專利名稱：香菇申香93菌種的分子特異標(biāo)記及方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種香菇申香93菌種的分子特異標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)香菇產(chǎn)量已從1983年的1.95萬(wàn)噸迅速發(fā)展到2005年的242萬(wàn)噸，占全球香菇總產(chǎn)量的70％以上，改寫了世界食用菌產(chǎn)量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產(chǎn)量差距，有專家預(yù)測(cè)，由于中國(guó)香菇產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在近10年內(nèi)其將成為世界產(chǎn)量最高的食用菌。中國(guó)香菇以其驚人的發(fā)展速度，優(yōu)質(zhì)的品質(zhì)及低廉的成本為世界菇業(yè)人士矚目，中國(guó)香菇已風(fēng)靡世界。
優(yōu)質(zhì)菌種在香菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產(chǎn)業(yè)中的重要地位。1999年我國(guó)簽署了《國(guó)際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國(guó)家的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，同時(shí)也要加強(qiáng)保護(hù)我們國(guó)家自己的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記制度來(lái)真正保護(hù)我國(guó)的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定基礎(chǔ)。尤其日本2004年4月1日開(kāi)始實(shí)行《種苗法修正案》，對(duì)我國(guó)食用菌尤其是香菇的出口構(gòu)成了極大的威脅。就國(guó)內(nèi)而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現(xiàn)象，不僅給菇農(nóng)帶來(lái)了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國(guó)香菇的快速發(fā)展；而且，隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對(duì)香菇栽培菌株質(zhì)量的要求越來(lái)越高，需要發(fā)展更為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)，以保證每批次的用種都準(zhǔn)確無(wú)誤。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分子標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region)標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡(jiǎn)便、低成本的特點(diǎn)，本發(fā)明建立了香菇申香93菌種的SCAR分子標(biāo)記，能對(duì)香菇申香93菌種進(jìn)行快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能應(yīng)用于香菇申香93菌種快速鑒定和檢測(cè)的分子特異標(biāo)記及其獲得方法。
一種香菇申香93菌種的分子特異標(biāo)記為540bp大小的特異片段，其特異性PCR擴(kuò)增引物對(duì)序列為5’TCTGTTGCTCCTATTGC 3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA 3’。
一種香菇申香93菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，包括下列步驟a.菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取將低溫保藏的香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25℃培養(yǎng)活化，收集菌絲，用改進(jìn)的CTAB法提取基因組DNA。
b.香菇申香93菌株的特異DNA片斷的獲得采用PCR技術(shù)，經(jīng)過(guò)大量的篩選試驗(yàn)，采用隨機(jī)引物(引物序列TGCGCCCTTC)獲得了香菇菌株申香93的特異DNA片斷，分子量為553bp，將該片段克隆測(cè)序。
c.特異PCR擴(kuò)增引物的獲得以得到的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物，引物對(duì)的序列如下5’TCTGTTGCTCCTATTGC 3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA 3’d.用特異PCR擴(kuò)增引物對(duì)對(duì)香菇申香93菌株進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增為了排除其它菌種的假陰性情況，在SCAR-PCR反應(yīng)體系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)通用引物對(duì)(ITS1、ITS4)，驗(yàn)證所有模板DNA的完整性。
e.電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)可見(jiàn)香菇申香93菌株能擴(kuò)增出540bp大小的特異片斷(圖1)。
根據(jù)采用這一對(duì)特殊引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以能否產(chǎn)生540bpDNA片段作為對(duì)香菇申香93菌株進(jìn)行鑒定和檢測(cè)的依據(jù)。
該檢測(cè)方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。該檢測(cè)所需時(shí)間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間，出菇試驗(yàn)則需要至少3個(gè)月的時(shí)間；該方法在所收集的我國(guó)164個(gè)香菇生產(chǎn)菌株中具有香菇申香93的專一性。


圖1 SCAR-PCR擴(kuò)增結(jié)果9為香菇申香93菌株(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所)，箭頭所示為香菇申香93菌株擴(kuò)增出分子量約為540bp的特殊DNA條帶，其余編號(hào)為其它香菇菌株，均未見(jiàn)特異條帶。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
實(shí)施例1菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取將低溫保藏的香菇申香93菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25℃培養(yǎng)活化。兩周后接到100mL PD液體培養(yǎng)基中，25℃100r/min振蕩培養(yǎng)兩周，收集菌絲，放入-20℃冰箱凍存。用改進(jìn)的CTAB法提取基因組DNA，DNA稀釋至20ng/μL，-20℃冰箱貯藏備用。香菇申香93菌株的特異DNA片斷的獲得采用PCR技術(shù)，經(jīng)過(guò)大量的篩選試驗(yàn)，采用隨機(jī)引物(引物序列TGCGCCCTTC)獲得了香菇菌株申香93的特異DNA片斷，分子量為553bp，將該片段克隆測(cè)序。
