC7120中的 a77M朋基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c/7C^克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDrauet-cpc^a775M9，在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶和藻藍蛋白類 脫輔基蛋白B。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o/和克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o卜po^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因c/x^和裂合酶基因a7^^39在pCDFDuet中，c/ c5處于第一個多 克隆位點，酶切位點是￡boR I和尸"I ， a"5JJ2處于第二個多克隆位點酶切位點是A《7 II和J/ o I ; PCB合成酶基因是2個(/w/和pc^)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中， 力W處于第一個多克隆位點，在yVcoI和尸"I之間，pcj^I在第二個多克隆位點，在We I和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(3) 將pCDFDuet-cpc5 -377MW和pACYCDuet_/w7-pc/力轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì) 粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、 破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋 白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例6
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^ atee朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， i/. 7a/M'/ osa sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。Z朋力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必7柳i/ os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋6朋朋sp.PCC7120中的 a^5M^基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c/x^"斜5V克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-cpc^ (T斜5^-aL^"^在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶 和藻藍蛋白類脫輔基蛋白B。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和/ c/"克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-/w/-pc/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpcA (T斜5V和裂合酶基因a^5M^在pCDFDuet中，cpc^ 處于第一個多克隆位點，酶切位點是和P" I ， ai75^39處于第二個多克隆位點酶 切位點是5g7II和J力ol ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc/力，它們在同一個載體 pACYCDuet-1中，力W處于第一個多克隆位點，在yVco I和尸"I之間，pc州在第二個多 克隆位點，在We I和I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，
利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(3) 將pCDFDuet-c/ c5 (T斜6V-aW5"9和pACYCDuet-力0/-;^///轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當
這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至ODe。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-13-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1垂1/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、 破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋 白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例7
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種/)/ a6ae朋sp. PCC7120的全序列巳經(jīng)測定完成， M 7柳i/70Si/s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。///7a&e/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，i/. 7柳i/ owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7a6a朋a sp. PCC7120中的 a775^^效基因和復^肌'/70SiAs sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c;x^克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-cpc&a7^"Jc^，在大腸桿菌中能表 達betal55裂合酶和藻藍蛋白類脫輔基蛋白B。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-; cW，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpc5和裂合酶基因a775JJ9在pCDFDuet中，cpcA處于第一個多 克隆位點，酶切位點是^cdU和尸WI ， aL^J，效處于第二個多克隆位點酶切位點是^^
II和Z力o I ; PCB合成酶基因是2個(Z W和pcW)，它們在同一個載體pACYCDuet-l中， 力o7處于第一個多克隆位點，在辰ol和尸"I之間，/7C州在第二個多克隆位點，在Afcfe
I禾口 /力o1之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(3) 將pCDFDuet-cpc5 -a77MW和pACYCDuet-Z o7-pcW轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì) 粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、 破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋 白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例8
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力/7a6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必7a肌'/ os〃s sp. PCC7603部分序列己經(jīng)測定。A a6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，髮Ja啦'/70SiA9sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將J刀s力se/^ sp.PCC7120中的 a775J39基因和M 7a/zu'/7osi/s sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5 (r《^SV 克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-cpcA (T斜5V -377533《 在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶和藻藍蛋白類脫輔基蛋白B。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和； c^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o wA在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因"斜5V和裂合酶基因a"5M9在pCDFDuet中，a:W5V 處于第一個多克隆位點，酶切位點是^boR I和I ， a/75^，效處于第二個多克隆位點酶 切位點是5^ n和化ol ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc^)，它們在同一個載體 pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在Afco I和尸"I之間，pc/Z在第二個多 克隆位點，在We I和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(3) 將pCDFDuet-cpc5 (TW5V -aW5^9和pACYCDuet-力W-p《W轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當 這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、 破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋 白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例9
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力/7a力3e/7a sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 7a肌'/70s〃s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。Z/7aZ 朋/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號
為BA000019，必7a/wV os〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^73&朋a sp.PCC7120中的 a7753J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a77533A在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將力朋力se朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^克隆于Novagen 公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-c/ c5，在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻 藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達H01。
