專利名稱：一種高效篩選單酶切基因表達(dá)載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及基因重組技術(shù)，特別涉及一種表達(dá)載體的構(gòu)建和篩選方法，具體來說是一種高效篩選單酶切基因表達(dá)載體的方法。

背景技術(shù)：
基因重組技術(shù)是通過把目的基因重組至質(zhì)粒或病毒等載體，轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞，在細(xì)胞中表達(dá)目的基因和/或目的基因翻譯的蛋白質(zhì)的一種方法，該技術(shù)目前是研究基因或蛋白的常用方法之一。目前通過基因重組構(gòu)建質(zhì)?；虿《据d體時一般選用雙酶切方法，該方法具有能定向克隆的優(yōu)點，載體及插入片段在雙酶切及連接后不需鑒定插入片段的方向性；但花費較大，選用的兩種限制型內(nèi)切酶的酶切效率可能相差較大，技術(shù)要求較高，且要在多克隆位點插入多個片段時可能找不到合適的酶切位點。單酶切方法僅用一種限制型內(nèi)切酶，花費少，對技術(shù)的要求較低，在多克隆位點插入多個片段時可供選擇的酶切位點相對雙酶切明顯要多；但是單酶切的缺點是不能定向克隆，連接后需測序鑒定是否存在插入片段及插入片段的方向是否正確，構(gòu)建正確重組載體的概率小于50％，因此，測序的樣本量至少是雙酶切法的2倍，測序費用比雙酶切法明顯要多。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效篩選單酶切基因表達(dá)載體的方法，所述的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中的雙酶切方法構(gòu)建重組載體選用的兩種限制型內(nèi)切酶的酶切效率可能相差較大，技術(shù)要求較高，且在多次克隆時可能找不到合適的酶切位點和花費高的技術(shù)問題，同時要解決單酶切方法構(gòu)建重組載體不能定向克隆，構(gòu)建正確的重組載體的概率低和測序花費高的技術(shù)問題。
本發(fā)明一種高效篩選單酶切基因表達(dá)載體的方法，所述的方法包括一個選擇合適載體和限制性內(nèi)切酶的過程，還包括一個利用限制性內(nèi)切酶對載體進(jìn)行酶切的過程，還包括一個選擇插入基因片段的過程，還包括一個利用上述的限制性內(nèi)切酶對所述的基因片段進(jìn)行單酶切的過程，將單酶切酶切后的載體和單酶切酶切后的基因片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)理論上連接正確的重組質(zhì)粒的基因序列為模板，以插入基因片段的載體的上序列設(shè)計上游引物，根據(jù)插入基因片段序列設(shè)計下游引物，進(jìn)行菌落PCR，然后進(jìn)行電泳，在菌落PCR產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)的條帶為正確構(gòu)建的重組載體的菌落。
本發(fā)明的工作原理是單酶切后載體及待插入片段均在兩端形成黏性末端，連接后會有以下3種情況 A.載體與插入片段連接且方向正確； B.載體與插入片段連接但方向不正確； C.載體自身連接； 以“載體與插入片段連接且方向正確(A情況)”的重組載體序列為模板，根據(jù)載體上的序列設(shè)計上游引物，根據(jù)插入片段序列設(shè)計下游引物；在菌落PCR時，正確構(gòu)建的重組載體(A情況)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌由于存在DNA模板及相應(yīng)的上、下游引物，因此PCR能擴(kuò)增，電泳時可見條帶。而“載體與插入片段連接但方向不正確”(即B情況)轉(zhuǎn)化的菌落在PCR時由于插入片段的方向不正確，原先的下游引物此時相當(dāng)于上游引物，即體系中缺失了下游引物，因此不能擴(kuò)增出條帶。而“載體自身連接”(即C情況)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在PCR時沒有下游引物結(jié)合的序列，因此也不能擴(kuò)增出條帶。因此，只要是PCR能擴(kuò)增出條帶的菌落就是轉(zhuǎn)化有正確構(gòu)建重組載體的菌落。
