一種靈芝酸高產工程菌株Kmust-LS的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和代謝工程領域，通過基因工程對靈芝酸代謝途徑中的羊毛 甾醇合酶（LS)基因過表達的方法，構建了一個靈芝酸的高產工程菌株。
【背景技術】
[0002] 靈芝（Ganodermalucidum)是擔子菌綱，多孔菌科，靈芝屬真菌。靈芝真菌在 我國有20多種，包括赤芝，黃芝，紫芝，黑芝，薄蓋靈芝，樹舌等。我國應用靈芝作為藥物已有 兩千多年的歷史。靈芝對于增強人體免疫力，調節(jié)血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護 肝，促進睡眠等方面均具有顯著療效。由于其特殊的要用價值，靈芝的有效成分分析和藥理 學研究已經引起了國際上的廣泛關注，尤其在日本，美國，韓國等國家。目前，靈芝的研究已 經深入到了分子水平，一些專著相繼出版，從不同的角度介紹了靈芝的生物學特性、栽培技 術、藥理學作用及臨床應用等情況。
[0003]靈芝酸是一類分子結構中含有羧基的三萜類物質，從結構來看它屬于高度氧化的 羊毛留烷衍生物。自1982年KubotaT等人首次分離得到靈芝酸以來，目前已有130多種靈芝 酸被分離出來。它們多為四環(huán)三萜類化合物，含有30個碳原子，結構中一般都有羥基，在紅 外光譜中有較強的羥基吸收峰。在紫外光譜中也呈現(xiàn)多個波長的特征吸收，多數(shù)是在250 nm、237nm、365nm處有吸收峰。靈芝酸具有許多重要的藥理活性如:抗癌，抑制小鼠肝肉瘤 (HTC)細胞的增殖;護肝，靈芝中的靈芝酸提取物能加強其解毒作用;抗HIV;降血壓;抗 氧化;抑制血小板凝集，抑制組胺釋放，鎮(zhèn)痛，抑制真核細胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋 白轉移酶活性和促進體液免疫功能等作用。
[0004]羊毛留醇合酶（LS)基因是靈芝酸合成途徑中的一個較為重要的基因。它主要 催化鯊烯2，3-氧化物轉化為羊毛留醇，進而合成靈芝酸。靈芝酸是通過甲羥戊酸途徑合成 的。這條途徑普遍存在于動物，植物，真菌。首先是由乙酰輔酶A(AcetylCoA)在硫解酶 (AcetoacetylCoAthiolase)催化下縮合形成乙酰乙酰輔酶A(AcetoacetylCoA)， 乙酰乙酰輔酶A經HMG-CoA合成酶（HMG-CoAsynthase)催化與另一分子乙酰CoA縮合生 成3-羥基-3甲基-戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)，然后HMG-CoA還原酶（HMG-CoA reductase,HMGR)催化HMG-CoA轉化為甲羥戊酸。甲羥戊酸經甲羥戊酸激酶（MVK)、甲 羥戊酸5-磷酸激酶（PMK)和MDD三步酶促反應轉化為IPPJPP進一步轉化成法呢酯焦磷 酸FPPJPP在鯊烯合酶（SQS)的催化下合成鯊烯SQS后經過鯊烯單加氧酶的作用產生 藍稀2，3-氧化物，再經過羊毛留醇合酶lanosterolsynthasee(LS)的作用產生羊毛 甾醇。最后通過不同酶的修飾作用產生不同結構的靈芝三萜。靈芝酸的合成途徑如下所示：
由于野生靈芝生長周期長，受環(huán)境因素影響大且野生靈芝資源有限，靈芝菌絲培養(yǎng)成 為生產活性物質的重要方法。隨著對靈芝活性物質需求的不斷增加，如何提高靈芝酸的產 量和增加靈芝的有效成分越來越引起人們的關注。液體深層發(fā)酵技術是進行快速工業(yè)化生 產的重要手段?，F(xiàn)在市售的靈芝酸主要是從靈芝子實體和液體深層發(fā)酵得到的菌絲體中獲 得。由于野生靈芝液體深層發(fā)酵時靈芝酸在靈芝細胞中的含量較低，分離純化也較難，限制 了對靈芝酸的活性、作用機理的研究及其廣泛應用。近年來，基因工程與代謝工程迅速發(fā) 展，成為了現(xiàn)代分子育種的重要手段。通過分子克隆和基因拼接等分子生物學方法來改造 菌株的基因組，從而提高活性成分的含量越來越受學者們的青睞。如何從分子水平上提高 靈芝酸的產量是目前急需解決的技術問題。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是解決野生型靈芝菌株自身產靈芝酸較低的問題，提供一種靈芝酸 高產菌株，該菌株為高產靈芝酸的靈芝（Ganodermalucidum)工程菌Kmust-LS，已于 2015年11月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0.11603。
[0006] 本發(fā)明靈芝酸高產工程菌株的構建方法如下： 以PMD19-T為起始載體并使用靈芝本身的強啟動子P-gpd、終止子T-sdhB、cbx基因，cbx基因（具有carboxin抗性）是來自靈芝本身的抗性基因，其特點是在蘑菇類擔子菌的轉 化體系中同源標記基因的轉化效率更高，能夠穩(wěn)定遺傳，抗性強。
[0007] 1、將靈芝啟動子p-gpd與終止子T-sdhB與PMD19-T連接，將靈芝cbx抗性基因插入 至IJPstI酶切位點，從而構建成pJW-EXP載體;其具有靈芝的強啟動子和終止子，并具有靈芝 本身的抗性。
[0008] 其中擴增靈芝強啟動子P-gpd的引物序列為： P-gpd-F:5，-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3,， P-gpd-R:5 '-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG- 3 '； 擴增靈芝sdhB基因終止子的引物序列為： T-sdhB-F: 5，-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3，， T-sdhB-R: 5'-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3'； 擴增靈芝cbx抗性基因的引物為： cbx-F:5 '-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3 '， cbx-R:5 '-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3 '； 2、靈芝酸合成途徑中關鍵酶羊毛留醇合酶（LS)從靈芝基因組中克?。ㄋ玫囊?物為LS-Nhe-F和LS-Sma-R)，并插入到pJW-EXP載體中，得到pJW-EXP-tLS載體；引物序列 為： LS-Nhe-F:5，-GCTAGCATGGCAGCGTACGCCCCG- 3， LS-Sma-R:5 '-CCCGGGCTACTTCTTGGCGTGCAACTCCTTG- 3 '； LS基因核苷酸序列在GenBank上，其登錄號為KJ155729。