將藻藍膽素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pcW，在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpc5在PET30中是在EcoRV和Xho I兩個酶切位點之間；裂合酶 基因a"幻W在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是i5^II和J力ol ; PCB 合成酶基因是2個(Z o7和/ c/力)，hol在pACYCDuet-1中，處于第一個多克隆位點，在 〃co I和尸"I之間，pc州在pETDuet-1中第二個多克隆位點，在AWe I和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-a^5^3久pET30-cpc5和pACYCDuet-力o厶pETDuet-pc州轉(zhuǎn)入大腸 桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD6oo為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p_D-半乳糖苷 (isoprophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例10
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋Z7a朋a sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 7a/w'/ os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號
為BA000019，M Ja/M'; owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254, 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^^/7ae/73 sp. PCC7120中的 aW5^^^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-aW53J"在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將/J朋6ae/7a sp. PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^ (T6^S9克隆于 Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-cpc^ ^7<^5V，在大腸桿菌中能表 達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達H01 。
將藻藍膽素生物合成酶基因之一 pc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc^，在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpc5 O^^SV在pET30中是在EcoRV和Xho I兩個酶切位點之間； 裂合酶基因s775J，效在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是^^HI和i7 o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和/ c^)，力。7在pACYCDuet-1中，處于第一個多克隆位 點，在Afco I和尸"I之間，pc/力在pETDuet-l中第二個多克隆位點，在AWe I和Z力o I 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-aWM^A pET30-cpc5 "斜5V禾卩pACYCDuet—力o厶pETDuet-pcj^ 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振 蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例11
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^a&e朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必7柳i/705Y/s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^ a/fee/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M 2a/w'/ owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^s6朋朋sp.PCC7120中的 a775"J(效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775J3義在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將，髮7a肌'/7os^ sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-cpc5,在大腸桿菌中能表達脫輔基 蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o/，在大腸桿菌中能表達H01。
將藻藍膽素生物合成酶基因之一 pcjvl克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-; c州，在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因c/ c"在pET30中是在EcoRV和Xho I兩個酶切位點之間；裂合酶 基因a"M滯在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是5WII和; PCB合成酶基因是2個(力W和/ c/力)，hol在pACYCDuet-1中，處于第一個多克隆位點，在 Wco I和At I之間，pcj^在pETDuet-1中第二個多克隆位點，在AWe I和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段, 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，
利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-a^5^J久pET30-cpcA和pACYCDuet-pETDuet -; cj^轉(zhuǎn)入大腸 桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD6oo為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例12
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^7a&e朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， yK 7a肌'/70SiA9 sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力朋力a朋a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨7柳i/7os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋&e朋sp.PCC7120中的 3775J^效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-W75JJA在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將力朋力ae朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^ 克隆于 Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-cpc^ (C84S)，在大腸桿菌中能表 達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達H01 。
將藻藍膽素生物合成酶基因之一 pc州克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpc5 "6^ J在pET30中是在EcoRV和Xho I兩個酶切位點之間； 裂合酶基因W75^J9在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是5《711和i o I; PCB合成酶基因是2個(力o7和pcj^)， hol在pACYCDuet-l中，處于第一個多克隆位 點，在I和尸"I之間，pcj^在pETDuet-l中第二個多克隆位點，在Afefe I和J力o I 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-a775JM、 pET30-cpc5 (T斜W和pACYCDuet-力o入pETDuet-轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-卩-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 20。C至37。C振 蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提純得到相應的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例13
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^ a6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M 7a/w'/7os〃s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。/)朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000(H9，必7湖uVmm9sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254, 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將力朋6ae朋sp. PCC7120中的 a775539基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-aL^3J"在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將^7a6ae朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5克隆于Novagen 公司的表達載體pC0LADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-cpcA在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-Z o7-pc/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpc5在pCOLADuet-l第一個多克隆位點，在EcoR I和Pst I兩個 酶切位點之間；裂合酶基因s^5^^^在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點 是^g7II禾口 J/w I ; PCB合成酶基因是2個(Z o7和pcW)，它們在同一個載體pACYCDuet-1 中，力o7處于第一個多克隆位點，在辰ol和戶"I之間，pc^在第二個多克隆位點，在 Wcfel和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，
