利用MicroRNA156及其靶基因調(diào)控植物揮發(fā)油含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用MicroRNA156及其靶基因調(diào)控植物揮發(fā)油或其中倍半萜含量的方法。首次揭示一種調(diào)控植物揮發(fā)油或其中倍半萜類物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因——Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因(SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE genes，SPLs)，該基因是miR156的靶基因。SPLs通過(guò)直接與倍半萜合酶啟動(dòng)子結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄；并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，證實(shí)該機(jī)制在多種植物中發(fā)揮作用，可基于此獲得高產(chǎn)植物揮發(fā)油的植物。
【專利說(shuō)明】利用Micr〇RNA156及其靶基因調(diào)控植物揮發(fā)油含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和植物學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及利用MicroRNA156及 其靶基因調(diào)控植物揮發(fā)油或其中倍半萜含量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物揮發(fā)油（精油）是具有一定揮發(fā)性的油狀液體的統(tǒng)稱，是植物芳香物質(zhì)的提 取物。含揮發(fā)油的中草藥非常多，亦多具芳香氣味，尤以唇形科（薄荷、紫蘇、藿香等）、傘 形科（茴香、當(dāng)歸、芫荽、白芷、川芎等）、菊科（艾葉、茵陳篙、蒼術(shù)、白術(shù)、木香等）、蕓香科 (橙、桔、花椒等）、樟科（樟、肉桂等）、姜科（生姜、姜黃、郁金等）等科更為豐富。植物揮 發(fā)油成分復(fù)雜，主要由萜類化合物構(gòu)成，芳香族化合物次之，還包含少量的脂肪酸衍生物。 其中萜類化合物又分為單萜、倍半萜以及少量的二萜，常見(jiàn)的如薄荷中的薄荷酮、廣藿香中 的廣藿香醇等。揮發(fā)油大多具有抑菌殺毒、凝神靜氣、解熱鎮(zhèn)痛、矯味定香等作用，在醫(yī)藥、 食品、日化用品等方面應(yīng)用廣泛。目前植物揮發(fā)油的研究主要集中在提取工藝優(yōu)化、化學(xué)成 分分析以及精油成分的生物活性研究等方面，揮發(fā)油合成途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究很少。
[0003] 模式植物擬南芥開(kāi)花后，花序會(huì)釋放以單萜和倍半萜為主的揮發(fā)性成分，其中 大部分倍半萜由TPS21和TPS11兩個(gè)倍半萜合酶催化合成，其中TPS21主要催化法尼基 焦磷酸合成石竹烯，它們?cè)跀M南芥花器官特異表達(dá)，而在葉片中幾乎不表達(dá)（Chen，F(xiàn).等 (2003).The Plant celll5,481-494 ;Tholl,D.等（2005).The Plant journal:for cell and molecular biology42, 757-771)。推測(cè)植物發(fā)育因子在調(diào)控植物廠類合成的時(shí)空特異 性方面發(fā)揮重要作用。擬南芥中最近的研究表明SPL9通過(guò)破壞花青素合成的轉(zhuǎn)錄激活復(fù) 合體MYB-bHLH-WD40抑制了擬南芥中花青素的積累。
[0004] 廣藿香（Pogostemon cablin)是唇形科多年生草本植物，所產(chǎn)生的廣藿香精 油被廣泛應(yīng)用于香料及醫(yī)療行業(yè)。與其它唇形科植物產(chǎn)生的混合型精油不同，廣藿香 精油主要是由倍半廠構(gòu)成（Deguerry，F(xiàn).等（2006) .Archives of biochemistry and biophysics454,123-136)。廣藿香精油包含約 24 種倍半廠（Bur6，C.M.等（2004). Journal of Essential Oil Researchl6，17_19)，其中廣藿香醇（(-)-patchoulol)約占 35%，是其 重要組分。廣藿香醇香味持久、獨(dú)特宜人是良好的定香劑，目前作為天然香料被廣泛用于日 化產(chǎn)品中。此外，廣藿香醇還具有抑制真菌繁殖，驅(qū)除和毒殺白蟻的作用。廣藿香醇合酶 (patchoulol synthase，PTS)是一個(gè)多功能酶，負(fù)責(zé)合成廣藿香葉片提取物中廣藿香醇以 及其它13種倍半廠產(chǎn)物（Deguerry et al. ,2006)。
[0005] 本領(lǐng)域有必要對(duì)植物揮發(fā)油在植物中等產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行有效研究，并基于此改進(jìn)植 物中植物揮發(fā)油有效成分的含量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供利用Micr〇RNA156及其靶基因調(diào)控植物揮發(fā)油或其中倍 半萜含量的方法。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種調(diào)節(jié)植物（如芳香植物）揮發(fā)油或其中的倍半萜 含量的方法，所述方法包括：調(diào)節(jié)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)。
