專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種急性早幼粒細(xì)胞白血病dna疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于血液腫瘤免疫治療
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種急性早幼粒細(xì)胞白血病(即pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF)DNA疫苗及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：免疫療法治療腫瘤與白血病是目前的一個(gè)趨勢(shì)，DNA疫苗具備諸多傳統(tǒng)疫苗所不能比擬的優(yōu)勢(shì)，能夠誘導(dǎo)特異性體液免疫與細(xì)胞免疫。急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acutepromyelocyteleukemia,APL)是目前治療效果最好的一種白血病，但腫瘤的微小殘留病變(minimalresidualdisease,MRD)卻很難被現(xiàn)行治療方案根除，尋找一種能夠根除APL的MRD的治療方案迫在眉睫。盡管針對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acutepromyelocyticleukemia,APL)的聯(lián)合化療方案已經(jīng)取得很大進(jìn)展，患者的預(yù)后也有了較大改善，但腫瘤的微小殘留病變(minimalresidualdisease,MRD)卻很難被現(xiàn)行治療方案徹底消滅。由于許多白血病患者體內(nèi)都存在由于染色體易位所形成的融合基因，利用融合基因作為誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗白血病治療的靶點(diǎn)已經(jīng)成為眾多研究人員追求的目標(biāo)。由于體外表達(dá)的蛋白不一定具有與體內(nèi)蛋白一致的天然構(gòu)象，而且外源蛋白進(jìn)入體內(nèi)后以誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)為主，而DNA疫苗則能夠有效地克服這些缺陷，同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。利用PML-RARa(早幼粒白血病基因(PML)與維甲酸受體a(RARa)基因)融合基因制備DNA疫苗是有希望根除急性APL的MRD的方法之一。目前對(duì)于急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acutepromyelocyticleukemia,APL)的治療主要有傳統(tǒng)化療和誘導(dǎo)分化治療，雖然現(xiàn)有的治療方法已經(jīng)能夠在很大程度上提高患者的生存質(zhì)量，患者的預(yù)后也有了較大改善，但腫瘤的微小殘留病變(minimalresidualdisease,MRD)卻很難被現(xiàn)行治療方案徹底消滅。骨髓移植雖然能夠根除MRD，但骨髓來(lái)源少，配型成功率低，高昂的移植費(fèi)用以及嚴(yán)重的移植相關(guān)并發(fā)癥限制了該療法的推廣。在化療結(jié)束后輔以APL特異的DNA疫苗治療是有希望根除MRD的方法之一。大約有70XAPL患者體內(nèi)存PML-RARa(早幼粒白血病基因(PML)和維甲酸受體a(RARa)基因)融合基因，該融合基因是APL發(fā)病以及應(yīng)用全反式維甲酸治療有效的分子基礎(chǔ)，是一個(gè)特異的白血病抗原。表達(dá)PML-RARa融合基因的細(xì)胞可誘導(dǎo)T細(xì)胞克隆性增殖，提示該細(xì)胞內(nèi)的融合蛋白可以被MHC分子加工和提呈到細(xì)胞表面，因此可以利用PML-RARa融合蛋白或融合基因誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，或者誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)PML-RARa的特異性CTL，達(dá)到免疫治療的目的。Padua等研究發(fā)現(xiàn)利用跨越PML-RARa融合基因的融合點(diǎn)的基因片段構(gòu)建的DNA疫苗能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫保護(hù)作用。目前對(duì)于制備PML-RARa基因疫苗特異性目的基因的選擇尚無(wú)定論，如何篩選出具有最佳免疫原性的PML-RARa基因片段仍是此類(lèi)研究所面臨的核心問(wèn)題。目前尚未有融合基因pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF的構(gòu)建。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗(即pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF重組質(zhì)粒)。該融合基因pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF是能夠在真核細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)PML-RARa和hGM-CSF蛋白的質(zhì)粒。本發(fā)明利用基因克隆和重組技術(shù)構(gòu)建了急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗(即pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF重組質(zhì)粒)，并研究了通過(guò)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后基因和蛋白表達(dá)；小鼠體內(nèi)注射免疫后不同時(shí)期的基因和蛋白表達(dá)、抗體產(chǎn)生和特異性CTL效應(yīng)等的效應(yīng)。