專利名稱：：一種檢測豬流感病毒及血清亞型的引物集及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多重PCR檢測，尤其涉及檢測豬流感病毒(SIV)的PCR檢測引物。
背景技術(shù)：
：豬流感病毒(Swineinfluenzavirus,SIV)可引起豬的呼吸系統(tǒng)疾病，各品種、各年齡段的豬均可感染發(fā)病，對仔豬危害更為嚴(yán)重，該病最早報道是1918年美國豬群發(fā)生流行，1930年Shope等首次在豬體中分離到H1N1亞型病毒。1979年禽源H1N1開始在歐洲豬群中流行。1994年英國首先報道分離到新的重組H1N2亞型，而后多個國家相繼報道分離到這一新型毒株。1998年美國分離到H3N2毒株，20世紀(jì)70年代中國香港、大陸、臺灣等地陸續(xù)報道分離到SIV。血清學(xué)監(jiān)測及病原分離鑒定表明，我國目前SIV廣泛存在，流行株血凝素(Hemagglutinin,HA)亞型主要為Hl、H3，神經(jīng)氨酸酶亞型(Neuraminidase,NA)為N1、N2，因此建立針對這兩種亞型的快速、靈敏檢測方法對于適時監(jiān)測SIV流行和分布非常必要。RT-PCR技術(shù)已成功用于動物流感病毒的鑒別診斷，主要是根據(jù)流感病毒NP基因、M基因保守序列，設(shè)計合成引物，用于檢測病毒核酸。但這種方法只能鑒定出樣品中是否含有動物流感病毒，無法確定病毒的血清亞型，還需進一步采用血凝或血凝抑制試驗鑒定。近年來發(fā)展起來的利用PCR或NASABA方法鑒別流感病毒不同的血清亞型，也得以成功應(yīng)用，如熒光定量PCR檢測H5、H9亞型病毒核酸、RT-PCR分別檢測H5、H9亞型病毒核酸等。但鑒定一個血清亞型需要一個PCR體系，檢測過程相對煩瑣，不利于快速診斷。多重PCR是在單一PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，通過寡核苷酸引物組合，在一個PCR反應(yīng)體系中同時擴增多個靶序列，其擴增的特異性和效率與單一PCR相當(dāng)，但同時可擴增針對不同模板的多個靶序列，能節(jié)約時間和精力，在樣品的鑒別診斷中是一項簡便、快速的方法，尤其適用臨床病原分型檢測。Choi等、Poddar采用多重RT-PCR方法對SIV分型檢測、人流感病毒分型檢測進行了研究。但僅限于對已知H1、H3和N1、N2亞型的鑒定，不能確定被檢樣品中是否還有其它亞型的流感病毒。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供檢測豬體流感病毒及鑒別診斷Hl、H3和Nl、N2血清亞型的診斷方法，為臨床監(jiān)測SIV動態(tài)提供技術(shù)支撐。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種引物集。本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述引物集的試劑盒。本發(fā)明的再一個目的是提供一種檢測豬體流感病毒及鑒別診斷血清亞型的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于同一反應(yīng)體系中進行PCR擴增的引物集，它包括(1)流感病毒通用型NP基因的引物對；和(2)SIV亞型的引物對。在另一優(yōu)選例中，所述的SIV亞型包括血凝素亞型、或神經(jīng)氨酸酶亞型。在另一優(yōu)選例中，所述的血凝素亞型包括Hl、和/或H3;所述的神經(jīng)氨酸酶亞型包括N1、和/或N2。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集包括(1)流感病毒通用型NP的引物對；和(2)SIV血凝素亞型H1和H3的引物對；或(3)SIV神經(jīng)氨酸酶亞型Nl和N2的引物對。在另一優(yōu)選例中，所述的NP的引物對是SEQIDN0:11和12。在另一優(yōu)選例中，所述的H1、H3的引物對選自SEQIDN0:1和2、SEQIDNO:3和4、或SEQIDN0:17和18。在另一優(yōu)選例中，所述的Nl、N2的引物對選自SEQIDNO:5和6、SEQIDNO:25和6、或SEQIDNO:7和8、或SEQIDNO:9和10。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于同一反應(yīng)體系中進行PCR擴增的引物集，它包括SIV亞型血凝素亞型H1和H3的引物對；所述的H1和H3的引物對選自SEQIDNO:l—4或SEQIDNO:1，2，17，和18。在另一優(yōu)選例中，一種用于同一反應(yīng)體系中進行PCR擴增的引物集，它包括SIV神經(jīng)氨酸酶亞型Nl和N2的引物對；所述的Nl和N2的引物對選自SEQIDN0:5一8、SEQIDN0:5，6，9和10、SEQIDN0:25，6,7和8、或SEQIDN0:25，6，9和10。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種試劑盒，它包括①用于同一反應(yīng)體系中進行PCR擴增的引物集流感病毒通用型NP基因的引物對和SIV亞型的引物對；和②說明書。在另一優(yōu)選例中，一種試劑盒包括SIV亞型血凝素亞型HI和H3的引物對，所述的H1和H3的引物對選自SEQIDNO:l—4或SEQIDNO:1，2，17，和18。