本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步性是顯而易見的。本發(fā)明充分利用單酶切方法在多克隆位點插入多個片段時可供選擇的酶切位點相對雙酶切明顯要多的特點構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后使用特定設(shè)計的引物，根據(jù)菌落PCR的結(jié)果，直接篩選出正確構(gòu)建的重組載體，從而明顯減少測序費用，技術(shù)簡單，容易推廣使用，而且利用單酶切方法在限制型內(nèi)切酶上花費也較少。由于采用雙酶切法構(gòu)建重組載體，往往也需菌落PCR鑒定，因此本發(fā)明并不會增加額外的費用，解決了采用單酶切方法篩選正確構(gòu)建重組載體時測序費用比雙酶切法明顯要多的問題。即使雙酶切法構(gòu)建載體時不用行菌落鑒定，本發(fā)明的總費用也僅相當(dāng)于1-2次的測序費用(也相當(dāng)于1份限制型內(nèi)切酶的費用)，較不用該方法時的花費明顯減少。



圖1是本發(fā)明采用限制性內(nèi)切酶對載體進(jìn)行單酶切后的示意圖。
圖2是本發(fā)明采用限制性內(nèi)切酶對待插入片段進(jìn)行單酶切的示意圖。
圖3是本發(fā)明采用限制性內(nèi)切酶對載體進(jìn)行單酶切后形成黏性末端的示意圖。
圖4是本發(fā)明采用限制性內(nèi)切酶對待插入片段進(jìn)行單酶切后形成黏性末端的示意圖。
圖5是本發(fā)明采用限制性內(nèi)切酶對載體與插入片段進(jìn)行酶切后連接且方向正確的示意圖。
圖6是本發(fā)明采用限制性內(nèi)切酶對載體與插入片段進(jìn)行酶切后連接但方向不正確的示意圖。
圖7是本發(fā)明采用限制性內(nèi)切酶對載體與插入片段進(jìn)行酶切后載體自身連接的示意圖。
圖8是本發(fā)明以正確構(gòu)建的重組載體為模板，設(shè)計引物的示意圖。
圖9是本發(fā)明采用的pTracer-CMV/Bsd真核表達(dá)質(zhì)粒示意圖。
圖10是本發(fā)明的CHMP5-pTracer質(zhì)粒構(gòu)建正確的原理示意圖。
圖11是本發(fā)明的CHMP5-pTracer質(zhì)粒構(gòu)建不正確的原理示意圖。
圖12是本發(fā)明的菌落PCR電泳圖，M為100bp Marker；1-13為各菌落PCR結(jié)果。
圖13是本發(fā)明的pTracer-CMV/Bsd質(zhì)粒上Bst XI單酶切的位點前后的序列。
圖14是本發(fā)明的CHMP5-pTracer重組質(zhì)粒載體測序結(jié)果圖。

具體實施例方式 本發(fā)明的單酶切法構(gòu)建重組載體及轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌的實驗方法均為常規(guī)使用的方法，參考《分子克隆》等分子生物學(xué)書籍。
實施例1 本發(fā)明首先采用限制性內(nèi)切酶對載體進(jìn)行單酶切(如圖1所示)，然后再采用限制性內(nèi)切酶對待插入片段進(jìn)行單酶切(如圖2所示)，單酶切后載體在兩端形成黏性末端(如圖3所示)；及待插入片段均在兩端形成黏性末端(如圖4所示)；連接后會有以下3種情況 A.載體與插入片段連接且方向正確(如圖5所示)； B.載體與插入片段連接但方向不正確(如圖6所示)； C.載體自身連接(如圖7所示)；即 以“載體與插入片段連接且方向正確”(即A情況)的重組載體序列為模板，使用引物設(shè)計軟件如primer 5或“primer 2”等網(wǎng)上免費軟件，根據(jù)載體上的序列設(shè)計上游引物，根據(jù)插入方向正確的片段序列設(shè)計下游引物，(如圖8所示)，在菌落PCR時，正確構(gòu)建的重組載體(A情況)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌由于存在DNA模板及相應(yīng)的上、下游引物，因此PCR能擴(kuò)增，電泳時可見條帶。而“載體與插入片段連接但方向不正確”(即B情況)轉(zhuǎn)化的菌落在PCR時由于插入片段的方向不正確，原先的下游引物此時相當(dāng)于上游引物，即體系中缺失了下游引物，因此不能擴(kuò)增出條帶。而“載體自身連接”(即C情況)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在PCR時沒有下游引物結(jié)合的序列，因此也不能擴(kuò)增出條帶。因此，只要是PCR能擴(kuò)增出條帶的菌落就是轉(zhuǎn)化有正確構(gòu)建重組載體的菌落。
實施例2 本發(fā)明采用單酶切法構(gòu)建重組載體時以“載體與插入片段連接且方向正確”的重組載體序列為模板，使用引物設(shè)計軟件如primer 5或“primer2”等網(wǎng)上免費軟件，根據(jù)載體上的序列設(shè)計上游引物，根據(jù)插入方向正確的片段序列設(shè)計下游引物，行菌落PCR，電泳有DNA條帶的即為構(gòu)建正確的重組載體。
本實施例用單酶切法構(gòu)建CHMP5-pTracer重組質(zhì)粒載體。
2.CHMP5-pTracer重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒載體pTracer-CMV/Bsd購自Ivitrogen公司，如圖9所示，其有限制性內(nèi)切酶BstXI酶切位點。
