一種檢測(cè)a型豬流感病毒的rt-lamp試劑盒及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬流感病毒的引物以及試劑盒，尤其涉及用于檢測(cè)A型豬流 感病毒的通用型RT-LAMP引物組、以及檢測(cè)A型豬流感病毒的通用型RT-LAMP試劑盒。本 發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒（Influenzavirus)屬于正粘病毒科流感病毒屬。流感病毒基因組是由 8條負(fù)鏈RNA節(jié)段組成，編碼11或12個(gè)蛋白。豬流行性感冒（Swineinfluenza，SI)是由 豬流感病毒（Swineinfluenzavirus，SIV)引起的豬的一種急性、傳染性呼吸器官疾病。 其特征為突發(fā)，咳嗽，呼吸困難，發(fā)熱及迅速轉(zhuǎn)歸。該病流行傳播迅速，導(dǎo)致豬群生產(chǎn)性能嚴(yán) 重下降并伴隨死亡。目前，SI在世界范圍內(nèi)廣泛存在，主要流行亞型為H1NUH1N2和H3N2。 豬流感的另一危害是其與人流感密切相關(guān)。2009年4月引起全球范圍爆發(fā)的甲型H1N1流 感（PandemicH1N1/2009,ρΗΙΝΙ/2009)，對(duì)人類的生命和財(cái)產(chǎn)安全都造成了巨大的損失。研 究表明該病毒8個(gè)基因片段均來(lái)自于SIV，又一次地突出了豬作為中間宿主及其在流感病 毒跨種間傳播中的重要作用。
[0003] 2009年以前，我國(guó)豬群中主要流行經(jīng)典型（Classical，CS)HlNl、（Eurasian avian-like,EA)H1N1 和北美三重組（Triplereassortant，TR)HlN2,很少發(fā)生基因重組。 2009年甲型H1N1流感大流行毒株的在短時(shí)間內(nèi)造成全球人的感染，繼而又從人傳播到包 括豬在內(nèi)的其他哺乳動(dòng)物，該病毒目前已經(jīng)在北美、歐洲及亞洲等多個(gè)國(guó)家的豬群中分離 至丨J，并且在一些國(guó)家已經(jīng)分離到2009甲型H1N1流感病毒與傳統(tǒng)豬流感病毒的基因重組病 毒。我國(guó)于2009年11月份從豬群中監(jiān)測(cè)到該新型病毒的存在，監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示ρΗΙΝΙ/2009 流感病毒在豬群中持續(xù)存在，和EA-H1N1以及TR-H1N2以及人源H3N2共同流行于我國(guó)豬 群當(dāng)中，產(chǎn)生了多基因型的重組病毒，并且該類病毒對(duì)豬表現(xiàn)出不同程度致病性，可導(dǎo)致豬 的生產(chǎn)性能下降。豬在流感病毒變異與種間傳播過(guò)程中具有重要的公共衛(wèi)生意義，禽流感 病毒和人流感病毒均可感染豬，多種來(lái)源的流感病毒在豬體內(nèi)可發(fā)生基因片段交換，產(chǎn)生 新的病毒可能跨越種間屏障傳播到人群當(dāng)中。在北美、歐洲和亞洲等地區(qū)，近年來(lái)SIV感 染人的事件多有發(fā)生，對(duì)人類健康和生命造成巨大的威脅。ρΗΙΝΙ/2009類病毒對(duì)豬群的感 染改變了我國(guó)豬流感流行病學(xué)狀況，產(chǎn)生了多基因型的SIV，形成多基因型SIV共流行的 態(tài)勢(shì)。從這一角度講，一個(gè)有效的診斷方法必須能對(duì)當(dāng)前所有流行的SIV(包括CS-H1N1、 EA-H1N1、pHlNl/2009、TR-H1N2和H3N2)檢出，才能滿足準(zhǔn)確診斷的需要。
[0004] 常規(guī)的SIV診斷方法有：病毒分離、血凝（HA)及血凝抑制（HI)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸 附試驗(yàn)（ELISA)、免疫組織化學(xué)（IHC)等，隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，RT-PCR以及熒光定量 PCR等方法也應(yīng)用到SIV的檢測(cè)工作當(dāng)中。然而，有些方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度不高、特 異性不強(qiáng)的問(wèn)題，有些方法需要特殊的儀器設(shè)備，不適合養(yǎng)殖場(chǎng)和動(dòng)物疾病診斷機(jī)構(gòu)臨床 樣本的檢測(cè)。如今，隨著對(duì)動(dòng)物疾病快速診斷的需要的增加，迫切需要適合養(yǎng)殖場(chǎng)、動(dòng)物疾 病診斷機(jī)構(gòu)和邊境口岸的簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)方法及試劑。