[0008] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)是：上 調(diào)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)，從而提高植物揮發(fā)油或其中的倍半萜含 量。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的上調(diào)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)包括： 將Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)化植物，獲得過(guò)表達(dá)Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的 轉(zhuǎn)基因植物，所述的轉(zhuǎn)基因植物的揮發(fā)油或其中倍半萜含量提高。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的將Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)化植物包括：
[0011] (a)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述表達(dá)載體中含有構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物含有 Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)盒；
[0012] (b)將植物細(xì)胞、組織或器官與步驟（a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述的構(gòu)建物轉(zhuǎn) 入植物。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：
[0014] (c)選擇出轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物的植物細(xì)胞、組織或器官；以及
[0015] (d)將步驟（c)中的植物細(xì)胞、組織或器官再生成植物。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因（SPL)是miR156祀向的 Squamosa 啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因；更佳地，選自：SPL3，SPL4，SPL5，SPL9，SPL15，SPL2，SPL10， SPL11, SPL6, SPL13A, SPL13B。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的SPL9基因選自：(a)At2g42200所示核苷酸序列的多核苷 酸；或（b)核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與（a)限定的多核苷酸序列雜交且編碼的蛋白具 有At2g42200編碼的蛋白同樣功能的多核苷酸；（c)核苷酸序列與（a)限定的多核苷酸序 列有70%以上（較佳地80%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上）相 同性且編碼的蛋白具有At2g42200編碼的蛋白同樣功能的多核苷酸。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的SPL10基因選自：（a'）ATlG27370所示核苷酸序列的多核 苷酸；或（b'）核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與（a'）限定的多核苷酸序列雜交且編碼的蛋 白具有AT1G27370編碼的蛋白同樣功能的多核苷酸；(c'）核苷酸序列與（a'）限定的多核 苷酸序列有70%以上（較佳地80%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以 上）相同性且編碼的蛋白具有AT1G27370編碼的蛋白同樣功能的多核苷酸。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的上調(diào)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)包括： 將下調(diào)miR156表達(dá)的抑制分子轉(zhuǎn)化植物，通過(guò)下調(diào)miR156來(lái)上調(diào)Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋 白基因的表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植物的揮發(fā)油或其中倍半萜含量提高。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的下調(diào)miR156表達(dá)的抑制分子是MM156或其活性片段 (發(fā)揮抑制作用的關(guān)鍵位點(diǎn)片段）；較佳地，所述的Μ頂156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所 示，所述的MM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第237-256位所示。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)是：下 調(diào)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)，從而降低植物揮發(fā)油或其中倍半萜含量。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的下調(diào)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)包括： 將Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)抑制分子轉(zhuǎn)化植物，獲得Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋 白基因表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因植物，所述的轉(zhuǎn)基因植物的揮發(fā)油或其中倍半萜含量降低。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)抑制分子是 miR156f ;較佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO: 1中第82-101位所示核苷酸序列；所述 的miR156f前體具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括（但不限于）：十字花科植物（如擬南芥），唇形 科植物（如廣藿香，薄荷，羅勒），傘形科植物，菊科植物，蕓香科植物，樟科植物，姜科植物， 禾本科植物，茄科植物。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的倍半萜包括（但不限于）：石竹烯，廣藿香醇，廣藿香 烯，廣藿香烯，α-廣藿香烯，β-欖香烯，α-愈創(chuàng)木烯，4, 11-愈創(chuàng)木二烯，α-布藜 烯。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的用途，用于提高植物揮發(fā) 油或其中倍半萜含量。