本發(fā)明的另-一目的在于提供上述急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供上述急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗的應(yīng)用。所述急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗是一種能夠在真核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)PML-RARa蛋白和hGM-CSF蛋白的DNA疫苗，它能夠誘導(dǎo)APL患者機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)APL細(xì)胞的特異性CTL從而清除患者體內(nèi)的微小殘留病變，達(dá)到治愈APL的目的。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗，所述DNA疫苗(pIRES-PML-RARa-hGM-CSF)由pIRES質(zhì)粒、PML-RARaGTGAACGCGTTTG;所構(gòu)建的基因片段是245bp，但實(shí)際上有效片段是210bp，ATG為啟始密碼子，TGA為終止密碼子；前后的序列為酶切位點(diǎn)等。所述hGM-CSF基因(大小為458bp)序列如下AGGTCTAGAACC^^TGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCGACTCT。上述急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗的制備方法，包括如下步驟(1)首先提取NB4細(xì)胞的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后利用引物PP1和PP2通過(guò)PCR擴(kuò)增出PML-RARa基因；擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物標(biāo)記為PML-RARa，其大小為245bp;所述的PP1:5，TTAGC7MGCACCATGCTGGATGGACCGCCTA3，；其中，GCTAGC為/酶切位點(diǎn)；所述的PP2:5'CAA4C(7CC77CTACTCACTCAGTAGCCTGAGGACTTG3,;其中，ACGCGT為M7w/酶切位點(diǎn)；將擴(kuò)增的基因PML-RARa利用T4DNA連接酶與pIRES質(zhì)粒進(jìn)行連接，插入到pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A中構(gòu)建出pIRES-PML-RARa;(2)然后通過(guò)PCR從pORF-hGM-CSF質(zhì)粒中擴(kuò)增出hGM-CSF基因以pORF-hGM-CSF質(zhì)粒作為模板，用引物PG1、PG2PCR擴(kuò)增hGM-CSF基因，擴(kuò)增的目的片斷hGM-CSF基因長(zhǎng)度為458bp;上游引物為PG1，下游引物為PG2;所述的PG1:5，AG(J7TT4G^CCATGTGGCTGCAGAGC3，；其中，TCTAGA為laI酶切位點(diǎn)；所述的PG2:5，AGA|G7r04ClATTCACTCCTGGACTGGC3，；其中，GTCGAC為1酶切位點(diǎn)；(3)將上述擴(kuò)增得到的hGM-CSF基因利用T4DNA連接酶與pIRES質(zhì)粒進(jìn)行連接，插入到pIRES-PML-RARa的多克隆位點(diǎn)B中，經(jīng)過(guò)測(cè)序正確后，構(gòu)建了pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF質(zhì)粒。所述步驟(1)擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性94。Clmin，退火60°Clmin;延伸72°Clmin，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；首次預(yù)變性為94°C3min，末次延伸為72°C10min。所述步驟(2)擴(kuò)增反應(yīng)條件為首先94"C預(yù)變性3min，然后94°C1min，56。C1min，72。C1min循環(huán)30次，最后72°C總延伸6min。上述急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗(pIRES-PML-RARa-hGM-CSF)可應(yīng)用于制備治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果1、該DNA疫苗是一個(gè)能夠在真核細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)PML-RARa和hGM-CSF蛋白的質(zhì)粒，將該DNA疫苗注射到急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)患者體內(nèi)能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)APL細(xì)胞的特異性免疫效應(yīng)，從而達(dá)到根除患者體內(nèi)的微小殘留病變的目的。可應(yīng)用于制備治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物。2、本發(fā)明利用PML-RARa融合基因構(gòu)建DNA疫苗用于根除APL的MRD，本發(fā)明提供了一個(gè)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗APL免疫效應(yīng)的PML-RARcc(245bp)-hGM-CSF雙基因DNA疫苗，為治療APL的DNA疫苗的研發(fā)提供重要的數(shù)據(jù)和資料。