專利名稱：一種含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株及其用于制備菊粉外切酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及含有菊粉酶基因的鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌株，以及用該基因工程菌株制備菊粉外切酶的方法。
背景技術(shù)：
菊粉(Inulinase)(Edelman，J.and T.G.Jefford.1964.The metabolismof fructose polymers in plants.4.Beta-fructofuranosidases of tubers ofHelianthus tuberosus L.Biochem.J 93148-161)，又稱菊糖，分布在菊科、龍膽科、桔梗科等植物中，特別是菊芋的塊莖中含量豐富。菊粉是由6-60個(gè)呋喃構(gòu)形的D-果糖經(jīng)β-2，1-糖苷鍵脫水聚合，兩端再各連接一個(gè)分子葡萄糖而形成的多聚物。菊粉外切酶(2，1-β-D-fructan fructanohydrolase EC3.2.1.7)能水解β-2，1-D-果聚糖果糖糖苷鍵，將菊粉水解成單糖。
菊粉酶在以下方面有重要的應(yīng)用前景。第一方面，是高果糖漿的制備。高果糖漿是理想的天然甜味劑，果糖的甜度比蔗糖高出80％；它在肝臟中磷酸化后能直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)，不像葡萄糖那樣受到胰島素的控制，也能適合糖尿病人食用，有望成為替代蔗糖的新一代甜味劑。同時(shí)還具有營(yíng)養(yǎng)保健功能，能調(diào)節(jié)腸胃、提高免疫力、排毒養(yǎng)顏、降解血糖和抗癌等等，被稱為第三代功能食品。傳統(tǒng)的高果糖漿的制備是以淀粉為原料，在淀粉酶的作用下水解成葡萄糖，再在異構(gòu)酶的作用下將葡萄糖異構(gòu)成果糖，這種方式生產(chǎn)的高果糖漿中果糖的含量不足50％，并且果糖和葡萄糖分離難，成本高；新型的生物酶法生產(chǎn)高果糖漿，是以菊粉為原料，一步生物酶反應(yīng)，即可獲得果糖含量高于90％的高果糖漿，工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高。但高活性的菊粉酶是制備高果糖漿的關(guān)鍵。第二方面，是生物能源領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，生物乙醇的生產(chǎn)主要是以玉米淀粉為原料，原料的種植面臨與人用糧食爭(zhēng)奪土地的尷尬。菊芋的主要成分菊粉，它的生長(zhǎng)條件粗狂，種植可不占用耕地，不僅能生長(zhǎng)鹽堿地，還能生長(zhǎng)在荒漠地區(qū)，能防止土地沙化，以菊粉為原料生產(chǎn)生物乙醇可以成為目前淀粉乙醇的補(bǔ)充和后備方法。菊粉在菊粉酶的作用下，水解成單糖，能直接被酵母利用，產(chǎn)生乙醇。因此，菊粉酶的生產(chǎn)成本直接影響了菊粉乙醇的成本，是用菊粉做原料制備乙醇的關(guān)鍵。
菊粉酶來(lái)源非常廣泛，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，產(chǎn)菊粉酶的有絲狀真菌17個(gè)屬50余種，酵母菌10個(gè)屬20余種，細(xì)菌12個(gè)屬10余種(Pandey，A.，C.R.Soccol，P.Selvakumar，V.T.Soccol，N.Krieger，and J.D.Fontana.1999.Recentdevelopments in microbial inulinases.Its production，properties，andindustrial applications.Appl.Biochem.Biotechnol.8135-52)。但具有生產(chǎn)價(jià)值的菊粉酶的生產(chǎn)，一般選用馴化過(guò)的菊粉酶產(chǎn)生菌，如曲霉、克魯維酵母等；也可以通過(guò)基因工程菌的方法。后者因經(jīng)過(guò)基因工程改造，使菊粉酶的產(chǎn)量更高，因此更具競(jìng)爭(zhēng)性。但目前已經(jīng)報(bào)道的基因工程菌生產(chǎn)的菊粉酶，主要是用嗜甲醇的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)(王建華，王明華等，2004，一種外切菊粉酶的生產(chǎn)方法，中國(guó)發(fā)明專利CN1495252A)，這種制備菊粉酶的方法，需要甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，生產(chǎn)出的菊粉酶在制備食品級(jí)高果糖漿的應(yīng)用中受到限制；另一方面，這種制備方法，發(fā)酵原料成分復(fù)雜，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)生的酶產(chǎn)量依然低下，使得生產(chǎn)菊粉酶的成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是獲得一種組成型表達(dá)的菊粉外切酶鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌株，從而避免在發(fā)酵過(guò)程中在培養(yǎng)基中添加甲醇，并降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明的另一個(gè)目的就是獲得一種由所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶的方法。