[0027] 在本發(fā)明的另一方面，提供下調(diào)miR156表達(dá)的抑制分子的用途，用于提高植物揮 發(fā)油或其中倍半萜含量。
[0028] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的下調(diào)miR156表達(dá)的抑制分子是MM156或其活性片段；較 佳地，所述的MM156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述的MM156的活性片段的核苷 酸序列如SEQ ID N0: 2中第237-256位所示。
[0029] 在本發(fā)明的另一方面，提供Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)抑制分子的用 途，用于降低植物揮發(fā)油或其中倍半萜含量。
[0030] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)抑制分子是 miR156f ;較佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO: 1中第82-101位所示核苷酸序列；所述 的miR156f前體具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
[0031] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖l、miR156f、rSPLs (以SPL10為例）的雙元植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
[0033] A、截取miR156f基因組中包含前體序列（下劃線標(biāo)出）共計(jì)276bp長(zhǎng)的片段構(gòu)建 Pro35S:MIR156f 雙元載體。
[0034] B、將SPL10基因 cDNA中miR156靶位點(diǎn)的核苷酸序列進(jìn)行同義突變。單下劃線： SPL10基因中原始miR156靶位點(diǎn)的核苷酸序列；方框：靶位點(diǎn)的核苷酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸 序列；黑色：SPL10基因中miR156靶位點(diǎn)突變后的核苷酸序列。
[0035] C、PCR突變SPL10中miR156靶位點(diǎn)的核苷酸序列示意圖。P1(S)和P2(AS)為片 段全長(zhǎng)序列。P3(AS)為突變位點(diǎn)上游反向引物。P4引物5'端15-20bp與引物P3互補(bǔ)，3' 端20bp左右與突變位點(diǎn)下游序列互補(bǔ)，中部為突變后序列。
[0036] 圖 2、TPS21 受 miR156 調(diào)控。其中，thujopsene :羅漢柏烯； trans-β -Caryophyllene (Caryophyllene):石竹烯；n-Nonyl acetate :乙酸壬酉旨。
[0037] A 和 B、GC-MS 檢測(cè) Pro35S:MIR156 和 Pro35S:MIM156 植物花序中倍半萜含量。** 代表P〈0. 01，*代表P〈0. 05,即與野生型擬南芥相比具有顯著差異。
[0038] C、Pro35S:MIR156 和 Pro35S:MIM156 植物花序中 TPS21、TPS11 表達(dá)水平 qRT-PCR 檢測(cè)。
[0039] 圖3、miR156靶基因 SPLs激活TPS21表達(dá)。
[0040] A、qRT-PCR 檢測(cè) TPS21 在 Pro35S:rSPL3、ProSPL9:rSPL9、Pro35S:rSPL10 花序中 表達(dá)。
[0041] B、qRT-PCR 檢測(cè) TPS21 在誘導(dǎo)體系 ProAlcA:MIR156f 和 ProSPL9:rSPL9-GR 植物 中的瞬時(shí)表達(dá)水平。
[0042] C-E、ProTPS21:⑶S 在野生型（C)、Pro35S:MIR156(D)、Pro35S:MIM156(E)背景下 花序的⑶S染色結(jié)果。Bar=lcm。
[0043] 圖4、SPL9直接結(jié)合TPS21啟動(dòng)子。
[0044] A、TPS21上游1376bp片段包含SPL蛋白結(jié)合位點(diǎn)GTAC(以黑色三角標(biāo)注）示意圖。 cisl、cis2、cis3代表用于EMSA實(shí)驗(yàn)的3個(gè)片段；I、II、III、IV代表ChIP實(shí)驗(yàn)中Real-time 擴(kuò)增片段位置。
[0045] B、體外EMSA驗(yàn)證SPL9與TPS21啟動(dòng)子結(jié)合。上行是不同濃度HIS - SPL9融合蛋 白（0、30、90ng)分別與Cy5標(biāo)記的cisl、cis2、cis3以及負(fù)對(duì)照kasO啟動(dòng)子片段結(jié)合實(shí) 驗(yàn)；下行是cisl、cis3分別與各自未標(biāo)記的冷探針的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。
[0046] C、體內(nèi)ChIP富集實(shí)驗(yàn)證明GFP-rSPL9蛋白結(jié)合TPS21啟動(dòng)子。收集生長(zhǎng)4周的 Pr〇SPL9:GFP-rSPL9和野生型對(duì)照的花序作為ChIP實(shí)驗(yàn)材料。TPS21啟動(dòng)子不同區(qū)域富集 倍數(shù)計(jì)算：首先以GFP抗體沉淀得到DNA中基因豐度比加 HA抗體沉淀得到DNA中基因豐 度，再以ProSPL9: GFP-rSPL9植物中該比值比野生型植物中該比值。
