專利名稱：人胚胎干細胞體外誘導分化為肝細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用人胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hES細 胞)的生物學特性，獲得類似早期胚胎的球體結構一擬胚體(embryoid body, EB)，以地塞米松和人胰島素聯合I型膠原的方法，實現體外定向高效誘導人 胚胎干細胞分化為肝細胞的技術。
背景技術：
由各種原因(病毒、藥物、腫瘤及遺傳性疾病等)引發(fā)的終末期肝病嚴重 威脅人類健康。目前，它的治療主要依賴于原位肝移植，但是，供體的極度短 缺、移植及手術本身相關的死亡、終生服用免疫抑制劑及其所致的致死性并發(fā) 癥等一系列問題極大的限制了這一治療手段的廣泛開展。肝細胞移植和生物人 工肝作為肝移植的輔助方式，可以部分緩解上述問題，但其來源細胞同樣也面 臨著存活期短，難以大量擴增，特別是隨著培養(yǎng)時間的延長，肝功能逐漸降低 等問題，因此，尋求合適的肝細胞來源已屬迫在眉睫。通過胚胎千細胞分化定向誘導獲取肝細胞是解決肝細胞來源的有效途徑。從 不同角度來分，胚胎干細胞分化的分類方法有很多種，例如以誘導劑的不同分類、 以分化過程的不同分類等，其中，以分化過程可分為l.胚胎干細胞自發(fā)分化； 2.胚胎干細胞直接以誘導劑誘導其分化；3.胚胎干細胞先形成擬胚體(即EB)， 之后將一個個球形EB (含有眾多細胞、具有三維結構)直接接種，再添加各種 誘導劑來誘導分化。其中，1998年，人ES細胞的成功建系打開了體外生產可供移 植治療的所有類型的人體細胞、組織乃至器官的大門。因此，體外定向誘導人ES 細胞分化為肝臟細胞成為目前研究的熱點(Lavon N, Benvenisty N. Study of hepatocyte differentiation using embryonic stem cells. Journal of Cellular Biochemistry, 2005, 96:1193—1202.)。EB是ES細胞在體外一定條件下自發(fā)形成的類似早期胚胎的球體結構，其 三胚層的形成與分化基本模擬了體內胚胎早期發(fā)育中組織細胞分化的過程，可 以作為研究哺乳動物胚胎發(fā)育尤其是早期譜系決定、胚層相互誘導等現象的理 想體外模型。然而，現有的誘導分化方法是將EB作為一個球體直接接種，這
樣會使細胞層疊，既不利于充分接觸，操作中也只能通過其周邊爬出的那些細 胞來進行形態(tài)觀察，因此，現有的誘導分化方法還有必要改進。發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種改進的人胚胎干細胞體外定向誘導分化為肝 細胞的方法。使該方法在操作中便于形態(tài)觀察，同時讓細胞與因子和胞外基 質能夠充分接觸，從而能有效地以及快捷地誘導出肝細胞。為實現上述目的，本發(fā)明人胚胎干細胞體外誘導分化為肝細胞的方法， 采用以下步驟1) 擴增人胚胎干細胞；2) 形成成熟擬胚體；3) 將誘導的成熟擬胚體消化成單個細胞；4) 將單個細胞以條件培養(yǎng)液誘導分化，得到肝細胞。 上述方法中，更具體的步驟包括1) 采用膠原酶IV消化法對hESCs進行傳代擴增，獲得大量干細胞；2) 將hESCs用擬胚體培養(yǎng)液懸浮、培養(yǎng)，接種到低吸附性的細菌皿中形成 成熟擬胚體EB;3) 將成熟的囊性EB用胰蛋白酶消化為單個細胞；4) 將單個細胞后接種到預先包被有I型膠原的組織培養(yǎng)皿，以含有地塞米 松和人胰島素的條件誘導液培養(yǎng)，通過觀察鑒定得到肝細胞。