專利名稱：一種生產1,2－環(huán)氧丙烷的方法及其專用混合菌群的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生產1，2-環(huán)氧丙烷的方法及其專用混合菌群。
背景技術：
環(huán)氧丙烷是重要的基礎化工原料，大量用于聚氨酯塑料、不飽和樹脂和表面活性劑的生產。環(huán)氧丙烷的衍生物還廣泛用于食品、煙草、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)。已生產的下游產品近百種，是精細化工產品的重要原料，發(fā)展前景廣闊。
目前工業(yè)上主要采用過酸、過氧化物或氯醇法生產環(huán)氧丙烷，這些方法都存在環(huán)境污染和生成大量附加值較低的副產品等問題。因此，尋找無污染、成本低的新方法一直倍受學術界和工業(yè)界的關注。甲烷氧化菌中的甲烷單加氧酶(MMO)可在常溫常壓下直接用空氣作氧化劑氧化丙烯生產環(huán)氧丙烷，因而利用甲烷氧化菌生物氧化丙烯生產環(huán)氧丙烷具有巨大的市場潛力和應用前景，但現(xiàn)有研究表明，該法得到的產物濃度較低，水相反應時最大僅為1.7mM，水-十六烷兩相體系中，環(huán)氧丙烷雖略有提高，也僅為2.6mM(Soni BK，Kelley RL，Srivastava VJ，Technical andeconomic evaluation of different reactors for methanotrophic cultures forpropylene oxide production，APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY 74(2)115-123)。
目前關于甲烷氧化菌的研究和應用以單一純菌為主，常用的菌株有M.trichosporiumOB3b或M.capsulatus Bath。而甲烷氧化菌純菌存在的最大問題是培養(yǎng)時間長，得到的細胞濃度較低，一般在2g干細胞/L發(fā)酵液以下，這些都是限制甲烷氧化菌或甲烷單加氧酶(MMO)工業(yè)化應用的瓶頸問題。另外，甲烷氧化菌對如丙烯等有機化合物的共代謝反應，可能對細胞產生抑制作用。因此，有必要開發(fā)一種增殖速度較快、轉化能力強的微生物體系，利用甲烷單加氧酶(MMO)催化合成化工產品，實現(xiàn)工業(yè)應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種生產1，2-環(huán)氧丙烷的方法及其專用混合菌群。
本發(fā)明的所提供的生產1，2-環(huán)氧丙烷的方法，是將含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893菌體置于密閉的甲烷與丙烯的混合氣體環(huán)境中，反應得到1，2-環(huán)氧丙烷。
所述含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893菌體是懸浮在反應液中的，所述反應液為含有4.5-6.5mM MgCl2和18-22mM甲酸鈉，pH為7.0-7.4的磷酸緩沖液；所述反應液優(yōu)選為含有5mM MgCl2和20mM甲酸鈉，pH為7.0-7.4的磷酸緩沖液。
所述反應的溫度可為27-33℃，優(yōu)選為30℃。
所述含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893懸于反應液中的細胞濃度可為15-30g細胞干重/L，優(yōu)選為25g細胞干重/L。
所述甲烷與丙烯的混合氣體中丙烯和甲烷氣體體積比可為1∶0.2-1∶2.5；優(yōu)選為1∶1。
所述反應在轉速為100-220轉/分鐘的搖床上振蕩反應。
所述含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893菌體可將含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893接種于MNMS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，收集菌體得到；所述MNMS培養(yǎng)基可為含有KH2PO41.06g/L，Na2HPO4·12H2O 4.34g/L，NaNO31.70g/L，K2SO40.34g/L，MgSO4·7H2O 0.074g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.024g/L，微量元素溶液4ml，pH為7.0的培養(yǎng)基；其中，所述微量元素溶液為含有ZnSO4·7H2O 0.287mg/L，MnSO4·7H2O 0.223mg/L，H3BO30.062mg/L，Na2M0O4·2H2O 0.048mg/L，C0Cl2·6H2O 0.048mg/L，KI 0.083mg/L，CaCl2·2H2O 3.5mg/L，pH為7.0的溶液。
所述MNMS培養(yǎng)基中還可添加有3-10umol/L的銅離子。
所述含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893在空氣與甲烷的體積比為1∶0.5-1∶1.5的封閉環(huán)境中，在27℃-33℃，130rpm-200rpm搖床上培養(yǎng)；優(yōu)選為在空氣與甲烷的體積比約為1∶1的封閉環(huán)境中，在30℃，170rpm搖床上培養(yǎng)。
