專利名稱：：一種豬肌內脂肪含量基因Lpinl的克隆及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于動物基因工程
技術領域：
，具體涉及一種豬肌內脂肪含量基因丄^"7的克隆以及作為豬肌內脂肪含量的分子標記的應用。
背景技術：
：隨著人民生活水平的日益提高，豬肉品質越來越受到人們的重視。國外一些高度培育的瘦肉型品種和品系，雖然飼料轉化率高，生長快和瘦肉產量多，但肉質不好，PSE肉出現(xiàn)的機率高，往往使養(yǎng)豬業(yè)蒙受巨大經濟損失。肉質改良已成為目前豬育種工作的重點。肌內脂肪(IntramascularFat，IMF)含量是評價肉質的一個非常重要的指標，IMF存在于肌肉內，主要位于肌外膜、肌束膜和肌內膜上。據研究，IMF含量與肉品質的嫩度、多汁性以及風味密切相關，是影響肉品質風味的重要因素(Gondret等，2002;Wood等，1988)。據研究IMF含量具有較高的遺傳力(1^0.50)(Hovenier，1993)，而IMF含量與痩肉率的相關性較小(-0.250.30)，這說明在不犧牲痩肉率的前提下進行IMF含量的選擇是可能的。在現(xiàn)代豬禽育種中，要求降低胴體中的脂肪含量以滿足消費者對f瘦肉的要求，這一般是通過背膘厚的減少來衡量的。然而伴隨這一過程的是其他脂肪沉積部位的脂肪含量.如IMF含量也同樣減少，但IMF含量與其他生產性狀的遺傳相關雖然不利卻只是中度的，背膘厚的下降與IMF含量的下降并不完全一致，因此，兩個性狀有分別進行選擇的可能。據報道，豬肉IMF含量在23。/。的范圍內是較理想的(DeVol等，1988;Cameron等，1991),對于肌肉IMF含量是否越高越好尚存在爭議，但對于低IMF含量品種的改良、培育優(yōu)質畜禽品種，高肌內脂肪豬種的存在必然有著十分重要的意義。由于IMF含量在活體動物上很難進行測定，只能在胴體上測量，常規(guī)的選擇育種一般是基于同窩個體的屠宰性狀記錄，提高豬肌肉中1MF的含量是比較困難的。對F這一類胴體性狀，為了加快選擇反應的速度，額外的標記或基因輔助育種是非常有前途的(Meuwissen等，1996)，使用分子遺傳標記技術能極大地推動育種進程。目前已研究的與豬肌內脂肪含量相關的基因有(l)MI基因MI基因是在對19頭梅山公豬和126頭荷蘭母豬雜交產生的850頭F2代豬進行肉質性狀數據分離分析時發(fā)現(xiàn)的，是影響IMF含量的主效基因，并作用于剪切力和失水率。統(tǒng)計分析結果表明，MI基肉雙攜帶者將具有3.9°/的TMF含量，而單攜帶者和非攜帶者IMF僅為1.8%，有極顯著的差異(Janss等，1997)。該基因具體位于哪條染色體上目前還不清楚。(2)心臟脂肪酸結合蛋白(heartfattyacidbindingprotein,〃-,A5乃基因〃-F/15P位f豬6號染色體上(Gerbens等，1997),H-FABP對長鏈脂肪酸具有很強的親和力，在多水的細胞漿液中含量很高，能承載脂肪酸并在細胞漿及漿液到亞細胞器間便利的通行，有轉運長鏈脂肪酸和對脂肪酸代謝平衡調節(jié)的功能(Norbert等，2004)，其對脂肪酸的功能在小鼠上已經通過〃-尸/^尸基因的敲除實驗得以證實(Schaap等，2003;Binas等，1999;Schaap等，1999)。可以結合長鏈脂肪酸及其CoA和肉毒堿酯(Paulussen等，1988)、亞鐵血紅素、膽紅素、前列腺素和視黃醇類物質，H-FABP與脂肪酸的親和力要高于比它與長鏈?；鵆oA酯的親和力。Gerbens等(1997)應用PCR-RFLP技術在豬H-FABP基因上發(fā)現(xiàn)了三個SNP，其中附fl/1位點位于5'上游區(qū)域，而泡eIII和ifepl位丁第2內含子內，其中，ifepI酶切位點有A和a等位基因，〃sel11有D和d等位基因，ffi/:/1則有等位基因H和h,Gerbens節(jié)(1999)研究發(fā)現(xiàn)，aadd冊基因型豬比AADDhh基因型豬的IMF含量高約0.4%。林萬華等(2003)對二花臉豬的研究也證實H-FABP基因與IMF含量間存在著一定的相關，并發(fā)現(xiàn)#邵1和^aein位點具有明顯的加性效應。(3)脂肪組織脂肪酸結合蛋白(adipocytefattyacidbindingprotein,v4-/^5/*)基因豬/^5/M立于4號染色體(Gerbens等，1998)，與H-FABP相同，A-FABP的主要配基也是長鏈脂肪酸，只不過A-FABP對游離脂肪酸水平變化的反應要更快一些。在豬A-FABP基因的研究中發(fā)現(xiàn)，在距離第二外顯子69bp處的第一內含子上發(fā)現(xiàn)了一個[CA]21微衛(wèi)星序列，在所檢測的6個豬品種共檢測到9個等位基因，等位基因頻率在豬種間有較大差異。在杜洛克群體中，此位點有3個等位基因22(A1)、33(A2)和19(A3)，共組成6種基因型。統(tǒng)計分析表明在杜洛克群體中具有A1A3基因型的個體其IMF含量顯著地高于A1A1型個體，IMF相差達1%，因此等位基因A3似乎對IMF含量的提高有利(Gerbens等，1998)。