在另一優(yōu)選例中，一種試劑盒包括SIV神經(jīng)氨酸酶亞型Nl和N2的引物對；所述的Nl和N2的引物對選自SEQIDN0:5—8、SEQIDNO:5，6，9和10、SEQIDNO:25'6，7和8、或SEQIDN0:25，6，9和10。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種對SIV進行分型的方法，它包括步驟(a)在一個體系中加入用于同一反應(yīng)體系中進行PCR擴增的引物集(包括流感病毒通用型NP基因的引物對和SIV亞型的引物對)，進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶檢驗該體系中是否含有一種亞型的SIV;(b)如果電泳結(jié)果顯示出相應(yīng)的條帶，則表示該體系中存在該種亞型的SIV，從而得到檢測結(jié)果；如果電泳結(jié)果沒有顯示出相應(yīng)的條帶，表示該體系中不存在上述的這種亞型的SIV，同時根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶檢驗該體系中是否含有流感病毒；(c)如果電泳結(jié)果顯示出流感病毒條帶，則在另一個體系中加入SIV亞型的引物對，進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶檢驗該體系中是否含有另一種亞型的SIV;(d)如果電泳結(jié)果顯示出相應(yīng)的條帶，則表示該體系中存在所述的NA亞型SIV;如果電泳條帶沒有顯示出相應(yīng)的SIV亞型條帶，表示該體系中不存在所述亞型SIV。在另一優(yōu)選例中，所述的SIV亞型包括血凝素亞型、和神經(jīng)氨酸酶亞型。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測方法，包括步驟(a)在一個體系中加入流感病毒通用型NP的引物對和SIV血凝素亞型HI和H3的引物對，進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶，檢驗該體系中是否含有SIVHl和/或H3血凝素亞型；(b)如果電泳條帶顯示出SIV血凝素亞型HI禾口/或H3，則表示該體系中存在HI和/或H3血凝素亞型SIV;如果電泳條帶沒有顯示SIV血凝素亞型Hl和/或H3條帶，則根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶檢驗該體系中是否含有流感病毒；(c)如果電泳條帶顯示出含有流感病毒，則在另一個體系中加入神經(jīng)氨酸酶亞型N1和N2的引物對，迸行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶，檢驗該體系中是否含有神經(jīng)氨酸酶Nl和/或N2亞型SIV;(d)如果電泳條帶顯示出神經(jīng)氨酸酶亞型Nl和/或N2相應(yīng)條帶，則表示該體系中存在神經(jīng)氨酸酶Nl和/或N2亞型SIV;如果電泳條帶沒有顯示出Nl和N2相應(yīng)條帶，表示該體系中不存在神經(jīng)氨酸酶Nl和/或N2亞型SIV。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測方法，包括步驟-(a)在一個體系中加入流感病毒通用型NP的引物對和SIV神經(jīng)氨酸酶亞型Nl和N2的引物對，進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶，檢驗該體系中是否含有SIV及是否為Nl和/或N2神經(jīng)氨酸酶亞型病毒；(b)如果電泳條帶顯示出SIV神經(jīng)氨酸酶亞型N1和/或N2，則表示該體系中存在Nl和/或N2亞型SIV神經(jīng)氨酸酶；如果電泳條帶沒有顯示SIV神經(jīng)氨酸酶亞型N1和N2，則根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶檢驗該體系中是否含有流感病毒；(c)如果電泳條帶顯示出流感病毒，則在另一個體系中加入SIV血凝素亞型H1和H3的引物對，進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶，檢驗該體系中是否含有Hl和/或H3血凝素亞型SIV;(d)如果電泳條帶顯示出血凝素亞型Hl和/或H3，則表示該體系中存在血凝素亞型H1和/或H3;如果電泳條帶沒有顯示出血凝素亞型m和/或H3，表示該體系中不存在Hl和/或H3血凝素亞型。在另一優(yōu)選例中，一種對SIV進行分型的方法，包括步驟-(a)在一個體系中加入SIV亞型血凝素亞型Hl和H3的引物對和流感病毒通用型NP的引物對，進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶檢驗該體系中是否含有Hl禾口/或H3血凝素亞型SIV;(b)如果電泳結(jié)果顯示出相應(yīng)的Hl和/或H3條帶，則表示該體系中存在Hl和/或H3亞型的SIV，從而得到檢測結(jié)果；如果電泳結(jié)果沒有顯示出相應(yīng)的HI和H3條帶，表示該體系中不存在Hl禾口/或H3亞型SIV，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶檢驗該體系中是否含有流感病毒；(c)如果電泳結(jié)果顯示出流感病毒條帶，則在另一個體系中加入神經(jīng)氨酸酶亞型N1和N2的引物對，進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶，檢驗該體系中是否含有神經(jīng)氨酸酶Nl和/或N2亞型SIV;(d)如果電泳條帶顯示含有神經(jīng)氨酸酶亞型Nl和/或N2，則表示該體系中存在神經(jīng)氨酸酶N1和/或N2亞型SIV;如果電泳條帶沒有顯示出神經(jīng)氨酸酶亞型Nl和N2，表示該體系中不存在這兩種神經(jīng)氨酸酶亞型SIV。