上述生產1，2-環(huán)氧丙烷用含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893也屬于本發(fā)明的保護范圍。該含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9已于2006年12月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市海淀區(qū)中關村北一條13號)，保藏號為CGMCC №.1893。
本發(fā)明的方法，利用上述含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893中的甲烷氧化菌專有的甲烷單加氧酶(MMO)，在溫和的條件下，催化氧化丙烯合成1，2-環(huán)氧丙烷工藝簡單，合成的1，2-環(huán)氧丙烷濃度高達0.48mM/OD600，生產效率高；實驗證明低銅離子濃度下，含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893的環(huán)氧丙烷生產能力高于M.trichosporium OB3b，銅離子濃度為5μM時混合菌的整細胞的環(huán)氧丙烷生產能力最大，為0.85mM/OD600，是常用菌株M.trichosporiumOB3b的1.43倍。本發(fā)明的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893不僅菌群結構穩(wěn)定，較純甲烷氧化菌生長速度快，培養(yǎng)容易，而且酶催化效率高，具有工業(yè)應用前景。


圖1為含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.189分離出的甲烷氧化菌MMO基因片段PCR產物凝膠電泳2為含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893經過連續(xù)傳代培養(yǎng)時，每次傳代的混合菌細胞濃度和pH值圖3A為含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893生產1，2-環(huán)氧丙烷反應溶液氣相色譜分析譜3B為1，2-環(huán)氧丙烷標準品氣相色譜分析譜4為銅離子對含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893成產環(huán)氧丙烷的影響曲線圖5A為含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893在不同細胞濃度下，不同反應時間內生產的1，2-環(huán)氧丙烷濃度圖5B含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893在不同細胞濃度下，不同反應時間內生產的1，2-環(huán)氧丙烷比生產效率圖6為不同銅離子濃度條件下，M.trichosporiumOB3b和含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893的1，2-環(huán)氧丙烷生產效率對比具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
下述實施例中進行細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為改進的NMS(Higgens nitrate minimalsalt)培養(yǎng)基(即MNMS培養(yǎng)基)和LB培養(yǎng)基；其中，MNMS培養(yǎng)基的組成成分如下KH2PO41.06g/L，Na2HPO4·12H2O 4.34g/L，NaNO31.70g/L，K2SO40.34g/L，MgSO4·7H2O 0.074g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.024g/L，微量元素溶液4ml，去離子水1000ml，pH 7.0。其中，微量元素溶液組成為ZnSO4·7H2O 0.287mg/L，MnSO4·7H2O 0.223mg/L，H3BO30.062mg/L，Na2M0O4·2H2O 0.048mg/L，C0Cl2·6H2O 0.048mg/L，KI 0.083mg/L，CaCl2·2H2O 3.5mg/L，pH 7.0。
LB培養(yǎng)基組成成分如下酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，1000ml去離子水。
所有培養(yǎng)基中的溶劑均為去離子水。
實施例1、生產1，2-環(huán)氧丙烷的混合微生物體系的獲得及其生長穩(wěn)定性測試
1、生產1，2-環(huán)氧丙烷的混合微生物體系的篩選和馴化從重慶山區(qū)農業(yè)土壤中采樣，將土樣碾碎，稱取0.2g放入20ml MNMS培養(yǎng)基中，在30℃搖床上振蕩。2h后取培養(yǎng)液1ml作為種子接入分裝有10ml MNMS培養(yǎng)基的70ml玻璃培養(yǎng)瓶中，加蓋密封橡膠塞。用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶內一定體積的空氣，通過已滅菌的氣體過濾器注入相同體積的甲烷，使瓶中空氣與甲烷的體積比為1∶1，在0℃，170rpm搖床上培養(yǎng)，1～2周后，得到接種用種子培養(yǎng)液。