利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-aWMJA pCOLADuet-cpc^和pACYCDuet-/ o7-pc/力轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng) 基中，37t:振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、 破碎細胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋 白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例14
(1)從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae朋sp. PCC7120的全序列己經(jīng)測定完成， 尨7a/wV70s"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^ a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M ^/zu'/70s〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋6ae朋sp. PCC7120中的 a775^39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a7753JA在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。(2) 將^7aZ^e朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c;x^(C84S)克隆于 Novagen公司的表達載體pCOLADuet — l中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-cpc5(C84S)，在大腸 桿菌中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o卜pc/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因c/ c夙C84S)在pC0LADuet-l第一個多克隆位點，在EcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因W^^^^在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶 切位點是5WII和/力o1 ; PCB合成酶基因是2個(力o/和/7cy力)，它們在同一個載體 pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在AfcoI和尸Wl之間，pc州在第二個多 克隆位點，在AWe I和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a775^3久pC0LADuet-c; c5(C84S)和pACYCDuet-/ o7-pcjvl轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0K。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例15
(1)從GeneBank中可以查到，藻種sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M 7a/w'/ os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力朋6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，vK 7a/w'"os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^ s力ae;73 sp. PCC7120中的 aL 55J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-3L 5J3A在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將#. 7柳i/7oms sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^克隆于 Novagen公司的表達載體pCOLADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-cpc5，在大腸桿菌中能 表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(Zw7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o/-pc/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpc5在pCOLADuet-l第一個多克隆位點，在EcoR I和Pst I兩個 酶切位點之間；裂合酶基因a^5^J^在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點 是^"7II和Z力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc/"，它們在同一個載體pACYCDuet-1 中，力o7處于第一個多克隆位點，在Afcol和Atl之間，pc^在第二個多克隆位點，在 腸I禾口勘I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a^5^3A pC0LADuet-cpc5和pACYCDuet-/ o/-pc_M轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng) 基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D卿為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(5-D-半乳糖苷(isoprcDphyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、 破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋 白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例16
(1)從GeneBank中可以查到，藻種力朋6朋朋sp.PCC7120的全序列己經(jīng)測定完成， yK 7aTW'/jos"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^7a/ 朋朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必7a歷i/ o幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋&e朋sp.PCC7120中的 3L^ ^效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775JJA在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將尨^3/w'/7o iA9 sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c; c^(C84S)克隆 于Novagen公司的表達載體pCOLADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-cpc萬(C84S),在大 腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和pc/力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ o7-pc^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpc5(C84S)在pCOLADuet-1第一個多克隆位點，在EcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因a^5JJ^在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶 切位點是5g/n和; PCB合成酶基因是2個(力W和pc州)，它們在同一個載體 pACYCDuet-1中，力o/處于第一個多克隆位點，在yVcoI和尸"I之間，pc/力在第二個多 克隆位點，在I和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a^5^J久pCOLADuet-cpc/ (C84S)和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-13-D-半乳糖苷 (is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B:離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例17
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^朋力ae/ a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必7<a7wV7a As sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^7a6s朋a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必2a肌Vjos"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254，可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^a力ae/7s sp.PCC7120中的 a77MJ9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-W75^J義在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將力朋力ae朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c/ c^克隆于Novagen 公司的表達載體pCOLADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-cpcA在大腸桿菌中能表達脫 輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達HOl。
將藻藍膽素生物合成酶基因之一 / c^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-/7C/A在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpc5在pC0LADuet-1第一個多克隆位點，在^boR I和尸"I兩個 酶切位點之間；裂合酶基因aL 5^39在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點 是ife^II和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc州)，hol在pACYCDuet-1中，處于 第一個多克隆位點，在I和戶W I之間，； cj^在pETDuet-l中第二個多克隆位點，在 她I禾口勘I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a775^J久pC0LADuet-cpt^和pACYCDuet-/ o厶pETDuet -pc/Z轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD咖為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。實施例18
