專利名稱：：一種克隆胚胎移植方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種克隆胚胎移植方法。
背景技術(shù)：
：通常意義上的胚胎移植，是指是將一頭良種母畜配種后的早期胚胎取出，移植到另一頭處在同步發(fā)情期的母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新的個(gè)體，又稱借腹懷胎，該方法可以極大地提高優(yōu)良母畜的利用率和繁殖率，充分挖掘母畜的遺傳和繁殖能力。動(dòng)物克隆技術(shù)是將供體體細(xì)胞核經(jīng)顯微操作和/或細(xì)胞融合的方法移植到去核卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，重新組成胚胎(重構(gòu)胚)。重構(gòu)胚經(jīng)培養(yǎng)發(fā)育至囊胚，再將囊胚移植到同步發(fā)情的代孕體子宮內(nèi)，待發(fā)育成熟后分娩出動(dòng)物，該動(dòng)物被稱為"克隆動(dòng)物"，該技術(shù)則被稱為"體細(xì)胞克隆技術(shù)"或"體細(xì)胞核移植技術(shù)，，(somaticcellnucleartransfer,SCNT)。其中將囊胚移植到同步發(fā)情的代孕體子宮內(nèi)這一過(guò)程，稱為克隆胚胎的移植。自從克隆羊多莉誕生以來(lái)(Wilmut,I.,Schnieke,A.E.,Mcwhir，J.，Kind,etal.Nature1997,385:810-813)，體細(xì)胞核移植技術(shù)作為一種生物技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)，利用體細(xì)胞核移植技術(shù)可以大量繁殖性狀優(yōu)良的家畜、拯救瀕危動(dòng)物、培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、進(jìn)行治療性克隆等。哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆發(fā)展近十年來(lái),克隆胚胎在體外的發(fā)育已與體外受精胚胎的囊胚率和早期受孕率相當(dāng)(GomezMC,PopeCE，GiraldoA,etal.CloningStemCell2004,6:247-258;DeanW，SantosF,ReikW.SeminCellDevBiol2003,14:93-100)，但克隆胚胎移植到受體動(dòng)物子宮內(nèi)以后受孕效率較低，仍然是制約體細(xì)胞核移植技術(shù)廣泛應(yīng)用的瓶頸。近年來(lái)，申請(qǐng)人針對(duì)形成重構(gòu)胚所需的供體細(xì)胞和受體細(xì)胞進(jìn)行了深入的研究，相繼申請(qǐng)了一系列中國(guó)發(fā)明專利，如"一種同體細(xì)胞核移植方法"(申請(qǐng)?zhí)?00410016219.7)，"一種哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植方法"(申請(qǐng)?zhí)?00510023872.0)以及"一種細(xì)胞核移植方法"(申請(qǐng)?zhí)?00610029674.X)的專利。研究過(guò)程中申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行牛的體細(xì)胞核移植時(shí)，不同亞種的克隆囊胚形成率存在一定的差異(YangXY,ZhaoJG,LiHWetal.2005.Theriogenology.64(6):1263-72)。發(fā)明人由此聯(lián)想到，目前常規(guī)胚胎移植方法，對(duì)亞種沒(méi)有特別的選擇，只要代孕體處在同步發(fā)情期時(shí)即移植，這樣由于克隆胚胞質(zhì)與代孕體亞種間內(nèi)環(huán)境的不同，可能會(huì)導(dǎo)致受孕率的降低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就在于提供一種克隆胚胎移植方法，該方法選取與克隆胚受體胞質(zhì)亞種相同的代孕體進(jìn)行移植。為了達(dá)到上述目的，發(fā)明人將發(fā)育到囊胚的重構(gòu)胚移植到與克隆胚受體胞質(zhì)亞種相同的代孕體子宮內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用亞種相同的胚胎移植能夠有效提高移植后的受孕率。具體地，本發(fā)明的克隆胚胎方法包括以下步驟a、選取某非人哺乳動(dòng)物，以其皮膚成纖維細(xì)胞或卵丘細(xì)胞作為供核體細(xì)胞b、選取步驟a哺乳動(dòng)物的某一亞種，以其卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞；C、受體卵母細(xì)胞去核；d、將供核體細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，使細(xì)胞核融入卵母細(xì)胞，形成重構(gòu)胚。