[0009] 3、通過PEG介導原生質體融合的方法，將PJW-EXP-LS轉化到野生型靈芝細胞中，以carboxin作為抗性來篩選靈芝轉化子，在含有carboxin抗性的CYM平板上篩選出轉化子。
[0010] 4、將轉化子在carboxin抗性的CYM平板中進行傳代培養(yǎng)。
[0011] 5、靈芝細胞的液體培養(yǎng)： PDA培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖10,瓊脂20，硫酸鎂1.5，磷酸二氫鉀3,維生素B1 0.05 和制備好的土豆汁。
[0012] 土豆汁的制備方法:將200g去皮新鮮土豆切成小塊，加入去離子水1.0L煮沸30min，用八層紗布過濾，取濾液，用于PDA培養(yǎng)基的配制。
[0013]種子培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖35、蛋白胨5、酵母膏2.5、磷酸二氫鉀1、硫酸鎂0.5和 維生素B1 0.05。
[0014]發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨5、酵母膏5、磷酸二氫鉀1.0、硫酸鎂0.5、維生素B1 0.05,乳糖35,起始pH5.5。
[0015]CYM培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20、麥芽糖10、酵母粉2、蛋白胨2、MgS〇4 0·5、ΚΗ2Ρ〇4 4.6、瓊脂 10。
[0016]斜面培養(yǎng):接種菌絲于土豆汁-葡萄糖-瓊脂（PDA)斜面中28 °C培養(yǎng)5-7天。 [0017] 一級種子培養(yǎng):在250mL搖瓶中添加40mL培養(yǎng)基和10mL菌絲體懸液（從一支 斜面中獲得），并在30 °C，120rpm下培養(yǎng)5天。
[0018] 二級種子培養(yǎng):在250mL搖瓶中加入45mL培養(yǎng)基和5mL-級種子培養(yǎng)液（大約 500mgDW/L，一級培養(yǎng)物用玻璃珠打碎后接種），在30 °C，120rpm下培養(yǎng)2天。
[0019] 發(fā)酵培養(yǎng):在250mL搖瓶中加入45mL發(fā)酵培養(yǎng)基和5mL二級種子發(fā)酵液（大約 500~600mgDW/L，二級培養(yǎng)物用玻璃珠打碎后接種），在30 °C，120rpm下培養(yǎng)。
[0020] 6、單體靈芝酸的分離和提取 準確稱取干細胞粉末100mg，加入3mL70%(v/v)乙醇浸泡過夜，超聲處理3次，每次30mirulOOOOrpm離心5min后獲得上清液。在50 °C烘箱中烘干。用200yL色譜級甲醇徹底溶 解，用0.22μπι濾膜過濾。用HPLC檢測靈芝酸單體。HPLC檢測條件為:HPLC色譜柱為C18柱(Agilent1200series，5μπιAgilentZorbaxSB-C18column，250X4.6mm);進樣量 20 yL;流速1mL/min;流動相A為甲醇/乙酸（100:0.5(v/v))，流動相B為超純水，0-20min:A 相為80%-100%等梯度洗脫;20 11^11-30 11^114相為100%洗脫;30 11^11-35 11^114相為80 %洗脫；紫外檢測波長為245nm;洗脫時間35min。記錄相應的峰面積和出峰時間。按照標 準曲線計算出各個靈芝酸單體的濃度和含量。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點和技術效果：通過搖瓶發(fā)酵實驗表明，LS轉化子菌株產單體靈芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S的含量分別是WT菌株的2.1，1. 6，2.35，1.3倍。在同等情況下，使 用本發(fā)明構建的工程菌株可以節(jié)約勞動力，縮短生產周期，降低成產成本。因此，本高產菌 株可以作為生產靈芝酸的工程菌株，適用于工業(yè)化生產，具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明中靈芝基因組，圖中:G為靈芝基因組，Μ為DNAMarker; 圖2為本發(fā)明中pJW-EXP載體結構示意圖； 圖3為本發(fā)明中擴增LS基因的電泳圖；圖中:Μ為500bpDNA Ladder(DyePlus)的核酸 標準品（Takara );L為LS基因； 圖4為本發(fā)明中pJW-EXP-LS載體結構示意圖； 圖5為本發(fā)明中驗證LS陽性轉化子的電泳圖；圖中：Μ為500bpDNALadder(DyePlus) 的核酸標準品（Takara)，P為陽性對照，L為轉LS基因的陽性轉化子，WT為野生型菌株，N 為陰性對照。
【具體實施方式】
[0023]下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的內容并不局限于此，本 實施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑 或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0024] 實施例1:pJW-EXP載體的構建 1、靈芝基因組DNA的提取 稱取約0.2g凍干野生型靈芝（CCGMC5.0616 )的菌絲體在液氮中研磨成粉末，將 粉末轉入1.5mL經65 °C預熱的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨）抽取緩沖液中，