專利名稱：：一種根瘤固氮菌株系bxbl9及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種根瘤固氮菌株系BXBL9及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：生物固氮是生命科學(xué)中的重大基礎(chǔ)研究課題之一，它在生產(chǎn)實際中發(fā)揮著重要作用。共生固氮是生物固氮中最重要的一種。豆科植物與根瘤菌的共生由于具有固氮能力強(qiáng)、固氮量大、抗逆能力強(qiáng)等特點,成為生物固氮研究的焦點。國內(nèi)外大量試驗證明，接種根瘤菌在多數(shù)土壤中可以提高豆科作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。接種高效根瘤菌，作為大豆增產(chǎn)的主要措施，在我國北方已得到了大面積的應(yīng)用。當(dāng)前，大豆已成為華南廣大酸性缺磷紅壤很有價值的豆科作物之一。長期以來，雖然大豆在酸性缺磷紅壤區(qū)具有一定的種植面積，但由于南方土壤偏酸性，普通根瘤菌在南方地區(qū)鮮有應(yīng)用。其中一個原因是接種根瘤菌劑，遇到了根瘤菌能否耐酸和耐鋁的問題。為了提髙根瘤菌的結(jié)瘤率和固氮效果，必須選育耐酸、耐鋁的根瘤菌株以適應(yīng)酸性土壤條件，這樣才能獲得高產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種根瘤固氮菌株系BXBL9，該根瘤固氮菌株系是慢生根癇菌屑的新菌株系，具有耐酸鋁、高效固氮的特點。本發(fā)明的另一個目的是提供上述根癇固氮菌株系BXBL9在豆科植物共生固氮中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的木發(fā)明公開的根瘤固氮菌株系BXBL9于2007年7月28號保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCCNO:M207122。一、根瘤固氮菌株系BXBL9的分離1)取新鮮根瘤，用水沖洗干凈，并用濾紙吸干表面水分；2)放入95%的酒精中處理3分鐘，再放入0.1免HgCl2中，滅菌35分鐘，取出后用無菌水沖洗56次；3)在用火焰滅過菌的載玻片上切成兩半，用無菌鑷子夾住半個瘤，切口面向YMA培養(yǎng)基表面劃線，YMA培養(yǎng)基的配方如表1所示，倒置后在28'C下培養(yǎng)；表lYMA(YeastMannitolAgar)培養(yǎng)基配方(L")試劑名__試劑名_用量甘露醇10gK2ffi>040.25gMgS04.7H200.2gKH^Oj0.25gNaClO.lgCaC033g(保存時加)酵母粉_^_^_15g4)待長出菌體后，先根據(jù)以下兩個方面初步判斷是否為根瘤菌O)菌落形態(tài)根癇菌的菌落為圓形、乳白色、半透明、邊緣整齊、粘質(zhì)或多或少。培養(yǎng)35天菌落直徑達(dá)24rnrn為快生型根瘤菌，培養(yǎng)710天菌落才1mm的為慢生型根瘤菌。②菌休形態(tài)標(biāo)記初步確認(rèn)為根瘤菌菌落，從中挑取菌苔涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察。根瘤菌為(0.50.9)X(1.20.3)^m的小桿菌。內(nèi)常含P-羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆粒或使菌體呈環(huán)節(jié)狀，革蘭氏陰性(G-),無芽孢，菌體單個或成對。5)根據(jù)上述兩個方面，從平板上挑選形態(tài)上像根瘤菌的菌落在平板上劃線培養(yǎng)。3天之后觀察菌落情況，一直觀察到15天，因為慢生根瘤菌需715天出現(xiàn)菌落。二、根瘤固氮菌株系BXBL9的性質(zhì)1、形態(tài)特征本菌株在菌落形態(tài)上，均為慢生型，圓形較小、乳白色、半透明，粘質(zhì)較多。在YMA平板上生長57天后的直徑為0.82.0mm。2、培養(yǎng)特性該菌的最適生長條件為pH=7.0，溫度28'C，轉(zhuǎn)速180r/min。能夠利用廣泛的炭源和氮源。3、生理特性經(jīng)革蘭氏染色反應(yīng)鏡檢均為G-,呈小短桿狀。4、功能特性根瘤固氮菌株系BXBL9具有固氮能力強(qiáng)、固氮量大、抗逆能力強(qiáng)、耐酸鋁等特點。當(dāng)菌體被釋放到自然環(huán)境中時，對人、動物和植物無害，不會污染環(huán)境，反而增加了土壤間根瘤菌的群體，對豆科植物的結(jié)瘤固氮有促進(jìn)的作用。三、根瘤固氮菌株系BXBL9的16SrDNA序列測序為了鑒定根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位，對所分離的菌株16SrDNA序列進(jìn)行測序。首先提取菌株的總DNA，然后進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上檢驗后，用于序列測定。測序結(jié)果如SEQIDNO:l所示。