e、待重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚，將克隆囊胚移植到與克隆胚受體胞質(zhì)同一亞種的代孕體子宮內(nèi)。本發(fā)明的同種(克隆胚胎受體胞質(zhì)亞種與代孕體亞種相同)克隆胚胎移植方法能夠有效提高移植后受孕率，相比異種(克隆胚胎受體胞質(zhì)亞種與代孕體亞種不同)胚胎移植受孕率提高了約3倍。因?yàn)橥ㄟ^(guò)同種克隆胚胎移植，增加了胚胎與代孕體間的兼容性，從而有利于受孕。因此，利用克隆胚受體胞質(zhì)與代孕體來(lái)自同一亞種的方法可有效解決胚胎受孕過(guò)程中的不兼容問(wèn)題，從而提高受孕率。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1、受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備黃牛和奶牛為哺乳綱偶蹄目?？婆?zèng)r5V7/v'肌'《e/7iM種的兩個(gè)亞種。對(duì)黃?；蚰膛５那嗄昴概＿M(jìn)行活體取卵，具體方法見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)枮?00510023510.1的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)。將收集液倒入揀卵杯中，用無(wú)鈣鎂杜氏磷酸緩沖液(DPBS,1升去離子水中含8gNaCl，0.2gKCl,1.44gNa2HP04,0.24gKH2P04,30gBSA和2000u肝素)沖洗，揀出卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulusoocytecomplexes,COCs)移入培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下對(duì)COCs進(jìn)行分級(jí)，選擇胞質(zhì)均勻，周圍卵丘細(xì)胞排列緊密，包繞三層以上的卵母細(xì)胞，放入成熟液(TCM-199(Gibco，GrandIsland,NY)外加10%胎牛血清(FBS)、lOjig/ml促黃體生成激素、l嗎/ml雌二醇和lUg/ml促卵泡生成素)中培養(yǎng)1530h。實(shí)施例2、供核體細(xì)胞的準(zhǔn)備1、分別取青年牛成纖維細(xì)胞和卵丘細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM/F12(Gibco公司，產(chǎn)品號(hào)為11039-021)進(jìn)行培養(yǎng)。①成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)取新生牛耳組織，置于含雙抗(2%青鏈霉素)的0.9%生理鹽水中，耳組織經(jīng)碘釘和75%酒精浸泡消毒后，無(wú)菌生理鹽水洗35遍，剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，37'C消化2h，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。②卵丘細(xì)胞的原代培養(yǎng)將成熟20h小時(shí)的COCs(見(jiàn)實(shí)施例l)放入含0.5%透明質(zhì)酸酶的無(wú)鈣鎂的DPBS中，消化l2min，同時(shí)用吸胚管反復(fù)吹吸，脫去外層疏松、擴(kuò)展的卵丘細(xì)胞。收集這部分的卵丘細(xì)胞，盡快移入無(wú)鈣鎂的DPBS中，1200rpm離心5min，棄上清；加入100^10.25%胰酶吹打lmin，加入DMEM/F12+10%FBS(1體積FBS+9體積DMEM/F12培養(yǎng)液)終止消化，lOOOrpm離心5min，DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌2次。用DMEM/F12+10XFBS懸浮細(xì)胞，輕輕吹打，使細(xì)胞充分吹散，接種至25cm2培養(yǎng)瓶(接種密度約為1X105,內(nèi)含DMEM/F12+10XFBS培養(yǎng)液5ml)，于38.5。C，5%C02，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、約35天生長(zhǎng)匯合后，進(jìn)行傳代。3、取培養(yǎng)15代的細(xì)胞用作核移植的供核細(xì)胞。