專利名稱：重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術領域的合成方法，具體是一種重復利用活 細胞作為生物催化劑的手性生物合成方法。
技術背景生物催化劑的立體選擇性使生物合成手性化合物在藥物、食品、農業(yè)化學和 化妝品方面有著潛在的工業(yè)應用。利用活細胞作為生物催化劑不但可以避免制備 純化酶的繁瑣步驟，更為重要的是利用活細胞作為生物催化劑有利于多酶催化或 需要輔酶的生物轉化過程。面包酵母因生長快、培養(yǎng)條件簡單、是非病源微生物，且具有多種酶催化系 統(tǒng)而具有作為生物催化劑的潛在工業(yè)價值。利用活細胞代謝葡萄糖再生輔酶轉化芳香酮合成手性芳香醇是經(jīng)典例子，如式1所示的面包酵母為催化劑催化芳香酮苯乙酮還原制備手性芳香醇s-i-苯乙醇。S-1-phenylethanol R-1-phenylethanol式i如式2所示，利用面包酵母的脫羧酶對丙酮酸的脫羧反應和苯甲醛結合合成 手性苯基乙?；际枪I(yè)上制備麻黃素前體的重要反應，該反應需要活細胞代 謝葡萄糖(glucose)產生丙酮酸作為催化反應的底物之一。Glu<pose O i
上述反應的特點是必須利用活細胞作為生物催化劑以便循環(huán)利用輔酶或利 用活細胞的代謝產物。而且這類反應都是以非極性或弱極性的有機化合物作為底 物/產物。高濃度的底物/產物將抑制甚至毒害微生物的生長和活性。這導致常規(guī) 的水溶液系統(tǒng)中生物轉化過程的產物濃度很低而使其缺乏工業(yè)化價值。為了提高催化反應的效率，除采用催化劑工程技術外，介質工程已成為研究 的又一熱點。其中水一有機溶劑兩相分配系統(tǒng)被視為一種有效的手段，但其生物 相容性，尤其是具有中等極性的底物/產物的生物轉化，是其工業(yè)化應用的限制 因素。非離子表面活性劑水溶液在溫度高于某一溫度時形成互不相溶的兩相，這一 溫度稱為濁點。這一表面活性劑水溶液系統(tǒng)稱為濁點系統(tǒng)。濁點系統(tǒng)中的溶質將 不均勻地分配于濁點系統(tǒng)的兩相，利用這一性質而分離或濃縮溶質的技術稱為濁 點萃取。底物、產物和生物催化劑在兩相系統(tǒng)將不均勻地分配于系統(tǒng)的兩相，其 中一相充當著底物的貯存庫和產物的萃取劑，從而實現(xiàn)底物的原位添加和產物的 原位萃取，這一技術稱為兩相分配生物反應技術。濁點系統(tǒng)應用于酶催化反應或 生物轉化過程的優(yōu)勢有非離子表面活性劑在操作溫度下基本不揮發(fā)，環(huán)境友好； 系統(tǒng)具有特殊的微水環(huán)境結構，使酶、微生物保持了高度活性和穩(wěn)定性；溶質在系統(tǒng)中分配的可調節(jié)因素多，操作彈性大；操作工藝和常規(guī)水一有機溶劑兩相系 統(tǒng)基本一致，工業(yè)化基礎好。經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，Zhilong Wang， "The potential of cloud point system as a novel two-phase partitioning system for biotransformation. Applied microbiology and biotechnology. '， 2007, 75: 1-10.(王志龍."濁度系統(tǒng)作為新的兩相分配系統(tǒng)應用于生物轉化的潛力". 《應用微生物與生物技術》，2007， 75: 1-10)中介紹，在水-有機溶劑兩相分 配系統(tǒng)的萃取生物轉化過程中萃取極性產物和維持細胞的活性，但是往往難以同 時實現(xiàn)。在進一步的檢索中，還沒有發(fā)現(xiàn)于本發(fā)明關于濁度系統(tǒng)中萃取極性產物 生物轉化的文獻報道。發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種重復利用活細胞作為生物 催化劑的手性生物合成方法。本發(fā)明利用濁點系統(tǒng)兩相分配技術，實行在高底物 /產物濃度下，活細胞作為生物催化劑并重復利用的生物轉化過程，以獲得具有 手性結構的生物產品，如手性芳香醇、苯基乙?；嫉龋瑥亩岣哌^程的生產 效率。