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取了8個參比菌株，應(yīng)用軟件GeneDoc和TREECONW對分離菌株和參比菌株的16SrDNA部分序列進(jìn)行了分析，構(gòu)建了分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系圖，得到反映待測大豆根瘤菌株與參比菌株之間進(jìn)化與發(fā)育關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定分離出來的根瘤固氮菌株系BXBL9為慢生根瘤菌屬(5ra辦/"Afeo辦/M/n)的新菌株系，并命名為華固2號。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明的根瘤固氮菌株系BXBL9具有耐酸鋁、髙效結(jié)瘤的特性，接種該根瘤菌至少能夠提高大豆產(chǎn)量20-30%,可用于實際生產(chǎn)；2.通過接種本發(fā)明的根瘤固氮菌株系BXBL9,能達(dá)到改善大豆氮營養(yǎng)，從而達(dá)到大豆高產(chǎn)并且培肥土壤的目的；3.本發(fā)明的根瘤固氮菌株系BXBL9適用于華南酸性土壤地區(qū)，作為大豆常規(guī)栽培的措施之一。圖1為根瘤固氮菌株系BXBL9在YMA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；圖2為根瘤固氮菌株系BXBL9經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下的觀察圖像；圖3為根瘤固氮菌株系BXBL9的16SrDNA部分序列分析系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖4為大試管紙培裝置；其中，圖3中方框內(nèi)為根瘤固氮菌株系BXBL9。具體實施例方式實施例1根瘤固氮菌株系BXBL9的分離和純化取新鮮根瘤，用水沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分。先放入95%的乙醇中處理3分鐘，取出用無菌水沖洗56次，再放入0.2%HgCl2滅菌5分鐘，取出用無菌水沖洗56次。然后在用火焰滅過菌的載玻片上切成兩半，用無菌鑷子夾住半個瘤，切口面向YMA(表1)培養(yǎng)基表面劃線，倒置后在28'C下培養(yǎng)。待長出菌體后，從平板上挑選形態(tài)上像根瘤菌的菌落在平板上劃線培養(yǎng)。3天之后觀察菌落情況，一直觀察到15天，因為慢生根瘤菌需715天出現(xiàn)菌落。根據(jù)以下兩個方面可初步判斷是否為根瘤菌①菌落形態(tài)根瘤菌的菌落為圓形、乳白色、半透明、邊緣整齊，粘質(zhì)或多或少。培養(yǎng)35天菌落直徑達(dá)24mm為快生型根瘤菌，培養(yǎng)710天菌落才lmm的為慢生型根瘤菌。②菌體形態(tài)標(biāo)記初步確認(rèn)為根瘤菌菌落，從屮挑取菌苔涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察。根瘤菌為(0.50.9)X(1.20.3)iiim的小桿菌。內(nèi)常含P-羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆?；蚴咕w呈環(huán)節(jié)狀，革蘭氏陰性(G')，無芽孢，菌體單個或成對。如菌落菌體均像根瘤菌，則將標(biāo)記好的那個菌落接入試管斜面培養(yǎng)保存。木實施例的菌株均為慢生型，在菌落形態(tài)上為圓形較小、乳白色、半透明、粘質(zhì)較多；在YMA平板上生長57天后的直徑為0.82.0mm(圖1);最適生長條件為pH=7.0，溫度28'C，轉(zhuǎn)速180r/min，能夠利用廣泛的炭源和氮源；經(jīng)革蘭氏染色反應(yīng)鏡檢均為G-,呈小短桿狀(圖2)。利用這個分離純化的方法，經(jīng)過若干代反復(fù)純化，在固體培養(yǎng)基YMA(表l)中劃線培養(yǎng)，得到多株純菌，純菌經(jīng)過回接試驗驗證其結(jié)瘤固氮能力，本實施例分離純化到耐酸鋁髙效根瘤固氮菌株系BXBL9。實施例2根瘤固氮菌株系BXBL9的16SrDNA序列測序提取菌株的總DNA,進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上檢驗后，送到英駿公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果如SEQIDNO:l所示。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取了8個參比菌株，應(yīng)用軟件GeneDoc和TREECONW對分離菌株和參比菌株的16SrDNA部分序列進(jìn)行分析，構(gòu)建分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系圖，如圖3所示，從而確定分離出來的根瘤固氮菌株系BXBL9為慢生根瘤菌屬(fira辦rWzoW"m)的新菌株系，并命名為華固2號。實施例3回接試驗回接試驗復(fù)證采用上述的大試管紙培裝置(圖4)，大豆種子處理也如前所述。菌液培養(yǎng):用接種環(huán)在試管中挑一環(huán)根瘤菌到TY液體培養(yǎng)基中，TY液體培養(yǎng)基的配方如表2所示，用棉塞塞好后，用牛皮紙密封，放在震蕩器上培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約46天)，培養(yǎng)溫度為28'C。