盡管豬肌內脂肪含量侯選基因的研究取得了一些重要進展，已揭述了幾個候選基因，但豬的肌內脂肪含量涉及到的生理生化過程相當復雜，可能受多個基因的調控，仍有其它具有大效應的新基因有待發(fā)現(xiàn)。(lipinl)基因最先是通過位置克隆方法從/A/(fattyliverdystrophy)小鼠中分離得到，研究發(fā)現(xiàn)/7d小鼠中i/^W基因的無義突變造成脂肪營養(yǎng)障礙(lipodystrophy),表現(xiàn)為嚴重的脂肪組織缺失，胰島素抵抗和周圍神經病變(P6terfy等，2001)。小鼠中的研究表明，^w'/l基因缺失能阻止飲食造成的和遺傳性的肥胖；在轉基因小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，在肌肉組織或者脂肪組織中增加A^W的表達均能促進肥胖；僅在脂肪組織中增加Zpi/^的表達，增加脂肪生成基因的表達；而在肌肉中分別抑制和促進Z/p/"7的表達對脂肪酸代謝的基因的表達有相反的作用。脂肪組織中l(wèi)ipinl蛋白影響脂肪細胞儲存脂肪的能力，小鼠脂肪組織中含多余的lipinl會因為它們細胞存儲過多的脂肪而使體重增加；而肌肉組織中l(wèi)ipinl蛋白決定全身的能量消耗和脂肪的利用，肌肉中含過量lipinl的小鼠則因抑制脂肪代謝的基因使得它們比正常小鼠燃燒的脂肪少而變肥胖(Phan等，2005)。lipinl蛋白在脂肪細胞中呈現(xiàn)雙向性表達模式，在脂肪形成中有2個表達峰，進一步的研究發(fā)現(xiàn)小鼠中經mRNA不同選擇性剪切有多個轉錄本，其中，Lipina定位于3T3-L1的細胞核表達峰值在3T3-L1細胞分化的第二天，此后水平逐漸下降；LipinP定位于細胞質，其表達在分化的10h短暫的升高，20h時降低到背景水平，在第2天至第6天時逐漸升高；在小鼠的胚胎成纖維細胞(mouseembryonicfibroblasts,MEFs)中超表達Lipina，導致脂肪細胞分化必須的轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferatorsactivatedrec印tor，PPARy)禾口CCAAT"曾強子結合蛋白(CAAT/enhancerbindingprotein,C/EBP)的上調表達；Lipine蛋白定位于細胞核，起誘導脂肪合成基因表達的作用，在MEFs中超表達Lipine，導致脂肪酸合成過程中的關鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase1，ACC1)，脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase,FAS)，硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoylCoAdesaturase1，SCD1),磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK))和二?；视王；D移酶(diacylglycerolacyltransferase，DGAT)等基因的上調表達(P6terfy等，2005)?；蛟卺劸平湍?Saccharamycescerev('s,'ae)中的同源基因為iM/W，基因編碼一種Mg2+依賴的磷脂酸磷脂酶一_催化磷脂酸的脫磷酸作用，產生甘油二酯和磷酸。該酶在甘油三酯，磷酸卵磷酯和腦磷酯的生物合成中起重要作用。釀酒酵母中超表達/M//7基因直接導致Mg2+依賴的磷脂酸磷脂酶活性的提高；基因在大腸桿菌中的異源表達證實了其編碼產物為Mg2+依賴的磷脂酸磷脂酶，且酶的屬性與從酵母中純化的酶的屬性相似。缺少p^^基因的突變體將會使細胞積累磷脂酸，而甘油二酯及其衍生物甘油三酯的含量降低。在大腸桿菌中異源表達人的i^'"/基因也證實了i^'W基因編碼產物為一種Mg2+依賴的磷脂酸磷脂酶(Han等，2006)。此外，在小鼠和人上的研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中4^"/mRNA水平與血清中的葡萄糖，胰島素和甘油三酯含量存在很強的負相關(r=-0.81，P=0.001;r=-0.74;P=0,001;r=-0.64,P=0.001)。人上的研究發(fā)現(xiàn)，Z/^"7mRNA水平與"〃7^mRNA含量存在顯著相關(r=069，p<0.0001)(Suviolahti等，2006;vanHarmelen等，2007)