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明具體包括如下步驟 步驟一，構建由非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成，或者由聚合物、非 離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成的濁點系統(tǒng)；步驟二，檢測步驟一構建的濁點系統(tǒng)的生物相容性將步驟一中得到的濁點系統(tǒng)裝入搖瓶中，接種新鮮面包酵母種子，然后添加 一定濃度的底物/產物，于搖床中培養(yǎng)，離心收獲細胞并測定濕細胞重量，以濕 細胞重量測定在此底物/產物濃度范圍內的生物相容性，并將測定具有生物相容 性的濁點系統(tǒng)用于步驟三的反應；步驟三，濁度系統(tǒng)中的活細胞微生物轉化在微生物培養(yǎng)基中接種新鮮面包酵母種子裝入搖瓶中，于搖床中培養(yǎng)，離心 收獲細胞并測定濕細胞質量，將收獲新鮮細胞加入步驟一中得到的、且經(jīng)步驟二 檢測后具有生物相容性的濁點系統(tǒng)中，添加底物苯乙酮或苯甲醛，在搖床中反應后，離心去除細胞，取清液。所述的非離子表面活性劑選自聚氧乙烯型非離子表面活性劑、多元醇系非離 子表面活性劑、聚醚型非離子表面活性劑、烷醇酰胺系非離子表面活性劑中的任 意一種或者組合。所述的聚氧乙烯型非離子表面活性劑，包括脂肪醇聚氧乙烯醚(AE0)、脂 肪酸聚氧乙烯酯、烷基酚聚氧乙烯醚(APE0)、聚氧乙烯酰胺、聚氧乙烯脂肪胺、 聚氧乙烯醇、吐溫等。其中烷基酚聚氧乙烯醚類包括Triton X-100、 Triton X-114 (辛基酚聚氧乙烯醚類)；其中聚氧乙烯醇類包括Brij (買譯)30、 Brij35、 Bri j56、 C12E7;聚氧乙烯醚類包括Tween(吐溫)20、 Tween40、 Tween60、 Tween80、 Span (司盤)20、 Span40、 Span60、 Span80;以上化合物都可以直接購買得到。所述的多元醇系非離子表面活性劑，包括脂肪酸乙二醇酯、單脂肪酸甘油酯 (單甘酯)、季戊四醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等。所述的聚醚型非離子表面活性劑，包括環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙垸嵌段共聚物。所述的烷醇酰胺系非離子表面活性劑包括脂肪酸二乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇 酰胺、氧化胺和烷基多苷(APG)等。所述非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成的濁點系統(tǒng)，具體為通常非離
子表面活性劑對微生物細胞具有生理毒性，如Triton X-45對微生物具有毒性。 混合的非離子表面活性劑Triton X-114與Triton X-45的體積比大于6: 4 ， 與微生物培養(yǎng)基按體積比l: IO組成濁點系統(tǒng)。所述由聚合物、非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成的濁點系統(tǒng)，具體為 聚乙二醇(PEG)濃度大于8g/100ml和Triton X-100濃度大于7. 5 ml/100ml與微生物培養(yǎng)基也能組成濁點系統(tǒng)。所述微生物培養(yǎng)基，其組成為100ml水中含2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡 萄糖或9g葡萄糖、lg酵母粉、lg (NH4) 2S04、 0. 3 g KH2P04、 0. 2g Na2HP04、 0. lg MgS04和0. 005g CaCl2。所述檢測步驟一構建的濁點系統(tǒng)的生物相容性，具體為將20-50ml濁點系 統(tǒng)裝入250ml的搖瓶中，接種新鮮面包酵母種子，然后添加濃度小于1% (v/v) 的底物或濃度小于0.6% (v/v)的產物，于30°C， 200rpm的搖床中培養(yǎng)1天， 離心收獲細胞并測定濕細胞重量。以濕細胞重量測定在此底物/產物濃度范圍內 的生物相容性。所述濁度系統(tǒng)中的活細胞微生物轉化，具體為在20ml微生物培養(yǎng)基中接 種新鮮面包酵母種子裝入250ml搖瓶中，于30°C， 200rpm的搖床中培養(yǎng)1天， 離心收獲細胞并測定濕細胞質量。將收獲新鮮細胞按濃度2-20% (g/ml)加入上 述的濁點系統(tǒng)中，添加濃度為O. 1-P/。(v/V)底物苯乙酮或苯甲醛，在30。C， 200rpm 的搖床中反應8-24小時后，離心去除細胞，取清液用HPLC分析產物濃度，由于 微生物酶催化的立體選擇性，產物的光學純度用GC分析表明ee值在95%以上。本發(fā)明采用活細胞作為生物催化劑的目的在于利用其多酶系統(tǒng)或輔酶系統(tǒng)。本發(fā)明開采用濁點系統(tǒng)應用于生物轉化的目的在于利用解除底物/產物，尤 其是極性相對較強的底物/產物，對生物催化劑的抑制和毒害作用。本發(fā)明解除底物/產物對生物催化劑抑制的目的在于實現(xiàn)高底物/產物濃度 下的生物轉化過程和實現(xiàn)全細胞生物催化劑的重復利用。本發(fā)明實現(xiàn)高底物/產物濃度下的生物轉化和重復利用細胞作為生物催化劑 的目的在于降低生物合成手性化學品的生產成本。如s-l-苯乙醇，苯基乙?；?原醇。本發(fā)明優(yōu)先使用了混合的非離子表面活性劑Triton X系列和聚乙二醇 (PEG)系列多聚物誘導的非離子表面活性劑Triton X系列獲得了具有生物相容