本發(fā)明提供了一種含有菊粉外切酶(即菊粉酶，NCBI登陸號(hào)為AF178979)基因序列的基因工程菌株，即采用基因工程方法將菊粉外切酶基因克隆到真核表達(dá)載體pUKDS上，并轉(zhuǎn)化鷹嘴豆克魯維酵母Y179U(CCTCC NoM202031)，從而構(gòu)建獲得組成型表達(dá)的菊粉外切酶克魯維酵母基因工程菌株。
本發(fā)明所采用的表達(dá)載體pUKDS中，PINU菊粉酶啟動(dòng)子；SINU菊粉酶分泌信號(hào)肽；TINU菊粉酶終止子，KD1克魯維酵母自主復(fù)制序列；pUK19大腸桿菌自主復(fù)制序列，KcURA3鷹嘴豆克魯維酵母URA3序列。
本發(fā)明的含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株在制備過(guò)程中，首先，設(shè)計(jì)引物克隆得到菊粉外切酶基因序列；然后，將該菊粉外切酶基因序列克隆到pUKDS上，獲得pUKDS-INU；最后，轉(zhuǎn)化鷹嘴豆克魯維酵母Y179U即得。其中，例如大腸桿菌培養(yǎng)、感受態(tài)細(xì)胞的制備以及轉(zhuǎn)化等基因工程操作均為常規(guī)方法，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.Sambrook，et al.，第二版，1996)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種制備菊粉外切酶的方法，即取上述含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株在常溫常壓下發(fā)酵即得。具體而言，可以取上述含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株在28-32℃發(fā)酵2-8天，然后去除菌體，即得；發(fā)酵液初始菌濃度為OD600＝0.2-1.6；發(fā)酵液pH值為5.5-8.0；發(fā)酵液中含有0.5-2％(質(zhì)量體積百分比)的酵母粉和濃度不低于2％(質(zhì)量體積百分比)的碳源。
OD600表示菌體濃度，是用分光光度計(jì)(UNIC7200，上海儀器有限公司)600nm處測(cè)定獲得的光密度(Optical Density)來(lái)表示。
發(fā)酵可以采用常規(guī)發(fā)酵方式和設(shè)備，例如發(fā)酵罐發(fā)酵，搖瓶發(fā)酵，等等。發(fā)酵的時(shí)間、溫度等條件可以隨發(fā)酵方式和設(shè)備的改變而改變。例如，本發(fā)明可以采用搖瓶發(fā)酵方式，搖床轉(zhuǎn)速180-250rpm，發(fā)酵時(shí)間為3-4天。
本發(fā)明的制備菊粉外切酶的方法中，發(fā)酵液pH值可以為6.0-6.5。測(cè)pH值可以采用pH試紙、pH計(jì)等常規(guī)方法。
本發(fā)明的制備菊粉外切酶的方法中，發(fā)酵壓強(qiáng)可以為常壓。
本發(fā)明的制備菊粉外切酶的方法中，發(fā)酵液初始菌濃度較好為OD600＝0.6-0.8。
本發(fā)明的制備菊粉外切酶的方法中，碳源可以是菊粉或者葡萄糖等。如果采用菊粉作為碳源，菊粉濃度較好為4％-6％，質(zhì)量體積比。如果采用葡萄糖作為碳源，葡萄糖濃度較好為2％-4％，質(zhì)量體積比。
具體而言，本發(fā)明的制備菊粉外切酶的方法可以包括以下步驟(1)克魯維酵母的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)在固體YEPD(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂粉)培養(yǎng)基上的鷹嘴豆克魯維酵母Y179U，接種到液體YEPD中，30℃培養(yǎng)24小時(shí)，參照《酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南》(A.Adams，et al.，2000)制備感受態(tài)細(xì)胞，用LiAc的方法轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒pUKDS-INU，并涂布在SD固體培養(yǎng)基(0.67％YNB，2％葡萄糖，2％瓊脂)上，30℃培養(yǎng)2-3天，挑選轉(zhuǎn)化子，用搖瓶發(fā)酵方法篩選、分析具有高水平表達(dá)菊粉酶基因的轉(zhuǎn)化子。
(2)搖瓶發(fā)酵篩選方法轉(zhuǎn)化子接種在液體SD培養(yǎng)基中，30℃，220rpm搖床培養(yǎng)24小時(shí)，轉(zhuǎn)接液體YEPD培養(yǎng)基，30℃，220rpm搖床培養(yǎng)3天，用SDS-Page分析，并菊粉酶活性檢測(cè)。