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克隆一種豬肌內脂肪含量基因丄戸'"/，利用該基因的一個多態(tài)性位點作為豬肌內脂肪含量的分子標記的應用，為豬的育種提供一種標記輔助選擇。本發(fā)明通過以下技術實現(xiàn)本申請人克隆得到一種豬肌內脂肪含量基因i^>7/，它的cDNA序列如序列表SEQIDNO:1所述。所獲得的cDNA序列長度為5559bp，序列中包含2685bp的開放閱讀框，lllbp的5'非翻譯區(qū)和2763bp的3'非翻譯區(qū)，即在該序列中。第l-lllbp處為5'UTR，第112-2796位CDS，第2797-5559位為3'UTR。在此基礎上，本申請人獲得了一種豬肌內脂肪含量基因的部分DNA序列如序列表SEQIDNO:3所述。該DNA片段長度為316bp，其中第1-162位為第二外顯子序列，第163-316位為第二內含子序列。在序列表SEQIDNO:3的第61bp處有一個C61-T61的堿基突變，導致/-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明設計了一對檢測序列表SEQIDNO;3中C61-T61堿基處突變的正、反向引物，該引物的序列如下所示正向引物5'GTTTGTCACCGTGAAGGA3',反向引物5'AAGCCACAGTAATCAGAACA3'。一種篩選適用于豬肌內脂肪含量性狀的分子標記的方法，按照以下步驟第一步用人Z^W基閔cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得相似性80%以上的EST;然后構建豬EST-重疊群，設計引物擴增cDNA片段，PCR產物純化、克隆和測序；設計3'RACE引物；提取豬肌肉組織總RNA并做cDNA第一鏈反轉錄；RACE的PCR擴增和RACE產物的純化、克隆和測序；通過序列分析獲得如序列表SEQIDNO:1所述的cDNA序列。第二步根據序列表SEQIDNO:l所述的cDNA序列與人i;^"7的基因組全長DNA序列的比對結果人致得岀外顯子的拼接位點，并根據豬i^'"7基因cDNA篩選豬DNA序列，設計引物進行PCR擴增，PCR產物純化、克隆和測序，獲得如序列表SEQIDNO:3所述的DNA序列。更詳細的技術方案清參見《具體實施方式》的實施例部分。申請人應用上述PCR-RFLP方法對豬內脂肪含量基因Z^'"7第61位堿基突變進行了檢測的應用。序列表SEQIDNO:1和SEQIDNO:3是本發(fā)明克隆的豬肌內脂肪含量基因的cDNA和DNA序歹U;圖l:是本發(fā)明i^/w/基因的制備的流程圖；圖2:是本發(fā)明中豬基因C61-T61堿基處r叫I-RFLPs的二種基因型(TTCCTC)電泳結果。具體實施方式實施例l:i/^/^基因的克隆(1)引物設計用人Z^加/基因cDNA(GenBank收錄號NMJ45693)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在Nucleotide數據庫豬EST數據庫中做同源序列篩選，獲得一系列相似性為80%以丄的ESTs(片段長度大于100bp)，將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)査'向相應序列，然后用DNAStat中的SeqMan程序構建豬EST-重疊群。根據EST拼接序列設計如表1所列的引物。(2)建立3'RACE方法以脂肪組織總RNA為模版，用引物anchor(見表l)進行反轉錄，以完成cDNA第一鏈的合成，然后進行兩輪PCR:以cDNA為模版，以adaptor和lpn-3Routter(序列見表1)為弓I物進行PCR擴增；以第一輪PCR產物為模版，以adaptor和lpn-3Rinner為弓I物進行第二輪PCR擴增(弓|物見表l)。表l:用于丄內"7基因cDNA克隆的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)PCR產物的純化、克隆和測序PCR產物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含冃的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，于7(TC溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產物純化試劑盒(購自Promega公司)純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是在每300融化的凝膠中加入1mlResin,混勻20s，將Resin/DNA混合物裝入注射器，使?jié){液通過Minicolumn擠出。再在注射器屮加入80%的異丙醇2ml，輕推活塞使異丙醇通過Minicolumn擠出，取FMinicolumn裝入1.5mlEpendorff管中，10，000g離心2min以干燥Resin，將Minicolumn裝入另一個干凈的1.5mlEpendorff管中，加入30~50|il滅菌水，靜置lmin，10,000g離心20s，以洗脫DNA存于Ependorff管巾。連接反應將純化PCR產物與pMD18-T載體連接，連接反應總體積是5pi,其中包括2.5^2xbuffer,0.5pi的T載體(購自TakaRa公司)，2pi的純化PCR產物，置16'C水浴過夜。