核移植前，用0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，將消化下來(lái)的細(xì)胞用3mg/ml的鏈霉蛋白酶處理50秒，并離心洗滌，最后用DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco公司)10(^1重懸，并反復(fù)吹打成單個(gè)細(xì)胞的懸液，保存于恒溫箱中待用。實(shí)施例3、細(xì)胞核移植1、核移植所需ACM培養(yǎng)液的配制ACM培養(yǎng)液的配方如下NaCl(SigmaS掘6)0.580gKC1(SigmaP-5405)0.022gNaHC03(SigmaS-5761)0.209gL-谷氨酰胺(SigmaG-8540)0.015gCaCl22H20(SigmaC-7卯2)O扁g丙酮酸(2.2mg/ml貯存于PBS中)2mlBME氨基酸(SigmaB-6766)2mlMEM氨基酸(SigmaM-7145)lml青鏈霉素(GIBCO-BRL公司)lml乳酸(SigmaL-7900)14pl酚磺酞(SigmaP-0290)lOOplBSA(無(wú)脂肪酸)(SigmaA-6003)0.300g將除BSA外的所有干粉成分溶解于盛有70ml胚胎水的燒杯中，為防止BME/MEM受到污染，加入所有液體成分并用罩子罩住燒杯進(jìn)行攪拌，然后加入BSA干粉繼續(xù)攪拌直至完全溶解，用量筒定容至100ml，最后用0.2pm的濾膜過(guò)濾，于4。C貯存不超過(guò)兩周。2、細(xì)胞核移植將卵母細(xì)胞在煙酸己可堿Hoechst33342(Sigma公司)中染色，在帶有紫外燈的顯微操作儀下，用內(nèi)徑為15~20um的玻璃細(xì)管將受體卵母細(xì)胞的第一極體及其附近區(qū)域的卵核去除，然后將供體細(xì)胞核注入去核卵母細(xì)胞卵周隙，以2.5KV/cm_3V/cm和6—10ns的融合參數(shù)，將供核細(xì)胞核融入卵母細(xì)胞，獲得克隆重構(gòu)胚。融合操作后的卵移入羥乙基哌嗪乙磺酸TL-HEPES(配方見(jiàn)后)中洗3遍，置于ACM培養(yǎng)微滴中，于5%<302、38.5°C，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后，用5ng/ml離子霉素(Ionomycin，Sigma1-0634)禾口10ug/ml亞胺環(huán)己酮(cyclohemixide，Sigma公司)，活化5h后將重構(gòu)胚放入ACM和胎鼠成纖維細(xì)胞(MEF)的共培養(yǎng)體系中，在5%C02、38.5°C，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后更換ACM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。TL-HEPES操作液配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>NaHCCbSigmaS57610.0840g<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>加胚胎水至500ml，調(diào)節(jié)pH至7.4放置4'C冰箱備用，貯存不超過(guò)三周。實(shí)施例4、克隆胚胎移植將活化后培養(yǎng)6—7d的囊胚挑選形態(tài)正常，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)致密的進(jìn)行移植，代孕體挑選有穩(wěn)定的發(fā)情周期，良好的健康狀況，黃體要在1.0cm以上且彈性要好的黃牛和奶牛。將裝有胚胎的移植管裝入移植套管再裝入移植槍內(nèi)，移植套膜套在最外層。將用于胚胎移植的受體母牛站立保定，lml"846合劑"(5ml/l支，解放軍農(nóng)牧大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所)肌注及2ml利多卡因(100mg/5ml/支，上海福達(dá)制藥有限公司)尾椎硬膜外麻醉。清除直腸糞便，消毒外陰，將移植槍緩慢的推至子宮角處進(jìn)行移植。分別在60天，90天，120天時(shí)則通過(guò)直腸觸診來(lái)診斷受孕情況，結(jié)果如表l所示。表l克隆胚受體胞質(zhì)與代孕體亞種不同搭配受孕效率的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注受孕率=受孕頭次/移植頭次根據(jù)表1的結(jié)果，分別統(tǒng)計(jì)同種克隆胚受體胞質(zhì)與代孕體亞種(黃牛-黃牛，奶牛-奶牛)以及異種克隆胚受體胞質(zhì)與代孕體亞種(黃牛-奶牛，奶牛-黃牛)的受孕效率，結(jié)果如表2所示。