專利名稱：：一種根瘤固氮菌株系ry2菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物營(yíng)養(yǎng)和牧草栽培
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種生物固氮技術(shù)，尤其是涉及一種能使柱花草高效結(jié)瘤并達(dá)到高產(chǎn)的根瘤菌。
背景技術(shù)：
：柱花草(StylosanthesguianensisSW.)又名熱帶苜蓿、巴西苜蓿，原產(chǎn)于南美洲。1982年由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院引自國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)中心(CIAT)，并在海南試種成功，先已大面積推廣于華南各省(區(qū))。柱花草在盛花期的干物質(zhì)中含粗蛋白質(zhì)16.020.0%，粗脂肪1.82.5%，租纖維17.019.0%，無(wú)氮浸出物38.044.0%，粗灰分8.010.0%，是一種優(yōu)良的熱帶豆科牧草。中國(guó)南方如廣東、廣西等省(區(qū))，將柱花草與果樹(shù)間種，除了用于飼草外，還可起到覆蓋、保持水土和綠肥作用。如果與禾本科牧草如狗尾草等混播，可建成良好的人工草地用于放牧。柱花草通常選擇排水良好、土層深厚、土質(zhì)較好的沙壤或壤土種植。但在貧瘠土壤播種柱花草不形成根瘤，或僅有一些由土著根瘤侵染形成的無(wú)效根瘤，在貧瘠的土地上豆科植物接種根瘤菌可增加生長(zhǎng)量1550%。為提高柱花草結(jié)瘤率，固氮肥土，宜用柱花草根瘤菌拌種，可有效提高柱花草的結(jié)瘤率。因此篩選能使柱花草高效結(jié)瘤并達(dá)到高產(chǎn)的根瘤菌具有重要的意義。柱花草以其高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)及耐粗放管理的特性在引進(jìn)后很快成為我了我國(guó)南方豆科牧草的主推品種。在柱花草引進(jìn)之初由于種植地土壤中柱花草土著菌的含量極低，柱花草不能很好的結(jié)瘤固氮，主要依靠施肥獲得高產(chǎn)。這樣就不能體現(xiàn)出真正的高產(chǎn)和耐粗放管理。后來(lái)我國(guó)從澳大利亞引進(jìn)了根瘤菌菌劑施用于柱花草種植地，對(duì)柱花草的產(chǎn)量有了一定的提高。但是由于澳大利亞的根瘤菌菌劑是基于澳大利亞的土壤和氣候環(huán)境選出的高效菌株，到我國(guó)的氣候和土壤環(huán)境只是能少量的提高柱花草產(chǎn)量，并不能達(dá)到澳大利亞那樣的高產(chǎn)效果。目前我國(guó)還沒(méi)篩選出適合于我國(guó)氣候土壤條件的菌株，故從我國(guó)種植柱花草的不同類型土壤條件的土著菌中篩選適合于特定區(qū)域的柱花草高效固氮根瘤菌有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種根瘤固氮菌株系RY2，一種能使柱花草高效結(jié)瘤并達(dá)到高產(chǎn)的根瘤菌。本發(fā)明人于2008年11月14于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱經(jīng)所試驗(yàn)地內(nèi)(N=24°45.684'，E=98°55.546'，H=1023m)采集到一株結(jié)瘤多生長(zhǎng)茂盛的柱花草的根瘤，剪掉柱花草地上部分將整個(gè)根系連同根瘤一起裝入保鮮袋后置于冰袋中低溫保存，經(jīng)分離及純化得到一種根瘤固氮菌株系RY2(BradyrhizobiumyuanmingenseRY2)，于2009年11月13日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNo=M209266。其16sDNA序列如SEQIDNO1所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY2的培養(yǎng)方法。本發(fā)明將采集到的根瘤，剪掉柱花草地上部分將整個(gè)根系連同根瘤一起裝入保鮮袋后置于冰袋中低溫后續(xù)的保存?zhèn)浞蛛x和純化。