移取上述得到的種子培養(yǎng)液接入新鮮的MNMS培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，具體的傳代培養(yǎng)方法為將上述得到的種子培養(yǎng)液按體積比為4％(即3.508g細胞干重/L)的接種量接入裝有10ml MNMS培養(yǎng)基的70ml玻璃培養(yǎng)瓶中。接種后，加蓋密封橡膠塞。用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶30ml空氣，通過已滅菌的氣體過濾器注入相同體積的甲烷，使瓶中空氣與甲烷的體積比為1∶1，在30℃，170rpm搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)1～2周后，取培養(yǎng)液作為下一代培養(yǎng)的種子，繼續(xù)進行上述繼代培養(yǎng)。
經14次上述選擇性的傳代培養(yǎng)后，得到了能以甲烷作為唯一碳源和能源的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9，名稱為含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9CGMCC №.1893，該含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893已于2006年12月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市海淀區(qū)中關村北一條13號)，保藏號為CGMCC №.1893。
2、含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9CGMCC №.1893的結構分析采用純種分離方法，結合PCR擴增、16S rRNA雜交和MMO功能基因分析技術對含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893菌群結構進行了解析，具體方法如下所述。
將含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893，分別接種于以甲烷作為唯一碳源的MNMS固體平板和LB固體平板上，采用純種分離方法，從含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893中分離純化得到1株甲烷氧化菌和4株能在LB固體平板上生長的異養(yǎng)菌。
將分離純化的甲烷氧化菌和異養(yǎng)菌分別在MNMS和LB液體中培養(yǎng)，9000rpm離心10min，菌體用于總DNA的提取。然后以F27和R1492為引物，采用PCR方法從總DNA中分別擴增得到各自約1.5kb的16S rRNA基因，所用PCR引物和退火條件如表1所示；表1細菌16S rRNA和甲烷氧化菌MMO功能基因PCR引物

在賽百盛Easy-DoTMPCR PreMix體系中進行PCR反應加入1-3μl(10-50ng)DNA模板、1-5μl(20-50pmol)引物，之后用無菌去離子水補足至50μl。PCR反應程序如下94℃預變性7min；然后進行30個循環(huán)的94℃變性1min，55℃退火1min，74℃延伸2min的反應；最后，74℃補充延伸10min。
將PCR擴增產物送到上海生工測序，根據(jù)http://www.ncbi.nlm.nih.gov數(shù)據(jù)庫和Blast程序，將測定得到的16S rDNA序列與Genbank中已知的微生物的16S rDNA序列進行核苷酸同源性分析。結果表明，分離純化的1株甲烷氧化菌與Methylosinustrichosporium(發(fā)孢甲基彎曲菌)的同源性為99％以上。4株異養(yǎng)菌的16S rDNA序列分別與Acinetobacter junii、Cupriavidus metallidurans、Comamonastestosterone和Stenotrophomonas maltophilia的同源性都為99％以上。
甲烷氧化菌中MMO以sMMO和pMMO兩種形式存在。已有的研究表明，Methylosinus種屬的甲烷氧化菌兩種形式的MMO均含有。為此，采用細菌16S rRNA，sMMO羥化酶的α-亞基組分mmoX和mmoB，pMMO的27kDa多肽特異性引物PCR反應擴增16S rDNA、mmoB、mmoX和pmoA基因片段。進一步采用Methylosinus中sMMO羥化酶的α-亞基組分mmoX和mmoB，pMMO的27kDa多肽特異性引物(表1所示)，按照上述反應體系和反應程序分別進行PCR反應，從含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC№.1893及從含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893中分離的甲烷氧化菌的總DNA中擴增mmoX、mmoB和pmoA基因片段。結果均擴增得到長度分別為535、400和330bp的mmoX、mmoB和pmoA基因片段。結果表明，含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893的MMO具有sMMO和pMMO兩種形式，并且其MMO基因與Methylosinus具有很高的同源性。圖1為從含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9CGMCC №.1893中分離的甲烷氧化菌的MMO基因片段PCR產物(mmoX、mmoB和pmoA)凝膠電泳圖，圖1中泳道m(xù)arker為分子量Marker。