感受態(tài)細胞的制備從37"C培養(yǎng)了16~20h的新鮮平板上挑取一個DH5a單菌落接種于2mlLB中，丁-37'C振蕩培養(yǎng)3h，轉接1ml菌液于含有30mlLB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37'C振蕩培養(yǎng)約4h,待OD600達到0.30.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10~15min，然后將菌液轉入離心管中于4°C4，000g離心10min以收集細胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復4。C4，000g離心10min—次，用4ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4。C保存?zhèn)溆?。轉化無菌狀態(tài)—F取100~120pi感受態(tài)細胞于1.5mlEpendorff管中，將5pi的連接產物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s,其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3~4min,加入400|il無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)45min。取100jil涂布于已提前4h涂布了IPTG(Is(jpropylthio-e-D-galactoside，中文名稱為異丙基硫代一P-D—半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37'C平放1b后倒置培養(yǎng)。質粒的小量制備挑取平板上的單菌落，接種于2—3mlLB中，37。C300r/min培養(yǎng)過夜。用1.5mlEP管12000r/min離心數秒收集菌體。每管加入100|_d用冰預冷的溶液I[50mM葡萄糖，25mMTris.Cl(pH8.0),10mMEDTA(pH8.0)]，渦旋振蕩至齒體充分懸浮。加入新配制的溶液II200pl,快速顛倒混勻，冰浴5min，然后加入預冷的溶液III[5M乙酸鉀，冰乙酸11.5ml，H2028.5ml]150nl，混勻后冰浴5min,12000r/min離心5min，將上清轉至另一EP管中，加入苯酚氯仿異戊醇(體積比為25:24:1)500^1,渦旋振蕩，離心后小心吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，一20。C沉淀30min，12000r/min離心5min，沉淀用70《乙醇洗滌2次，抽干，加入含有RNA酶的TE20^1。重組質粒的酶切鑒定取3nl質粒DNA與適量的雙蒸水混勻，使其總體積為15pl，加入2—3U限制性內切酶EcoRI及2nl相應的10X限制性內切酶反應緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置37"C水浴l一2小時，取2—3nl反應液于瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切結果與預計完全相同者，即為目的重組質粒。重組質粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上進行測序，序列測定由北京奧科生物技術有限公司完成。(4)序列的同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術信息中心(NCBI，NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)網站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)軟件.將測序后獲得的序列與GenBank數據庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該序列的功能信息。(5)丄A"7基因DNA序列的擴增根據豬cDNA序列與人丄pW基因的基因組全長DNA序列的比對結果大致得出外顯子的拼接位點，并根據豬Z^"/基因cDNA篩選豬DNA序列，設計引物P-SIF和P-SIR進行PCR擴增，按照(3)所示的方法進行PCR產物純化、克隆和測序。丄—7P-SIF5'GTTTGTCACCGTGAAGGA3'，P-SIR5'AAGCCACAGTAATCAGAACA3'。豬基因的克隆結果從中國地方豬種通城豬的成年豬的脂肪組織提取總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，分別用表1所示的引物進行PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示均為特異的PCR產物。將PCR產物回收純化后克隆測序，并用DNAStar軟件中的S叫Man程序進行拼接，得到一條長度為5559bp的cDNA序列(如序列表SEQIDNO:1所示)。