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^a6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必J柳&o犯s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^73力朋/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M h孤'/70犯ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7s&e/7a sp.PCC7120中的 a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a^^5^J"在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將^ a6ae朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^ ^:6^5V克隆于 Novagen公司的表達載體pCOLADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-cpc5 (C84S),在大腸 桿菌中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達H01。
將藻藍膽素生物合成酶基因之一 j9Q^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-/ c/A在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因c; ci9 "斜W在pCOLADuet-1第一個多克隆位點，在￡boR I和/^t I兩個酶切位點之間；裂合酶基因aW5^39在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶 切位點是5《711和J/w I ; PCB合成酶基因是2個(Z o7和pc/力，hoi在pACYCDuet-1中， 處于第一個多克隆位點，在Afco I和尸"I之間，pc/z!在pETDuet-1中第二個多克隆位點， 在AWel和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-W75JJ久pCOLADuet-cpc5(T6^^和pACYCDuet-力o7、 pETDuet-; c/力
轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(isoprophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例19
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^ a&e朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必Ja/w'/ os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必h肌'/ os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7stee/ a sp.PCC7120中的 aWAX效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775"JJ義在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將，尨Js啦'/7o仰s sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc萬克隆于 Novagen公司的表達載體pCOLADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-cpc&在大腸桿菌中能 表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達H01。
將藻藍膽素生物合成酶基因之一 pc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因c/ c5在pC0LADuet-l第一個多克隆位點，在^coR I和I兩個 酶切位點之間；裂合酶基因aW5J3P在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點 是5^711和X力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和/ c/Z)， hol在pACYCDuet-1中，處于 第一個多克隆位點，在/Vcol和之間，pc/力在pETDuet-1中第二個多克隆位點，在 AWeI和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pCDFDuet-a77MW、 pCOLADuet-c/ c5和pACYCDuet—力o厶pETDuet-pc/力轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例20
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^ aZ ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， #. 7柳i/ os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力/3a力ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨Ja肌'/7os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將sp.PCC7120中的 a775^^9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-aL^3J^，在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將/J朋Z ae朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c/ c5 "斜59克隆于 Novagen公司的表達載體pC0LADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-cpc5 (C84S)，在大腸 桿菌中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達H01 。
將藻藍膽素生物合成酶基因之一 pc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-; c州，在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因c/ c5 "斜5J在pC0LADuet-1第一個多克隆位點，在￡boR I和尸" I兩個酶切位點之間；裂合酶基因a775^39在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶 切位點是和i7 o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和/ c/力)，hol在pACYCDuet-1中， 處于第一個多克隆位點，在Afcol和尸"I之間，； c州在pETDuet-1中第二個多克隆位點， 在7^/el和i7 o1之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-a775JJ久pC0LADuet-cpc^(^ ^5V和pACYCDuet—/w人pETDuet—pc_K/4 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-13-D-半乳糖 苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振 蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 上述制備方法適用于采用各種藍藻中的betal55裂合酶、藻藍蛋白類脫輔基蛋白、藻 藍膽素生物合成酶基因或其同源基因以及鏈霉親和素基因來制備鏈霉親和素標記的藻藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌種公開的問題，本發(fā)明只選用了GenBank中已公開 全序列的藍藻^朋6ae朋sp. PCC7120和已經(jīng)部分測序的2a肌'770s"s sp. PCC7603為例對 本發(fā)明方法加以說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容采用其它原料實施本發(fā) 明。
權(quán)利要求
1. 一種制備藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到betal55裂合酶表達質(zhì)粒；(2)用基因工程方法將藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質(zhì)粒；(3)用基因工程方法將PCB生物合成酶基因hol和pcyA或其同源基因同時克隆于第三個表達載體中或分別克隆于第三、第四個表達載體中，得到PCB合成質(zhì)粒；(4)將betal55裂合酶表達質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、PCB生物合成酶質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
2. —種制備藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括下述步驟-(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋 白基因或其同源基因同時克隆于表達載體中，得到betal55裂合酶和藻藍蛋白類脫輔基蛋 白表達質(zhì)粒；(2) 用基因工程方法將PCB生物合成酶基因力o/和pc/力或其同源基因同時克隆于第 二個表達載體中，得到PCB合成質(zhì)粒；(3) 將betal55裂合酶和藻藍蛋白類脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、PCB生物合成酶質(zhì)粒依 次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程 菌發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應的藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的宿主菌為大腸桿菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的betal55裂合酶基因是指 與^ a/ ae/7S sp. PCC7120中a^5^J^基因同源的基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基 因是指與J朋6ae朋sp. PCC7120或hffliVwstAS sp. PCC7603中cpc5基因同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，通過應用藻膽蛋白beta155裂合酶催化藻藍膽素與藻藍蛋白類脫輔基蛋白共價結(jié)合，制備藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法應用生物過程生產(chǎn)藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法。藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)能應用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應用為生物和醫(yī)學分子監(jiān)測領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號C12N15/09GK101412997SQ20071003088
公開日2009年4月22日 申請日期2007年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月17日
發(fā)明者佟順剛, 明 周, 坤 夏, 趙開弘 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司;華中科技大學