[0047] 圖5、轉(zhuǎn)基因廣藿香陽(yáng)性植株篩選。
[0048] A、qRT_PCR檢測(cè)SPL10在Pro35S:rSPL10葉片中表達(dá)。以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因廣藿香為 對(duì)照組，以廣藿香Patl8S(EF529587)作為內(nèi)標(biāo)基因。"L+數(shù)字"表示相應(yīng)轉(zhuǎn)基因株系中不 同植株編號(hào)，后續(xù)同。
[0049] B、qRT-PCR檢測(cè)Pro35S:MIR156轉(zhuǎn)基因廣藿香葉片中成熟miR156水平。以空質(zhì) 粒轉(zhuǎn)基因廣藿香為對(duì)照組，以廣藿香Patl8S(EF529587)作為內(nèi)標(biāo)基因。
[0050] 圖6、轉(zhuǎn)基因廣藿香陽(yáng)性植株中PTS表達(dá)水平檢測(cè)。
[0051] A、qRT_PCR檢測(cè)PTS在Pro35S:rSPL10葉片中表達(dá)。以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因廣藿香為對(duì) 照組，以廣藿香Patl8S(EF529587)作為內(nèi)標(biāo)基因。
[0052] B、qRT_PCR檢測(cè)Pro35S:MIR156轉(zhuǎn)基因廣藿香葉片中PTS水平。以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因 廣藿香為對(duì)照組，以廣藿香Patl8S(EF529587)作為內(nèi)標(biāo)基因。
[0053] 圖7A-B、miR156靶向的SPL基因調(diào)控廣藿香精油成分的合成。n-Nonyl acetate :乙酸壬酯；β -patchoulene : β -廣藿香烯；β -elemene : β -欖香烯； trans-β -caryophyllene ：石竹烯；a -guaiene : α -愈創(chuàng)木烯；a -patchoulene : α -廣藿香烯；γ -patchoulene : γ -廣藿香烯；guai-4, 11-diene :4, 11-愈創(chuàng)木二烯； a-bulnesene : α -布藜烯；（-)-patchoulol :廣藿香醇；pogostone :廣藿香酮。
[0054] 圖8、一月大T1代轉(zhuǎn)基因廣藿香葉片中PTS表達(dá)水平和廣藿香醇含量檢測(cè)。
[0055] A、qRT-PCR 檢測(cè) PTS 在 Pro35S:rSPL10 和 Pro35S:MIR156f 轉(zhuǎn)基因植物葉片中表 達(dá)?？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)基因廣藿香為對(duì)照組，廣藿香Patl8S(EF529587)作為內(nèi)標(biāo)基因。
[0056] B、Pro35S:rSPL10、空質(zhì)粒、Pro35S:MIR156f葉片中廣藿香醇含量檢測(cè)。首先與內(nèi) 標(biāo)相比，然后除以樣品鮮重，得出百分比。#代表P〈0. 01/代表P〈0. 05,即與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因 廣藿香相比具有顯著差異。
[0057] 圖9、掃描電鏡檢測(cè)廣藿香葉片表皮毛。
[0058] A、廣藿香葉片三種表皮毛：非腺毛（左）、頭狀腺毛（中）、盾狀腺毛（右）掃描電 鏡圖。
[0059] B-C、廣藿香近軸面B和遠(yuǎn)軸面C葉片表皮毛掃描電鏡圖。
[0060] D、廣藿香近軸面和遠(yuǎn)軸面葉片表皮毛密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果。**代表P〈0. 01，*代表 P〈0. 05,即與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因廣藿香相比具有顯著差異。

【具體實(shí)施方式】
[0061] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，首次揭示一種調(diào)控植物揮發(fā)油或其中倍半萜類物 質(zhì)合成的關(guān)鍵基因-Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因 （SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE genes，SPL(s))，該基因是miR156的靶基因。SPL通過(guò)直接與倍半萜合酶啟 動(dòng)子結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄；并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，證實(shí)該機(jī)制在多種植物（包括香料植物）中發(fā)揮 作用，可基于此獲得高產(chǎn)植物揮發(fā)油的植物。
[0062] 如本文所用，所述的"植物"包括但不限于：十字花科植物、唇形科植物等。比如， 所述的"植物"包括但不限于：十字花科鼠耳芥屬植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana)， 唇形科廣霍香屬植物如廣藿香（Pogostemoncablin)。較佳地，所述的"植物"為香料植物， 例如但不限于唇形科薄荷和羅勒、禾本科的檸檬香茅、茄科的番茄等。所述的植物適合進(jìn)行 基因的轉(zhuǎn)化操作。
[0063] 本發(fā)明人以擬南芥為模式植物，發(fā)現(xiàn)擬南芥miR156靶基因 SPL9直接結(jié)合TPS21 啟動(dòng)子，并激活TPS21轉(zhuǎn)錄，從而使TPS21催化產(chǎn)物石竹烯成為擬南芥花序的主要揮發(fā)成 分，含量翻倍。廣藿香（學(xué)名Pogostemon cablin)是唇形科植物，多年生草本直立植物，有 香氣；擬南芥miR156靶基因 SPL10能夠提高廣藿香中PTS轉(zhuǎn)錄水平，從而提高了廣藿香精 油重要組分廣藿香醇及大部分倍半萜成分的含量（如廣藿香醇及其他8種PTS催化的倍半 萜產(chǎn)物）。本發(fā)明的研究結(jié)果提示，miR156靶基因 SPLs同樣調(diào)控了十字花科（擬南芥）和 唇形科（廣藿香）的其他香料作物，甚至傘形科、菊科、蕓香科、樟科、姜科等的作物中植物 揮發(fā)油含量，提供了通過(guò)基因工程改進(jìn)作物中植物揮發(fā)油含量的方法。