3、本發(fā)明利用腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異抗原與細(xì)胞因子基因共同構(gòu)建DNA疫苗)還可以為其他治療性腫瘤DNA疫苗的研究所借鑒。4、本發(fā)明的DNA疫苗能清除APL患者體內(nèi)的微小殘留病變，最終達(dá)到治愈APL的目的。圖1為PIRES-PML-RARa-hGM-CSF雙表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。圖2為雙表達(dá)pIRES質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜，其中MCSA即為多克隆位點(diǎn)A，MCSB即為多克隆位點(diǎn)B。圖3為PCR擴(kuò)增獲得的PML-RAR(x基因片段。Lanel:PML-RARa(245bp)，245bp。圖4為pIRES-PML-RARa(1)和pIRES-PML-RARa(2)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖。Lane1:pIRES-PML-RARa(245bp)/NheI+MluI;Lane2:pIRES-PML-RARa(245bp)/Nhel+Mlul。圖5為PCR擴(kuò)增獲得的hGM-CSF基因的電泳檢測(cè)圖。圖6為pIRES-PML-RARa-hGM-CSF和pIRES-hGM-CSF重組質(zhì)粒雙酶切鑒定。其中，Lanel:pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF/XbaI+SalI;Lane3:pIRES-hGM-CSF/XbaI+SalI。圖7為pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF重組質(zhì)粒中PML-RARa測(cè)序比對(duì)結(jié)果圖。圖8為pIRES-PML-RARa(245)-hGM-CSF重組質(zhì)粒中hGM-CSF測(cè)序比對(duì)結(jié)果圖。圖9為點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。1:陽(yáng)性對(duì)照；2:轉(zhuǎn)染了pIRES-PML-RARa-hGM-CSF的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液；3:轉(zhuǎn)染了pIRES-hGM-CSF的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液；4:轉(zhuǎn)染了pIRES的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液。圖10為初次免疫后小鼠血清做為一抗，羊抗鼠FITC標(biāo)記二抗，標(biāo)記NB4細(xì)胞的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果圖。其中，陽(yáng)性表達(dá)PML-RARa-GM-CSF-pIRES免疫小鼠組，陰性對(duì)照空載體組。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗(pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF重組質(zhì)粒)的構(gòu)建構(gòu)建流程圖如圖l所示，利用RT-PCR擴(kuò)增PML-RARa基因，將該基因插入到pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A(圖2所示)中構(gòu)建出pIRES-PML-RARa(245bp)，然后通過(guò)PCR從pORF-hGM-CSF質(zhì)粒中擴(kuò)增出hGM-CSF基因，將該基因插入至IJpIRES-PML-RARa(245bp)的多克隆位點(diǎn)B中構(gòu)建pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF，經(jīng)過(guò)測(cè)序正確后，就成功構(gòu)建了pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF質(zhì)粒。具體歩驟如下1pIRES-PML-RARa重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.1PML-RARa基因的擴(kuò)力從NB4細(xì)胞株中提取RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板(NB4細(xì)胞的RNA提取和cDNA合成均按常規(guī)方法進(jìn)行)，用上游引物PPl、下游引物PP2進(jìn)行PCR擴(kuò)增PML-RARa基因，總反應(yīng)體積為20|iL，其中含2pLcDNA和1U聚合酶其余各試劑的終濃度為引物0.5(imol/L，dNTP0.1mmol/L，MgCl21.5mmol/L，lxBuffer緩沖液。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，94°Clmin(首次為3min);退火60°Clmin;延伸72。Clmin(末次為10min)，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠在100伏電壓下電泳。電泳結(jié)果如圖3所示，產(chǎn)物片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物標(biāo)記為PML-RARa(245bp)，其大小為245bp。ppi:5'ttaIgcx4Gc1accatgctggatggaccgccta3，方框內(nèi)為A^;I酶切位點(diǎn)；pp2;'caa4ccfcc7ctactcactcagtagcctgaggacttg3,方框內(nèi)為M/wI酶切位點(diǎn)；1.2酶切E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化PML-RARa(245bp)基因PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物和pIRES質(zhì)粒用M2eI和M7wI進(jìn)行雙酶切處理，具體反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)體系旋渦振蕩混勻后置于PCR儀中，37°C反應(yīng)5小時(shí)。