具體的分離及純化過(guò)程從冰袋中取出柱花草的根系沖洗干凈，轉(zhuǎn)移到滅菌后的培養(yǎng)皿中，滅菌，將根瘤搗碎，蘸取乳白色汁液在準(zhǔn)備好的YMA固體培養(yǎng)基上劃線。將劃好的板倒置于保鮮袋中置于培養(yǎng)箱(28士1°C、黑暗)中培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中注意檢查培養(yǎng)基上是否有長(zhǎng)出菌落，標(biāo)記菌落，記錄形態(tài)和光澤度，確定為根瘤菌。排除非根瘤菌菌落后根據(jù)上述標(biāo)記的菌落將生長(zhǎng)單菌落的時(shí)間相差3天以上的菌落及板上生長(zhǎng)形態(tài)、菌落大小、菌落透明度、及燈光下的折射、菌落顏色不一致的菌落挑出，在新的YMA培養(yǎng)基上劃板并編號(hào)。每一次對(duì)新劃板的菌落都采用上述方法進(jìn)行一次純化直至同一塊板上的菌落生長(zhǎng)形態(tài)、菌落大小、菌落透明度、及燈光下的折射、菌落顏色一致為止。通過(guò)逐級(jí)純化將純化后的板進(jìn)行鏡檢和回接后劃入YMA斜面中保存。所述菌落形態(tài)根瘤菌生長(zhǎng)初期菌落水樣的半透明或白色不透明點(diǎn)狀物，后期菌落為圓形、乳白色、半透明、邊緣整齊、粘質(zhì)或多或少。培養(yǎng)24天菌落直徑達(dá)24mm為快生型根瘤菌，培養(yǎng)510天菌落菌落直徑才Imm的為慢生型根瘤菌。b.菌體形態(tài)標(biāo)記初步確認(rèn)為根瘤菌菌落，從中挑取菌苔涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，在100倍顯微鏡下觀察。根瘤菌為(0.50.9)X(1.20.3)μm的小桿菌。內(nèi)常含β-羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆?；蚴咕w呈環(huán)節(jié)狀，革蘭氏陰性(G-)，無(wú)芽孢，菌體單個(gè)或成對(duì)。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY2制備得到的菌劑。通過(guò)將平板上的菌洗入液體YMA培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌得到的菌懸液(含菌量大于1.OXIO9個(gè))拌種、直接回接到植物根部或拌土。也可以混合菌體吸附材料例如例如草炭、蛭石或珍珠巖等制成菌劑使用，混合比例優(yōu)選IOml菌液/50g草炭、IOml菌液/15g蛭石或IOml菌液/15g珍珠石οο本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供柱花草接種所述根瘤固氮菌株系RY2菌的方法。所述根瘤固氮菌株系RY2菌通過(guò)搖菌制備得到液體菌劑可在播種前用菌液浸種、育苗前浸泡植株根部、移植后澆于柱花草根部土壤中，也可以將菌液混合菌體吸附材料例如草炭、蛭石、珍珠巖等制成菌劑移植前混施于土壤中。本發(fā)明得有益效果是將RY2回接到TPRC2柱花草后使柱花草的固氮酶活性得到極大的提高。制成菌劑施用于土壤后對(duì)TPRC2產(chǎn)量的提高是TPRC5的一倍，如果大面積施用于單一種植TPRC2的大田中將會(huì)使柱花草干草產(chǎn)量增加3倍以上；RY2還是一個(gè)耐鹽性比較強(qiáng)的根瘤菌菌株，在其他菌不能生長(zhǎng)的鹽濃度下RY2能很好生長(zhǎng)，這對(duì)我國(guó)南方鹽漬土壤中提高柱花草產(chǎn)量提供了技術(shù)保障。圖1根瘤菌RY2回接檢驗(yàn)2根瘤菌RY2菌落圖圖3根瘤菌RY2革蘭氏染色圖片圖4回接根菌RY2后的結(jié)瘤情況圖5RY2瓊脂糖凝膠電泳6NCBI比對(duì)7RY2根瘤菌聚類分析8回接RY2TPRC2、TPRC5產(chǎn)量變化9RY2耐酸菌液OD值圖10RY2耐NaCl菌液OD值圖11回接RY2對(duì)柱花草產(chǎn)量影響圖具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1根瘤菌RY2的獲得和培養(yǎng)2008年11月14于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱經(jīng)所試驗(yàn)地內(nèi)(N=24°45.684'，E=98°55.546'，H=1023m)采集到一株結(jié)瘤多生長(zhǎng)茂盛的柱花草的根瘤，剪掉柱花草地上部分將整個(gè)根系連同根瘤一起裝入保鮮袋后置于冰袋中低溫保存。