性的濁點系統(tǒng)。本發(fā)明采用濁點系統(tǒng)兩相分配反應技術，實現(xiàn)了在高底物/產物濃度下的活 細胞生物催化?；罴毎锎呋欣谳o酶循環(huán)和利用細胞的代謝產物，高濃度 的底物反應和對極性相對較強的產物的原位萃取有利于實現(xiàn)高產物濃度的生物 轉化，推動其產業(yè)化進程。然而，由于上述反應都要利用葡萄糖的代謝再生輔酶 或產生輔底物，應用本技術提高目標產物的濃度將需要進一步優(yōu)化其過程技術。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下 進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限 于下述的實施例。本發(fā)明實施的具體條件構建由非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成，或者由聚合物、非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成生物相容性的濁點系統(tǒng)，如非離子表面活性劑Triton X-45在水溶液中存在Krafft點和濁點。在溫度低于其Krafft點時形成混濁的 不分相的分散體系。在溫度高于其濁點時溶液出現(xiàn)混濁并出現(xiàn)分相現(xiàn)象。不同體 積比的非離子表面活性劑Triton X-114與Triton X-45混合非離子表面活性劑 水溶液有分相行為。在低Triton X-45份率時，混合表面活性劑溶液的Krafft 點較室溫低，其濁點溫度隨其分率的增加而降低。在高Triton X-45份率時，室 溫下是混濁且不分相的，這表明其Krafft點高于室溫。在低Triton X-45分率 的TritonX-45和Triton X-114混合常規(guī)培養(yǎng)液可以獲得濁點溫度低于培養(yǎng)溫 度的濁點系統(tǒng)。生物相容性由接種酵母細胞后20ml表面活性劑-培養(yǎng)液混合系統(tǒng) 在30°C搖床培養(yǎng)2天的細胞量(濕細胞重)測定。只要當濁點低于培養(yǎng)溫度30°C 時，表面活性劑溶液具有生物相容性。采用一定濃度的PEG溶液滴定一定濃度的Triton X-100或者采用一定濃度 的Triton X-100溶液滴定一定濃度的PEG，類似于雙水相系統(tǒng)，在一定濃度范 圍內，PEG和Triton X-100形成單相的穩(wěn)定的水溶液。而在高于一定的濃度范 圍內，PEG和Triton X-100在水溶液中形成兩相分配體系，其中一相富含非離 子表面活性劑，而另一相富含多聚物。有機溶劑-水溶液組成的兩相分^體系統(tǒng) 的生物相容性隨有機溶劑的極性降低而升高，即微生物在極性有機溶劑中不具有 生物相容性。而濁點系統(tǒng)和PEG誘導的濁點系統(tǒng)雖極性較強但同時具有生物相容性。微生物轉化的背景技術提及的式1和2所示的反應都存在產物/底物對微生 物活性的抑制，在獲得上述生物相容性的濁點系統(tǒng)和PEG誘導濁點系統(tǒng)中進行微 生物轉化，濁點系統(tǒng)能提高面包酵母細胞生長對毒性底物的耐受能力。在PEG誘導的Triton X-100濁度系統(tǒng)進一步提高了式2中微生物生長耐受 有機底物的濃度。通過濁點系統(tǒng)的兩性分配解決了常規(guī)水溶液中底物/產物抑制， 維持了高濃度下的微生物全細胞的生物反應活性。利用酵母細胞內酶的立體選擇性進行手性生物合成，在高底物濃度下活細胞 能再生輔酶并且活細胞作為生物催化劑可以進一步重復利用，并且可以實現(xiàn)對相 對極性較高的產物的原位萃取以解除產物抑制。從而實現(xiàn)高底物濃度下活細胞生 物轉化獲得高濃度的手性產物。下列實施例中未注明具體條件的實施方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠 商所建議的條件。 