[0064] 在本發(fā)明中，"Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白（SPL) "指具有提高植物揮發(fā)油或其中倍 半萜含量功能的多肽。較佳地，所述的SPL是編碼基因受到miR156調(diào)控的一類SPL。例如， 擬南芥中，miR156可調(diào)控11個(gè)SPL靶基因，進(jìn)一步分為SPL3/4/5，SPL9/15，SPL2/10/ll和 SPL6/13A/B共4個(gè)分枝。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的SPL是SPL9或SPL10 ;所述的SPL9 可以具有At2g42200所示核苷酸序列或其同源序列、衍生物或變異體；所述的SPL10可以具 有AT1G27370所示核苷酸序列或其同源序列、衍生物或變異體。
[0065] 本發(fā)明還包括具有與SPL蛋白相同功能的、SPL蛋白的變異形式。這些變異形式包 括（但并不限于）：若干個(gè)（通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10 個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè)）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端 添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)（通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi)）氨基 酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功 能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。 該術(shù)語(yǔ)還包括SPL蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0066] 本發(fā)明還包括SPL蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"片段"、"衍生 物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的SPL蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā) 明的多肽片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基（優(yōu) 選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺 傳密碼編碼的，或（ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽。根據(jù)本文的定義 這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
[0067] 任何一種SPL蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，SPL蛋白的生 物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長(zhǎng)的SPL蛋白的全部或部分功能。 通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長(zhǎng)SPL蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件 下，所述活性片段能夠保持全長(zhǎng)SPL蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。 [0068] 多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突 變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與SPL蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗 SPL蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含SPL蛋白或其片段 的融合蛋白。
[0069] 任何與所述的SPL蛋白同源性高（比如與SEQ ID N0:2所示的序列的同源性為 70%或更高；優(yōu)選的，同源性為80%或更高；更優(yōu)選的，同源性為90%或更高，如同源性95%， 98%或99%)的、且具有SPL蛋白相同功能的蛋白也包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0070] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明SPL蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。所述的 多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。 DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。術(shù)語(yǔ)"編碼多肽的多核苷酸 (編碼基因）"可以是包括編碼所述多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編 碼序列的多核苷酸。
[0071] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或 非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