在另一優(yōu)選例中，所述的Hl和H3的引物對選自SEQIDN0:1—4或SEQIDNO:1，2，17，和18。；所述的Nl和N2的引物對選自SEQIDN0:5—8、SEQIDN0:5，6，9和10、SEQIDN0:25，6，7禾卩8、或SEQIDN0:25，6，9和10。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種檢測豬體流感病毒及鑒別診斷Hl、H3和N1、N2血清亞型的診斷方法，為臨床監(jiān)測SIV動態(tài)提供技術(shù)支撐。圖1顯示了H1、H3分型多重PCR檢測H1/H3混合模板的情況；其中1表示H1/H3/NP組合I;2表示H1/H3/NP組合II;3表示H1/H3/NP組合III;4表示H1/H3/NP組合IV;5表示H1/H3/NP組合V;M表示DL2000標(biāo)記物。圖2顯示了Nl引物對H1N1、H5N1模板擴增結(jié)果；其中A表示H1N1模板；B表示H5N1模板；1表示Nl引物對495/855;2表示Nl引物對491/855;3表示Nl引物對710/1094;4表示Nl引物對824/1094;5表示Nl引物對802/1094;6表示Nl引物對721/931;7表示Nl引物對770/1201;8表示陰性對照；M表示DL2000分子量標(biāo)記物。圖3顯示了N2分型引物對H3N2模板(A)、H9N2模板(B)單一PCR檢測結(jié)果；其中1表示N2引物對273/432;2表示N2引物對273/433;3表示N2引物對818/1010;4表示N2引物對411/628;5表示N2引物對1036/1290;6表示N2引物對566/836;7表示N2引物對730/1013;8表示N2引物對804/1132;9表示N2引物對606/1012;10表示N2引物對804/1290;M表示DL2000分子量標(biāo)記物。.圖4顯示了N1/N2亞型引物組合對不同模板驗證結(jié)果；其中1表示H1模板；2表示模板；3表示H1/H3模板；4表示H5模板；5表示H9模板；6表示H5/H9模板。圖5顯示了H1、H3亞型引物組合靈敏性檢測結(jié)果；其中l(wèi)一8表示Hl/H3引物組合I;9-14表示Hl/H3引物組合II。圖6顯示了實施例2中Hl/H3組合I、II對不同亞型SIV模板擴增結(jié)果；其中1,6表示H1/H3模板；2，7表示H9亞型模板；3，8表示H5亞型模板；4，9表示H3亞型模板；5.10表示H1亞型模板；M表示DL2000標(biāo)記物。圖7顯示了實施例3中NP/NA引物組合I、II、III、和VI對不同亞型SIV模板擴增結(jié)果；其中1，5,9，13為H1N1模板；2，6,10，14為H3N2模板；3，7，11，15為H1N1H3N2混合模板；4，8,12，16為陰性對照；M表示DL2000分子量標(biāo)記物。圖8顯示了實施例3中HA引物組合I、II對不同亞型SIV模板擴增結(jié)果；其中1，5為H1N1模板；2，6為H3N2模板；3，7為H1N1/H3N2混合模板；M表示DL2000分子量標(biāo)記物。具體實施方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了一種用于同一反應(yīng)體系中進行PCR擴增的引物集，所述的引物集包括SIV亞型引物對和流感病毒通用型引物對。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了一種用于同一反應(yīng)體系中進行PCR擴增的引物集，所述的引物集包括SIVHl和H3亞型的引物對，或包括SIVNl和N2亞型的引物對，所述的Hl和H3的引物對選自SEQIDN0:l—4或SEQIDNO:1，2，17，和18;所述的Nl和N2的引物對選自SEQIDN0:5—8、SEQIDN0:5，6，9和10、SEQIDN0:25，6，7和8、或SEQIDN0:25，6，9和10。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果在某一系統(tǒng)中存在SIV亞型引物對和流感病毒通用型引物對，可以檢驗系統(tǒng)中是否存在某種SIV亞型。即使系統(tǒng)中沒有某種SIV亞型存在，也可以通過所進行的多重PCR判斷系統(tǒng)中是否存在流感病毒。如本文所用，"引物集"是指在同一體系中進行PCR擴增時，所用到的含有多對引物的集合體，其中含有1-10對引物；較佳地，含有1-5對；更佳地，含有2-3對。如本文所用，"流感病毒通用型NP的引物對"是指對所有動物流感病毒均保守的核酸序列，例如但不限于，SIV、禽流感病毒。如本文所用，"引物對"是指針對目的基因中相對保守的核酸序列所設(shè)計的一組正向和反向引物。