經(jīng)分離及純化得到一種根瘤固氮菌株系RY2(BradyrhizobiumyuanmingenseRY2)，于2009年11月13日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNO=M209266。(1)從冰袋中取出柱花草的根系在自來(lái)水下沖洗23遍將根系沖洗干凈，用剪刀將新鮮完整、顏色暗紅的根瘤帶2mm的根剪下于培養(yǎng)皿中用2級(jí)水將表面沖洗干凈；此過(guò)程要確保根瘤表面的完整。(2)將沖洗干凈的根瘤轉(zhuǎn)移到滅菌后的培養(yǎng)皿中，加入95%(體積比濃度)的酒精浸泡3分鐘后，將酒精倒出，用無(wú)菌水沖洗45次，加入0.(質(zhì)量體積濃度，0.IgHgCl2/100ml水)的HgCl2溶液滅菌23分鐘，迅速將HgCl2倒出并加入無(wú)菌水，轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈工作臺(tái)操作，用無(wú)菌水沖洗6遍以上，將無(wú)菌水倒出，選取根瘤轉(zhuǎn)移至滅菌后的培養(yǎng)皿中(可在火焰上滅菌)，用滅菌后的的鑷子和接種環(huán)將根瘤搗碎，蘸取乳白色汁液在準(zhǔn)備好的YMA固體培養(yǎng)基上劃線。將劃好的板倒置于保鮮袋中置于培養(yǎng)箱(28°C、黑暗)中培養(yǎng)。YMA培養(yǎng)基配方如表1，調(diào)節(jié)PH值為6。表IYMA(YeastMannitolAgar)培養(yǎng)基配方(L-1)試劑名用量試劑名用量甘露醇IOgK2HPO40.25gMgSO4-7H200.2gKH2PO40.25gNaCl0.IgCaCO33g(保存時(shí)加)酵母粉_3g_MB_15g_(3)在培養(yǎng)的第3天開(kāi)始檢查培養(yǎng)基上是否有長(zhǎng)出菌落，直至第15天左右，將菌落標(biāo)記出來(lái)記錄形態(tài)和光澤度。在培養(yǎng)過(guò)程中從以下3點(diǎn)來(lái)確定是否為根瘤菌a.菌落形態(tài)根瘤菌生長(zhǎng)初期菌落水樣的半透明或白色不透明點(diǎn)狀物，后期菌落為圓形、乳白色、半透明、邊緣整齊、粘質(zhì)或多或少。培養(yǎng)24天菌落直徑達(dá)24mm為快生型根瘤菌，培養(yǎng)510天菌落菌落直徑才Imm的為慢生型根瘤菌。b.菌體形態(tài)標(biāo)記初步確認(rèn)為根瘤菌菌落，從中挑取菌苔涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，在100倍顯微鏡下觀察。根瘤菌為(0.50.9)X(1.20.3)μm的小桿菌。內(nèi)常含β-羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆粒或使菌體呈環(huán)節(jié)狀，革蘭氏陰性(G-)，無(wú)芽孢，菌體單個(gè)或成對(duì)；C.通過(guò)將分離出的根瘤菌在無(wú)菌條件下回接到柱花草上，能結(jié)瘤的則為根瘤菌。根瘤菌RY2的形態(tài)特征根瘤菌RY2為慢生根瘤菌屬的一種，培養(yǎng)50小時(shí)后沿第一筆涂布的痕跡開(kāi)始有水樣帶狀半透明的突起，到第4天以后突起開(kāi)始明顯并逐漸獨(dú)立成為單獨(dú)的菌落，第5天后最后一筆出現(xiàn)1.02.Omm的菌落圓形，邊緣完整，表面光滑，凸起水珠狀，無(wú)色透明度極高，粘性分泌物較少。見(jiàn)附圖2所示RY2根瘤菌菌落。RY2號(hào)的最適生長(zhǎng)條件為溫度28°C，pH值為6，轉(zhuǎn)速180r/min。能夠廣泛的應(yīng)用碳原和氮原，在各種植物來(lái)源的綜合抽提液上能很好的生長(zhǎng)，在YMA培養(yǎng)基上比在蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)好。