一種表達(dá)紅色熒光蛋白的重組家蠶質(zhì)型多角體病毒的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)紅色熒光蛋白的重組家蠶質(zhì)型 多角體病毒的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼腸孤病毒科（Reoviridae)病毒是一類能感染動(dòng)物、植物以及真菌的雙鏈RNA (dsRNA)病毒。質(zhì)型多角體病毒（Cytoplasmic polyhedrosis virus，簡(jiǎn)稱CPVs)是呼腸孤 病毒科質(zhì)型多角體病毒屬（Cypovirus)中的成員，其基因組由9至11個(gè)雙鏈RNA片段組成。 CPVs是農(nóng)林害蟲的重要病原，能感染鱗翅目（Ze/?i￡/o/7te_ra)、膜翅目（辦膨和鞘翅 目（Cbhoptera)昆蟲，在害蟲自然種群控制方面發(fā)揮重要的作用，是一種極具開發(fā)潛力的 生物殺蟲劑。
[0003] 根據(jù)CPVs基因組dsRNA在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的迀移模式，CPVs可分為20種 不同的類型。家香細(xì)胞質(zhì)型多角體病毒（及咖cytoplasmic polyhedrosis virus， BmCPV)是CPV1型中的典型種。
[0004] 你處_因編碼的紅色熒光蛋白（DsRed)由225個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為 25. 9ku。它的一級(jí)結(jié)構(gòu)與綠色熒光蛋白（GFP)的同源性很低(僅為23%)，但它們的二級(jí)結(jié) 構(gòu)很相似。與GFP相比，紅色熒光蛋白（DsRed)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)，其發(fā)射峰位于培養(yǎng) 基、組織培養(yǎng)器材及細(xì)胞成分等產(chǎn)生的熒光背景范圍之外，具有較高的信噪比，而且在細(xì)胞 內(nèi)熒光轉(zhuǎn)換效率高，更易檢測(cè)。
[0005] 由于家蠶細(xì)胞質(zhì)型多角體病毒基因組由S1至S10共計(jì)10個(gè)雙鏈RNA片段組成， 常規(guī)方法難以通過(guò)遺傳操作來(lái)構(gòu)建重組家蠶質(zhì)型多角體病毒表達(dá)外源基因。至目前為止， 未見體外構(gòu)建重組家蠶質(zhì)型多角體病毒表達(dá)外源基因的報(bào)道，也未見構(gòu)建其他重組質(zhì)型多 角體病毒表達(dá)外源基因的報(bào)道。因此，開發(fā)一種重組質(zhì)型多角體病毒表達(dá)外源基因的構(gòu)建 方法將會(huì)彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中的空白，將會(huì)為今后的科研及開發(fā)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述情況，本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)紅色熒光蛋白的重組家蠶質(zhì)型多 角體病毒的構(gòu)建方法。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下所述： 一種表達(dá)紅色熒光蛋白的重組家蠶質(zhì)型多角體病毒的構(gòu)建方法，其包括下列步驟： (1) 獲得家蠶質(zhì)型多角體病毒基因組； (2) 根據(jù)家蠶質(zhì)型多角體病毒基因組Sl、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的雙 鏈 RNA 的末端序列，設(shè)計(jì)并合成 10 對(duì)引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、 PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的 編號(hào)情況如下： 引物 PS1F 對(duì)應(yīng) SEQ ID N0:1，引物 PS1R 對(duì)應(yīng) SEQ ID N0:2， 引物卩52卩對(duì)應(yīng)5￡〇10勵(lì):3，引物卩521?對(duì)應(yīng)5￡〇10勵(lì):4， 引物 PS3F 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 5,引物 PS3R 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO:6， 引物 PS4F 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 7,引物 PS4R 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO:8， 引物 PS5F 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO:9,引物 PS5R 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 10， 引物 PS6F 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 11，引物 PS6R 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 12， 引物 PS7F 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 13,引物 PS7R 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 14， 引物 PS8F 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 15,引物 PS8R 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 16， 引物 PS9F 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 17,引物 PS9R 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO: 18， 引物？51(^對(duì)應(yīng)5￡〇10勵(lì)：19，引物卩5101?對(duì)應(yīng)5￡〇10勵(lì)：20， 各個(gè)引物的序列如下所示：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種表達(dá)紅色熒光蛋白的重組家蠶質(zhì)型多角體病毒的構(gòu)建方法，其包括下列步驟： 1) 獲得家蠶質(zhì)型多角體病毒基因組； 2) 根據(jù)家蠶質(zhì)型多角體病毒基因組Sl、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、SlO片段的雙 鏈RNA的末端序列，設(shè)計(jì)并合成 10 對(duì)引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、 PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的 編號(hào)情況如下： 引物 PSlF 對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 1，引物 PSlR對(duì)應(yīng)SEQIDNO:2， 引物 PS2F 對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 3,引物 PS2R對(duì)應(yīng)SEQIDNO:4， 引物 PS3F 對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 5,引物 PS3R對(duì)應(yīng)SEQIDNO:6， 引物 PS4F 對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 7,引物 PS4R對(duì)應(yīng)SEQIDNO:8， 引物PS5F對(duì)應(yīng)SEQIDNO:9,引物PS5R對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 10， 引物PS6F 對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 11，引物PS6R對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 12， 引物PS7F 對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 13,引物PS7R對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 14， 引物PS8F 對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 15,引物PS8R對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 16， 引物PS9F 對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 17,引物PS9R對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 18， 引物PSlOF對(duì)應(yīng)SEQIDNO: 19,引物PSlOR對(duì)應(yīng)SEQIDN0:20， 所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 1至SEQIDNO:20所示； 3) 獲得Sl至SlO片段的cDNA; 4) 分別以步驟3)中獲得的Sl至SlO片段的cDNA為模板，對(duì)應(yīng)使用步驟2)中合成的 10對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Sl至SlO片段全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物； 5) 將步驟4)中獲得的Sl至SlO片段全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物分別使用限制性內(nèi)切酶進(jìn) 行酶切，然后克隆到質(zhì)粒載體中，獲得分別帶有Sl至SlO片段全長(zhǎng)cDNA的重組質(zhì)粒pT-Sl、 pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10,其中所述限制性內(nèi)切酶 的使用情況如下： Sl片段全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物用5^1和fecll進(jìn)行酶切； S2片段全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物用5^1和fecll進(jìn)行酶切； S3片段全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物用5^1和fecll進(jìn)行酶切； S4片段全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物用如M和fecll進(jìn)行酶切； S5片段全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物用辦7/?1和fecll進(jìn)行