本發(fā)明所述的特異性擴增動物流感病毒或SIV亞型的引物，可通過常規(guī)的DNA合成方法合成而得(例如可以用商業(yè)化的DNA自動合成儀合成)。本發(fā)明的這些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進行標(biāo)記。引物集流感病毒通用型NP在自然界有多種天然變異形式。本發(fā)明提供的流感病毒通用型NP的引物對，可以是本領(lǐng)域熟知的針對所有動物流感病毒均保守的核酸序列。優(yōu)選的引物是其序列在野生型序列和多種變體序列中都存在的引物，例如當(dāng)引物對可以在90。/。以上動物流感病毒的反轉(zhuǎn)錄DNA模板中特異性擴增出產(chǎn)物，并且在其他病毒的反轉(zhuǎn)錄DNA模板中無法特異性擴增出產(chǎn)物，那么該引物對就是優(yōu)選的。優(yōu)選的引物對包括SEQIDNO:11和12。SIV亞型在自然界有多種天然變異形式。本發(fā)明提供的SIV血清亞型的引物對，可以是本領(lǐng)域熟知的針對血清亞型核酸保守區(qū)的核酸序列。優(yōu)選的引物是其序列在野生型序列和多種變體序列中都存在的引物，例如當(dāng)引物對可以在90%以上SIV某種血清亞型的反轉(zhuǎn)錄DNA模板中特異性擴增出產(chǎn)物，并且在其他亞型的反轉(zhuǎn)錄DNA模板中無法特異性擴增出產(chǎn)物，那么該引物對就是優(yōu)選的。本發(fā)明提供的SIV血凝素亞型HI的引物對，可以是本領(lǐng)域熟知的針對H3血清亞型核酸保守區(qū)的核酸序列，包括但不限于SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16。優(yōu)選的引物對包括SEQIDN0:1和2。本發(fā)明提供的SIV血凝素亞型H3的引物對，可以是本領(lǐng)域熟知的針對H3血清亞型核酸保守區(qū)的核酸序列。優(yōu)選的引物對包括SEQIDN0:3和4、或SEQIDNO:17和18。本發(fā)明提供的SIV血凝素亞型Nl的引物對，可以是本領(lǐng)域熟知的針對Nl血清亞型核酸保守區(qū)的核酸序列，包括但不限于包括但不限于SEQIDNO:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:25。優(yōu)選的引物對包括SEQIDN0:5和6、或SEQIDN0:25和6。本發(fā)明提供的SIV血凝素亞型N2的引物對，可以是本領(lǐng)域熟知的針對N2血清亞型核酸保守區(qū)的核酸序列，包括但不限于SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24。優(yōu)選的引物對包括SEQIDN0:7和8、或SEQIDN0:9和10。本發(fā)明提供的引物集中含有1-10組引物對；較佳地，含有1-5組；更佳地，含有2-3組。所述的引物對包括但不限于，流感病毒通用型NP的引物對、SIV亞型H1、H3、Nl、N2的引物對。本發(fā)明提供的引物集中可以含有。也可以含有流感病毒通用型NP的引物對和SIV亞型N1、N2的引物對。本發(fā)明提供的引物集中也可以只含有SIV亞型H1、H3的引物對、SIV亞型N1、N2的引物對或流感病毒通用型NP的引物對。本發(fā)明提供的引物集中的引物對應(yīng)能在同一體系中發(fā)揮作用，其分子量相差100bp或以上，而且各引物對之間應(yīng)沒有干擾。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的引物集中包括流感病毒通用型NP的引物對和SIV亞型H1/H3的引物對，所述的流感病毒通用型NP的引物對是SEQIDNO:ll和<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>本發(fā)明提供的試劑盒中可以含有引物集和說明書。還可以含有進行PCR擴增所需的本領(lǐng)域熟知的試劑，例如但不限于，提取RNA所需試劑、反轉(zhuǎn)錄酶、擴增緩沖液、DNA聚合酶、模板DNA等。本發(fā)明提供的試劑盒中所含有的引物集中，可以包括流感病毒通用型NP的引物對和流感病毒亞型的引物對。本發(fā)明提供的試劑盒中所含有的引物集中，也可以包括SIV亞型的引物對，例如Hl和H3，或Nl和N2。所述的Hl和H3的引物序列優(yōu)選為SEQIDN0:1和2/SEQIDNO:3和4，或SEQIDN0:1和2/SEQIDNO:17和18。所述的Nl和N2的引物序列優(yōu)選為SEQIDN0:5和6/SEQIDN0:7和8、SEQIDN0:5和6/SEQIDN0:9和10、SEQIDN0:25禾P6/SEQIDN0:7禾D8、或SEQIDN0:25和6/SEQIDN0:9和10。檢測方法本發(fā)明提供一種SIV分型的方法，所述的方法可用于診斷用途，也可用于非診斷用途，例如用于環(huán)境測評等。所述的方法構(gòu)建l-5個體系，較佳地為1-3個體系，更佳地為2個體系。如果是1個體系，在體系中加入流感病毒通用型NP的引物對和SIV亞型的引物對，通過PCR擴增，可以檢測出體系中是否含有相應(yīng)的SIV亞型，或是否含有流感病毒。如果是》2個體系，在一個體系中加入流感病毒通用型NP的引物對和SIV亞型的引物對，通過PCR擴增，可以檢測出該體系中是否含有相應(yīng)的SIV亞型，或是否含有流感病毒。