其中，所述步驟l)具體過程為將人ES細胞系，接種在小鼠胚胎成纖維細 胞飼養(yǎng)層上，37°C， 5%<:02條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液為無血清人ES細胞培養(yǎng)液DMEM 培養(yǎng)基、含20%血清替代物、1%非必需氨基酸、O.lmM卩-巰基乙醇、lmM谷氨酰 胺、4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子bFGF、 50IU/mL青霉素、50IU/mL鏈霉素， 每天更換培養(yǎng)液；培養(yǎng)一周后，用lmg/mL膠原酶IV在37'C條件下孵育10 20分 鐘進行消化傳代，離心，重懸，以1:4 1:6接種于新的培養(yǎng)皿，獲得匯合生長的 大量干細胞。所述步驟2)具體過程為將干細胞用膠原酶消化，離心，沉淀用擬胚體培 養(yǎng)液懸浮，細胞懸液移入100mm的低吸附性細菌培養(yǎng)皿中，37°C， 5%C02條件 下培養(yǎng)，每兩天更換l次培養(yǎng)液，所述擬胚體培養(yǎng)液為無血清人胚胎干細胞培養(yǎng) 液撤除bFGF因子KnockoutDMEM培養(yǎng)基、20%血清替代物、1%非必需氨基酸、0.1mM(5-巰基乙醇、lmM谷氨酰胺、50IU/mL青霉素、50IU/mL鏈霉素；取呈集 落狀生長的人ES細胞，將其接種于低吸附性的細菌皿，1周左右成成熟EB。所述步驟3)具體過程為在顯微鏡下利用口吸管吸取技術選取培養(yǎng)7d的、 大小較為均一的EB，將其先后置于兩個含有PBS的細菌皿中洗滌兩遍，然后 顯微鏡下利用口吸管轉移至預先添加有0.25%胰蛋白酶的細菌皿中進行消化， 37°C， 5%C02條件下孵育大約5分鐘，直至輕輕吹打可以全部形成單個細胞， 再以血清中止消化，用滴管轉移至10ml離心管中，1000rpm，離心5分鐘，棄 上清，沉淀即為所需單個細胞。所述步驟4)具體過程為將挑選的單個細胞接種到預先包被有I型膠原 的培養(yǎng)板上，加入肝細胞誘導條件培養(yǎng)液，37°C,5%C02條件下培養(yǎng)，每兩天 更換培養(yǎng)液，觀察細胞定向誘導分化進程至獲得肝細胞；所述肝細胞誘導條件 培養(yǎng)液IMDM培養(yǎng)基，含20%胎牛血清，50nM地塞米松，0.0625U/ml人胰 島素。所述步驟4)中，誘導時間為21天。本發(fā)明采用以上技術方案，利用人胚胎干細胞的生物學特性，形成成熟 囊性擬胚體，通過地塞米松、人胰島素等因子聯合胞外基質I型膠原從體外 定向誘導其分化為肝細胞。該方法用0. 25胰酶-O. 02% EDTA將EB消化為單 個細胞，再進行接種并添加誘導劑誘導，操作中便于形態(tài)觀察，同時單個細 胞與因子和胞外基質能夠充分接觸，可以在20天左右誘導出肝細胞，較現有 方法提前一周左右。本發(fā)明提供了一種新的種子細胞來源的方法，為細胞移 植和生物人工肝的臨床替代治療等奠定了基礎。


圖l:為人ES細胞及形成的EB圖片。其中(a)生長旺盛的人ES細胞， 呈克隆樣生長，形似鳥巢狀(40x); (b d) 3d/7d(成熟)/14d(老化)的EB (100"。圖2:為細胞誘導分化后形態(tài)學觀察圖片。其中(e)光學顯微鏡下(40x)， 條件培養(yǎng)后分化出較多的上皮樣細胞。(f)透射式電鏡下，誘導14d后的細胞 其內細胞器相當豐富，可見大量線粒體、光面內質網、糖原顆粒、溶酶體等細 胞器，細胞表面出現類似指狀突起的微絨毛(分別由箭頭所示)。圖3: RT-PCR檢測肝臟細胞特異性基因的表達。其中l(wèi)-6分別為DL2000 分子量標準、AFP、 ALB、 CK19、 CYP1B1和p-actin的擴增結果，A、 B和C
分別為誘導14d后的細胞、正常人胎肝細胞(陽性對照)和人EB的擴增結果。 圖4:為免疫熒光化學檢測圖片。其中圈示處為雙核、多核細胞。 圖5:為ICG攝取試驗圖片。其中左邊箭頭示孵育30分鐘內已攝取ICG的細胞，右邊箭頭示未攝取ICG的細胞。圖6:為PAS試驗圖片。其中箭頭示細胞內貯存的糖原顆粒。圖7:為分化細胞尿素和白蛋白的8h分泌量的圖片。其中1.未經誘導的人ES細胞；2. EB培養(yǎng)于條件誘導培養(yǎng)液14d; 3.陽性對照(正常人胎肝細胞)具體實施方式