表2TY液體培養(yǎng)基(/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>接種處理將催好芽的種子放到培養(yǎng)皿中用菌液浸泡15分鐘，用鑷子將種苗栽種在濾紙與管壁之間，每棵種苗加入菌液l-2mL，保證每棵種苗的接菌量達(dá)到1.0乂109個以上。另設(shè)不接種處理作為對照。培養(yǎng)條件及測定指標(biāo)培養(yǎng)條件如前所述，放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察及補(bǔ)加營養(yǎng)液。移苗后30天收獲，觀察大豆的結(jié)癇情況。以磷效率差異顯著的2個大豆基因型作為供試材料，其中巴西10號(BX10)為磷高效基因型，本地2號(BD2)為磷低效基因型。根癇菌采用回接時固氮酶活性較髙的華固2號(根瘤固氮菌株系BXBL9)，另設(shè)不接種作為對照。本試驗設(shè)兩個P水平(LP:2nmol/L;HP:1000nmol/L)，統(tǒng)一進(jìn)行低氮處理(LN:50nmol/L)。營養(yǎng)液的pH值模擬酸性紅壤中的酸度，調(diào)節(jié)pH值至5.5。每個處理設(shè)4個重復(fù)。從表3(不同營養(yǎng)條件下接種不同根瘤菌對大豆地上部干重的影響)和表4(低氮條件下接種不同根癇菌對地上部干重的影響)中可以看出，在低氮處理下，接種根瘤菌能顯著提高大豆的地上部干重，并且不同品種對接種根瘤菌的反應(yīng)也具有基因型差異。總體而言，本地2號接種根瘤菌的效果好于巴西10號。在LNLP條件下，接種華固2號對本地2號品種有較好的效果，與對照(LNLP不接種處理)相比提髙了7.59%;而在LNHP處理下，接種華固2號能顯著提髙地上部干物重，與對照(LNHP不接種處理)相比提髙了51.90%(表3)。說明高磷有利于木地2號的接種效果。表3不同營養(yǎng)條件下接種不同根瘤菌對大豆地上部干重的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注LNLP表示低弒低磷、LNHP表示低氮髙磷;表4低氮條件下接種不同根瘤菌對地上部千重的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注LNLP表示低氮低磷、LNHP表示低敏髙磷；表中百分?jǐn)?shù)為接種根瘤菌后與對照(LNLP不接種處理)相比提高的百分?jǐn)?shù)；計算公式為:(R-CK)/CK*100%。實施例4田間接種試驗本試驗在廣東省湛江市遂溪大華農(nóng)場進(jìn)行。播種時期為2007年1月2728日。本試驗設(shè)有2個處理接根瘤固氮菌株系BXBL9(華固2號)與不接根瘤菌劑處理，同時按50kgP/ha的施肥量施用磷肥，磷肥以底肥的方式按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)一次性施入。本試驗設(shè)3次重復(fù)。試驗采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，起壟栽培，播種密度為40cmxi0cm(行距x株距)。播種、施肥、灌溉、雜草及病蟲害按大豆常規(guī)管理執(zhí)行。第一次田間調(diào)査在大豆的開花結(jié)實期進(jìn)行，調(diào)査了單株平均株高、單株瘤重、結(jié)瘤數(shù)(結(jié)果見表5)、平均單株地上部干重、根干重、結(jié)莢數(shù)(結(jié)果見表6)。表5根瘤固氮菌株系BXBL9對大豆根瘤生長的影響測定指標(biāo)根瘤個數(shù)(個)根癇干重(mg)株髙(咖)品種處理ck接種.ck接種_^_接種粵舂03-35~12.7±6.1540.6土2624.5±0.5828.3±0.91粵春04^S08.7±2.9079.9±42,826.67±0.8830.53±4.鄰華春2號018.3±8.30142.8±65.229土1.2630.83±0.44從表5可見，接種根瘤菌株系BXBL9能夠促使大豆結(jié)瘤。接種處理與不接種處理的根瘤個數(shù)與根瘤干重均存在著顯著性差異。從單株根瘤個數(shù)和根瘤干重的結(jié)果來看，接種處理達(dá)到較顯著水平(根瘤個數(shù)F產(chǎn)13.88科；根瘤干重F產(chǎn)10,25財)。由于湛江大華農(nóng)場前作是甘蔗，土著根瘤菌幾乎不存在，所以做了不接種處理的大豆沒有結(jié)瘤。接種處理的單株平均株高要比不接種處理的平均株髙要髙--些，這有利于提髙大豆的產(chǎn)量。從試驗結(jié)果說明施用根瘤固氮菌株系BXBL9對于改良土壤，利用根瘤菌的固氮能力來提供作物的需氮量有很大的^^-^C。表6根瘤固氮菌株系BXBL9對大豆植物生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表6可見，施用大豆根瘤固氮菌株系BXBL9有明顯的增產(chǎn)效果，接種處理的大豆地上部干重明顯比不接種處理的高，增加的幅度大概是49.5~154.5%之間；同時，接種處理的根干重比不接種的高。是否接種對于結(jié)莢數(shù)有顯著的影響。接種處理能夠增加部分品種的結(jié)莢數(shù)，增加幅度是91.5116.6%之間。