根瘤菌RY2的生理特性根瘤菌RY2經(jīng)革蘭氏染色在顯微鏡下呈紫色，形狀為小短桿狀體，大小為0.50.9μmX1.23.0μm，細(xì)胞單個(gè)或成對(duì)，常可見(jiàn)成群排列。為革蘭氏陰性菌。見(jiàn)附圖3所示根瘤菌RY2革蘭氏染色圖片。(4)排除非根瘤菌菌落，根據(jù)上述標(biāo)記的菌落將生長(zhǎng)單菌落的時(shí)間相差3天以上的菌落及板上生長(zhǎng)形態(tài)、菌落大小、菌落透明度、及燈光下的折射、菌落顏色不一致的菌落挑出，在新的培養(yǎng)基上劃板并編號(hào)。每一次對(duì)新劃板的菌落都采用上述方法進(jìn)行一次純化直至同一塊板上的菌落生長(zhǎng)形態(tài)、菌落大小、菌落透明度、及燈光下的折射、菌落顏色一致為止。通過(guò)逐級(jí)純化將純化后的板進(jìn)行鏡檢和回接后劃入YMA斜面中保存。(5)回接驗(yàn)證柱花草根瘤菌a.菌液的準(zhǔn)備將分離純化出來(lái)的根瘤RY2用無(wú)菌水洗入準(zhǔn)備好的液體YMA培養(yǎng)基中，用封口膜封口，在搖床中180r/min搖菌3天后測(cè)定菌液的OD值，當(dāng)OD大于0.6時(shí)(即每ml菌液含菌量多于1.OXIO9個(gè)即得菌液，可使用于回接。所述液體YMA培養(yǎng)基是在表1的培養(yǎng)基中將瓊脂除去，并調(diào)節(jié)PH值為7。b.無(wú)菌種苗的準(zhǔn)備精選柱花草種子數(shù)粒在95%的乙醇中浸泡5分鐘，取出后在0.2%的HgCl2中處理5分鐘，用無(wú)菌水沖洗510遍，然后排在滅過(guò)菌、放好發(fā)芽紙的培養(yǎng)皿中，用滅過(guò)菌的0.05mmol/L硫酸鈣溶液浸濕發(fā)芽紙，放在28°C的培養(yǎng)箱中黑暗催芽3天。待苗長(zhǎng)到4厘米時(shí)候把苗移入準(zhǔn)備好的滅過(guò)菌的沙培箱中，待用。c.回接從沙培箱中選取壯實(shí)的苗放到培養(yǎng)皿中用步驟(5)a制備得到的菌液浸泡15分鐘，用鑷子將種苗栽種在裝滿滅菌砂的小花盆中，每盆中呈菱形狀栽植4株，每棵種苗加入菌液12ml，保證每裸種苗的接菌量達(dá)到1.0XIO9個(gè)以上。大約四周后拔起苗查看是否結(jié)瘤，結(jié)瘤則為根瘤菌。根瘤RY2經(jīng)回接檢驗(yàn)后結(jié)瘤明顯，可證明分離物為純的根瘤菌。見(jiàn)附圖ι所示根瘤菌RY2回接檢驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例2根瘤菌RY2的16SrDNA序列測(cè)序及類別的確定為了確定根瘤菌RY2的系統(tǒng)發(fā)育地位，對(duì)所分離得到的菌株的16SDNA系列進(jìn)行測(cè)序。首先利用omega公司的試劑盒進(jìn)行總DNA的提取，然后利用引物進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增。上游引物35fcCTKAAGAGTTTGATCMTGGCTCAGATTGAAC；下游引物1492r:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。反應(yīng)條件如下PCR反應(yīng)>Primer:35fc,1492r>PCRrecipeIOXReactionBuffer5.0μLdNTPs(IOmM)l.OyLP35fc(25Pmol)引物0.5μLP1492r(25Pmol)引物0·5μLTaqDNA聚合酶(5u/μL)l.OyL模板DNAl.OyL補(bǔ)超純水至41μL>PCRprocedure94°C預(yù)變性3min94°C變性50s56°C退火50s35個(gè)循環(huán)72°C延伸60s72°C最后延伸5min擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖5所示RY2瓊脂糖凝膠電泳圖，送北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQIDNO1所示。