實施例l、人ES細胞的培養(yǎng)及EB的形成將人ES細胞系H9 (外購于Wicdl公司)，接種在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層 (昆明小白鼠，血清、0.25胰酶-0.02% EDTA及DMEM培養(yǎng)基(外購于Hyclone公 司)(經Y射線照射滅活有絲分裂活性，接種在0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿中)上，培 養(yǎng)液為無血清人ES細胞培養(yǎng)液KnockoutDMEM培養(yǎng)基(外購于Gibco公司)、含 20。/o血清替代物(外購于Gibco)、 0.1mM(3-巰基乙醇(外購于Gibco)、 lmM谷氨酰胺 (外購于Gibco)、 4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，外購于Chemicon)、 50IU/mL青霉素、50IU/mL鏈霉素，1。/。的非必需氨基酸(夕卜購于Gibco公司)。37°C, 5%。02條件下培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液。 一周左右細胞匯合生長，用lmg/mL膠原 酶IV(外購于Gibco)在37r條件下孵育10 20分鐘進行消化傳代，500rpm離心 2min，重懸于新鮮制備的人ES細胞培養(yǎng)液中，以1:4 1:6的自身接種比率接種于 新的培養(yǎng)皿。匯合生長的細胞用膠原酶IV消化，500rpm離心2min，沉淀用擬胚體培養(yǎng)液(即 無血清人胚胎干細胞培養(yǎng)液撤除bFGF因子)懸浮，細胞懸液移入100mm的低吸 附性細菌培養(yǎng)皿(Greiner)中，37°C， 5%C02條件下培養(yǎng)，每兩天更換l次培 養(yǎng)液。人ES細胞呈集落狀生長，如圖la，將其接種于低吸附性的細菌皿后，ES 細胞呈懸浮生長，逐漸聚集成小團，如圖lb，約1周左右囊性變，如圖lc， 稱為成熟EB，繼續(xù)培養(yǎng)，光學顯微鏡下觀察，EB逐漸形成中空的囊狀，如圖 ld ，成為老化的EB。
實施例2、 EB消化為單個細胞在顯微鏡下利用口吸管吸取技術選取培養(yǎng)7d的、大小較為均一的EB，將 其先后置于兩含有磷酸緩沖液(PBS)的細菌皿中洗滌兩遍，然后轉移(顯微 鏡下利用口吸管轉移)至預先添加有0.25%胰蛋白酶(Amresco)的細菌皿中進 行消化，37°C， 5%C02條件下孵育大約5分鐘，直至輕輕吹打可以全部形成 單個細胞，再加入含10%血清(HYCLONE)的培養(yǎng)基中止消化1分鐘，用滴 管將單細胞懸液轉移至10ml離心管中，1000rpm，離心5分鐘，棄上清。實施例3、單個細胞向肝細胞的誘導分化將實施例2中離心所得沉淀以肝細胞誘導條件培養(yǎng)液重懸，該培養(yǎng)液成分 為IMDM培養(yǎng)基(Sigma)，含20。/。胎牛血清(Gibco)， 50nM地塞米松(Sigma)， 0.0625U/ml人胰島素(Lilly France S.A.S)。再接種到預先包被有I型膠原的培 養(yǎng)板上。37°C,5%C02條件下培養(yǎng)，每兩天更換培養(yǎng)液，觀察條件培養(yǎng)的定向 誘導分化作用。實施例4、誘導分化前后的細胞鑒定 1、細胞形態(tài)觀察光學顯微鏡下觀察細胞誘導分化前后形態(tài)的變化，記錄細胞誘導分化的過 程。并取誘導分化21d的細胞，吸棄培養(yǎng)液，以PBS洗滌兩遍，在41:條件下以3% 戊二醛于培養(yǎng)板原位前固定2h，再以1%鋨酸后固定1 h，用蔗糖緩沖液反復漂洗， 梯度乙醇脫水、加入丙酮后，以樹脂滲透、包埋、聚合，用ULTRACUTE/S型切 片機超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，Philips CM120透射電子顯微鏡觀察 細胞超微結構。