結果表明，含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893由II型甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium和至少4種非甲烷氧化菌(Acinetobacter junii、Cupriavidus metallidurans、Comamonas testosterone和Stenotrophomonasmaltophilia)組成。該含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893不排除含有其他難培養(yǎng)，難分離，鑒別困難的微生物存在的可能。
3、含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893的生長穩(wěn)定性測試為了能夠定量含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893生長性能的穩(wěn)定性，將經過14次傳代培養(yǎng)得到的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC№.1893，繼續(xù)按照步驟1所述的傳代培養(yǎng)方法進行傳代培養(yǎng)，在傳代培養(yǎng)過程中保持培養(yǎng)條件相同，測定細胞濃度和培養(yǎng)液pH值。具體為在70ml的玻璃培養(yǎng)瓶中分裝10ml MNMS培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC№.1893培養(yǎng)液按體積百分含量4％(即3.508g細胞干重/L)接種量接入MNMS培養(yǎng)基后，加蓋密封橡膠塞。用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶30ml空氣，通過已滅菌的氣體過濾器注入相同體積的甲烷，使瓶中空氣與甲烷的體積比為1∶1，然后在30℃，170rpm搖床上進行培養(yǎng)。4天后移取其中0.4ml培養(yǎng)液作為種子接入新鮮的MNMS培養(yǎng)基中，如此重復操作30次。每轉接1次，即是傳代1次。測定每次傳代的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893細胞濃度(圖2中柱形圖)和pH值(圖2中曲線圖)。
結果如圖2所示，結果表明，含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893經過連續(xù)傳代培養(yǎng)，細胞濃度基本穩(wěn)定，表明含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893是一個能以甲烷作為唯一碳源的、生長性能穩(wěn)定的甲烷氧化混合菌。
實施例2、利用含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893生產1，2-環(huán)氧丙烷將含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893按3.5g細胞干重/L的量接入MNMS培養(yǎng)基后，加蓋密封橡膠塞。用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶30ml空氣，通過已滅菌的氣體過濾器注入相同體積的甲烷，使瓶中空氣與甲烷的體積比為1∶1，然后在30℃，170rpm搖床上進行培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
離心收集含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893，分成三組進行對比實驗第一組將離心收集的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893重懸于磷酸緩沖溶液(含有5mM MgCl2和20mM甲酸鈉的磷酸緩沖液(PBS)，PBS緩沖溶液組成為NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO41.44g/L，KH2PO40.24g/L，pH＝7.0-7.4)，使含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893的濃度為25g細胞干重/L，密封，充入丙烯和甲烷的混合氣體(丙烯與甲烷的體積比為1∶1)，30℃，轉速為170rpm下進行振蕩反應。