特異PCR擴(kuò)增引物的獲得以得到的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物，引物對(duì)的序列如下5’TCTGTTGCTCCTATTGC 3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA 3’SCAR分子標(biāo)記擴(kuò)增體系總體積為25μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L申香93菌株檢測(cè)專用引物對(duì)各1μL，模板DNA 1μL(濃度1ng～10ng/μL)，ddH2O 18.6μL。PCR反應(yīng)條件94℃ 1min；94℃ 15second，61℃15second，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃5min。
為了排除其它菌種的假陰性情況，在SCAR-PCR反應(yīng)體系中加入ITS通用引物(ITS1、ITS4)，驗(yàn)證所有模板DNA的完整性。
電泳檢測(cè)取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8μL，與1μL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5％的瓊醋糖凝膠上，于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。
權(quán)利要求
1.一種香菇申香93菌種的分子特異標(biāo)記，其特征在于特異性PCR擴(kuò)增引物對(duì)序列為5’TCTGTTGCTCCTATTGC 3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA 3’；DNA片斷大小為540bp。
2.一種香菇申香93菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，其特征在于包括如下步驟a.菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取將低溫保藏的香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25℃培養(yǎng)活化，收集菌絲，用改進(jìn)的CTAB法提取基因組DNA；b.香菇申香93菌株的特異DNA片斷的獲得采用PCR技術(shù)，經(jīng)過(guò)大量的篩選試驗(yàn)，在在采用隨機(jī)引物獲得了香菇菌株申香93的特異DNA片斷，分子量為553bp，將該片段克隆測(cè)序；c.特異PCR擴(kuò)增引物的獲得以得到的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物，引物對(duì)的序列如下5’TCTGTTGCTCCTATTGC 3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA 3’；d.用特異PCR擴(kuò)增引物對(duì)對(duì)香菇申香93菌株菌株進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增為了排除其它菌種的假陰性情況，在SCAR-PCR反應(yīng)體系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)通用引物對(duì)(ITS1、ITS4)，驗(yàn)證所有模板DNA的完整性；e.電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)可見(jiàn)香菇申香93菌株能擴(kuò)增出540bp大小的特異片斷。
3.如權(quán)利要求2所述的一種香菇申香93菌種的分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于步驟b所用隨機(jī)引物序列為TGCGCCCTTC。
4.如權(quán)利要求2所述的一種香菇申香93菌種的分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于步驟a中菌絲培養(yǎng)條件為將低溫保藏的香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25℃培養(yǎng)活化，兩周后接到100mL PD液體培養(yǎng)基中，25℃100r/min振蕩培養(yǎng)兩周；所提取DNA稀釋至20ng/μL。
5.如權(quán)利要求2所述的一種香菇申香93菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所述步驟d中的SCAR-PCR擴(kuò)增擴(kuò)增體系總體積為25μL，擴(kuò)增體系10×PCR buffer2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L香菇申香93菌株檢測(cè)專用引物對(duì)各1μL，模板DNA 1μL(濃度1ng～10ng/μL)，ddH2O 18.6μL，PCR反應(yīng)條件94℃ 1min；94℃ 15second，61℃ 15second，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。
6.如權(quán)利要求2所述的一種香菇申香93菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所述步驟e電泳檢測(cè)為取步驟d PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8μL，與1μL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5％的瓊醋糖凝膠上，于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。
7.一種香菇申香93菌種的分子特異標(biāo)記應(yīng)用于香菇申香93菌種的快速鑒定和檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香菇申香93菌種的分子特異標(biāo)記及其獲得方法，香菇申香93菌種的分子標(biāo)記DNA片斷大小為540bp，其特異性PCR擴(kuò)增引物對(duì)序列為5′TCTGTTGCTCCTATTGC3′和5′CCTTCAGCTAACCCAAA 3′。方法包括步驟菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提?。幌愎缴晗?3的特異DNA片斷的獲得；特異PCR擴(kuò)增引物的獲得；SCAR－PCR擴(kuò)增；電泳檢測(cè)。本發(fā)明的分子標(biāo)記可應(yīng)用于香菇申香93菌種的快速鑒定和檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101086019SQ20071004032
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者宋春艷, 譚琦, 陳明杰, 尚曉冬, 潘迎捷 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所