光學顯微鏡下觀察到，在誘導之初，細胞處于旺盛的分裂狀態(tài)，細胞大，核 仁多個且明顯，圖2e為光學顯微鏡下觀察到，條件培養(yǎng)后分化出較多的上皮樣 細胞。隨著時間的推移，細胞逐漸由圓形變?yōu)殚L梭形或多角形，分化出較多的上 皮樣細胞，可見雙核和多核細胞。透射式電鏡下觀察到，誘導14d后的細胞其內 細胞器相當豐富，可見大量特征性的圓形或橢圓形、大小不一、嵴稀的線粒體、 分布于光面內質網周圍的簇狀糖原顆粒、溶酶體、高爾基體等細胞器,，細胞表 面出現類似指狀突起的毛細膽管或微絨毛，符合肝細胞典型的超微結構，如圖2f 所示。
2、 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測人ES細胞誘導前、后相關基因mRNA 的表達變化用TRIzol試劑(Invitrogen)提取誘導分化前及誘導分化21天(7天EB十14天條 件培養(yǎng))的細胞總RNA，分別用下述引物AFP (S: 5'-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3'，A: 5'-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3')， ALB ( S: 5'-TGCTTGAAGGTGCTGATGACAGGG-3'，A: 5'-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3')， CK19 ( S: 5 '-ATGGCCGAGCAGAACCGGAA-3'，A: 5'CCATGAGCCGCTGGTACTCC-3')， CYPIBI( S: 5'-GAGAACGTACCGGCCACTATCACT-3'，A: 5 '-GTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT-3')， P-actin( S: 5'-GATCCACATCTGCTGGAAGG陽3'，A: 5 '-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3') 進行RT-PCR反應(反轉錄體系RNA1.5ul， oligodT2ul， lOmMdNTPmixture 2ul， RNAase抑制劑0.5ul， 5xAMV4ul， AMVase lul， DEPC7夂9ul;程序室 溫10分鐘，42。Cl小時，72。C10分鐘，4。C①)(PCR體系:引物2ul， cDNA2ul， 10xPCRbuffer2ul， 2.5mMdNTPmixture 1.6ul， rTaq0.5ul，水11.9ul;程序94。C 5分鐘，33個循環(huán)(94°C30秒，50°C-60°C 30秒，72°C 30秒)，72。C延伸10 分鐘)，PCR產物用l。/。瓊脂糖凝膠電泳，用AlphaImager3300軟件對結果進行分 析。(所有RT-PCR應用產品均購自Takara公司)電泳結果顯示誘導后細胞弱表達原始肝細胞標志AFP和成熟肝細胞標志 ALB，而強表達CK19和細胞色素P450 (CYP) 1B1，結果見圖3。3、 間接免疫細胞化學檢測將誘導21d的細胞用PBS洗滌兩遍，4%多聚甲醛固定30分鐘，0.1X的Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)破膜15分鐘，山羊血清(中杉金橋生物技術有限 公司)室溫封閉抗原30分鐘后，分別與甲胎蛋白(alpha-fetoprotein， AFP) (R&D)、 細胞角蛋白18 (cytokeratin18， CK18， SantaCruz)標記的一抗工作液(中杉金橋 生物技術有限公司)4t:孵育過夜，再以不同熒光素(FITC、 TRITC)標記的二 抗(中杉金橋生物技術有限公司)避光繼續(xù)孵育30分鐘，DAPI (4',6-二脒基-2-苯 基B引哚，Roche)襯染細胞核，置共聚焦顯微鏡下觀察，用Laser-Sharp 2000軟件 分析圖像。