第二組將離心收集的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893重懸于磷酸緩沖溶液(含有5mM MgCl2和20mM甲酸鈉的磷酸緩沖液(PBS)，PBS緩沖溶液組成為NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO41.44g/L，KH2PO40.24g/L，pH＝7.0-7.4)，使含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893的濃度為30g細胞干重/L，密封，充入丙烯和甲烷的混合氣體(丙烯與甲烷的體積比為1∶2.5)，33℃，轉速為220rpm下進行振蕩反應。
第三組將離心收集的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893重懸于磷酸緩沖溶液(含有5mM MgCl2和20mM甲酸鈉的磷酸緩沖液(PBS)，PBS緩沖溶液組成為NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO41.44g/L，KH2PO40.24g/L，pH＝7.0-7.4)，使含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893的濃度為15g細胞干重/L，密封，充入丙烯和甲烷的混合氣體(丙烯與甲烷的體積比為1∶0.2)，27℃，轉速為100rpm下進行振蕩反應。
上述三組反應，進行0.5小時后，分別取反應液，用氣相色譜進行分析檢測1，2-環(huán)氧丙烷的產量。結果表明，第一組方法生產1，2-環(huán)氧丙烷的產量為0.48mM/OD600O，第二組方法生產1，2-環(huán)氧丙烷的產量為0.42mM/OD600，第三組方法生產1，2-環(huán)氧丙烷的產量為0.45mM/OD600。其中，第一組生產1，2-環(huán)氧丙烷結果如圖3A和圖3B所示。圖3A中存在保留時間(Rt)分別為0.8min、1.2min和6.2min的3個峰，其中保留時間為0.8min和1.2min的峰分別為水和丙烯。Rt為6.2min的峰與1，2-環(huán)氧丙烷標準品(圖3B)峰的保留時間相同，根據(jù)MMO的催化特性，該含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893能氧化丙烯積累環(huán)氧丙烷。
實施例3、銅離子對含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893轉化丙烯生產1，2-環(huán)氧丙烷的影響將含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893按3.5g細胞干重/L接入MNMS培養(yǎng)基(不加銅條件)或者含5μM CuSO4的MNMS培養(yǎng)基(加銅(5μM)條件)中，加蓋密封橡膠塞。用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶20-40ml空氣，通過已滅菌的氣體過濾器注入相同體積的甲烷，使瓶中空氣與甲烷的體積比為1∶0.5，然后在27℃，130rpm搖床上進行培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
離心收集上述培養(yǎng)的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893，重懸于磷酸緩沖溶液(含有5mM MgCl2和20mM甲酸鈉的磷酸緩沖液(PBS)，磷酸緩沖溶液組成為NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO41.44g/L，KH2PO40.24g/L，pH＝7.0-7.4)，使反應液中含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893細胞濃度為3.5g細胞干重/L。密封，充入丙烯和甲烷的混合氣體(甲烷與丙烯的體積比為1∶1)，30℃，轉速為170轉/分鐘下進行振蕩反應，用氣相色譜進行分析測定反應液相中1，2-環(huán)氧丙烷濃度(環(huán)氧丙烷采用氣相色譜(島津GC-2010氣相色譜儀)進行定量分析。分析條件如下AOC-20i自動進樣器，Porapak Q色譜柱，F(xiàn)ID檢測器，載氣為氮氣(60ml/min)，進樣口和檢測器溫度為140℃，柱溫為120℃，外標法定量)。隨時間的變化，得到含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893氧化丙烯生產1，2-環(huán)氧丙烷的動力學曲線。
結果如圖4所示，結果表明，無論在加銅還是無銅條件下培養(yǎng)的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893，在該反應條件下，均能很快氧化丙烯、積累1，2-環(huán)氧丙烷。不加銅條件下生長的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC№.1893，反應3h，生成的1，2-環(huán)氧丙烷的量到達最大(0.48mM/OD600(單位細胞光密度得到的環(huán)氧丙烷量)并保持穩(wěn)定。在加銅條件下生長的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893，反應前6h，環(huán)氧丙烷濃度逐漸增加，但到反應8h時，濃度略有下降。其單位細胞濃度(以OD600表示)環(huán)氧丙烷的生產能力為0.85mM/OD600，是不加銅條件下的1.8倍。