2.1高保真PCRCHMP5(Genbank編號NM_016410)，使用PrimerPremier 5設(shè)計引物，并在上、下游引物5′端加上BstX I的酶切位點及保護(hù)性堿基(下面小寫字部分)，上游引物為5′tag cca gtg tgg tgg TGC TCAAGA TGAACC GAC TCT 3′，下游引物為5′tgt cca ctg tgc tgg CGA AGAAAG CAT TTC CCA AGC 3′，按照設(shè)計，PCR后可得到一段編碼完整CHMP5蛋白的DNA序列，PCR產(chǎn)物長851bp。使用TAKARA公司的高保真Taq酶(LATaq)，按說明書行PCR，PCR反應(yīng)條件為94℃4min；94℃45s，55℃1min，72℃45s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳。瓊脂糖凝膠電泳后使用北京鼎國生物公司的DNA快速純化/回收試劑盒回收、純化851bp的PCR產(chǎn)物，操作步驟如下紫外燈下切取含DNA片段的瓊脂糖(100mg-300mg)并移入1.5ml EP管中，用移液器吸頭搗碎后按切取重量溶液A的體積比為1∶3的比例加入溶液A。65℃水浴5-10min，振蕩2次，待膠完全融化后置室溫，加入15μl溶液B，充分混勻后轉(zhuǎn)入離心柱中，靜置2min，10000rpm 30s，棄下清。加500μl溶液C于離心柱中，10000rpm 30s，棄下清。重復(fù)此步驟一次。12000rpm再次離心1min，棄下清。將離心柱裝入新的離心管中，敞開離心管管口室溫靜置10min。加入20μl 50℃水浴預(yù)熱的溶液D，靜置2min，13000rpm離心1min，管底液體即為回收的DNA。
2.2Bst XI限制性內(nèi)切酶單酶切使用MBI公司的限制性內(nèi)切酶Bst XI分別酶切PCR產(chǎn)物及pTracer-CMV/Bsd質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳后回收、純化酶切產(chǎn)物。酶切后的PCR產(chǎn)物及pTracer-CMV/Bsd質(zhì)粒使用T4DNA連接酶(MBI公司)相連接，對照質(zhì)粒為pTracer-CMV/Bsd空質(zhì)粒。Bst XI酶切體系為40μl體系10×buffer O+4μl，Bst XI 2μl，pTracer-CMV/Bsd質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物4μl，ddH2O 30μl；55℃2h，4℃10min進(jìn)行酶切。T4連接酶反應(yīng)體系為10μl，包括酶切后的pTracer-CMV/Bsd質(zhì)粒3μl，酶切后的PCR產(chǎn)物3μl，10×T4 Ligase Buffer 1μl，T4連接酶1μl，ddH2O2μl，混勻后，置22℃孵育16h。
2.3感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及陽性菌落的篩選取新鮮TOPO 10感受態(tài)菌200μl，加2μl連接物，混勻，冰上放置30min。42℃熱休克30s，冰上放置2min。加入250μl S.O.C培養(yǎng)基，37℃200rpm振搖1h。取40μl涂抗氨芐青霉素瓊脂平板，37℃過夜。
2.4菌落PCR篩選挑選單個菌落，置入5ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃200rpm振搖培養(yǎng)過夜后取2μl菌液行菌落PCR。由于我們采用的是Bst XI單酶切，酶切后pTracer-CMV/Bsd質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物在連接時方向可正可負(fù)，篩選出連接正確的重組質(zhì)粒較困難，因此，在設(shè)計菌落PCR的引物時我們以連接正確的重組質(zhì)粒的序列為模板，使用質(zhì)粒上的T7測序引物位點作為上游引物位點，并在CHMP5插入部分設(shè)計下游引物。如果CHMP5片段插入方向正確(如圖10所示)，可擴(kuò)增出長度約210bp的PCR產(chǎn)物，如果插入方向錯誤，則不能擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物(如圖11所示)。T7測序引物為5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3′，CHMP5下游引物為5′GTG CCA ATG CAG TCA GTC A 3′。PCR反應(yīng)條件為94℃4min；94℃45s，58℃45s，72℃45s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳(如圖12所示)，在菌落PCR產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)長度約210bp條帶的菌落中應(yīng)該轉(zhuǎn)有正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒。