間接免疫熒光結果從蛋白水平證實以肝細胞條件誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)后，部 分細胞表達肝細胞早期標志AFP與成熟肝細胞特異性標志CK18(結果見圖4)。4、 靛青綠(indocyanine green， ICG) (Sigma)的攝取、排泌實驗 誘導分化21d的細胞用PBS充分洗滌后，加入l mg/mlICG于37"C孵育30分鐘，顯微鏡下觀察細胞顏色的變化；再用PBS沖洗2遍，換回完全培養(yǎng)液繼續(xù)常規(guī)培 養(yǎng)，并觀察細胞顏色的變化。結果顯示，誘導后細胞約50%被染成深綠色，而其余的顏色無變化，見附圖 5;換回完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)6h之內，著色細胞的顏色完全退去，說明誘導后的 細胞大約50%具有類似肝細胞的染料排泄功能。5、 糖原染色實驗即高碘酸-雪夫反應(periodicacid-Schiff， PAS) PAS試劑盒(上海仁寶醫(yī)用試劑研究有限公司)用于檢測細胞內的糖原。將涂片滴加固定液固定3 5分鐘，水洗，晾干；滴加過碘酸于涂片上氧化10分鐘，水 洗，晾干；放入雪夫氏溶液中，置37'C水浴箱5 10分鐘；取出后流水洗滌10 20分鐘，晾干，鏡檢。鏡檢誘導后細胞發(fā)現，PAS陽性物呈紅色顆?；驈浬?，定位于細胞漿中。 紅色的深度與所含糖原的量有關量少呈淡紅色，量多呈深紅色，結果見圖6， 說明誘導后細胞具備類似肝細胞的貯存糖原的能力。6、 誘導分化14d的細胞經PBS沖洗換用無血清的IMDM培養(yǎng)基，加入 0.15mol/LNH4Cl，常規(guī)培養(yǎng)8h后收集細胞培養(yǎng)上清，在全自動生化分析儀 (Olympus， Tokyo, Japan)上檢測培養(yǎng)上清中尿素和ALB的分泌量。結果顯示，誘導分化14d的細胞具有與正常肝細胞類似的分泌ALB和氨 基代謝生成尿素的功能，而未加以誘導的ES細胞組幾乎未測到尿素和ALB。以上實驗結果證明通過形成成熟擬胚體并將其消化為單個細胞，以細胞 因子(地塞米松+人胰島素)聯合胞外基質(I型膠原)的方法能夠在21d 分化人胚胎干細胞為肝細胞，誘導分化高效，操作過程中易于觀察從而為進 一步優(yōu)化誘導條件創(chuàng)造了條件。
權利要求
1、一種人胚胎干細胞體外誘導分化為肝細胞的方法，采用以下步驟1)擴增人胚胎干細胞；2)形成成熟擬胚體；3)將誘導的成熟擬胚體消化成單個細胞；4)將單個細胞以條件培養(yǎng)液誘導分化，得到肝細胞。
2、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，更具體步驟包括1) 采用膠原酶IV消化法對hESCs進行傳代擴增，獲得大量干細胞；2) 將hESCs用擬胚體培養(yǎng)液懸浮、培養(yǎng)，接種到低吸附性的細菌皿中形成 成熟擬胚體EB;3) 將成熟的囊性EB用胰蛋白酶消化為單個細胞；4) 將單個細胞后接種到預先包被有I型膠原的組織培養(yǎng)皿，以含有地塞米 松和人胰島素的條件誘導液培養(yǎng)，通過觀察鑒定得到肝細胞。