表2不同類型胚胎移植受孕率的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表1和表2的數(shù)據(jù)可以看出，同種間的胚胎移植(黃牛-黃牛，奶牛-奶牛)在60天，90天，120天的受孕率均優(yōu)于異種間的胚胎移植(黃牛-奶牛，奶牛-黃牛)，60天、90天同種組的受孕率約為異種組的2.6—2.7倍，120天時(shí)達(dá)到3倍。綜上所述，采用本發(fā)明的方法可以克服現(xiàn)有技術(shù)中由于代孕體選擇不當(dāng)所導(dǎo)致的受孕率低下的問(wèn)題，選擇與克隆胚受體胞質(zhì)相同亞種的代孕體進(jìn)行胚胎移植，可以有效提高克隆胚移植后的受孕率。雖然以上僅以牛為例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容，顯然可以看出本發(fā)明的方法同樣適用于其它非人哺乳動(dòng)物，例如豬、羊以及老鼠等，因此，針對(duì)這些非人哺乳動(dòng)物的同種胚胎移植方法同樣應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1、一種克隆胚胎移植方法，其特征在于，該方法是以選擇與克隆胚胎受體胞質(zhì)亞種相同的代孕體進(jìn)行克隆胚胎移植。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟a、選取某非人哺乳動(dòng)物，以其皮膚成纖維細(xì)胞或卵丘細(xì)胞作為供核體細(xì)胞b、選取步驟a哺乳動(dòng)物的某一亞種，以其卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞；C、受體卵母細(xì)胞去核；d、將供核體細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，使細(xì)胞核融入卵母細(xì)胞，形成重構(gòu)胚。e、待重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚，將克隆囊胚移植到與克隆胚胎受體胞質(zhì)同一亞種的代孕體子宮內(nèi)。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述供核體細(xì)胞是鏈霉蛋白酶處理后，經(jīng)DMEM/F12培養(yǎng)液重懸的細(xì)胞。4、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述作為受體細(xì)胞的卵母細(xì)胞通過(guò)活體取卵的方法獲得。5、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述卵母細(xì)胞去核是通過(guò)煙酸己可堿染色，紫外燈輔助下將卵母細(xì)胞的第一極體及其附近區(qū)域的卵核去除。6、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞核融入卵母細(xì)胞的融合參數(shù)為2.5KV/cm_3V/cm,6—10ps。7、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述重構(gòu)胚經(jīng)離子霉素和亞胺環(huán)己酮活化處理后，在ACM和胎鼠成纖維細(xì)胞體系中共培養(yǎng)。8、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述移植的克隆胚指活化后培養(yǎng)6—7天的囊胚。9、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述代孕體有穩(wěn)定的發(fā)情周期，且黃體在l.Ocm以上。10、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述克隆胚的移植是使用移植槍的非手術(shù)方法。11、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳動(dòng)物包括牛、羊、豬和老鼠。12、如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物為牛。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種克隆胚移植方法，該方法是以選擇與克隆胚胎受體胞質(zhì)亞種相同的代孕體進(jìn)行克隆胚胎移植。本發(fā)明的方法增加了克隆胚胎與代孕體間的兼容性，能夠顯著提高克隆胚移植后的受孕率。文檔編號(hào)C12N15/06GK101380254SQ20071004569公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2007年9月7日優(yōu)先權(quán)日2007年9月7日發(fā)明者曾溢滔,趙磊文,黃淑幀申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院;上海滔滔轉(zhuǎn)基因工程股份有限公司