(3)搖瓶發(fā)酵基本條件是使用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，葡萄糖4％，酵母粉1％，在250ml的發(fā)酵搖瓶中裝25ml發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，220rpm，培養(yǎng)3天。發(fā)酵液中的菌體密度直接在600nm測(cè)定OD值(OD600)；發(fā)酵液用5000rpm離心10分鐘，上清液用于測(cè)定菊粉酶活性。
(4)菊粉酶活性的檢測(cè)菊粉酶活性單位(u)定義為每分鐘水解產(chǎn)生1微摩爾果糖所需要的酶量。本發(fā)明測(cè)定菊粉酶活性的方法為經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的發(fā)酵上清液，加入到含有5％菊粉(億利公司生物技術(shù)有限公司)的HAc-NaAc緩沖液pH4.6中，60℃反應(yīng)10分鐘，沸水滅活5分鐘，用DNS方法在分光光度儀520nm測(cè)定還原糖的量，根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶解反應(yīng)體系中還原糖的含量及酶活。
用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的菊粉外切酶，活性可達(dá)2500u/ml以上，發(fā)酵產(chǎn)量高，發(fā)酵周期短，發(fā)酵成本低，適用于推廣至大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為用于轉(zhuǎn)化鷹嘴豆克魯維酵母、含有菊粉酶基因的表達(dá)載體pUKDS-INU結(jié)構(gòu)示意圖。其中，PINU菊粉酶啟動(dòng)子；SINU菊粉酶分泌信號(hào)肽；INU菊粉外切酶編碼基因；TINU菊粉酶終止子，KD1克魯維酵母自主復(fù)制序列；pUK19大腸桿菌自主復(fù)制序列，KcURA3鷹嘴豆克魯維酵母URA3序列。
圖2為發(fā)酵時(shí)間對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)菊粉酶的影響圖。
圖3為接種量對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)菊粉酶的影響圖。
圖4為發(fā)酵液PH對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖。
圖5為菊粉濃度對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖。
圖6為葡萄糖濃度(5％菊粉存在時(shí))對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖。
圖7為酵母粉濃度對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖。
圖8為蛋白胨濃度(1％酵母粉存在時(shí))對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖。
圖9為鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌制備的菊粉酶酶解反應(yīng)溫度影響圖。
圖10為鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌制備的菊粉酶酶解反應(yīng)PH影響圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1菊粉酶鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌的構(gòu)建根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的菊粉酶基因(AF178979)，設(shè)計(jì)以下引物INU-Bcl-For5’-TCAGTGATCAATTACAAGAGAGACGGTGAC-3’(引入酶切位點(diǎn)BclI)；INU-Hind-Rev5’-GAGAAGCTTTCAAAGGTTAAATTGGGTAAC-3’(引入酶切位點(diǎn)HindIII)。PCR反應(yīng)條件為94℃，5min，一個(gè)循環(huán)；94℃60s，60℃60s，72℃90s，三十個(gè)循環(huán)；最后72℃再延長(zhǎng)10min。PCR產(chǎn)物膠回收，克隆到pMD18T載體上，獲得pMD18T-INU，測(cè)序分析獲得與NCBI報(bào)道一致的菊粉酶基因。用標(biāo)準(zhǔn)分子克隆的方法，將菊粉酶基因克隆到表達(dá)載體pUKDS上，獲得pUKDS-INU，轉(zhuǎn)化鷹嘴豆克魯維酵母Y179U(CCTCC NoM202031)，獲得菊粉酶克魯維酵母基因工程菌Y179U/pUKDS-INU。附圖1是含有菊粉酶基因的表達(dá)質(zhì)粒pUKDS-INU，菊粉酶基因的表達(dá)是在鷹嘴豆克魯維酵母中菊粉酶的啟動(dòng)子、分泌信號(hào)肽和終止子的控制下組成型分泌表達(dá)。