但對于粵春04-5的結(jié)莢數(shù)來說，接種效果不是很明顯；同時粵舂04-5的地上部干重的增幅也不是很大。從單株地上部干重與根干重的結(jié)果來看，接種處理和品種之間的差異均達(dá)到極顯著水平(地上部干重&=23.81***，F(xiàn)G=13.9***;根干重F產(chǎn)29.94科氣Fo-8.67科)；從單株結(jié)莢數(shù)結(jié)果來看，接種處理和品種之間的差異均達(dá)到顯著水平(&=7.8*，F(xiàn)cj=6.88*)。本試驗研究表明，在不施用氮肥的情況下，單純使用根瘤固氮菌株系BXBL9有較明顯的增產(chǎn)效果，可見由木研究室研制出來的根瘤固氮菌株系BXBL9可以川于大面積的推廣施用。田間接種試驗的研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤固氮菌株系BXBL9后，植株干重，根瘤重，結(jié)莢數(shù)和產(chǎn)量均髙于不接種對照。大豆接種根瘤固氮菌株系BXBL9有增產(chǎn)增效的效果。一種根瘤固氮菌株系BXBL9及其應(yīng)用.txtSEQUENCELISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>—種根瘇固氮苗株系BXBL9及其應(yīng)用<130><160>1<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>肪0<212>咖A<213>根癯菌(Bradyrhizobiuffl)<400>1ccgcgtgagtgatgaagggccct卿gttgtaaagctcttttgtgcgggaagat幼tgac60ggt8CCgC幼gaataagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggt助tacg助鵬g120gctagcgttgctcgg幼tcaCtgggCfft幼鄉(xiāng)Stgcgtaggcgggtctttaagtc鄉(xiāng)g180tgaaatcctggagctcaactccagaactgcctttgatactgaagatcttgagttcggga240gagfftgagtggaactgcgagtfftagaggtgaaattcgtagatattcgc幼gaacaccagt300肪cga鄉(xiāng)cggctcactggcccgatactgacgctgaggcacgaaagcgtggggagcaaac360鄉(xiāng)attagataccctggtagtccacgccgt助acgatgaatgccagccttagtgggttt420actcactagtggcgcagctaacgctttaagcattccgcctggggagtacggtcgcaagat柳taaaactc祖鄉(xiāng)助ttgacgggggcccgcacaagcggtg卿catgtggttt幼ttcga540cgcaacgcgcag幼ccttaccagcccttgacatcccggtcgcggactccagagacggafft600tcttcagttc卿tggaccggagacagtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtga660gatgttgggtt幼gtcccgcaacgagcgcaacccccgtccttagttgctaccatttagtt720gagcactcta鄉(xiāng)agactgccggtgat幼gccg鄉(xiāng)aaggtgg卿tgacgtc幼gtcct780catggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggcggtgacaatgggatgct幼840ggggcgaccc肪O權(quán)利要求1、一種根瘤固氮菌株系BXBL9，該菌株系屬于慢生根瘤菌屬，于2007年7月28號保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCCNOM207122。2、權(quán)利要求1所述的根瘤固氮菌株系BXBL9在豆科植物共生固氮中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種根瘤固氮菌株系BXBL9及其應(yīng)用，該菌株系是通過不同大豆品種分別捕捉土壤中的根瘤菌，從新鮮根瘤中對根瘤菌進(jìn)行分離和純化，并對菌株的16SrDNA部分序列進(jìn)行測定，通過系統(tǒng)發(fā)育分析，確定為慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)的新菌株系，并命名為華固2號。本發(fā)明的根瘤固氮菌株系BXBL9通過實驗室盆栽、田間回接試驗證明其具有耐酸鋁、高效結(jié)瘤的特性，接種該根瘤菌能夠提高大豆產(chǎn)量20-30％以上，可適用于華南酸性土壤地區(qū)，作為大豆常規(guī)栽培的措施之一。文檔編號C12N1/20GK101182477SQ200710032270公開日2008年5月21日申請日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日發(fā)明者嚴(yán)小龍,紅廖,曹桂芹申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)