[0072] 本發(fā)明還包括與本發(fā)明的核苷酸序列具有70%以上，更優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90% 以上，最優(yōu)選95%以上相同性的核酸，所述核酸也具有SEQ ID NO: 1所示序列相同的調(diào)控作 用。"相同性"是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水平（即序列同源 性、相似性或同一'I"生）。
[0073] 應(yīng)理解，雖然本發(fā)明的SPL基因優(yōu)選獲自十字花科植物，但是獲自其它植物的與 擬南芥SPL基因高度同源（如具有70%以上，如80%，85%、90%、95%、甚至98%序列相同性） 的其它SPL基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周 知的，例如BLAST。
[0074] 本發(fā)明也涉及包含所述的多核苷酸的載體，以及用所述的載體或SPL基因工程產(chǎn) 生的宿主細(xì)胞。
[0075] SPL基因可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)"重組表達(dá)載體"指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì) 粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主 體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起 點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
[0076] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等 真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌 屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。
[0077] 所述的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì) 使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于 啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng) 子和宿主細(xì)胞。
[0078] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化植物 可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如噴灑法、葉盤法、水稻幼胚轉(zhuǎn)化法等。對(duì)于轉(zhuǎn) 化的植物組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得植物揮發(fā)油性狀發(fā)生改變的植 物。
[0079] 本發(fā)明的SPL基因可由組織特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，特異性表達(dá)。所述的特異啟動(dòng)子可 以是外源（異源）的。對(duì)所述特異啟動(dòng)子的核酸序列沒(méi)有特別的限制（如一種結(jié)構(gòu)性核酸 序列），例如某些在農(nóng)業(yè)或植物改良上具有重要器官特異性的啟動(dòng)子。
[0080] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化植物也 可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法、花芽浸泡法等。對(duì)于轉(zhuǎn) 化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物。
[0081] 作為一種方式，制備轉(zhuǎn)基因植物的方法是：將攜帶啟動(dòng)子序列和目的基因（可操 作地連接）的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌再將含啟動(dòng)子和目的基因的載體片段整合到植 物的染色體上。涉及的轉(zhuǎn)基因受體植物例如是擬南芥，廣藿香。
[0082] 本發(fā)明提供了所述的SPL蛋白或SPL基因的用途，用于提高植物揮發(fā)油或其中倍 半萜含量。
[0083] 本發(fā)明還涉及SPL的上調(diào)劑或下調(diào)劑及其用途。由于SPL的上調(diào)劑或下調(diào)劑可調(diào) 節(jié)SPL的表達(dá)和/或調(diào)節(jié)SPL的活性等，因此，所述的SPL的上調(diào)劑或下調(diào)劑也可通過(guò)對(duì) SPL的影響來(lái)調(diào)節(jié)植物揮發(fā)油或其中倍半萜含量，從而達(dá)到改良植物的目的。
[0084] 任何可提高SPL蛋白的活性、提高SPL蛋白的穩(wěn)定性、促進(jìn)SPL蛋白的表達(dá)、延長(zhǎng) SPL蛋白有效作用時(shí)間、或促進(jìn)SPL的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，用于提高植物揮 發(fā)油或其中倍半萜含量。任何可降低SPL蛋白的活性、降低SPL蛋白的穩(wěn)定性、抑制SPL蛋 白的表達(dá)、減少SPL蛋白有效作用時(shí)間、或降低SPL的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明， 作為SPL的下調(diào)劑、拮抗劑或抑制劑（即：下調(diào)SPL蛋白表達(dá)的物質(zhì)），如抗所述SPL蛋白 的抗體，干擾所述SPL蛋白的編碼基因表達(dá)的干擾分子（如可形成microRNA的干擾分子）。 所述的下調(diào)劑、拮抗劑或抑制劑可用于通過(guò)下調(diào)SPL的表達(dá)，降低植物揮發(fā)油或其中倍半 萜含量。在得知了靶序列后，制備干擾特定基因表達(dá)的干擾分子的方法是本領(lǐng)域人員熟知 的。
[0085] 本發(fā)明還涉及一種改良植物的方法，該方法包括調(diào)節(jié)所述植物中SPL基因的表 達(dá)。
[0086] -方面，本發(fā)明還提供了一種提高植物揮發(fā)油或其中倍半萜含量的方法，所述的 方法包括：上調(diào)所述植物中SPL基因的表達(dá)（包括使SPL基因過(guò)表達(dá)）。