將所得的序列結(jié)果在美國(guó)美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)根瘤菌菌株RY2與已知菌株AB509380Bradyrhizobiumyuanmingense相似性達(dá)100%，見(jiàn)附圖6所示NCBI比對(duì)圖。應(yīng)用軟件DNAStar和TREEC0NW對(duì)所測(cè)的菌株進(jìn)行聚類，見(jiàn)附圖7所示RY2根瘤菌聚類分析圖。由比對(duì)結(jié)果和聚類圖可知RY2為慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)的新株系，命名為熱研2號(hào)(RY2)。實(shí)施例3根瘤菌RY2的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)為了確認(rèn)RY2對(duì)柱花草的作用，采用兩個(gè)主要的柱花草品種(TPRC2、TPRC5)，用沙培的方法將根瘤RY2回接到柱花草根部，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)(菌、砂和種苗的處理參見(jiàn)回接實(shí)驗(yàn)步驟)，以不接種根瘤為對(duì)照(CK)，進(jìn)行回接對(duì)比。整個(gè)過(guò)程中采用低氮營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行澆灌。柱花草TPRC2、TPRC5回接根瘤菌RY2后對(duì)柱花草的生理指標(biāo)影響見(jiàn)表2和附圖8。附圖8中左邊方柱(a)為TPRC5，右邊方柱(b)為TPRC2(附圖8中其他方柱圖為現(xiàn)有根瘤菌對(duì)照結(jié)果，與本發(fā)明技術(shù)沒(méi)有直接關(guān)系，未做標(biāo)注)。由表2可以看出回接根瘤菌RY2后柱花草TPRC2、TPRC5的根瘤數(shù)、根瘤干重、株高、植株鮮重、和固氮酶活性都比對(duì)應(yīng)的對(duì)照(CK)大幅度增加，差異達(dá)到極顯著。特別是固氮酶活性非常高。以如此少的根瘤就能有這么大的固氮酶活性，若改變?cè)耘啻胧┠苄纬筛嗟母觯敲碦Y2將會(huì)提高TPRC5的固氮酶活性，為植株、土壤和間作植物提高大量的氮。固氮酶活性是衡量根瘤菌和植株結(jié)合后孤單能力大小的指標(biāo)，固氮酶活性活性大則表示菌株和對(duì)應(yīng)的植株結(jié)合后能很好的固氮，植株就有很高的增產(chǎn)潛力。柱花草根瘤是根瘤菌和柱花草的共生的專一性體系，不同品種的柱花草和不同菌系的搭配所表現(xiàn)的結(jié)果也不同。表2根瘤菌RY2回接到TPRC2、TPRC5后對(duì)柱花草生理指標(biāo)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)，根瘤菌RY2和TPRC2柱花草共生后，使TPRC2柱花草的株高大大提高，同時(shí)比TPRC5高出許多，結(jié)瘤后根瘤的固氮酶活性值也大大提高，對(duì)TPRC2有很強(qiáng)的增產(chǎn)潛力，為TPRC2間作為其他植物供氮提供了好的菌株。見(jiàn)附圖4回接根瘤菌RY2后的結(jié)瘤情況。當(dāng)菌體被釋放到自然環(huán)境中時(shí)，對(duì)人、動(dòng)物和植物無(wú)害，不會(huì)污染環(huán)境，反而增加了土壤間根瘤菌的群體，對(duì)柱花草的結(jié)瘤固氮有促進(jìn)的作用。南方土壤普遍pH值低，柱花草適應(yīng)南方酸性土壤除了其自身的耐酸體制外，根瘤菌也起到了平衡酸的作用。在抗性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，根瘤菌能使培養(yǎng)基的PH上升，生長(zhǎng)越快的菌株其PH值上升也越大。各菌株經(jīng)活化后，接種于YMA液體培養(yǎng)基中，置恒溫振蕩器中28士1°C下培養(yǎng)，待OD600約為1，分別吸取50μ1菌懸液接種到pH值為4、4·5、4·8、5、5·5、6、7(體積為50ml)，置恒溫振蕩器中28士1°CISOrpm振蕩培養(yǎng)，以培養(yǎng)液渾濁度的變化來(lái)檢測(cè)菌的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)72小時(shí)后用分光光度計(jì)測(cè)量0D·。