表2PML-RARa基因片段PCR產(chǎn)物和pIRES質(zhì)粒雙酶切反應(yīng)體系_PML-RARa基因PCR產(chǎn)物plRES質(zhì)粒10xMBuffer2pL2pLWtel_1.3|jL_l阜<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1.3連接純化上述酶切反應(yīng)產(chǎn)物，酶切后的PML-RARa基因片段與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的pIRES質(zhì)粒利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。體系配好混勻后16'C過(guò)夜，連接產(chǎn)物4"C保存，盡量24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。連接反應(yīng)體系共25pL，包括2.5pL10xBuffer，5pLPCR產(chǎn)物，3fiL載體，l(iLT4DNA連接酶和13.5fiL滅菌水。經(jīng)過(guò)上述步驟將擴(kuò)增的基因PML-RARa(245bp)插入到pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A中構(gòu)建出pIRES-PML-RARa(245bp)重組質(zhì)粒。1.4轉(zhuǎn)化、篩選鑒定陽(yáng)性克隆將構(gòu)建好的pIRES-PML-RARa(245bp)重組質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，16小時(shí)左右長(zhǎng)出菌落。每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)挑選數(shù)個(gè)單菌落，分別置于100pLLB培養(yǎng)液(Amp100pg/mL)中，旋渦震蕩混勻。取溶解單菌落的培養(yǎng)液1|iL作為模板分別配以相應(yīng)的引物PP1，PP2進(jìn)行PCR(擴(kuò)增體系和方法同1.1)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠在IOO伏特電壓下進(jìn)行電泳。1.5提取質(zhì)粒及酶切鑒定收集擴(kuò)增的大腸桿菌利用質(zhì)粒提取試劑盒提取pIRES-PML-RARa(245bp)重組質(zhì)粒；將提取的重組質(zhì)粒分別用NheI和MluI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系共20(iL，包括2fiL10xBuffer，1Nhel，1MluI，10(iLDNA和6(iL滅菌水。體系配好后旋渦振蕩混勻，然后置于PCR儀中37'C反應(yīng)12小時(shí)，酶切產(chǎn)物100伏電壓下用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結(jié)果如圖4所示，從pIRES-PML-RARa(245bp)中切下來(lái)的PML-RARa基因片段，大小為245bp，與預(yù)期結(jié)果相符。1.6重組質(zhì)粒序列分析鑒定構(gòu)建的pIRES-PML-RARa(245bp)重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定正確后，還需要進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證插入多克隆位點(diǎn)A(MCSA)序列的正確性，從插入片段的上游開(kāi)始延順時(shí)針?lè)较虿捎秒p脫氧鏈末端終止法進(jìn)行單向測(cè)序，引物序列為"GGCACCTATTGGTCTTACTG"標(biāo)記為PC1。測(cè)序結(jié)果與Genbank中PML-RARa融合基因序列比對(duì)結(jié)果如圖7所示，由該圖可以看出重組質(zhì)粒中的插入的PML-RARa(245bp)基因序列完全正確。2pIRES-PML-RARa-hGM-CSF重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.1PCR擴(kuò)增hGM-CSF基因以pORF-hGM-CSF質(zhì)粒作為模板，用上游引物PG1、下游引物PG2PCR擴(kuò)增hGM-CSF基因，擴(kuò)增的目的片斷長(zhǎng)度為458bp。總反應(yīng)體積為20pL，其中含2jiLcDNA禾卩1U聚合酶其余各試劑的終濃度為引物0.5pmol/L，dNTPO.lmmol/L，MgCl2L5mmol/L，lxBuffer緩沖液。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行。反應(yīng)條件首先94'C預(yù)變性3min，然后94°C1min，56°C1min，72°C1min循環(huán)30最后72°C總延伸6min。擴(kuò)土1/在IOO伏特電壓下，用1.5。％瓊脂糖凝膠電泳檢效結(jié)果見(jiàn)圖PG1:5，AGGTCT4GL4ACCATGTGGCTGCAGAGC3，方框內(nèi)為^al酶切位點(diǎn)；PG2:5'AGA(7rCGL4CATTCACTCCTGGACTGGC3'方框內(nèi)為&n酶切位點(diǎn)；2.2酶切E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化hGM-CSF基因PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物和pIRES-PML-RARa重組質(zhì)粒以及pIRES質(zhì)粒用XbalI和SalI進(jìn)行雙酶切處理，酶切反應(yīng)體系共40(iL，包括8fiL10xTangoBuffer，2(iLXbal，2pLSalI，lOpLDNA和18(iL滅菌水。