[0087] 在得知了所述的SPL蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來(lái)調(diào)節(jié) 所述的SPL蛋白的表達(dá)。比如可通過(guò)本領(lǐng)域人員已知的途徑將攜帶SPL基因的表達(dá)單位 (比如表達(dá)載體或病毒等）遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá)活性的SPL蛋白。
[0088] 此外，也可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來(lái)降低SPL基因的表達(dá)或使之缺失 表達(dá)，比如將靶向SPL基因的miRNA或攜帶反義SPL基因的表達(dá)單位（比如表達(dá)載體或病 毒等）遞送到靶點(diǎn)上，使得細(xì)胞或植物組織不表達(dá)或降低表達(dá)SPL基因。
[0089] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：（1)將外 源的SPL基因轉(zhuǎn)入植物組織、器官或組織，獲得轉(zhuǎn)化入SPL基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種 子；和（2)將步驟（1)獲得的轉(zhuǎn)入了外源SPL基因的植物組織、器官或種子再生成植物植 株。
[0090] 作為一種優(yōu)選的實(shí)例，所述的方法包括步驟：（si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌， 所述的表達(dá)載體含有SPL基因；（s2)將植物組織、器官與步驟（si)中的農(nóng)桿菌接觸，從而 使SPL基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；（s3)選擇出轉(zhuǎn)入SPL基因的 植物細(xì)胞、組織、器官或種子；以及（s4)將步驟（s3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生 成植物。
[0091] 作為另一種優(yōu)選方式，鑒于SPL基因是miR156的靶基因，可通過(guò)下調(diào)miR156來(lái)上 調(diào)SPL基因的表達(dá)?？上抡{(diào)miR156的抑制分子例如是MM156。
[0092] 其它增加 SPL基因或其同源基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域周知的。例如，可通過(guò)用強(qiáng) 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)從而增強(qiáng)SPL基因或其同源基因的表達(dá)?；蛘咄ㄟ^(guò)增強(qiáng)子（如水稻waxy基因 第一內(nèi)含子、Actin基因第一內(nèi)含子等）來(lái)增強(qiáng)該SPL基因的表達(dá)。適用于本發(fā)明方法的 強(qiáng)啟動(dòng)子包括但不限于：35s啟動(dòng)子，水稻、玉米的Ubi啟動(dòng)子等。
[0093] 優(yōu)選的，還提供了一種降低植物中SPL基因的表達(dá)的方法，所述的方法包括：（1) 將SPL基因表達(dá)抑制分子轉(zhuǎn)入植物組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn)化入所述表達(dá)抑制分子的植 物組織、器官或種子；（2)將步驟（1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述表達(dá)抑制分子的植物組織、器官或 種子再生成植物。較佳地，所述的表達(dá)抑制分子是miR156f。
[0094] 本發(fā)明還包括利用前述任一種方法獲得的植物，所述的植物包括：轉(zhuǎn)入了 SPL基 因或其同源基因的轉(zhuǎn)基因植物；或者SPL蛋白表達(dá)量（包括低表達(dá)或不表達(dá)）降低的植物 等。
[0095] 可采用任何適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來(lái)實(shí)施所述的方法。
[0096] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0097] 實(shí)施例1、擬南芥miR156和SPL10基因的分離
[0098] 依據(jù)擬南芥信息資源網(wǎng)站（The Arabidopsis Information Resource，TAIR)網(wǎng)站 上AT5G26147(miR156f)的基因組序列信息，序列是（SEQ ID N0:1) :TGGCTAGGGTTTATAGATG TATGTGATATTAAGAGATATGAAACATATTTGTCGACGGTTTGAGTGGTGAGGAATTGATGGTGACAGAAGAGAGTG AGCACACATGGTGGCTTTCTTGCATATTTGAAGGTTCCATGCTTGAAGCTATGTGTGCTCACTCTCTATCCGTCACC CCCTTCTCTCCCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTACAGCATTTCATTTAGTTTTTAGAGTTAAACATTTTGATTTT GATTTTTACATCCATTCTTTTGGTTT。
[0099] 合成引物 miR156-F-BamHI、miR156-R-SacI，PCR 擴(kuò)增得到擬南芥 miR156f 基因組 部分序列（圖ΙΑ);根據(jù)AT1G27370(SPL10)序列信息，合成引物SPL10-F、SPL10-R，PCR擴(kuò)增 得到編碼擬南芥 SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE 基因 SPL10 序列。將 miR156f 和SPL10的PCR擴(kuò)增片段ΤΑ克隆到pMD18-T載體中，測(cè)序正確后作為模板。
[0100] 表1、載體構(gòu)建及qRT-PCR引物列表
[0101]