實(shí)施例2制備菊粉外切酶制備過(guò)程如下(1)克魯維酵母的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)在固體YEPD(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂粉)培養(yǎng)基上的鷹嘴豆克魯維酵母Y179U，接種到液體YEPD中，30℃培養(yǎng)24小時(shí)，參照《酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南》(A.Adams，et al.，2000)制備感受態(tài)細(xì)胞，用LiAc的方法轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒pUKDS-INU，并涂布在SD固體培養(yǎng)基(0.67％YNB，2％葡萄糖，2％瓊脂)上，30℃培養(yǎng)2-3天，挑選轉(zhuǎn)化子，用搖瓶發(fā)酵方法篩選、分析具有高水平表達(dá)菊粉酶基因的轉(zhuǎn)化子。
(2)搖瓶發(fā)酵篩選方法轉(zhuǎn)化子接種在液體SD培養(yǎng)基中，30℃，220rpm搖床培養(yǎng)24小時(shí)，轉(zhuǎn)接液體YEPD培養(yǎng)基，30℃，220rpm搖床培養(yǎng)3天，用SDS-Page分析，并菊粉酶活性檢測(cè)。
(3)搖瓶發(fā)酵基本條件是使用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，葡萄糖4％，酵母粉1％，在250ml的發(fā)酵搖瓶中裝25ml發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，220rpm，培養(yǎng)3天。發(fā)酵液中的菌體密度直接在600nm測(cè)定OD值(OD600)；發(fā)酵液用5000rpm離心(HimacCR22E，HITACHI)10分鐘，上清液用于測(cè)定菊粉酶活性。
實(shí)施例3接種量對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響在基本發(fā)酵條件下，優(yōu)選發(fā)酵初始的菌體密度對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響。在25ml的發(fā)酵液中，接種種子液的菌體量OD600分別為5，10，15，20，30，40，相當(dāng)于初始發(fā)酵液菌體密度是0.2，0.4，0.6，0.8，1.2，1.6。附圖3表明，25ml發(fā)酵液的初始菌濃為OD6000.6-0.8時(shí)，可獲得較高的酶活和較快的生長(zhǎng)。
實(shí)施例4發(fā)酵液PH對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響在基本發(fā)酵條件下，用50mM濃度的Na2HPO4-KH2PO4配制不同pH(5.5，6.0，7.0，7.5，8.0)的發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)選發(fā)酵液pH對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響。見(jiàn)附圖4，pH6.0-6.5為菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶理想條件。
實(shí)施例5不同碳源及含量對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響考慮到所用克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)選用了菊粉酶的啟動(dòng)子和分泌信號(hào)肽，本發(fā)明檢測(cè)了菊粉酶作為唯一碳源時(shí)不同濃度對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源選用1％酵母粉，菊粉的濃度分別是3，4，5，6％。見(jiàn)附圖5，在菊粉濃度為5％時(shí)，菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶最佳，菌密度可達(dá)440D600，菊粉酶活力2594u/ml。
在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明分析了添加不同濃度的葡萄糖是否對(duì)基因工程菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶有利。見(jiàn)附圖6，在以1％酵母粉為氮源，以5％菊粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加2，3，4，5，6％的葡萄糖，盡管添加葡萄糖有助于菌體密度的提高(OD600可達(dá)57)，但是并沒(méi)有提高產(chǎn)酶量。因此，菊粉可以作為唯一的碳源，不需要添加葡萄糖，降低了生產(chǎn)成本。
