用于急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測(cè)的納米探針及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測(cè)的納米探針及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)是急性髓細(xì)胞白血病的一種特殊類型，約占成人急性髓細(xì)胞白血病的10%，絕大多數(shù)的APL患者存在典型的t (15; 17) (q22;q21)染色體異位，陽(yáng)性率約占98%，維A酸受體α基因(RARa)與15號(hào)染色體的早幼粒細(xì)胞白血病(PML)基因形成PML-RARa融合基因，該融合基因的下游蛋白分子復(fù)合物為轉(zhuǎn)錄共抑制分子，通過(guò)抑制基因轉(zhuǎn)錄從而抑制細(xì)胞的分化與凋亡，這是APL的特異性標(biāo)志和靶向治療的重要分子基礎(chǔ)，它不僅能夠幫助APL的診斷，而且可以作為APL治療過(guò)程中病情和療效檢測(cè)的主要指標(biāo)。所以，PML/RARa融合基因的檢測(cè)在APL的診斷和治療過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
[0003]PML/RARa融合基因的檢測(cè)一直是細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研宄領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一，目前常用的檢測(cè)方法主要有:染色體分析、熒光原位雜交(FISH)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等。盡管染色體分析法可以在結(jié)構(gòu)和數(shù)量上分析單個(gè)細(xì)胞染色體的異常，但是卻要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間和精力，從而降低了檢測(cè)效率。熒光原位雜交是非放射性檢測(cè)體系，熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全、穩(wěn)定，而且靈敏度高，但是，不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的互補(bǔ)DNA探針時(shí)效率明顯下降。雖然流式細(xì)胞術(shù)可以高速分析術(shù)上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，但是，僅限于在細(xì)胞水平上識(shí)別細(xì)胞的形貌、尺寸以及熒光性質(zhì)等。RT-PCR法具有很高的靈敏度，但常常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，此外，該方法難以定量。因此，開(kāi)發(fā)高靈敏度、高選擇性，背景影響小的可用于PML/RARa融合基因熒光檢測(cè)的納米探針具有重要的理論意義及現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種用于急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測(cè)的納米探針，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PML/RARa融合基因的檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明的目的之二在于提供該納米探針的制備方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是:
一種用于急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測(cè)的納米探針，其特征在于該納米探針由能量給體和能量受體組成，所述的能量給體和能量受體通過(guò)JT-JT鍵相互作用結(jié)合在一起；所述的能量給體是一端帶有氨基的探針DNA通過(guò)共價(jià)鍵鍵合的方式嫁接到表面羧基化后的具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶上而形成的，所述的能量給體與能量受體的質(zhì)量比為20:1~24:1 ;所述的能量受體為:單壁碳納米角、氧化石墨烯或碳納米管；所述的具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的表面羧基化率為:30%~60% ;所述的探針DNA為:5’ -NH2-TCTCAA TGG CTG CCT CCC-3’ ；所述的帶有氨基的探針DNA與所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的摩爾比為:1:2000~1:2500 ο
[0007]上述的具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶為:NaYF4:Yb，EriNaYF4, NaYF4:Yb, EriNaYF4: Yb, Er、NaYF4: Yb, Er觀&6(^4或 NaYF 4:Yb:Er觀aGdF4:Yb, Er。
[0008]一種制備上述的用于急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測(cè)的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.通過(guò)配體交換法將具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶表面修飾上羧基，得到Cit-UCNPs ;將該Cit-UCNPs經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺和1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺活化，得到活化后的Cit-UCNPs ；
b.將步驟a所得活化后的Cit-UCNPs與探針DNADNA分子按照質(zhì)量比260:1~290:1的比例溶于去離子水中，4°C攪拌10~12小時(shí)；經(jīng)分離提純得到能量給體即Cit-UCNPs-ssDNA ；
c.將步驟b所得能量給體與能量受體按照質(zhì)量比為20:1~24:1的比例溶于去離子水中，4°C攪拌1~2小時(shí)，最終得到急性早幼粒細(xì)胞白血病熒光檢測(cè)的納米探針。
[0009]上述的步驟a的具體方法為:
(1)將具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶分散在甲苯和氯仿的混合溶劑中，其中，甲苯和氯仿的體積比為1:2~2:3 ;上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶與混合溶劑的質(zhì)量體積比為:lmg/mL~3mg/mL ；
(2)惰性氣氛下，將無(wú)水檸檬酸鈉溶于二乙二醇中配制成濃度為0.1388M-0.1735M的溶液，在100°C ~120°C下保持30~40min，冷卻；
(3)將步驟(I)所得納米晶溶液慢慢滴加到步驟(2)所得到的溶液中，加熱至130°C，保持40~50min，蒸發(fā)除掉甲苯、氯仿，加熱至180°C，氬氣環(huán)境下，保持1~2小時(shí)，冷卻、離心，用乙醇和水洗滌，即制得水溶性的Cit-UCNPs納米晶。
[0010](4)將N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺按照質(zhì)量比1:1-3:1加入到l~3mL去離子水中，然后加入步驟(3)所得Cit-UCNPs納米晶，4°C攪拌2~4小時(shí)，將所得到的混合物離心，用去離子水洗滌3次，得到活化的Cit-UCNPs納米晶；