3、 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟l)具體過程為-將人ES細胞系，接種在小鼠胚胎成纖維細胞詞養(yǎng)層上，37。C,5。/。C02條件下培養(yǎng)， 培養(yǎng)液為無血清人ES細胞培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)基、含20%血清替代物、1%非必 需氨基酸、0.1mM(3-巰基乙醇、lmM谷氨酰胺、4 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子 bFGF、 50IU/mL青霉素、50IU/mL鏈霉素，每天更換培養(yǎng)液；培養(yǎng)一周后，用 lmg/mL膠原酶IV在37nC條件下孵育10 20分鐘進行消化傳代，離心，重懸，以 1:4 1:6接種于新的培養(yǎng)皿，獲得匯合生長的大量干細胞。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟2)具體過程為將 干細胞用膠原酶消化，離心，沉淀用擬胚體培養(yǎng)液懸浮，細胞懸液移入100mm的 低吸附性細菌培養(yǎng)皿中，37°C， 5%C02條件下培養(yǎng)，每兩天更換l次培養(yǎng)液， 所述擬胚體培養(yǎng)液為無血清人胚胎干細胞培養(yǎng)液撤除bFGF因子Knockout DMEM培養(yǎng)基、20%血清替代物、1%非必需氨基酸、0.1mM(5-巰基乙醇、lmM 谷氨酰胺、50IU/mL青霉素、50IU/mL鏈霉素；取呈集落狀生長的人ES細胞，將 其接種于低吸附性的細菌皿，1周左右成成熟EB。
5、 根據權利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述步驟3) 具體過程為在顯微鏡下利用口吸管吸取技術選取培養(yǎng)7d的、大小較為均一 的EB，將其先后置于兩個含有PBS的細菌皿中洗滌兩遍，然后顯微鏡下利用 口吸管轉移至預先添加有0.25%胰蛋白酶的細菌皿中進行消化，37°C， 5%C02 條件下孵育大約5分鐘，直至輕輕吹打可以全部形成單個細胞，再以血清中止 消化，用滴管轉移至10ml離心管中，1000rpm，離心5分鐘，棄上清，沉淀即 為所需單個細胞。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟4)具體過程為 將挑選的單個細胞接種到預先包被有I型膠原的培養(yǎng)板上，加入肝細胞誘導條 件培養(yǎng)液，37°C,5%C02條件下培養(yǎng)，每兩天更換培養(yǎng)液，觀察細胞定向誘導 分化進程至獲得肝細胞；所述肝細胞誘導條件培養(yǎng)液IMDM培養(yǎng)基，含20% 胎牛血清，50nM地塞米松，0.0625U/ml人胰島素。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟4)誘導時間為 21天。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人胚胎干細胞(hES)體外定向誘導分化為肝細胞的方法，首先利用hES細胞的高度自我更新和增殖的生物學特性，采用膠原酶IV消化法進行傳代擴增，獲得大量干細胞；再將hES細胞接種到低吸附性的細菌皿中形成成熟擬胚體(EB)；然后將成熟的囊性EB用0.25胰酶-0.02％EDTA消化為單個細胞后接種到預先包被有I型膠原的組織培養(yǎng)皿，以含有地塞米松和人胰島素的條件誘導液培養(yǎng)，并觀察鑒定其向肝細胞方向分化。本發(fā)明提供hES細胞高效分化為肝細胞的方法，同時此法使得后續(xù)的鑒定工作更加簡單、有效，為干細胞移植或生物人工肝治療重癥肝炎、肝衰竭等疾病奠定了基礎。
文檔編號C12N5/08GK101117626SQ20071011872
公開日2008年2月6日 申請日期2007年7月12日 優(yōu)先權日2007年7月12日
發(fā)明者習佳飛, 劉雨瀟, 雪 南, 施雙雙, 楊印祥, 王韞芳, 白慈賢, 裴海云, 裴雪濤, 琳 陳 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所