如果檢測出該體系中沒有相應(yīng)的SIV亞型，但是含有流感病毒，則在另一個體系中加入與第一個體系中所加入的不同的SIV亞型的引物對，通過PCR擴增，檢測此該體系中是否含有相應(yīng)的SIV亞型。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，構(gòu)建2個多重RT-PCR體系，體系I用于同時鑒別體系中是否含有動物流感病毒以及是否為HI或H3亞型，且可以檢測到樣品中是否含有H1、H3亞型以外的其它亞型SIV。當(dāng)體系I確定含有流感病毒粒子時，采用體系II鑒別該流感病毒是Nl還是N2亞型。利用H1N1/H5N1、或H3N2/H9N2為模板驗證體系II對Nl、N2分型檢測的準(zhǔn)確性，均可擴增出預(yù)期條帶，即針對各種來源的N1、N2亞型均適用。建立的兩個多重RT-PCR體系均采用Oligod(T)做反轉(zhuǎn)錄引物，避免了由于加入特異性引物而引起的非特異性交叉反應(yīng)。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1、本發(fā)明提供的引物集和建立的檢測方法不僅可用于已知SIVHl/H3、Nl/N2陽性病毒血清亞型的鑒別，而且可檢測到樣品中是否存在其它亞型的流感病毒。2、本發(fā)明提供的方法可很好地檢測到樣品組織中含有的流感病毒粒子，并對H1/H3、Nl/N2亞型進行準(zhǔn)確分型。下面將結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。本發(fā)明的實驗操作程序A.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)A-l.按下列組成配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>A-2.按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>B.PCR擴增B-l.按下列組分配制反應(yīng)混合液.<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>混合上述成分，加入到A-2.反應(yīng)產(chǎn)物中，進行PCR擴增<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)果判定反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液5-10ul，2.0%瓊脂糖凝膠電泳，判定反應(yīng)結(jié)果。出現(xiàn)大小為445bp片段時，判定為SIV陽性，否則判定為陰性；出現(xiàn)大小為445bp/186bp片段時，判定為SIV血凝素Hl亞型陽性，否則判定SIV血凝素H1亞型陰性；出現(xiàn)大小為445bp/225bp擴增片段時，判定為SIV血凝素H3亞型陽性，否則判定為SIV血凝素H3亞型陰性。實施例l(1)SIV病毒核酸，藍耳病病毒(PRKSV)、圓環(huán)病毒(PCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、偽狂犬病毒(PRV)核酸分別購自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。載Genbank登錄的SIVNP基因、H1N1亞型、H3N2亞型的HA、NA基因，用Dnastar軟件進行類比分析，篩選決定不同亞型的保守區(qū)域，軟件PrimierPrimer3.0設(shè)計分型引物，引物購自上海申能博彩生物工程公司、上海生物工程公司，用DEPC&0稀釋引物工作濃度為20pmo1/^(3)RNA提取試劑Trizol，為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶、rTaq酶及Buffer等購自大連寶生物工程公司(TakaRaCo.，)(4)RNA提取按照說明書進行。(5)Hl/H3血凝素亞型、N1/N2神經(jīng)氨酸酶亞型單一RT-PCR體系建立(6)反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增體系、循環(huán)條件優(yōu)化(7)Hl/H3HA亞型、Nl/N2NA亞型多重PCR體系組合根據(jù)不同亞型擴增結(jié)果，選擇NP/H1/H3引物、Nl/N2引物進行配比組合，構(gòu)建多重PCR體系。按一定比例混合H1、H3亞型病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄，再以此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做模板，進行多重PCR反應(yīng)，體系中加入不同的引物組合。反應(yīng)完畢，取樣電泳，觀察結(jié)果。篩選擴增效果好的引物組合。(8)多重PCR體系特異性、靈敏性(9)組建多重PCR體系，組裝試劑盒。結(jié)果一、H1/H3分型檢測多重PCR體系建立根據(jù)單一PCR結(jié)果及擴增片段大小不同，將H1、H3分型引物進行配比組合成多重PCR體系表lH1/H3血凝素亞型多重PCR體系引物組合<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>對篩選到的引物組合，采用Hl/H3混合模板驗證，結(jié)果見圖l。