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。RY2在不同PH中的生長(zhǎng)情況見(jiàn)附圖9。從附圖9可以看出RY2根瘤菌在PH小于4.8時(shí)生長(zhǎng)不正常，不能形成大于IO9個(gè)菌/ml的菌液。當(dāng)PH為5時(shí)可以形成正常的菌液，當(dāng)PH值為5.5時(shí)RY2的生長(zhǎng)達(dá)到最好。PH大于6后生長(zhǎng)活性稍微下降。大多數(shù)能使豌豆和三葉草等豆科植物結(jié)瘤的根瘤菌對(duì)鹽都很敏感，而且高濃度NaCl會(huì)降低豆科植物接菌劑中根瘤菌的數(shù)目。所以，根瘤菌的耐鹽性對(duì)提高它們?cè)谕寥乐械拇婊钅芰透?jìng)爭(zhēng)性是很重要的。耐鹽抗性實(shí)驗(yàn)采用添加NaCl的YMA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)根瘤菌，3天后用分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD值，OD值的大小可以反映菌生長(zhǎng)快慢的情況。各菌株經(jīng)活化后，接種于YMA液體培養(yǎng)基中，置恒溫振蕩器中28士1°C下培養(yǎng)，待0D_約為1，分別吸取50μ1菌懸液接種到NaCl濃度為0,0.05,0.08,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30mol/LYMA液體培養(yǎng)基中(pH6.O、體積為50ml)，置恒溫振蕩器中28士1°C、ISOrpm振蕩培養(yǎng)，以培養(yǎng)液渾濁度的變化來(lái)檢測(cè)菌的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)72小時(shí)后用分光光度計(jì)測(cè)量OD_。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。RY2在不同鹽濃度中的生長(zhǎng)情況如附圖10，附圖10中曲線RY2為根瘤菌RY2的耐鹽性曲線，其他幾條曲線為現(xiàn)有豆科植物根瘤菌的實(shí)驗(yàn)曲線，與本發(fā)明技術(shù)無(wú)關(guān)，所以未作標(biāo)注。從附圖10可以看出RY2的耐鹽性很強(qiáng)，當(dāng)鹽濃度為0.lmol/L時(shí)還能形成IO9個(gè)菌/ml菌液，而大多數(shù)能使豌豆和三葉草等豆科植物結(jié)瘤的根瘤菌在濃度為0.08mol/L時(shí)基本不生長(zhǎng)。鹽條件對(duì)RY2生長(zhǎng)的的限制可達(dá)0.25mol/L。RY2在無(wú)鹽或低濃度鹽時(shí)生長(zhǎng)不及其他菌快，當(dāng)鹽度大于0.05mol/L時(shí)RY2的生長(zhǎng)就超過(guò)其他菌。故RY2極適用于鹽漬土壤中，對(duì)柱花草的增產(chǎn)和鹽漬土壤的改良都有極大的促進(jìn)作用。實(shí)施例4根瘤菌RY2菌劑及應(yīng)用所述菌劑可以在搖菌后進(jìn)行拌種處理、以液體菌劑澆于剛移苗的柱花草根部。也可以混合菌體吸附材料例如草炭、蛭石或珍珠巖等吸附劑制成菌劑移植前混施于土壤中。所述混合比例為IOml菌液/50g草炭、IOml菌液/15g蛭石或IOml菌液/15g珍珠巖。如上沙培方法準(zhǔn)備無(wú)菌種子和育苗。將根瘤菌從固體培養(yǎng)基上洗入三角瓶中28°C培養(yǎng)96小時(shí)，用無(wú)菌水洗脫菌體，并用無(wú)菌水稀釋，用漩渦打旋器均勻菌體，測(cè)定OD值(入=600nm)，保證田間接種時(shí)每粒種子的含菌量大于IO9個(gè)。將草炭粉碎(過(guò)2mm篩孔)后在121°C滅菌40分鐘后冷卻備用。在播種前將不同菌液按IOml菌液50g草炭的比例倒入草炭中，并充分混合讓草炭吸收菌液。