圖10表明CHMP5片段正確插入質(zhì)粒時，針對質(zhì)粒上T7測序位點的上游引物與CHMP5的下游引物在行PCR時能擴(kuò)出DNA條帶；圖11表明CHMP5片段反向插入質(zhì)粒時，設(shè)計的上、下游引物此時相當(dāng)于兩條上游引物，由于缺少下游引物，因此不能擴(kuò)出DNA條帶。同理，當(dāng)載體自身連接時(沒有圖示)，由于沒有與設(shè)計的下游引物結(jié)合的DNA模板，因此也不能擴(kuò)增出條帶。由圖12可知，菌落7、9和13的PCR產(chǎn)物電泳后可見長度在200-300bp的條帶，與我們設(shè)計的PCR產(chǎn)物長度為210bp相符，說明在這三個菌落中有正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒。
2.5測序鑒定取菌落PCR陽性的菌液(選用圖12中的7號)3ml，送上海生工生物公司測序；由于pTracer-CMV/Bsd質(zhì)粒Bst XI單酶切的位點前后的序列為5′CCG AGC TCG GAT CCA CTA GTC CAG TGTG(酶切位點)G TGGA3′(如圖13所示)，高保真PCR時的上游引物(不是菌落PCR時的上游引物)為5′tag cca gtg tg(酶切位點)g tgg TGC TCA AGA TGA ACCGAC TCT3′，因此，如果插入片段方向正確，測序結(jié)果應(yīng)該為5′CCG AGCTCG GAT CCA CTA GTC CAG TGT G g tgg TGC TCA AGA TGA ACC GACTCT 3′。我們的測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒中插入序列的方向完全正確(如圖14所示)，表明我們篩選構(gòu)建正確的單酶切基因表達(dá)載體的方法是有效的。
權(quán)利要求
1.一種高效篩選單酶切基因表達(dá)載體的方法，所述的方法包括一個選擇合適載體和限制性內(nèi)切酶的過程，還包括一個利用限制性內(nèi)切酶對載體進(jìn)行酶切的過程，還包括一個選擇插入基因片段的過程，還包括一個利用上述的限制性內(nèi)切酶對所述的基因片段進(jìn)行單酶切的過程，其特征在于將單酶切后的載體和單酶切后的基因片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)理論上連接正確的重組質(zhì)粒的基因序列為模板，以插入基因片段的載體的上序列設(shè)計上游引物，根據(jù)插入基因片段序列設(shè)計下游引物，進(jìn)行菌落PCR，然后進(jìn)行電泳，在菌落PCR產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)的條帶為正確構(gòu)建的重組載體的菌落。
全文摘要
一種高效篩選單酶切基因表達(dá)載體的方法，包括一個選擇合適載體和限制性內(nèi)切酶的過程，一個利用限制性內(nèi)切酶對載體進(jìn)行酶切的過程，一個選擇插入基因片段的過程，一個利用限制性內(nèi)切酶對基因片段進(jìn)行單酶切的過程，將單酶切后的載體和單酶切后的基因片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)理論上連接正確的重組質(zhì)粒的基因序列為模板，以插入基因片段的載體上的序列設(shè)計上游引物，以插入基因片段序列設(shè)計下游引物，進(jìn)行菌落PCR，然后進(jìn)行電泳，在菌落PCR產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)的條帶為正確構(gòu)建的重組載體的菌落。本發(fā)明采用單酶切方法構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后使用特定設(shè)計的引物，進(jìn)行PCR，根據(jù)菌落PCR的結(jié)果，直接篩選出正確構(gòu)建的重組載體，減少了測序費用。
文檔編號C12N15/63GK101333536SQ20071004303
公開日2008年12月31日 申請日期2007年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日
發(fā)明者王海嶸, 陳芳源 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院