實施例4、細胞濃度對1，2-環(huán)氧丙烷生成的影響將含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 C6MCC №.1893按3.5g細胞干重/L的量接入MNMS培養(yǎng)基后，加蓋密封橡膠塞。用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶30ml空氣，通過已滅菌的氣體過濾器注入相同體積的甲烷，使瓶中空氣與甲烷的體積比為1∶1，然后在30℃，170rpm搖床上進行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)72h的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893。
將上述得到的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893分別按照重懸于磷酸緩沖溶液(含有5mM MgCl2和20mM甲酸鈉的磷酸緩沖液(PBS)，其組成為NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO41.44g/L，KH2PO40.24g/L，pH＝7.0-7.4)，重懸濃度分別為0.60g細胞干重/L(OD600為0.85)、1.15g細胞干重/L(OD600為1.62)、1.71g細胞干重/L(OD600為2.41)、2.07g細胞干重/L(OD600為2.92)、2.51g細胞干重/L(OD600為3.54)，然后分別按照實施例2的方法進行反應，反應過程中(反應1h、3h和6h)檢測生成1，2-環(huán)氧丙烷的濃度(環(huán)氧丙烷采用氣相色譜(島津GC-2010氣相色譜儀)進行定量分析。分析條件如下AOC-20i自動進樣器，Porapak Q色譜柱，F(xiàn)ID檢測器，載氣為氮氣(60ml/min)，進樣口和檢測器溫度為140℃，柱溫為120℃，外標法定量)。
結果如圖5A和圖5B所示，結果表明，1，2-環(huán)氧丙烷的生成濃度隨著反應細胞濃度變化的曲線圖(圖5A)表明，隨著細胞濃度增加，生成的環(huán)氧丙烷濃度增大。在細胞反應濃度為2.51g細胞干重/L(OD600為3.54)時，反應1h、3h和6h，環(huán)氧丙烷生成濃度分別為1.60、2.19和2.38mmol/L。但是，在低細胞濃度反應條件下(0.60g細胞干重/L(OD600為0.85)，1，2-環(huán)氧丙烷的生成濃度反應3h后也基本不變，并沒有隨著反應時間的增加。1，2-環(huán)氧丙烷的比生產效率(每單位OD600生成的1，2-環(huán)氧丙烷濃度，單位是mmol/OD600)隨反應細胞濃度的變化曲線圖(圖5B)表明，在測試細胞濃度范圍內，反應1h，1，2-環(huán)氧丙烷的比生產速率受細胞濃度影響不大。但是，隨著反應時間的增加，環(huán)氧丙烷的產率隨細胞濃度增大而減小，在細胞反應濃度為1.71-2.51g細胞干重/L(OD600為2.5-3.5)范圍內，環(huán)氧丙烷的比生產速率受細胞濃度影響較小。從反應液中丙烯濃度來看，反應進行到一定時間停止，并不是由于底物的缺少，而是來自1，2-環(huán)氧丙烷與甲烷單加氧酶(MMO)活性位點的競爭?？梢?，為了得到高濃度環(huán)氧丙烷，提高反應細胞濃度是必要的。
實施例5、銅離子濃度對混合菌和M.trichosporium OB3b生長和對1，2-環(huán)氧丙烷生成的影響的影響將含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893或常用的M.trichosporiumOB3b細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號為ATCC 55314)按3.508g細胞干重/L的量接入分別添加5uM、10uM、20uM、30uM、50uM CuSO4的MNMS培養(yǎng)基后，加蓋密封橡膠塞。用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶30ml空氣，通過已滅菌的氣體過濾器注入相同體積的甲烷，使瓶中空氣與甲烷的體積比為1∶1，然后在30℃，170rpm搖床上進行培養(yǎng)，離心收集不同銅離子濃度下生長的含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893或常用的M.trichospordumOB3b細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號為ATCC 55314)，重懸于磷酸緩沖溶液(含有5mM MgCl2和20mM甲酸鈉的磷酸緩沖液(PBS)，PBS磷酸緩沖液組成為NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO41.44g/L，KH2PO40.24g/L，pH＝7.0-7.4)，密封，充入丙烯和甲烷的混合氣體(丙烯與甲烷的體積比為1∶1)，30℃，轉速為170轉/分鐘，下進行振蕩反應，0.5小時后取反應液，用氣相色譜進行分析檢測1，2-環(huán)氧丙烷的濃度(環(huán)氧丙烷采用氣相色譜(島津GC-2010氣相色譜儀)進行定量分析。分析條件如下AOC-20i自動進樣器，Porapak Q色譜柱，F(xiàn)ID檢測器，載氣為氮氣(60ml/min)，進樣口和檢測器溫度為140℃，柱溫為120℃，外標法定量)。