結(jié)果表明，組合i、n檢測結(jié)果最佳，選擇作為試驗用體系。二、Nl、N2單一RT-PCR體系建立與引物篩選用SIVH1N1、AIVH5N1RNA做模板，驗證Nl引物對Nl基因擴增的特異性，見圖2。分別用H3N2、H9N2RNA為模板，驗證N2引物對對N2基因擴增的特異性，見圖3。三、神經(jīng)氨酸酶分型檢測多重PCR體系建立根據(jù)單一PCR結(jié)果及擴增片段大小不同，組合N1、N2亞型引物對(表2)，并對不同模板進行驗證，見圖4。表2N1/N2神經(jīng)氨酸酶亞型多重PCR體系引物組合<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>四、靈敏性分析測定提取的RNA濃度，經(jīng)系列濃度稀釋，檢測擴增效果，最低檢出限量為Hl為O.15ng，H3為0.2ng。即利用建立的多重PCR體系，檢測Hl、H3亞型模板限量為ng級。五、特異性分析分別以SIV、PRRSV、PRV、FMDV、PCV核酸為模板，采用建立的RT-PCR多重體系進行檢測，驗證引物組合的特異性。結(jié)果表明，建立的多重PCR體系只能檢測出SIV特異性核酸，而不能擴增出其它病毒核酸，表明多重PCR體系特異性好，可用于SIV鑒別診斷。六、模擬樣品檢測將臨床檢測為SIV陰性的豬糞便，混合病毒粒子，再提取RNA，進行多重RT-PCR擴增檢測，檢測結(jié)果與用病毒尿囊液檢測結(jié)果一致。結(jié)果表明，對臨床樣品檢測也是可行的。七、臨床樣品檢測直接以多重PCR檢測臨床具有呼吸道癥狀的豬肺10份，呼吸道棉試子75份，同時病料接種10日齡SPF雞胚，血凝/血凝抑制試驗鑒別病毒及其血清亞型，結(jié)果所有樣品多重RT-PCR檢測和雞胚分離后血凝/血凝抑制試驗鑒定均為陰性。結(jié)果表明，兩種方法對陰性樣品檢測符合率為100%。實施例2(1)SIV病毒核酸，藍耳病病毒(PRRSV)、圓環(huán)病毒(PCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、偽狂犬病毒(PRV)核酸分別購自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。(2)引物設(shè)計及合成下載Genbank登錄的SIVNP基因、H1N1亞型、H3N2亞型的HA、NA基因，用Dnastar軟件進行類比分析，篩選決定不同亞型的保守區(qū)域，軟件PrimierPrimer3'0設(shè)計分型引物，引物購自上海申能博彩生物工程公司、上海生物工程公司，用DEPC1120稀釋引物工作濃度為20pmol/iL(3)RNA提取試劑Trizol，為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶、rTaq酶及Buffer等購自大連寶生物工程公司(TakaRaCo.,)(4)RNA提取按照說明書進行。(5)Hl/H3血凝素亞型、Nl/N2神經(jīng)氨酸酶亞型單一RT-PCR體系建立(6)反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增體系、循環(huán)條件優(yōu)化(7)Hl/H3HA亞型、Nl/N2NA亞型多重PCR體系組合根據(jù)不同亞型19擴增結(jié)果，選擇NP/H1/H3引物、Nl/N2引物進行配比組合，構(gòu)建多重PCR體系。按一定比例混合H1、H3亞型病毒咖A，反轉(zhuǎn)錄，再以此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做模板，進行多重PCR反應(yīng)，體系中加入不同的引物組合。反應(yīng)完畢，取樣電泳，觀察結(jié)果。篩選擴增效果好的引物組合。(8)多重PCR體系特異性、靈敏性(9)組建多重PCR體系，組裝試劑盒。采用Hl/H3引物組合I、II對各種亞型模板檢測結(jié)果表3H1/H3血凝素亞型多重PCR體系引物組合<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>H5N1、H9N2亞型模板，僅出現(xiàn)流感病毒NP基因條帶，而沒有出現(xiàn)H1和/或H3亞型條帶。(附圖6)利用Nl/N2引物組合I、II、III、VI對各種亞型模板檢測(H1N1、H3N2、H5N1、H9N2)則均可檢測出相應(yīng)的Nl和/或N2亞型。(附圖5)表4Nl/N2神經(jīng)氨酸酶亞型多重PCR體系引物組合<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>結(jié)果表明，上述引物組合均可有效擴增樣品中含有的動物流感病毒N1和/或N2神經(jīng)氨酸酶亞型。實施例3(1)SIV病毒核酸，藍耳病病毒(PRRSV)、圓環(huán)病毒(PCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、偽狂犬病毒(PRV)核酸分別購自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。