育苗前將混合好的菌劑混施于土壤中。小區(qū)面積為20m2，設(shè)四個(gè)重復(fù)。三個(gè)月后收樣，其結(jié)果見(jiàn)附圖11，附圖11中右邊方柱(a)為TPRC5，左邊方柱(b)為TPRC2(附圖11中其他方柱圖為現(xiàn)有根瘤菌對(duì)照結(jié)果，與本發(fā)明技術(shù)沒(méi)有直接關(guān)系，未做標(biāo)注)。從附圖11可見(jiàn)在不回接根瘤菌的時(shí)候TPRC2和TPRC5的地上不分產(chǎn)量差別不大。在回接了不同的菌以后產(chǎn)量和對(duì)照相比都有所提高。對(duì)RY2來(lái)說(shuō)柱花草TPRC5的產(chǎn)量和回接其他的菌的差別不大，但是柱花草TPRC2的產(chǎn)量就有大幅提高，是CK的4倍以上。SEQUENCELISTING<110>劉國(guó)道，黃艷霞，董榮書<120>一種根瘤固氮菌株系RY2菌株及其應(yīng)用<130><160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1378<212>DNA<213>人工序列<400>1caggcttaacacatgcaagtcgagcgggcgtagcaatacgtcagcggcagacgggtgagt60aacgcgtgggaacgtaccttttggttcggaacaacacagggaaacttgtgctaataccgg120ataagcccttacggggaaagatttatcgccgaaagatcggcccgcgtctgattagctagt180tggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatcagtagctggtctgagaggatgatcagcc240acattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtggggaatattggac300aatgggggcaaccctgatccagccatgccgcgtgagtgatgaaggccctagggttgtaaa360gctcttttgtgcgggaagataatgacggtaccgcaagaataagccccggctaacttcgtg420ccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgctcggaatcactgggcgtaaaggg480tgcgtaggcgggtctttaagtcaggggtgaaatcctggagctcaactccagaactgcctt540tgatactgaagatcttgagtccgggagaggtgagtggaactgcgagtgtagaggtgaaat600tcgtagatattcgcaagaacaccagtggcgaaggcggctcactggcccggtactgacgct660gaggcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaac720gatgaatgccagccgttagtgggtttactcactagtggcgcagctaacgctttaagcatt780ccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaa840gcggtggagcatgtggtttaattcgacgcaacgcgcagaaccttaccagcccttgacatg900tccaggaccggtcgcagagatgtgaccctctcttcggagcctggagcacaggtgctgcat960ggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccccc1020gtccttagttgctaccatttagttgagcactctaaggagactgccggtgataagccgcga1080ggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggctacacacgtgcta1140caatggcggtgacaatgggatgctaaggggcgacccttcgcaaatctcaaaaagccgtct1200cagttcggattgggctctgcaactcgagcccatgaagttggaatcgctagtaatcgtgga1260tcagcacgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatggg1320agttggttttacctgaagacggtgcgctaacccgcaagggaggcagccggccacggta1378權(quán)利要求一種根瘤固氮菌株系RY2菌株(BradyrhizobiumyuanmingenseRY2)，于2009年11月13日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNOM209266。2.—種權(quán)利要求1所述根瘤固氮菌株系RY2菌株，其特征在于其16SDNA序列如SEQIDNO1所示。3.一種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述根瘤固氮菌株系RY2菌株的方法，其特征在于是于28士1°C下YMA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述培養(yǎng)方法，其特征在于所述YMA固體培養(yǎng)基的組成為甘露醇10g,K2HPO4O.25g,MgSO4·7Η200·2g，KH2PO4O.25g,NaClO.lg，酵母粉3g，瓊脂15g。5.一種菌劑，其特征在于是由權(quán)利要求1所述根瘤固氮菌株系RY2菌株的菌液混合菌體吸附劑制備得到。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述菌劑，其特征在于所述菌體吸附劑為草炭、蛭石或珍珠巖；混合比例為IOml菌液/50g草炭、IOml菌液/15g蛭石或IOml菌液/15g珍珠巖。7.—種柱花草接種所述根瘤固氮菌株系RY2菌株的方法，其特征在于將菌株在搖菌后進(jìn)行拌種處理或以菌液澆于柱花草根部或?qū)⒕夯旌暇w吸附材料制成菌劑在柱花草播種或移植前混施于土壤中。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述菌液中菌的濃度為含菌量為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>個(gè)/ml菌液；所述拌種處理為用菌液浸泡種子45分鐘50分鐘。9.一種權(quán)利要求1所述根瘤固氮菌株系RY2菌株的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于柱花草TPRC2的間作。10.一種權(quán)利要求1所述根瘤固氮菌株系RY2菌株的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于回接鹽漬性土壤中種植的柱花草。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種根瘤固氮菌株系RY2菌株及其應(yīng)用。所述菌株(BradyrhizobiumyuanmingenseRY2)于2009年11月13日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNOM209266。本發(fā)明的根瘤固氮菌株系RY2能專一地使TPRC2的固氮酶活性得到極大的提高，比TPRC5高出3倍以上，并且能以極少的根瘤數(shù)到達(dá)較高的固氮酶活性，接種該根瘤菌能夠提高柱花草產(chǎn)量30～40％以上，可適用于柱花草TPRC2的間作，為柱花草、作物和土壤提供大量的氮。同時(shí)RY2具有極強(qiáng)的耐鹽性，能在NaCl濃度高于0.25mol/L的環(huán)境中成長(zhǎng)，可用于鹽漬性土壤中種植，對(duì)柱花草的產(chǎn)量提高和鹽漬性土壤的利用改良有較好的作用。文檔編號(hào)C12N1/20GK101824390SQ20091021431公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2009年12月29日優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日發(fā)明者劉國(guó)道,董榮書,黃艷霞申請(qǐng)人:劉國(guó)道;黃艷霞;董榮書