實施例1Triton X-45和Triton X-114比例為1:，的混合表面活性劑溶液，與培養(yǎng) 基按體積比為l: 10組成體積為22ml的濁點系統(tǒng)，培養(yǎng)基組成為100ml水中含 2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡萄糖或9g葡萄糖、lg酵母粉、lg (NH4) 2S04、 0. 3 g KH2P04、 0.2g Na2HP04、 0. lg MgS04和0. 005g CaCl2。將濁點系統(tǒng)裝入 50ml的搖瓶中接種酵母細胞在30°C， 200rpm的搖床中培養(yǎng)2天，離心后測定 濕細胞重量為1.7g。這表明該濁點系統(tǒng)具有生物相容性。實施例2培養(yǎng)基組成為100ml水中含2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡萄糖或9g葡萄糖、 lg酵母粉、lg (NH4) 2S04、 0. 3 g KH2P04、 0. 2g Na2HP04、 0. lg MgS04和0. 005g CaCl2。在100ml培養(yǎng)基中加入PEG 20000 8g、表面活性劑Triton X-100 7.5ml 組成濁點系統(tǒng)。將20ml濁點系統(tǒng)裝入50ml的搖瓶中接種酵母細胞在30°C， 200rpm的搖床中培養(yǎng)2天，離心后測定濕細胞重量為1. 5g。這表明該濁點系統(tǒng) 具有生物相容性。實施例3在實施例1中的濁點系統(tǒng)中，將22ml濁點系統(tǒng)裝入50ml的搖瓶中接種酵母
細胞，并添加底物苯乙酮1% (v/v)濃度，在30°C， 200rpm的搖床中培養(yǎng)2天， 離心后測定濕細胞重量為1.2g。這表明濁點系統(tǒng)能耐受高濃度的毒性底物。 實施例4在實施例1中的濁點系統(tǒng)中，將22ml濁點系統(tǒng)裝入50ml的搖瓶中接種酵母 細胞，并添加產物1-苯乙醇0.6 % (v/v)濃度，在30t， 200rpm的搖床中培 養(yǎng)2天，離心后測定濕細胞重量為1.3g。這表明濁點系統(tǒng)能耐受高濃度的毒性產物。實施例5在實施例2中的濁點系統(tǒng)中，將20ml濁點系統(tǒng)裝入50ml的搖瓶中接種酵母 細胞，并添加底物苯甲醛0. 3 % (v/v)濃度，在30°C， 200rpm的搖床中培養(yǎng)2 天，離心后測定濕細胞重量為1.2g。這表明濁點系統(tǒng)能耐受高濃度的毒性底物。實施例6100 ml水溶液中含20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉的培養(yǎng)液中，加入混 合表面活性劑10ml，其中TritonX-45 : Triton X-114=1: 9, 組成濁點系統(tǒng)。 加入新鮮的濕酵母20g，底物苯乙酮2ml。裝入500ml搖瓶中，在30°C、 280r卿 的搖床中反應1天。測定轉化液中苯乙醇的濃度為0.4 mM。本實施例表明濁點 系統(tǒng)中在非常高的底物濃度下也存在底物抑制現(xiàn)象。實施例7100 ml水溶液中含20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉的培養(yǎng)液中，加入混 合表面活性劑10ml，其中Triton X-45 : Triton X-114=1: 9， 組成濁點系統(tǒng)。 加入新鮮的濕酵母20g，底物苯乙酮0. 8 ml。裝入500ml搖瓶中，在30°C、 280rmp 的搖床中反應1天。測定轉化液中苯乙醇的濃度為0.6 mM。本實施例和實例6 比較表明在底物濃度低于其抑制生物催化劑活性濃度內有利于獲得高產物濃度。實施例8100ml水溶液中含20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉、1.07g擰檬酸、3. 5g N&HP04的培養(yǎng)液中，加入混合表面活性劑10 ml，其中Triton X-45 : Triton X-114=l: 9，組成濁點系統(tǒng)。加入新鮮的濕酵母20g，底物苯乙酮1.2 ml。裝 入500ml搖瓶中，在30t、 280rmp的搖床中反應1天。測定轉化液中苯乙醇的 濃度為0. 72 mM。本實施例和實例6比較表明高底物濃度有利于獲得高產物濃度。實施例9 100 ml水溶液中含20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉的培養(yǎng)液中，加入混 合表面活性劑10ml，其中TritonX-45 : Triton X-114=1: 9， 組成濁點系統(tǒng)。 