(2)引物設(shè)計及合成下載Genbank登錄的SIVNP基因、H1N1亞型、H3N2亞型的HA、NA基因，用Dnastar軟件進行類比分析，篩選決定不同亞型的保守區(qū)域，軟件PrimierPrimer3'0設(shè)計分型引物，引物購自上海申能博彩生物工程公司、上海生物工程公司，用DEPCH20稀釋引物工作濃度為20praol/氐(3)RNA提取試劑Trizol，為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶、rTaq酶及Buffer等購自大連寶生物工程公司(TakaRaCo.，)(4)RNA提取按照說明書進行。(5)Hl/H3血凝素亞型、N1/N2神經(jīng)氨酸酶亞型單一RT-PCR體系建立(6)反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增體系、循環(huán)條件優(yōu)化(7)Hl/H3HA亞型、Nl/N2NA亞型多重PCR體系組合根據(jù)不同亞型擴增結(jié)果，選擇NP/N1/N2引物、Hl/H3引物進行配比組合，構(gòu)建多重PCR體系。按一定比例混合N1、N2亞型病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄，再以此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做模板，進行多重PCR反應(yīng)，體系中加入不同的引物組合。反應(yīng)完畢，取樣電泳，觀察結(jié)果。篩選擴增效果好的引物組合。(8)多重PCR體系特異性、靈敏性(9)組建多重PCR體系，組裝試劑盒。采用Nl/N2引物組合I、II、III、VI對各種亞型模板檢測結(jié)果表5Nl/N2神經(jīng)氨酸酶亞型多重PCR體系引物組合(含通用引物NP引物)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>利用N1/N2/NP引物組合I、II、III、VI對各種亞型模板檢測(H1N1、H3N2)均可檢測出相應(yīng)的Nl禾卩/或N2亞型條帶及動物流感病毒NP基因條帶。(附圖7)利用H1/H3引物組合I、II對各種亞型模板檢測(H1N1、H3N2)可檢測出相應(yīng)的Hl和/或H3亞型目的條帶。(附圖8)表6H1/H3血凝素亞型多重PCR體系引物組合(無通用引物NP)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)果表明，上述引物組合均可有效擴增樣品中含有的動物流感病毒H1和/或H3血凝素亞型。實施例4試劑盒為了有利于本方法的商品化，特制備方便使用的試劑盒，盒中含有下列試劑和材料1.引物溶液(20umol/L):SEQIDNO:1—262.使用說明書(一份)3.反轉(zhuǎn)錄酶AMV(5U/ul)4.RNA酶抑制劑RNaseInhibitor(5U/ul)5.OligodTPrimer(2.5pmol/ul)6.RNaseFreedH207.TaqDNApolymerase(5U/ul)8.10XRTBuffer9.5XPCRBuffer10.DNTPMixture(各lOmM)11.MgCh(25mM)12.PrimerMixture(20pmol/ul)在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110〉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>—種檢測豬流感病毒及血清亞型的引物集及其試劑盒<130〉072290<160>26<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>1ttatgctggagcaaacagctt21<210〉2<211〉21<212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400〉2acataggcatctgcattttgg21<210〉3<211>25<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>3aaacggaacgctagtgaaaacaatc25<210〉4<211>25<212>腿<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物〈400〉4tccggcacatcataagggtaacagt<210〉5<211〉24<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>5actacgaggaatgctcctgttatc<210〉6<211〉24〈212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400〉6gtgcttttagttctccctatccaa<210〉7<211〉22<212〉DNA<213>人工序列<220><221〉misc_feature<223〉引物<400〉7ttgggtgacgagagaaccttat〈210〉8<211〉22<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400>8gaaatggaacacccaactcatt<210〉9說明書第23/27頁25242422<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><210〉14<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