(5)將步驟(4)得到的Cit-UCNPs納米晶與探針DNA分子按照質(zhì)量比260:1~290:1的比例溶于去離子水中，4°C攪拌10~12小時(shí)；將所得到的混合物離心，用去離子水洗3次后得到能量給體即Cit-UCNPs-ssDNA。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:以稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶作為能量給體構(gòu)筑納米探針，其激發(fā)光源位于近紅外光區(qū)的980nm，有效避免了高能量光的光損傷及生物背景熒光強(qiáng)的缺點(diǎn)。其次，所合成的納米探針具有良好生物相容性及低的生物毒性，可實(shí)現(xiàn)融合基因的檢測(cè)。另夕卜，本發(fā)明方法所制備的納米探針粒徑均一、形貌良好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且實(shí)驗(yàn)條件溫和，重復(fù)率尚O
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1 是本發(fā)明實(shí)施例1 中 UCNPs(A) ;CS_UCNPs(B)；Cit-UCNPs(C) ; Cit-UCNPs-ssDNA (D)的 TEM 圖。
[0013]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs中加入不同濃度的目標(biāo)DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
[0014]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-GO中加入不同濃度的目標(biāo)DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
[0015]圖4是本發(fā)明實(shí)施例3中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs加入不同濃度單堿基錯(cuò)配DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
[0016]圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs加入不同濃度非互補(bǔ)DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
[0017]圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-GO加入不同濃度單堿基錯(cuò)配DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
[0018]圖7為本發(fā)明實(shí)施例3中納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs加入不同濃度非互補(bǔ)DNA后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明。這些實(shí)施例僅起說(shuō)明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0020]具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的制備方法請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn):
Li, Z.; Zhang, Y., An efficient and user-friendly method for the synthesisof hexagonal-phase NaYF4:Yb, Er/Tm nanocrystals with controllable shape andupconvers1n fluorescence.Nanotechnology 2008, 19 (34)，345606.實(shí)施例1:
本實(shí)施例提供一例納米探針Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs的合成，其包括以下步驟:
(1)利用溶劑熱法合成具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米晶即CS-UCNPs，并分散到環(huán)己烷溶液中，即制得核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米晶；
(2)利用配體交換法將核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米晶從環(huán)己烷溶液中轉(zhuǎn)移到水相中，得到良好水溶性的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶，此時(shí)，納米晶表面含有羧基，即制得Cit-UCNPs ；
(3)將表面含有羧基的上轉(zhuǎn)換納米晶即Cit-UCNPs與一端帶有氨基的探針DNA進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)共價(jià)鍵鍵合的方式結(jié)合在一起，作為能量給體，即制得Cit-UCNPs-ssDNA ；
(4)將Cit-UCNPs-ssDNA與購(gòu)買的單壁碳納米角通過(guò)π-π相互作用結(jié)合在一起，構(gòu)筑含一對(duì)能量給體與能量受體，并可有效發(fā)生能量傳遞的納米探針，即制備Cit-UCNPs-ssDNA-SWCNHs 納米探針。
[0021]所述步驟(I)具體包括以下步驟:
(1.1)利用溶劑熱法制備上換納米晶NaYF4: Yb，Er，并分散在環(huán)己烷溶液中；
(1.2)使用上述納米晶，利用溶劑熱法合成具有核殼結(jié)構(gòu)的CS-UCNPs上轉(zhuǎn)換納米晶，其中納米粒子的殼層材料為六方相NaYF4，殼層的厚度約為2.5nm。
[0022]所述步驟(2)具體包括以下步驟:
(2.1)預(yù)備 8~10mgCS-UCNPs、3~5mL 甲苯、3~5mL 氯仿、15~20mL 二乙二醇、0.4-0.6g 無(wú)水檸檬酸鈉；
(2.2)將預(yù)備的核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶分散在預(yù)備的5mL甲苯和氯仿的混合溶液中，其中，甲苯和氯仿的體積比為1:2~2:3 ；
(2.3)將預(yù)備的無(wú)水檸檬酸鈉溶于15mL 二乙二醇中，氬氣環(huán)境下，加熱至110°C，并保持 30~40min，冷卻； (2.4)將步驟(2.2)所得納米晶慢慢滴加到步驟(2.3)所得到的溶液中，加熱至1300C，保持40~50min，蒸發(fā)除掉甲苯、氯仿，加熱至180°C，氬氣環(huán)境下，保持1~2小時(shí)，冷卻、離心，用乙醇和水洗滌，即制得Cit-UCNPs納米晶。
[0023]所述步驟(3)具體包括以下步驟:
(3.1)預(yù)備上述步驟(2.4)制備的Cit-UCNPs納米晶3~4mg、3~4mg N-輕基琥泊酰亞胺，即NHS、2~3mg 1- (3- 二甲氛基丙基)_3~乙基碳二亞胺，即EDC、20~30 μ L，100 μ M探針DNA分子、l~3mL去離子水；
(3.2)將預(yù)備的NHS以及EDC按照質(zhì)量比1:1-3:1加入到l~3mL去離子水中，然后加入預(yù)制備的Cit-UCNPs納米晶，4°C攪拌2~4小時(shí)，將所得到的混合物離心，用去離子水洗滌3次，得到活化的Cit-UCNPs納米晶；
(3.3)將上述步驟得到的混合物與探針DNA分子按照質(zhì)量比260:1~290:1的比例溶于去離子水中，4°C攪拌10~12小時(shí)；將所得到的混合物離心，用去離子水洗3次后得到能量給體即 Cit-UCNPs-ssDNA。
[0024]所述步驟(4)具體包括以下步驟:
(4.1)預(yù)備上