將這段cDNA序列在GenBank中進行同源性檢索，檢索結果該序列與人基因cDNA(GenBank收錄號NM—145693)的相似性為82%以上，序列分析表明該cDNA序列具有2685bp(nt112-2796)的開放閱讀框，編碼一個由894個氨基酸組成的蛋白質。然后從豬血液基因組中提取DNA，用引物P-SIF和P-SIR擴增得到長度為316bp特異擴增片段(如序列表SEQIDNO:3所示)，序列分析表明該序列包含部分第2外顯子和部分第2內含子(參見序列表SEQIDNO:3)。實施例2:基因C61-T6irfl9I-RFLP基因型與部分胴體性狀和肉質性狀的關聯(lián)分析的應用PCR-RFLP診斷方法MU)PCR擴增條件以P-SIF和P-SIR為引物進行PCR擴增，PCR反應總體積2(VI，其中豬基因組DNA約100ng，含IXbuffer(Promega)，1.5腿ol/LMgCl2，dNTP終濃度為150nmol/L,引物終濃度為0.4)jmol/L，2UragrDNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是94°C3min，循環(huán)35次94'C30s，58°C30s，然后72'C25s，最后72°C延伸5min。PCR反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(2)RFLP檢測條件PCR產物酶切反應體積是10nl,其中l(wèi)xbuffer1pi,PCR產物4pi,限制性內切酶raW為0.3^(10U一)，用H2O補足10nl，將樣品混勻后離心，65。C酶切4h，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照?；虻腃61-T61能被r卯T限制性內切酶(酶切位點為T丄CGA)識別，若基岡型為CC,酶切后產生60bp和256bp兩種大小的片段；若基因型為TT，酶切后長度仍為316bP:若基閑型為TC,則產生316bp、256bp和60bp三種大小的片段，三種基因型CC，TC，TT如圖2所述。標記性狀關聯(lián)分析申請人利用所在的動物分子生物學與育種實驗室組建的"通城豬"(該品種屬于一種公開飼養(yǎng)的中國地方豬品種)和其他血緣的豬群做性狀關聯(lián)分析，檢測的個體數共188頭，其中通城豬42頭，英國大白豬25頭，瑞典長白豬26頭，大長通豬47頭，長大通豬48頭，所分析的性狀有部分胴體性狀和肉質性狀(內脂率，板油率，3點平均背膘厚，肩部最厚處背膘厚，胸腰椎間背膘厚，臀中肌中點處背膘厚，6、7肋間背膘厚，IO肋背膘厚和肌內脂肪含量)。分析方法使用SAS(視窗V8版)軟件中的一般線性模型(GeneralLinearModel,GLM)程序進行性狀關聯(lián)分析，建立的最小一乘模型如下yijk=H+GENOTYPE,+PICIj十COMBINATIONk+sljk，其中，yijk是性狀觀察值，n為總體均數，GENOTYPEi為基因型效應，PICI」為批次效應，COMBINATIONk為組合的效應，syk為隨機誤差，假定服從N(0，02)分布?；蛐蜋z測結果表明在所檢測的188個個體中，CC基因型有149個，TC基因型有35個，TT基因型有4個。基因型間性狀的簡單均數和標準差分析結果總結于表2，關聯(lián)分析結果表明，TC基因型豬的肌內脂肪含量比CC基因型豬的高，且差異達到顯著水平(尸<0.05)。表2:不同Z戶/基因7hgI-RFLP基因型與部分生產性狀的關聯(lián)分析基因型個體數目肌內脂肪含量(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>序列表<110〉華中農業(yè)大學<120>—種豬肌內脂肪含量基因Lpinl的克隆及其應用<130><141〉2007-09-18<160〉3<170>Patentlnversion3.1<210>1<211〉5559<212〉DNA<213>豬(Susscrofa)<220><221〉CDS<222〉(112).(2796)<223〉<220><221〉mutation<222〉(204)..(204)<223〉<220><221>gene<222>(1)..(5559)<223><220><221>5'UTR<222〉(1)..(111)〈223><220><221>3'UTR<222〉(2797)..(5559)<223><400>1cgccgcctggtaaatcggatccacctcgcctcccgcctcccgcctcccgccttxggagtc60gagtccccgccgagccccggccgagccccggccgccgcagaggctcaaaccatgaac117MetAsn1tacgtcgggcagctggcgggccaggtgtttgtcaccgtgaaggagetc啦TyrValGlyGLnLeuAlaGlyGinValPheValThrValLysGluLeu51015tacaaggggctgaatcccgccaccctgtecggctgcategacateate2丄3TyrLysGlyLeuAsnProAlaThrLeuSerGlyCyslieAsplielie202530gtggtgeggcagcccaacgggagectgcagtgcteccccttccacgtg261ValValArgGinProAsnGlySerLeuGinCysSerProPheHisVal35404550cgcttcgggaagatgggggtcctgcgcteccgagagaaggtggtggac309ArgPheGlyLysMetGlyValLeuArgSerArgGluLysValValAsp556065atagagateaacggagagteagtggatctgcacatgaaactgggagac357lieGlulieAsnGlyGluSerValAspLeuHisMetLysLeuGlyAsp707580aatggagaggcattttttgttcaagagacggataatgatcaggaggtg405AsnGlyGluAlaPhePheValGinGluThrAspAsnAspGinGluVal859095atecccacgcacctggccacctecccaatectgteggaaggcgccteg453lieProThrHisLeuAlaThrSerProlieLeuSerGluGlyAlaSer100105110eggatggagteccagctgaaaaggaactecctggateggctgeggage501ArgMetGluSerGinLeuLysArgAsnSerLeuAspArgLeuArgSer115120125130ctggaccccageacgteagcccaggtcctgccccccggcgagagecct549LeuAspProSerThrSerAlaGinValLeuProProGlyGluSerPro135140145tecagtggctctttggtgaagaagagaeggaagagg.aggaggaagtec597SerSerGlySerLeuValLysLysArgArgLysArgArgArgLysSer150155160cagctggacagectgaaaagggacgacaacacgaaca_cgteggaggat645GinLeuAspSerLeuLysArgAspAspAsnThrAsnThrSerGluAsp165170175gaggacatgtttcccatagagatgageteggacgaggaggetgagccc693GluAspMetPheProlieGluMetSerSerAspGluGluAlaGluPro180185190ctggacageagtagaactctttctagtgagatecctccattccaggaa741LeuAspSerSerArgThrLeuSerSerGlulieProProPheGinGlu195200205210215220225gcctcgtaccctaattecgacagagagtggteacccagegccagtcct837AlaSerTyrProAsnSerAspArgGluTrpSerProSerAlaSerPro230235240teagttteceggccttecacacctaaaagtgatteagaattggtcagt885SerValSerArgProSerThrProLysSerAspSerGluLeuValSer245250255aagtecgcggacaggacaatgcagaagaacaaccttgaaatgctgtgg933LysSerAlaAspArgThrMetGinLysAsnAsnLeuGluMetLeuTrp260265270etctggggggagctgccgcaagccacaaagteatctccaetcaagctg981LeuTrpGlyGluLeuProGinAlaThrLysSerSerProLeuLysLeu275280285290aaagactecageccgttgaacageaggaaaatetatgata犯atgcac1029LysAspSerSerProLeuAsnSerArgLyslieTyrAspLysMetHis295300305tttcaagccattcacagtgaatcttcggacgcgttcagegaccagtea1077PheGinAlalieHisSerGluSerSerAspAlaPheSerAspGinSer310315320ccgacgggggccegggagtecccggtgccgccgetcttggagcagage1125ProThrGlyAlaArgGluSerProValProProLeuLeuGluGinSer325330335aagccccaggccgagatgccgttcgcgaacgaagaagacgttgaggcc1173LysProGinAlaGluMetProPheAlaAsnGluGluAspValGluAla340345350ttaggggetgcggccccgcctetaccca_ccategaagagcccaagccc1221LeuGlyAlaAlaAlaProProLeuProThrlieGluGluProLysPro355360365370etctct,gccageactgcccaatctgcgageaagacagactcgccttea1269LeuSerAlaSerThrAlaGinSerAlaSerLysThrAspSerProSer375380385agga犯aaggacaaacgaageagacacetcggggccgacggcgtctac1317ArgLysLysAspLysArgSerArgHisLeuGlyAlaAspGlyValTyr390395400ctggatgacetcacagacatggatcccgaagtcgccgccctgtatttc1365LeuAspAspLeuThrAspMetAspProGluValAlaAlaLeuTyrPhe艦410415cccaaaaacggagatccgtctgggetcacaaaacaggccagegacaac1413ProLysAsnGlyAspProSerGlyLeuThrLysGinAlaSerAspAsn420425430ggcgcccgctcggccaaccagtecccacagtecgcgggcagetctggc1461GlyAlaArgSerAlaAsnGinSerProGinSerAlaGlySerSerGly435440445450gtcgacageggcgtggagageacctecgacggcctgagggacctgccg1509ValAspSerGlyValGluSerThrSerAspGlyLeuArgAspLeuPro455460465tecategccatetecctgtgcgggggcetcagegacaacagggaaate1557SerlieAlalieSerLeuCysGlyGlyLeuSerAspAsnArgGlulie470475480accaaagatgtgtttttggaacaagccgtgtcgtatcaacagtttgtg1605ThrLysAspValPheLeuGluGinAlaValSerTyrGinGinPheVal485490495gacaaccctgccetcategacgaccccaatetcgtggtgaagateggg1653AspAsnProAlaLeulieAspAspProAsnLeuValValLyslieGly500505510aataaatactataactggacaacagccgcacctctgetcctggcgatg1701AsnLysTyrTyrAsnTrpThrThrAlaAlaProLeuLeuLeuAlaMet515520525530caggccttccagaaacctttgccaaaggccacggtggaatctateatg1749GinAlaPheGinLysProLeuProLysAlaThrValGluSerlieMet535540545agggataagatgccc,卿ggaggaagatggtggttttcgtggegg1797ArgAspLysMetProArgLysGlyGlyArgTrpTrpPheSerTrpArg550555560ggaagaaacaccgcgateaaagaggaaageaagccagagcagtgcttg1845GlyArgAsnThrAlalieLysGluGluSerLysProGluGinCysLeu565570575gcaggaagecacagtsetggggaigcagccgtcscagcttggcatg1893AlaGlyLysSerHisSerThrGlyGluGinProSerGinLeuGlyMet580585590gccaccagaatgaagcacgaateatectecagtgatgaggagcacgca1941AlaThrArgMetLysHisGluSerSerSerSerAspGluGluHisAla595600605610getgccaagccgtecggcacaagecacetccccctgttgtecagegtc1989AlaAlaLysProSerGlyThrSerHisLeuProLeuLeuSerSerVal615620625agetacagga_agaccctgeggetcacgtc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技術領域：
，具體涉及一種豬肌內脂肪含量基因Lpin1的克隆及其作為分子標記的應用。本發(fā)明的特征是克隆得到如序列表SEQIDNO1和SEQIDNO3所示的豬肌內脂肪含量基因Lpin1部分cDNA序列和DNA序列，經過管理分析的應用發(fā)現(xiàn)序列表SEQIDNO3中C61-T61與肌內脂肪含量存在顯著相關。本發(fā)明公開了豬Lpin1基因序列、影響肌內脂肪含量的基因變異位點以及獲得該基因的制備方法及其應用。本發(fā)明為豬的標記輔助育種提供了新的分子標記。文檔編號C12N15/12GK101157922SQ20071005325公開日2008年4月9日申請日期2007年9月18日優(yōu)先權日2007年9月18日發(fā)明者何小平,梅余,榜劉,彭中鎮(zhèn),徐學文,朱猛進,奎李,李長春,斌樊,趙書紅申請人:華中農業(yè)大學