加入新鮮的濕酵母20g，底物苯乙酮1. 4ml。裝入500ral搖瓶中，在30°C、 280rmp 的搖床中反應1天后再次加入葡萄糖20g后在相同條件下再轉化1天，測定轉化 液中苯乙醇的濃度為1.2 raM。且微生物消耗了大部分的葡萄糖。本實施例表明 濁點系統(tǒng)中高底物濃度下微生物作為生物催化劑長時間保持了再生輔酶的能力。實施例10100 ml水溶液中含3 g葡萄糖、lg酵母粉、2g蛋白胨、0. 3 g KH2P04、 0. 2g Na異、0. lg MgS04 、 0.005g CaCl2和0.6ml乙醛的培養(yǎng)液中，加入表面活性 劑Triton X-100 7.5ml， PEG 20000 8g組成PEG誘導的濁點系統(tǒng)。在濁點系統(tǒng) 中接種酵母細胞3g，加入0. 8ml底物苯甲醛。裝入500ml搖瓶中，在30。C、280r卿 的搖床中培養(yǎng)并繼續(xù)反應24小時。測定苯基乙酰基原醇的濃度為2.8g/L，且濁 點系統(tǒng)中富含表面活性劑相和富含PEG相產物濃度之比為3: 1。反應系統(tǒng)中的 葡萄糖幾乎全部消耗。本實施例表明PEG誘導濁點系統(tǒng)能在較高底物濃度下微生 物保持了代謝活性而使反應繼續(xù)進行，而且能萃取極性相對較強的產物，從而使 產物濃度有明顯提高。實施例11100 ml水溶液中含3 g葡萄糖、lg酵母粉、2g蛋白胨、1. 07 g檸檬酸、3. 5g Na風、0. lg MgS04 、 0.005g CaCl2和0.6ml乙醛的培養(yǎng)液中，加入表面活性 劑Triton X-100 7.5ml， PEG 20000 8g組成PEG誘導的濁點系統(tǒng)。在濁點系統(tǒng) 中接種酵母細胞4g，加入lml底物苯甲醛，裝入500ml搖瓶中，在30°C、 280rmp 的搖床中培養(yǎng)并繼續(xù)反應24小時。測定苯基乙?；嫉臐舛葹?.2g/L。這表 明在高底物濃度下，濁度系統(tǒng)能實現(xiàn)高產物濃度的轉化。
權利要求
1.一種重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方法，其特征在于，具體包括如下步驟步驟一，構建由非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成，或者由聚合物、非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成的濁點系統(tǒng)；步驟二，檢測步驟一構建的濁點系統(tǒng)的生物相容性將步驟一中得到的濁點系統(tǒng)裝入搖瓶中，接種新鮮面包酵母種子，然后產物，于搖床中培，離心收獲細胞并測定濕細胞重量，以濕細胞重量測定在此底物/產物濃度范圍內的生物相容性，并將測定具有生物相容性的濁點系統(tǒng)用于步驟三的反應；；步驟三，濁度系統(tǒng)中的活細胞微生物轉化在微生物培養(yǎng)基中接種新鮮面包酵母種子裝入搖瓶中，于搖床中培養(yǎng)，離心收獲細胞并測定濕細胞質量，將收獲新鮮細胞加入步驟一中得到的、且經(jīng)步驟二檢測后具有生物相容性的濁點系統(tǒng)中，添加底物苯乙酮或苯甲醛，在搖床中反應后，離心去除細胞，取清液。
2. 根據(jù)權利要求1所述的重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方 法，其特征是，所述的非離子表面活性劑選自聚氧乙烯型非離子表面活性劑、多元 醇系非離子表面活性劑、聚醚型非離子表面活性劑、垸醇酰胺系非離子表面活性劑 中的任意一種或者組合。
3. 根據(jù)權利要求2所述的重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方 法，其特征是，所述的聚氧乙烯型非離子表面活性劑，包括脂肪醇聚氧乙烯醚、脂 肪酸聚氧乙烯酯、烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酰胺、聚氧乙烯脂肪胺、聚氧乙烯 醇、吐溫。
4. 根據(jù)權利要求3所述的重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方 法，其特征是，所述垸基酚聚氧乙烯醚類包括Triton X-IOO、 Triton X-114;其中 聚氧乙烯醇類包括買譯30、買譯35、買譯56、 C12E7;聚氧乙烯醚類包括吐溫20、 吐溫40、吐溫60、吐溫80、司盤20、司盤40、司盤60、司盤80。