[0005] 反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Reversetranscriptionloop-mediatedisothermal amplification,RT-LAMP)技術(shù)是一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其特點(diǎn)是針對(duì)祀基因的6~8個(gè) 區(qū)域設(shè)計(jì)4~6條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（60-65Γ)保溫30~ 60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。產(chǎn)物檢測(cè)便捷，LAMP在合成DNA的同時(shí)產(chǎn)生大量的焦磷 酸根離子，它們能與鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，可根據(jù)反應(yīng)體系中是否形成白 色沉淀來(lái)定性判斷LAMP反應(yīng)結(jié)果。與其他的檢測(cè)技術(shù)相比，具有方便快捷、特異敏感、穩(wěn)定 性強(qiáng)、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀的特點(diǎn)。與常規(guī)RT-PCR相比，該方法不需要模 板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程，反應(yīng)速度更快。該技術(shù)在靈敏度、特異性和 檢測(cè)時(shí)間等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于RT-PCR技術(shù)；由于不依賴任何專門(mén)的儀器設(shè)備可實(shí)現(xiàn) 現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量RT-PCR，目前這一技術(shù)已經(jīng)被用于多種病 原微生物的檢測(cè)。
[0006] 流感病毒第7基因節(jié)段編碼包膜蛋白，包括基質(zhì)蛋白（Ml)和膜離子通道蛋白 (M2)。相對(duì)于其他基因片段，A型流感病毒的Μ基因編碼區(qū)很少出現(xiàn)變異，非常保守，被認(rèn) 為是具有交叉免疫保護(hù)性的結(jié)構(gòu)蛋白，所以通常作為流感通用型疫苗研制以及診斷方法的 建立的目標(biāo)基因。
[0007] 自 2009 年以來(lái)，CS-H1N1、ΕΑ-Η1Ν1、pHlNl/2009、TR-H1N2 和Η3Ν2 亞型SIV共 流行于我國(guó)豬群當(dāng)中，目前未見(jiàn)有能根據(jù)當(dāng)前流行病學(xué)情況研制的檢測(cè)SIV的LAMP診斷 試劑盒，因此迫切需要根據(jù)我國(guó)豬流感分子流行病學(xué)發(fā)展?fàn)顩r，建立快速、敏感和特異的 RT-LAMP診斷方法并組成試劑盒，以滿足各級(jí)動(dòng)物疾病診斷實(shí)驗(yàn)室和相關(guān)機(jī)構(gòu)快速檢測(cè) SIV病原的需要。
[0008] 本發(fā)明以我國(guó)豬流感分子流行病學(xué)研究為基礎(chǔ)，以Μ基因?yàn)槟繕?biāo)基因，設(shè)計(jì) RT-LAMP引物組，以此為技術(shù)核心，提供一種可檢測(cè)包括CS-H1N1、ΕΑ-Η1Ν1、ρΗΙΝΙ/2009、 TR-H1N2 和H3N2 亞型SIV的RT-LAMP試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、敏感性高、結(jié)果判定直觀的檢測(cè)A 型豬流感病毒的RT-LAMP試劑盒及其用途。
[0010] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0011] ⑴從GenBank檢索獲得自2004年1月1日至2014年6月30日所有公開(kāi)發(fā)布的 我國(guó)A型豬流感病毒的Μ基因序列，通過(guò)DNAstar基因序列分析軟件進(jìn)行同源性分析。獲 得A型豬流感病毒Μ基因的特異性的保守靶序列；
[0012] (2)根據(jù)步驟⑴所得的保守靶DNA序列，設(shè)計(jì)得到SEQIDΝ0 :1~4所示的 RT-LAMP引物；
[0013] 本發(fā)明設(shè)計(jì)得到的用于檢測(cè)A型豬流感病毒的RT-LAMP引物組由一對(duì)外引物和一 對(duì)內(nèi)引物組成，其中，所述外引物的序列分別為SEQIDN0:1和SEQIDN0:2所示，所述內(nèi) 引物的序列分別為SEQIDN0 :3和SEQIDN0 :4所示。
[0014] (3)根據(jù)所得的RT-LAMP引物配制LAMP反應(yīng)液，構(gòu)成檢測(cè)體系，進(jìn)而組裝成一種用 于檢測(cè)A型豬流感病毒的RT-LAMP試劑盒。
[0015] 本發(fā)明的一種用于檢測(cè)A型豬流感病毒的RT-LAMP試劑盒，其包含以下組分：
[0016] (1)LAMP反應(yīng)液：