實(shí)施例6不同氮源及含量對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響在5％菊粉為碳源時(shí)，本發(fā)明分析了不同濃度的酵母粉(0，0.5，1，1.5，2％)對(duì)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。見(jiàn)附圖7，1％的酵母粉較好。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步分析了添加不同濃度的蛋白胨(1，2，3，4％)對(duì)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。見(jiàn)附圖8，少量蛋白胨的添加(1％)有助于菌體的生長(zhǎng)，但是不利于產(chǎn)酶；同時(shí)，SDS-Page分析也發(fā)現(xiàn)，蛋白胨的存在增加了發(fā)酵上清液中雜蛋白的含量，不利于下游目的蛋白的純化。因此，在1％酵母粉為氮源時(shí)，不需要再添加蛋白胨。
實(shí)施例7發(fā)酵時(shí)間對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響在基本發(fā)酵條件下，優(yōu)選不同發(fā)酵時(shí)間24，36，48，60，72，84，96小時(shí)，對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響。見(jiàn)附圖2，發(fā)酵3天(72小時(shí))菊粉酶的活性達(dá)到最高，基因工程菌在48小時(shí)基本完成生長(zhǎng)，進(jìn)入穩(wěn)定期。
實(shí)施例8取上述含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株在常溫常壓下發(fā)酵3-4天，然后去除菌體，離心收集發(fā)酵上清液。發(fā)酵液初始菌濃度為OD600＝0.6-0.8；發(fā)酵液pH值為6.0-6.5；發(fā)酵液中含有0.5-2％(質(zhì)量體積百分比)的酵母粉和濃度46％(質(zhì)量體積百分比)的菊粉。
在上述條件下，多次重復(fù)，發(fā)酵上清液酶活分別為3404u/ml，2893u/ml，2594u/ml，2516u/ml，3843u/ml等，發(fā)酵上清液酶活在2500u/ml以上，最高為3843u/ml。用氟林酚方法測(cè)定蛋白濃度后，計(jì)算獲得發(fā)酵上清液的菊粉酶比活為1141u/mg，純化后的菊粉酶的純度高于90％，比活達(dá)到4439u/mg。進(jìn)一步，直接用發(fā)酵上清液(菊粉酶含量超過(guò)80％)分析鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌制備菊粉酶的特性。見(jiàn)附圖9和附圖10，菊粉酶水解菊粉的最適溫度是60℃，反應(yīng)的最適pH低于4.2。
權(quán)利要求
1.一種含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株，其特征是，采用分子生物學(xué)方法將菊粉外切酶基因克隆到真核表達(dá)載體pUKDS上，并轉(zhuǎn)化鷹嘴豆克魯維酵母Y179U，即得。
2.一種制備菊粉外切酶的方法，其特征是，取權(quán)利要求1所述的基因工程菌株在28-32℃條件下發(fā)酵2-8天，然后去除菌體，即得；發(fā)酵液初始菌濃度為OD600＝0.2-1.6；發(fā)酵液pH值為5.5-8.0；發(fā)酵液中含有質(zhì)量體積比為0.5-2％的酵母粉和質(zhì)量體積比不低于2％的碳源。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，采用搖瓶發(fā)酵方式，發(fā)酵時(shí)間為3-4天。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，發(fā)酵液pH值為6.0-6.5。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，發(fā)酵壓強(qiáng)為常壓。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，發(fā)酵液初始菌濃度為OD600＝0.6-0.8。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，碳源為菊粉或者葡萄糖。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征是，菊粉的濃度為4％-6％的質(zhì)量體積比。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征是，葡萄糖的濃度為2％-4％的質(zhì)量體積比。
全文摘要
本發(fā)明屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明將菊粉外切酶基因克隆到真核表達(dá)載體pUKDS上，并轉(zhuǎn)化鷹嘴豆克魯維酵母Y179U，形成表達(dá)菊粉外切酶的克魯維酵母基因工程菌株。發(fā)酵時(shí)，取上述基因工程菌株在常溫常壓下發(fā)酵2－8天，然后去除菌體，即得；發(fā)酵液初始菌濃度為OD
文檔編號(hào)C12N9/24GK101063089SQ20071004039
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者呂紅, 李育陽(yáng), 袁漢英 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)