>14tttaggtctggctgctatttctg23<210><211〉<212〉<213><220〉<221〉<223〉1524腿人工序列misc—feature引物<400〉15aggaatatcccctctattcaatcc24<210〉16<211〉24<212〉腿<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉16catggaaatctagagtcctttcgt24<210〉17<211〉22<212>DNA<213〉人工序列<400〉17gcctgtcccagatatgttaagc22<210〉18<211>22<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉18gaggtcctgaattctcccttct22<210〉19<211>26<212〉DNA<<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><400〉23tagacagcattggttcatggtc22<210〉〈211〉<212〉<213><220><221〉<223〉2422DNA人工序列misc—feature引物<400>24actggcctattagagcctttcc22<210〉25<211〉24<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>25gagttgaatgcccctaattatcac24<210〉<211〉〈212〉<213〉<220〉<221>〈223〉2622DNA人工序列misc—feature引物<400〉26aaatggaacacccaactcattc2權(quán)利要求1.一種用于同一反應(yīng)體系中進行PCR擴增的引物集，其特征在于，它包括(1)流感病毒通用型NP基因的引物對；和(2)豬流感病毒亞型的引物對。2.如權(quán)利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的豬流感病毒亞型包括血凝素亞型、或神經(jīng)氨酸酶亞型。3.如權(quán)利要求2所述的引物集，其特征在于，所述的血凝素亞型包括H1、和/或H3;所述的神經(jīng)氨酸酶亞型包括N1、和/或N2。4.如權(quán)利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的NP的引物對是SEQIDNO:11和12。5.如權(quán)利要求3所述的引物集，其特征在于，所述的H1、H3的引物對選自SEQIDN0:1和2、SEQIDN0:3禾口4、或SEQIDNO:17和18。6.如權(quán)利要求3所述的引物集，其特征在于，所述的N1、N2的引物對選自SEQIDN0:5和6、SEQIDN0:25和6、或SEQIDNO:7和8、或SEQIDN0:9和10。7.—種用于同一反應(yīng)體系中進行PCR擴增的引物集，其特征在于，它包括豬流感病毒亞型血凝素亞型HI和H3的引物對；所述的HI和H3的引物對選自SEQIDNO:l—4或SEQIDNO:1，2，17，和18。8.—種試劑盒，其特征在于，它包括①如權(quán)利要求1所述的引物集；和②說明書。9.一種對豬流感病毒進行分型的方法，其特征在于，它包括步驟(a)在一個體系中加入如權(quán)利要求l所述的引物集，進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶檢驗該體系中是否含有一種亞型的豬流感病毒；(b)如果電泳結(jié)果顯示出相應(yīng)的條帶，則表示該體系中存在該種亞型的豬流感病毒，從而得到檢測結(jié)果；如果電泳結(jié)果沒有顯示出相應(yīng)的條帶，表示該體系中不存在上述的這種亞型的豬流感病毒，同時根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶檢驗該體系中是否含有流感病毒；(c)如果電泳結(jié)果顯示出流感病毒條帶，則在另一個體系中加入豬流感病毒亞型的引物對，進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳條帶檢驗該體系中是否含有另一種亞型的豬流感病毒；(d)如果電泳結(jié)果顯示出相應(yīng)的條帶，則表示該體系中存在所述的NA亞型豬流感病毒；如果電泳條帶沒有顯示出相應(yīng)的豬流感病毒亞型條帶，表示該體系中不存在所述亞型豬流感病毒。10.如權(quán)利要求9所述的分型方法，其特征在于，所述的豬流感病毒亞型包括血凝素亞型、和神經(jīng)氨酸酶亞型。全文摘要本發(fā)明公開了一種引物集，它包括流感病毒通用型NP基因的引物對和SIV亞型的引物對。所述的引物集可制得一種RT-PCR檢測試劑盒，所述的試劑盒可用于豬流感病毒(SIV)H1/H3、N1/N2血清亞型的鑒別，而且可檢測到樣品中是否存在除H1&H3和N1&N2以外的其它亞型的流感病毒。文檔編號C12Q1/68GK101323882SQ20071004198公開日2008年12月17日申請日期2007年6月14日優(yōu)先權(quán)日2007年6月14日發(fā)明者劉惠莉,周宗清,楊秋峰,潔潘,邢繼蘭,饒柏忠申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院