[0017]由以下成分組成：10 X ThermoPol緩沖液2· 5μL;25mM MgS046μL;5M甜菜堿 5μL;10π?Μ(1Ν?'Ρ2·5μL;5μΜ3|?|^Ρ31μL;5μΜ3|@Β31μL;40μΜ3|@ΡΙΡ1μL; 40μM引物BIP 1μL;8U/μLBst酶1μL;5U/μLAMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL以及滅菌ddH20 1μL；
[0018] 其中，引物F3和Β3為外引物，其序列分別為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示； 引物FIP和BIP為內(nèi)引物，其序列分別為SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；
[0019] (2)陽(yáng)性模板：
[0020] A型豬流感病毒RNA;
[0021] (3)顯色液：SYBRGreen I〇
[0022] 4、如權(quán)利要求3所述的RT-LAMP試劑盒，其特征在于用于檢測(cè)Α型豬流感病毒，按 照以下步驟進(jìn)行：
[0023] (1)配制23μL上述LAMP反應(yīng)液，按常規(guī)方法提取待測(cè)樣品中的核酸；
[0024] (2)取2μL核酸提取液加到上述已配制好的LAMP反應(yīng)液中，使終反應(yīng)體積為 25μL；
[0025] (3) 8000rpm，瞬時(shí)離心30s以混勻反應(yīng)液，置63°C恒溫60min進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增；
[0026] (4) 80°C10min滅活酶的活性；
[0027] (5)結(jié)果判定可采取兩種方法：
[0028] (a)8000rpm離心2min，根據(jù)管底部白色沉淀有無(wú)，進(jìn)行結(jié)果判定：如有白色沉淀， 說(shuō)明待測(cè)樣品中存在A型豬流感病毒；如無(wú)白色沉淀，說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在A型豬流感病 毒；
[0029] (b)加入顯色液1μL，震蕩混勻后，反應(yīng)液如變成綠色說(shuō)明待測(cè)樣品中存在A型豬 流感病毒，如為桔黃色說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在A型豬流感病毒。
[0030] 相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有下列突出的優(yōu)點(diǎn)：
[0031] (1)高靈敏度：LAMP其所需擴(kuò)增模板僅需要0·lpg核酸（圖1)。
[0032] (2)高特異性：4條引物對(duì)靶序列6個(gè)特異區(qū)域的識(shí)別保證了LAMP擴(kuò)增的高度特 異性，只對(duì)A型豬流感病毒進(jìn)行擴(kuò)增（圖2)。
[0033] (3)操作簡(jiǎn)單：反應(yīng)體系建立后，只要將檢測(cè)樣品（靶核酸）和試劑一起放入63°C 恒溫水浴鍋60min，就可以判斷擴(kuò)增與否。
[0034] (4)結(jié)果判定簡(jiǎn)便：反應(yīng)完成后觀察反應(yīng)管中是否出現(xiàn)混濁以判定擴(kuò)增結(jié)果，為 方便觀察，可采取兩種方法：（1)SOOOrpm離心2min，根據(jù)管底部白色沉淀有無(wú)，進(jìn)行結(jié)果判 定：如有白色沉淀，說(shuō)明待測(cè)樣品中存在A型豬流感病毒；如無(wú)白色沉淀，說(shuō)明待測(cè)樣品中 不存在A型豬流感病毒。（2)加入顯色液1μL，震蕩混勻后，反應(yīng)液如變成綠色說(shuō)明待測(cè)樣 品中存在Α型豬流感病毒，如為桔黃色說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在Α型豬流感病毒。
[0035] 本發(fā)明的檢測(cè)體系可以在等溫條件下，快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測(cè)到 包括03-!1謂144-!1謂1，？!1謂1/2009、了1?-!1謂2和!13吧亞型的豬流感病毒，不需要復(fù)雜儀器， 為疫病檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，能較好滿足養(yǎng)殖場(chǎng)、動(dòng)物疾病診斷服務(wù)部門(mén)、出入境檢疫 部門(mén)等的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需要，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效 益。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1為本發(fā)明的A型豬