反應(yīng)體系旋渦振蕩混勻后置于PCR儀中，37"C反應(yīng)5小時(shí)。2.3連接純化上述酶切反應(yīng)產(chǎn)物。酶切后的hGM-CSFPCR產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的pIRES-PML-RARa重組質(zhì)粒利用T4DNA連接酶行連接反應(yīng)。體系配好混勻后16"C過(guò)夜，連接產(chǎn)物4"C保存，盡量24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。連接反應(yīng)體系共lOjiL，包括l(iL10xBuffer，l(aLPCR產(chǎn)物，2(iL載體，l|iLT4DNA連接酶和5pL滅菌水。經(jīng)過(guò)上述步驟將擴(kuò)增的hGM-CSF基因插入到pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)B(如圖2所示)中構(gòu)建出pIRES--hGM-CSF禾npIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF重組質(zhì)粒2.4轉(zhuǎn)化及篩選鑒定陽(yáng)性克隆方法同1.4;取溶解單菌落的培養(yǎng)液1作為模板用PG1、PG2作為引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增體系和方法同2.1。2.5常規(guī)提取質(zhì)粒及酶切鑒定將提取的pIRES--hGM-CSF和pIRES-PML-RARa-hGM-CSF重組質(zhì)粒用XbaI和Sall進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系共20iiL，包括4)iL10xTangoBuffer，1.5pLXbal，1.5pLSal1，6fiLDNA和7jiL滅菌水。體系配好后旋渦振蕩混勻，然后置于PCR儀中37°C反應(yīng)12小時(shí)，酶切產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結(jié)果如圖6所示，從各重組質(zhì)粒中切下來(lái)的hGM-CSF基因片段大小均為458bp，與預(yù)期結(jié)果相符。2.6重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定從插入片段的下游開(kāi)始延逆時(shí)針?lè)较蜻M(jìn)行單向測(cè)序，測(cè)序引物序列為"CGTCCATTCGCCATTCAG"標(biāo)記為PC2，測(cè)序比對(duì)結(jié)果(見(jiàn)圖8)顯示插入到pIRES-PML-RARa(245bp)重組質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)B(MCSB)中的hGM-CSF序列，與Genebank中的hGM-CSF序列是完全一致的。實(shí)施例2研究構(gòu)建的急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗(即pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF重組質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后基因和蛋白表達(dá)1篩選合適的待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用Lipofectamine2000Kit轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞經(jīng)巢式PCR證明K562細(xì)胞總RNA中不含有hGM-CSF基因及PML-RARa基因，因此可以將插構(gòu)建的pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株。利用LipofectamineTM2000Kit轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，將培養(yǎng)板放入5%0)2培養(yǎng)箱中(37。C)培養(yǎng)，46小時(shí)后將培養(yǎng)基更換為含有胎牛血清和抗生素的培養(yǎng)基，48小時(shí)后收集上清液和細(xì)胞。2RT-PCR檢領(lǐng)U收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48小時(shí)的K562細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，分別用引物PP1，PP2(用于擴(kuò)增PML-RARa基因，245bp)禾QPGl，PG2(用于擴(kuò)增hGM-CSF基因，458bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠在100伏特電壓下電泳。確定PML-RARa/hGM-CSF基因轉(zhuǎn)錄情況。3翻譯水平(點(diǎn)雜交)檢測(cè)外源質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48小時(shí)的K562細(xì)胞上清液(含hGM-CSF蛋白)，冷凍濃縮干燥后作為樣品，用于點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hGM-CSF蛋白在K562細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖9。