結果如圖6所示，結果表明，當生長銅離子濃度高于50μM時，含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893和M.trichosporium OB3b的MMO活性都為0。低銅離子(3μM-10μM)濃度下，含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC№.1893的環(huán)氧丙烷生產能力高于M.trichosporium OB3b。銅離子濃度為5μM時含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893的環(huán)氧丙烷生產能力最大，為0.5mM/OD600，是常用菌株M.trichosporium OB3b的1.43倍。
權利要求
1.含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893。
2.一種生產1，2-環(huán)氧丙烷的方法，是將含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9CGMCC №.1893菌體置于密閉的甲烷與丙烯的混合氣體環(huán)境中，反應得到1，2-環(huán)氧丙烷。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893菌體是懸浮在反應液中的，所述反應液為含有4.5-6.5mMMgCl2和18-22mM mM甲酸鈉，pH為7.0-7.4的PBS磷酸緩沖液；所述反應液優(yōu)選為含有5mM MgCl2和20mM甲酸鈉，pH為7.0-7.4的磷酸緩沖液。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述反應的溫度為27-33℃。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于所述反應的溫度為30℃。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述甲烷與丙烯的混合氣體中丙烯和甲烷氣體體積比為1∶0.2-2.5；優(yōu)選為1∶1。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述反應在轉速為100-220轉/分鐘的搖床上振蕩反應。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893菌體是將含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9CGMCC№.1893接種于MNMS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，收集菌體得到；所述MNMS培養(yǎng)基為含有KH2PO41.06g/L，Na2HPO4·12H2O 4.34g/L，NaNO31.70g/L，K2SO40.34g/L，MgSO4·7H2O 0.074g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.024g/L，微量元素溶液4ml，pH為7.0的培養(yǎng)基；其中，所述微量元素溶液為含有ZnSO4·7H2O 0.287mg/L，MnSO4·7H2O 0.223mg/L，H3BO30.062mg/L，Na2M0O4·2H2O 0.048mg/L，C0Cl2·6H2O 0.048mg/L，KI 0.083mg/L，CaCl2·2H2O 3.5mg/L，pH為7.0的溶液。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述MNMS培養(yǎng)基中還添加有3-10umol/L的銅離子。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893在空氣與甲烷的體積比約為1∶0.5-1∶1.5的封閉環(huán)境中，在27-33℃，130-200rpm搖床上培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產1，2－環(huán)氧丙烷的方法及其專用混合菌群。該方法，是將含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9 CGMCC №.1893菌體懸于反應液中，在密閉的甲烷與丙烯的混合氣體環(huán)境中，振蕩反應得到1，2－環(huán)氧丙烷。本發(fā)明的方法，催化氧化丙烯合成1，2－環(huán)氧丙烷工藝簡單，合成的1，2－環(huán)氧丙烷濃度高達0.85mM/OD
文檔編號C12N1/26GK101050439SQ20071006436
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月13日 優(yōu)先權日2007年3月13日
發(fā)明者邢新會, 吳昊, 羅明芳, 緱仲軒 申請人:清華大學