5. 根據(jù)權利要求2所述的重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方 法，其特征是，所述的多元醇系非離子表面活性劑，包括脂肪酸乙二醇酯、單脂肪 酸甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯；所述的聚醚 型非離子表面活性劑，包括環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷嵌段共聚物；所述的垸醇酰胺系非 離子表面活性劑包括脂肪酸二乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、氧化胺和烷基多苷。
6. 根據(jù)權利要求1所述的重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方 法，其特征是，所述濁點系統(tǒng)由非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成，具體為-非離子表面活性劑Triton X-114與Triton X-45按照體積比大于6: 4混合，然后 與微生物培養(yǎng)基按體積比l: IO組成濁點系統(tǒng)。
7. 根據(jù)權利要求1所述的重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方 法，其特征是，所述濁點系統(tǒng)由聚合物、非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成， 具體為采用濃度大于8g/100ml的聚乙二醇和濃度大于7.5 ml/100ml的Triton X-100與微生物培養(yǎng)基組成濁點系統(tǒng)。
8. 根據(jù)權利要求1或6或7所述的重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物 合成方法，其特征是，所述微生物培養(yǎng)基，其組成為100ml水中含2g蛋白胨、2g 酵母粉、2g葡萄糖或9g葡萄糖、lg酵母粉、lg (NH4) 2S04、 0.3gK跳、0. 2g Na2HP04、 0. lg MgS04和0. 005g CaCl2。
9. 根據(jù)權利要求1所述的重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方 法，其特征是，所述采用濁點系統(tǒng)提高微生物對底物/產物的耐受性，具體為將 20-50ml濁點系統(tǒng)裝入250ml的搖瓶中，接種新鮮面包酵母種子，然后添加濃度小 于1%體積比的底物或濃度小于0.6%體積比的產物，于30°C， 200rpm的搖床中 培養(yǎng)1天，離心收獲細胞并測定濕細胞重量，以濕細胞重量測定在此底物/產物濃 度范圍內的生物相容性。
10. 根據(jù)權利要求1所述的重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方 法，其特征是，所述濁度系統(tǒng)中的活細胞微生物轉化，具體為在20ml微生物培 養(yǎng)基中接種新鮮面包酵母種子裝入250ml搖瓶中，于30t， 200rpm的搖床中培養(yǎng)1 天，離心收獲細胞并測定濕細胞質量，將收獲新鮮細胞按g/ml濃度2-20%加入上述 的濁點系統(tǒng)中，添加濃度為0. 1-1%體積比底物苯乙酮或苯甲醛，在30t， 200rpm的 搖床中反應8-24小時后，離心收獲細胞后重復用于生物轉化反應過程。
全文摘要
一種重復利用活細胞作為生物催化劑的手性生物合成方法，屬于生物工程技術領域。步驟為構建由非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成，或者由聚合物、非離子表面活性劑與微生物培養(yǎng)基組成的濁點系統(tǒng)；將得到的濁點系統(tǒng)裝入搖瓶中，接種新鮮面包酵母種子，然后產物，于搖床中培，離心收獲細胞并測定濕細胞重量，以濕細胞重量測定在此底物/產物濃度范圍內的生物相容性；在微生物培養(yǎng)基中接種新鮮面包酵母種子裝入搖瓶中，于搖床中培養(yǎng)，離心收獲細胞并測定濕細胞質量，將收獲新鮮細胞加入經(jīng)步驟二檢測后具有生物相容性的濁點系統(tǒng)中，添加底物反應。本發(fā)明實現(xiàn)了高底物/產物濃度下活細胞作為生物催化劑的重復利用。
文檔編號C12P1/00GK101153286SQ200710045630
公開日2008年4月2日 申請日期2007年9月6日 優(yōu)先權日2007年9月6日
發(fā)明者張文智, 麗 王, 王志龍, 齊瀚實 申請人:上海交通大學