由該圖可以看出轉(zhuǎn)染了pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF和pIRES-hGM-CSF的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)雜交結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF和pIRES-hGM-CSF重組質(zhì)粒能夠在K562細(xì)胞中表達(dá)hGM-CSF蛋白，并且該蛋白能夠與hGM-CSF抗體發(fā)生特異結(jié)合4取細(xì)胞裂解液(含PML-RARa蛋白)通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PML-RARa蛋白表達(dá)情況。實(shí)施例3研究小鼠體內(nèi)注射免疫急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗(pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF重組質(zhì)粒)后不同時(shí)期的基因和蛋白表達(dá)、抗體產(chǎn)生和特異性CTL效應(yīng)等30只68周的健康純系雄性BALB/c小鼠隨機(jī)均分為5組(每組6只)，各小鼠分別于第l周、2周、4周各免疫1次，共3次。A組每次于雙側(cè)股四頭肌肌內(nèi)分別注射pIRES200嗎；B組每次于雙側(cè)股四頭肌肌內(nèi)分別注射PML-RARa-pIRES200|ig;C組每次于雙側(cè)股四頭肌肌內(nèi)分別注射PML-RARa-hGM-CSF-pIRES200嗎；D組每次于雙側(cè)股四頭肌肌內(nèi)分別注射hGM-CSF-pIRES200叱；E組每次于雙側(cè)股四頭肌肌內(nèi)分別注射生理鹽水200|ig。于2次免疫和末次免疫接種后第7d將每組小鼠隨機(jī)選3只處死，分離出脛前肌。用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)目的基因在小鼠骨骼肌中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；ELISA法檢測(cè)小鼠血清中INF-y含量；LDH釋放法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞特異性CTL活性。結(jié)果(1)在小鼠注射部位肌肉組織的常規(guī)石蠟切片(HE染色)可見(jiàn)在各組肌肉間隙中發(fā)現(xiàn)有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，呈散在或不連續(xù)性的簇狀分布。小鼠肌肉組織提取的RNA中可檢測(cè)(RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR)到PML-RARa基因及hGM-CSF基因的表達(dá)。(2)利用間接免疫熒光法檢測(cè)小鼠血清中抗PML-RARa蛋白的抗體(熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記NB4細(xì)胞)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在初次免疫后7周四組小鼠血清中存在特異性抗體，而對(duì)照組為陰性(圖10)。(3)在初次免疫小鼠第7周時(shí)，疫苗免疫組小鼠脾細(xì)胞(體外培養(yǎng)7天后)，效應(yīng)細(xì)胞耙細(xì)胞為10:1，經(jīng)LDH檢測(cè)顯示其對(duì)NB4細(xì)胞具有特異性細(xì)胞毒性作用，對(duì)NB4細(xì)胞的殺傷率明顯高(27.45%)明顯高于Molt4細(xì)胞對(duì)照組(0.93%)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>暨南大學(xué)<120>—種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗及其制備方法和應(yīng)用<130>35<160>2<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>245<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>PML-RARa基因序列<400>1ttagctagcaccatgctggatggaccgcctagccccaggagccccgtcataggaagtgag60gtcttcctgcccaacagcaaccacgtggccagtggcgccggggaggcagccattgagacc120cagagcagcagttctgaagagatagtgcccagccctccctcgccaccccctctaccccgc180atctacaagccttgctttgtctgtcaggacaagtcctcaggctactgagtgagtgaacgc240gtttg245<210〉2<211>458<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223〉hGM-CSF基因序列<400>2aggtctagaaccatgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcctgcagcatc60tctgcacccgcccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatc120caggaggcccggcgtctcctgaacctgagtagagacactgctgctgagatgaatgaaaca180gtagaagtcatctcagaaatgtttgacctccaggagccgacctgcctacagacccgcctg240gagctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcaccaagctcaagggccccttgaccatg300atggccagccactacaagcagcactgccctccaaccccggaaacttcctgtgcaacccag360actatcacctttgaaagtttcaaagagaacctgaaggactttctgcttgtcatccccttt420gactgctgggagccagtccaggagtgaatgtcgactct458權(quán)利要求1、一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗，其特征在于，所述急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗為pIRES-PML-RARα(245bp)-hGM-CSFDNA疫苗，所述DNA疫苗由pIRES質(zhì)粒、PML-RARα基因和hGM-CSF基因組成，所述PML-RARα基因序列如下TTAACCATGCTGGGACCGCCTAGCCCCAGGAGCCCCGTCATAGGAAGTGAGGTCTTCCTGCCCAACAGCAACCACGTGGCCAGTGGCGCCGGGGAGGCAGCCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGATAGTGCCCAGCCCTCCCTCGCCACCCCCTCTACCCCGCATCTACAAGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACAAGTCCTCAGGCTACTGAGGTGATTG；所述hGM-CSF基因序列如下AGGTCTAGAACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGACTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGAATGTCGACTCT。2、權(quán)利要求1所述的一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)首先提取NB4細(xì)胞的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后利用引物PP1和PP2通過(guò)PCR擴(kuò)增出PML-RARa基因；擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物標(biāo)記為PML-RARa，其大小為245bp;所述的PP1:5，TTAGC7MGCACCATGCTGGATGGACCGCCTA3，；其中，GCTAGC為Mze/酶切位點(diǎn)；所述的PP2:5，caaUcgc^ctactcactcagtagcctgaggacttg3，；其中，ACGCGT為M/w/酶切位點(diǎn)；將擴(kuò)增的基因PML-RARa利用T4DNA連接酶與pIRES質(zhì)粒進(jìn)行連接，插入到pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A中構(gòu)建出pIRES-PML-RARa;(2)然后通過(guò)PCR從pORF-hGM-CSF質(zhì)粒中擴(kuò)增出hGM-CSF基因以pORF-hGM-CSF質(zhì)粒作為模板，用引物PG1、PG2PCR擴(kuò)增hGM-CSF基因，擴(kuò)增的目的片斷hGM-CSF基因長(zhǎng)度為458bp;上游引物為PG1，下游引物為PG2;所述的PG1:5，AG(^7T7^(74^CCATGTGGCTGCAGAGC3，；其中，TCTAGA為I酶切位點(diǎn)；所述的PG2:5，AG傘rCGL4(JATTCACTCCTGGACTGGC3，；其中，GTCGAC為Sa/I酶切位點(diǎn)；(3)將上述擴(kuò)增得到的hGM-CSF基因利用T4DNA連接酶與pIRES質(zhì)粒進(jìn)行連接，插入到pIRES-PML-RARa的多克隆位點(diǎn)B中，經(jīng)過(guò)測(cè)序正確后，構(gòu)建了pIRES-PML-RARa(245bp)-hGM-CSF質(zhì)粒。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟(l)擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性94"Clmin，退火60°Clmin;延伸72。Clmin，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；首次預(yù)變性為94°C3min，末次延伸為72°C10min。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟(2)擴(kuò)增反應(yīng)條件為首先94。C預(yù)變性3min，然后94°C1min，56°C1min，72°C1min循環(huán)30次，最后72°C總延伸6min。5、權(quán)利要求1所述的急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗在制備治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗，即融合基因pIRES-PML-RARα(245bp)-hGM-CSF。本發(fā)明還公開(kāi)了上述DNA疫苗可應(yīng)用于制備治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物。本發(fā)明利用PML-RARα融合基因構(gòu)建DNA疫苗用于根除APL的MRD，本發(fā)明提供了一個(gè)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗APL免疫效應(yīng)的PML-RARα(245bp)-hGM-CSF雙基因DNA疫苗，為治療APL的DNA疫苗的研發(fā)提供重要的數(shù)據(jù)和資料。本發(fā)明方法還可以為其他治療性腫瘤DNA疫苗的研究所借鑒。本發(fā)明的DNA疫苗能清除APL患者體內(nèi)的微小殘留病變，最終達(dá)到治愈APL的目的。文檔編號(hào)C12N15/85GK101229381SQ20071003175公開(kāi)日2008年7月30日申請(qǐng)日期2007年11月28日優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日發(fā)明者周羽竝,岑東芝,李揚(yáng)秋,楊力建,剛胡,陳少華申請(qǐng)人:暨南大學(xué)