【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)節(jié)植物揮發(fā)油或其中的倍半萜含量的方法，其特征在于，所述方法包括：調(diào) 節(jié)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的調(diào)節(jié)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋 白基因的表達(dá)是：上調(diào)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)，從而提商植物揮發(fā)油 或其中的倍半萜含量。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的上調(diào)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋 白基因的表達(dá)包括：將Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)化植物，獲得過(guò)表達(dá)Squamosa啟動(dòng) 子結(jié)合蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植物，所述的轉(zhuǎn)基因植物的揮發(fā)油或其中倍半萜含量提高。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的上調(diào)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合 蛋白基因的表達(dá)包括：將下調(diào)miR156表達(dá)的抑制分子轉(zhuǎn)化植物，通過(guò)下調(diào)miR156來(lái)上調(diào) Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植物的揮發(fā)油或其中倍半萜含量提 商。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的下調(diào)miR156表達(dá)的抑制分子是 MM156或其活性片段；較佳地，所述的MM156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述的 MM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第237-256位所示。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的調(diào)節(jié)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋 白基因的表達(dá)是：下調(diào)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)，從而降低植物揮發(fā)油 或其中倍半萜含量。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的下調(diào)植物中Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合 蛋白基因的表達(dá)包括：將Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)抑制分子轉(zhuǎn)化植物，獲得 Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因植物，所述的轉(zhuǎn)基因植物的揮發(fā)油或其 中倍半萜含量降低。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表 達(dá)抑制分子是miR156f ;較佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO: 1中第82-101位所示核 苷酸序列；所述的miR156f前體具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括：十字花科植物，唇形科植 物，傘形科植物，菊科植物，蕓香科植物，樟科植物，姜科植物，禾本科植物，茄科植物。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的倍半萜包括：石竹烯，廣藿香醇， β -廣藿香烯，Y -廣藿香烯，α -廣藿香烯，β -欖香烯，α -愈創(chuàng)木烯，4, 11-愈創(chuàng)木二烯， α -布藜烯。 11. Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的用途，用于提高植物揮發(fā)油或其中倍半萜含量。
12. 下調(diào)miR156表達(dá)的抑制分子的用途，用于提高植物揮發(fā)油或其中倍半萜含量。
13. 如權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，所述的下調(diào)miR156表達(dá)的抑制分子是 MM156或其活性片段；較佳地，所述的MM156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述的 MM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第237-256位所示。 14. Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的表達(dá)抑制分子的用途，用于降低植物揮發(fā)油或其 中倍半萜含量。
15. 如權(quán)利要求14所述的用途，其特征在于，所述的Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因的 表達(dá)抑制分子是miR156f;較佳地，所述的miR156f具有SEQ ID N0:1中第82-101位所示 核苷酸序列；所述的miR156f前體具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104232655SQ201310237889
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月14日
【發(fā)明者】陳曉亞, 于宗霞, 王凌健, 王佳偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院